BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
BÙI THỊ LUYẾN
XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH
DƯ LƯỢNG MỘT SỐ CHẤT NHÓM
QUINOLON TRONG THỰC PHẨM BẰNG
KỸ THUẬT LC-MS/MS
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
HÀ NỘI 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
BÙI THỊ LUYẾN
XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH
DƯ LƯỢNG MỘT SỐ CHẤT NHÓM QUINOLON
TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 60720410
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS Nguyễn Tường Vy
2. Ths. NCS Cao Công Khánh
HÀ NỘI 2014
LỜI CẢM ƠN
Để có thể hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ về mọi
mặt từ các thầy cô, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè.
Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới:
PGS.TS. Nguyễn Tường Vy – Phó Trưởng Phòng SĐH- ĐH Dược Hà Nội
Th.S NCS Cao Công Khánh – Viện KN ATVSTPQG
đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài này.
Đồng thời tôi xin cảm ơn các cán bộ Viện Kiểm Nghiệm An toàn vệ sinh thực
phẩm Quốc gia đã luôn sẵn lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong
quá trình thực nghiệm.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình và bạn bè đã
luôn động viên và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 08 năm 2014
Tác giả
Bùi Thị Luyến
MỤC LỤC
CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
Đặt vấn đề ..................................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN...........................................................................................1
1.1. Vài nét về Quinolon.............................................................................................3
1.1.1. Cấu tạo chung.....................................................................................................3
1.1.2. Phân loại ............................................................................................................3
1.1.3. Cơ chế tác dụng..................................................................................................3
1.1.4. Tác dụng phụ ................................................................................................... 3
1.1.5. Đặc tính của các quinolon nghiên cứu ................................................................4
1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao và chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc
ký ...............................................................................................................................5
1.3. Nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm ............................................12
1.3.1. Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi ................................................12
1.3.2. Các nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm ở trong nước ..................13
1.3.3. Các nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm ở ngoài nước...................14
1.3.4. Một số quy định về giới hạn tồn dư quinolon trong thực phẩm .........................16
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu của đề tài .......................................................................20
2.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất................................................................................20
2.2.1. Thiết bị, dụng cụ...............................................................................................20
2.2.2. Thuốc thử, hóa chất ..........................................................................................20
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu .............................................................20
2.3.1. Nghiên cứu các điều kiện LC-MS/MS ..............................................................20
2.3.2. Nghiên cứu và lựa chọn quy trình xử lý mẫu ...................................................22
2.3.3. Thẩm định lại phương pháp đã xây dựng..........................................................24
2.3.4. Thực nghiệm xác định quinolon trên mẫu thịt, cá ............................................24
2.4. Tính toán kết quả, xử lí số liệu .........................................................................25
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả khảo sát và lựa chọn các thông số cho LC-MS ..................................27
3.1.1. Xác định các thông số của detector khối phổ (MS ............................................27
3.1.2. Xác định các thông số của phần LC để tách các chất nhóm Quinolon ...............28
3.2. Xác định kỹ thuật xử lý mẫu.............................................................................29
3.2.1. Quy trình tách chiết các chất cần phân tích khỏi nền mẫu .................................29
3.2.2. Quy trình làm sạch và làm giàu mẫu qua SPE...................................................31
3.2.3. Quy trình xử lí mẫu được lựa chọn ...................................................................33
3.3. Thẩm định phương pháp đã xây dựng .............................................................34
3.3.1. Tính thích hợp của hệ thống ............................................................................34
3.3.2. Độ đặc hiệu/độ chọn lọc ..................................................................................35
3.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn .................................................................35
3.3.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) .................................39
3.3.5. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp.........................................................39
3.4. Phân tích trên mẫu thực nghiệm ......................................................................44
Chương 4. BÀN LUẬN
4.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật ............................................................................46
4.1.1. Các điều kiện phân tích trên hệ thống LC-MS/MS............................................46
4.1.2. Điều kiện xử lý mẫu .........................................................................................47
4.2. Thẩm định quy trình đã xây dựng...................................................................47
Kết luận ...................................................................................................................50
Kiến nghị .................................................................................................................52
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
HPLC
Tiếng Anh
High Performance Liquid
Tiếng Việt
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Chromatography
LC-MS/MS
Liquid Chromatograph
Sắc ký lỏng ghép 2 lần khối
Tandem Mass Spectrometer
phổ
LOD
Limit of Detection
Giới hạn phát hiện
LOQ
Limit of Quantitative
Giới hạn định lượng
SPE
CE
Solid phase extraction
Capillary electrophoresis
Chiết pha rắn
ESI
Electrospray ionization
EU
European Union
Điện di mao quản
Ion hóa phun điện tử
Liên minh Châu Âu
Atmospheric pressure chemical
APCI
AOAC
IS
ion hoá hoá học áp suất khí
ionization
quyển
Association of Official Analytical.
Hiệp hội các nhà hoá phân tích
Chemists
Internal Standard
Nội chuẩn
Mẫu PT
Mẫu phân tích
TL
Thịt lợn
TG
Thịt gà
C01
Cá 01
RSD
Relative Standard Deviation
Độ lệch chuẩn tương đối
Ppb
Part per billion
Phần tỷ
Ppm
Part per million
Phần triệu
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Giới hạn tồn dư tối đa của các quinolone theo quyết định số 2377/90/EC của
Ủy ban Châu Âu……………………………………………………….…………...…15
Bảng 1.2 : Danh mục các quinolone hạn chế sử dụng trong sản xuất kinh doanh thủy
sản..………………………………...…………………………………...….………….16
Bảng 3.1. Thông số chung của detector khối phổ…………...........................………..27
Bảng 3.2 Thông số chi tiết của 4 Quinolon………………………...…………………27
Bảng 3.3 Gradient pha động khi sử dụng cột Symmetry……………….…...……….28
Bảng 3.4 Gradient pha động khi sử dụng cột Xbridge………...……………….....…..28
Bảng 3.5: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Norfloxacin……....29
Bảng 3.6: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Ciprofloxacin….....30
Bảng 3.7: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Enrofloxacin......…30
Bảng 3.8: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Flumequin.…...….30
Bảng 3.9: Kết quả thử nghiệm cột SPE khi phân tích Norfloxacin………......……….31
Bảng 3.10: Kết quả thử nghiệm cột SPE khi phân tích Ciprofloxacin……...….……..32
Bảng 3.11: Kết quả thử nghiệm cột SPE khi phân tích Enrofloxacin………...………32
Bảng 3.12: Kết quả thử nghiệm cột SPE khi phân tích Flumequin..…………...……..33
Bảng 3.13. Kết quả phân tích tính thích hợp của hệ thống………..…………………..34
Bảng 3.14: Kết quả phân tích dãy chuẩn Norfloxacin………………….……………..36
Bảng 3.15: Kết quả phân tích dãy chuẩn Ciprofloxacin………………...……………37
Bảng 3.16: Kết quả phân tích dãy chuẩn Enrofloxacin………..…………………...…37
Bảng 3.17: Kết quả phân tích dãy chuẩn Flumequin…………………………….……38
Bảng 3.18: LOD và LOQ của các chất phân tích tính trên nền mẫu thịt………...……39
Bảng 3.19: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE HLB của Norfloxacin………..……40
Bảng 3.20: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE HLB của Ciprofloxacin……..…….40
Bảng 3.21: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE HLB của Enrofloxacin………...….41
Bảng 3.22: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE HLB của Flumequin..……….…….41
Bảng 3.23: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE C18 của Norfloxacin…….………..42
Bảng 3.24: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE C18-E của Ciprofloxacin…………42
Bảng 3.25: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE C18-E của Enrofloxacin…….…….41
Bảng 3.26: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE C18-E của Flumequin.……..…….41
Bảng 3.27 : Kết quả phân tích 20 mẫu thịt gà (đơn vị là µg/kg)……...…………..…44
Bảng 3.28: Kết quả phân tích 20 mẫu thịt lợn (đơn vị là µg/kg)………………..….....44
Bảng 3.29: Kết quả phân tích 20 mẫu cá nước ngọt (đơn vị là µg/kg)…………….....44
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Cấu trúc cơ bản của nhóm quinolon ..………………………………… …….3
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin ………………..……………………...4
Hình 1.3. Công thức cấu tạo của Enrofloxacin ……….………….…….……..……….5
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Norfloxacin ….……………………………………..5
Hình 1.5. Công thức cấu tạo của Flumequin …….……………………………………5
Hình 3.1: Sắc ký đồ thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích norfloxacin……..29
Hình 3.2: Sắc ký đồ thử nghiệm cột SPE khi phân tích Norfloxacin…………………32
Hình 3.3: Sắc ký đồ khi phân tích tính thích hợp của hệ thống………………..….35
Hình 3.4: Đồ thị đường chuẩn của Norfloxacin (trái) và Ciprofloxacin (phải)……….36
Hình 3.5: Sắc ký đồ khi xây dựng đường chuẩn của norfloxacin…………………….37
Hình 3.6: Đồ thị đường chuẩn của Enrofloxacin (trái) và Flumequin (phải)…..……..38
Hình 3.7: sắc ký đồ của norfloxacin khi xử lí mẫu qua cột SPE HLB …………….....40
Hình 3.8: Sắc ký đồ của mẫu thực tế có (hoặc không có) norfloxacin………………..45
ĐẶT VẤN ĐỀ
An toàn vệ sinh thực phẩm luôn được đặt lên hàng đầu trong công tác bảo vệ
sức khoẻ con người. Trong chăn nuôi hiện nay, vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh
(trong thức ăn, điều trị bệnh gia súc, gia cầm) là rất phổ biến và được coi là một tiến
bộ của công nghệ sinh học. Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc kháng sinh nói chung
và nhóm Fluoroquinolon nói riêng có thể làm nguồn thực phẩm cung cấp cho con
người còn chứa một lượng nhỏ chất kháng sinh, người sử dụng loại thực phẩm này
trong thời gian dài có thể gây nguy hại cho sức khoẻ.
Trong tiến trình gia nhập WTO, thị trường hàng hoá của Việt nam được mở
rộng, đặc biệt trong lĩnh vực xuất khẩu các mặt hàng nông sản, thuỷ sản. Tuy nhiên,
do việc kiểm soát dư lượng hoá chất kháng sinh có hại đến sức khoẻ người tiêu
dùng chưa được thực hiện nghiêm túc nên một số lô hàng bị thị trường xuất nhập
khẩu phát hiện kháng sinh có hại vẫn còn cao. Tình trạng trên không chỉ gây thiệt
hại lớn về kinh tế cho các doanh nghiệp mà còn ảnh hưởng nghiêm trọng đến uy tín
chất lượng hàng Việt nam trên thị trường thế giới và sức khỏe người tiêu dùng.
Quinolon có phổ tác dụng diệt khuẩn rộng, hiệu quả cao nên chúng được sử
dụng rộng rãi để chữa bệnh cho người, gia cầm và thủy sản trong công nghiệp.
Trong quá trình nuôi dưỡng, nếu không tuân thủ về thời gian dùng thuốc và thời
gian sản xuất hoặc chế biến thì sẽ dẫn đến lượng Quinolon còn lại trong thịt gia cầm
hay thủy sản. Điều này sẽ gây rất nhiều mối nguy hiểm. Đặc biệt là gây ra hiện
tượng kháng thuốc của một số vi khuẩn như: Salmonella, Campylobacter spp,
Escherichia coli,... Hậu quả là giảm hiệu quả của Quinolon đối với các chủng vi
khuẩn trên, gây khó khăn và tốn kém trong điều trị cho con người.
Để bảo vệ quyền lợi của người tiêu dùng, ở châu Âu, tổ chức EU đã thiết lập
giới hạn lớn nhất (MRLs) đối với dư lượng thuốc trong nguồn thực phẩm khi cung
cấp cho con người vào năm 1990. Theo sự kiểm tra và định hướng của các chuyên
gia phòng thí nghiệm, EU đã công bố “Council directive 96/23/EC in 1996” [23] ,
trong đó quy định rõ hàm lượng kháng sinh theo từng loại thực phẩm và từng loại
thuốc, ví dụ như với enrofloxacin trong cơ, gan, thận của bò, lợn, gia cầm (gà, vịt)
là 30µg/kg; trong sữa bò là 100 µg/kg; Ở châu Mỹ, Hoa kỳ và các nước Bắc Mỹ đã
1
cấm sử dụng kháng sinh họ Fluoroquinolon. Bộ Thủy sản đã ra quyết định số
07/2005/QD-BTS ban hành ngày 24/02/2005 quy định danh mục 17 loại kháng sinh
cấm sử dụng và danh mục 34 loại hạn chế sử dụng trong đó có nhóm Quinolon [10]
và Quyết định số 26/2005/QD-BTS ban hành ngày 18/8/2005 bổ sung nhóm
Quinolon vào danh mục cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản xuất khẩu
vào thị trường Bắc Mỹ và Hoa Kỳ [11].
Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình xác định dư lượng một
số chất nhóm Quinolon trong thực phẩm bằng kỹ thuật LC-MS/MS”, với 2 mục tiêu
chính như sau:
1. Xây dựng quy trình xác định dư lượng ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin ,
flumequin trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép 2 lần khổi phổ LC-MS/MS.
2. Ứng dụng quy trình đã xây dựng để sơ bộ khảo sát dư lượng Quinolon trong một
số loại thực phẩm (Thịt, cá) trên thị trường Hà Nội.
2
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về Quinolon [5]
1.1.1. Cấu tạo chung
Đôi khi ở vị trí 8 là N. Vậy đa số chúng là dẫn chất của acid 1,4-dihydro-4oxo-quinolein-3-carboxylic.
O
COOH
R1
4
5
3
6
7
1
8
2
N
R2
R
Hình 1.1 Cấu trúc cơ bản của nhóm quinolon
1.1.2. Phân loại
- Quinolon thế hệ I: Gồm các chất không gắn F (trừ flumequin), hiện nay hầu như
chỉ dùng acid nalidixic.
- Quinolon thế hệ II: Được dùng từ năm 1985, gồm các chất có gắn F (ít nhất là ở vị
trí 6) hay các fluoroquinolon có phổ rộng trên cả vi khuẩn gram (-) và gram (+), với
hoạt tính mạnh:
+ Tác dụng trên cả vi khuẩn gram (-) đã kháng acid nalidixic, trực khuẩn mủ xanh,
nhiều vi khuẩn gram (-) khó trị khác.
+ Trên các vi khuẩn gram (+) thì đặc biệt là tụ cầu vàng, S.epidermitis đã kháng
gentamycin, liên cầu, cầu khuẩn ruột (Enterococus) và các vi khuẩn kỵ khí.
+ Trên các vi khuẩn phát triển trong tế bào, và một số loại vi khuẩn đặc biệt nguy
hiểm (như Legionella, Chlamydia, Ureoplasma, Mycoplasma, các vi khuẩn kháng
alcol...)
1.1.3. Cơ chế tác dụng
Theo một hoặc hai cơ chế sau và đều cho tác dụng diệt khuẩn:
- Ức chế ADN-gyrase, là enzym tham gia vào quá trình tổng hợp acid nhân.
- Tạo phức với kim loại hóa trị hai của các protein chứa các kim loại này, đồng thời
phức đó ion hóa thành ion phức có hoạt tính cao với các enzym chuyển hóa
1.1.4. Tác dụng phụ
Tác dụng phụ của thuốc chủ yếu là lên dạ dày - ruột, thần kinh trung ương và da.
- Tiêu hóa: Buồn nôn, nôn, ỉa chảy, đau bụng, rối loạn tiêu hoá
3
- Da: Nổi ban, ngứa, viêm tĩnh mạch nông.
- Cơ xương: Ðau ở các khớp, sưng khớp. Ðau cơ, viêm gân (gân gót) và mô bao
quanh. Có một vài trường hợp bị đứt gân, đặc biệt là ở người cao tuổi khi dùng phối
hợp với corticosteroid.
- Thần kinh trung ương: Cơn co giật, lú lẫn, rối loạn tâm thần, hoang tưởng, mất
ngủ, trầm cảm, loạn cảm ngoại vi, rối loạn thị giác kể cả ảo giác, rối loạn thính giác,
ù tai, rối loạn vị giác và khứu giác, tăng áp lực nội sọ.
- Da: Hội chứng da - niêm mạc, viêm mạch, hội chứng Lyell, ban đỏ da thành nốt,
ban đỏ đa dạng tiết dịch.
- Gan: Ðã có báo cáo về một vài trường hợp bị hoại tử tế bào gan, viêm gan, vàng
da ứ mật.
- Tiết niệu - sinh dục: Có tinh thể niệu khi nước tiểu kiềm tính, đái ra máu, suy thận
cấp, viêm thận kẽ.
- Khác: Nhạy cảm với ánh sáng khi phơi nắng, phù thanh quản hoặc phù phổi, khó
thở, co thắt phế quản.
1.1.5. Đặc tính của các quinolon nghiên cứu
Ciprofloxacin
Tên gọi: 1-Cyclopropyl-6-fluoro-1,4-dihydro-4-oxo-7-(1-piperazinyl)-3-quinolinecarboxylic
acid
HN
Công thức hóa học: C17H18FN3 O3
N
N
Trọng lượng phân tử: 331.35 g/mol
Nhiệt độ nóng chảy: 318-3200 C
F
COOH
O
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin
Tính chất: là bột kết tinh màu vàng nhạt, tan một phần trong nước, tan rất ít trong ethanol,
methylen chlorid. Tan tốt trong dung dịch acid acetic loãng, có hai giá trị pKa là 6.0 và 8.8
Enrofloxacin
Enrofloxacin là kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolone, loại PQ, có thể chống vi
khuẩn gram dương và gram âm.
4
Tên gọi: acid 1-Cyclopropyl-7-(4-ethyl-1-piperazinyl)-6-fluoro-1,4-dihydro-4-oxo3-quinolinecarboxylic.
Công thức hóa học: C19H22FN3O3
H3C
N
N
Trọng lượng phân tử: 359.4 g/mol
Nhiệt độ nóng chảy: 219-2210C
N
F
COOH
O
Hình 1.3. Công thức cấu tạo của Enrofloxacin
Tính chất: là tinh thể màu vàng nhạt, tan nhẹ một phần trong nước ở pH = 7,
có hai giá trị pKa: khoảng 5 và 8-9
Norfloxacin
Tên gọi: acid 1-ethyl-6-fluoro-4-oxo-7-(piperazin-1-yl)-1,4-dihydroquinolin-3-carboxylic
Công thức hóa học C16H18FN3O3
Trọng lượng phân tử: 319,3
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Norfloxacin
Tính chất : Bột kết tinh màu trắng hoặc vàng nhạt, dễ hút ẩm, nhạy cảm với ánh
sáng. Rất khó tan trong nước, khó tan trong aceton và ethanol 96%.
Flumequin
H
CH 3
Tên gọi: acid 9-Fluoro-5-methyl-1-oxo-6,
N
7-dihydro-1H,5H-benzoquinolizin-2-carboxylic
Công thức hóa học: C14H12FNO3
F
COOH
O
Trọng lượng phân tử: 261,3
Hình 1.5. Công thức cấu tạo của Flumequin
Tính chất: Bột trắng, không tan trong nước, ít tan trong methylen chlorid, rất
ít tan trong methanol, dễ tan trong kiềm
1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao và chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký
[2], [7]
Quá trình tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố
của các chất tan giữa hai pha khác nhau (pha động, pha tĩnh). Dung dịch các chất
5
phân tích khi vào cột sẽ được hấp thụ hay liên kết với pha tĩnh tùy thuộc vào bản
chất của cột và của chất cần phân tích. Khi pha động dịch chuyển với một tốc độ
nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột. Tùy theo
bản chất của pha tĩnh, bản chất của chất tan, bản chất của dung môi mà quá trình
rửa giải tách được các chất ra khỏi nhau. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát
hiện bởi detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng được đưa
ra máy in hoặc hiển thị trên màn hình. Nếu ghi quá trình tách sắc ký của hỗn hợp
nhiều thành phần, ta sẽ có một sắc đồ gồm nhiều pic. Quá trình tách sắc ký tốt thì
hỗn hợp có bao nhiêu thành phần thì sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt trên sắc đồ.
1.2.1. Kết nối sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với phổ khối lượng (MS)
Trong nhiều quá trình phân tích, các hợp chất quan tâm thường nằm trong
một hỗn hợp phức tạp, và vai trò của kỹ thuật sắc ký là thiết lập sự tách các thành
phần của hỗn hợp, cho phép định tính hoặc định lượng chúng. Về mặt định tính,
nhược điểm chính của kỹ thuật sắc ký trong quá trình tách là không có khả năng
cung cấp thông tin về định tính một cách rõ ràng cho các hợp phần mẫu, thậm chí cả
trong trường hợp chúng được tách hoàn toàn khỏi nhau. Việc định tính được dựa
trên cơ sở so sánh các đặc tính lưu giữ, mà đơn giản nhất là thời gian lưu của một
chất chưa biết với các chất so sánh được xác định trong cùng một điều kiện thí
nghiệm. Tuy nhiên, trên thực tế rất nhiều trường hợp thậm chí có cùng các đặc tính
lưu giữ của cấu tử chưa biết và vật liệu so sánh, trong giới hạn sai số thực nghiệm,
định tính, người phân tích cũng không thể kết luận một cách tuyệt đối hai hợp chất
này là giống nhau. Mặc dù các điều kiện sắc ký tương đối mở rộng cho các nhà
phân tích, nhưng không phải lúc nào cũng có thể thực hiện được quá trình tách tất
cả các cấu tử của một hỗn hợp mẫu và điều này có thể ảnh hưởng đến độ đúng, độ
chính xác trong quá trình phân tích định lượng của các chất cần quan tâm.
Khả năng của thiết bị sắc ký - khối phổ trên thực tế phụ thuộc vào phổ khối
lượng của nhiều chất mà các chất này đã có đầy đủ các phổ (thư viện phổ). Điều này
cho phép việc nhận dạng chúng một cách dễ dàng với độ tin cậy cao, mặc dù nhiều
khi không hoàn toàn như vậy. Nếu chất phân tích nằm trong một phần của hỗn hợp
6
thì phổ khối lượng nhận được sẽ chứa các ion từ tất cả các chất có mặt. Trong
trường hợp đặc biệt, nếu chất phân tích là một hỗn hợp của các thành phần lượng
nhỏ thì việc nhận dạng sẽ trở nên khó khăn và dường như không thể. Sự kết hợp khả
năng tách của phương pháp sắc ký cho phép các chất tinh khiết được đưa vào máy
phổ khối. Khả năng nhận dạng của máy phổ khối rất rõ ràng, vì thế có thuận lợi và
đặc biệt cho các chất tương tự nhau hoặc giống hệt nhau về các đặc trưng lưu,
nhưng có phổ khối lượng hoàn toàn khác nhau và có thể phân biệt được các chất
này. Ngoài ra, phổ khối lượng còn cho phép định lượng với độ chính xác phụ thuộc
vào mức độ phức tạp của hỗn hợp mẫu và bản chất của mỗi thành phần trong hỗn
hợp. Công việc này nếu chỉ riêng phép sắc ký thôi thì không thể thực hiện được.
Phương pháp sắc ký
- Là phương pháp tách dành cho hỗn hợp mẫu.
- Nhận dạng các mẫu dựa trên thời gian lưu.
- Cho phép phân tích định tính và định lượng.
- Phân lập và tinh chế chất.
Phương pháp phổ khối lượng
- Là phương pháp nhận dạng các lượng mẫu nhỏ.
- Cung cấp phổ khối lượng của các hỗn hợp phức tạp.
Sự kết hợp của HPLC và phổ khối lượng vì thế cho phép nhận dạng rõ ràng và xác định
số lượng của các hợp chất mà phương pháp sắc ký không phân tích đầy đủ được.
1.2.2. Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng - khối phổ
Một máy sắc ký lỏng khối phổ bao gồm 3 bộ phận chính (hình 1.1).
- Thiết bị sắc ký lỏng (LC, Liquid Chromatography): thông thường sử dụng máy
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC, High Performance Liquid Chromatography),
hiện đại hơn là máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC – Ultra Performance Liquid
Chromatography)
- Bộ kết nối (Interface): có nhiệm vụ loại dung môi rửa giải và đưa mẫu chất vào
buồng ion hoá của máy phổ khối. Đây là bộ phận rất quan trọng và là chìa khoá của
phương pháp LC-MS.
7
- Thiết bị phổ khối lượng (MS, Mass Spectrometry).
Máy tính điều khiển và phân tích số liệu
Dung
môi
Bơm chân không
Bộ tiêm
mẫu
Bơm cao áp
Cột sắc ký
Sắc ký lỏng
Bộ kết
nối
Nguồn
ion
Bộ kết nối
Bộ phân
tích khối
Bộ phát
hiện
Khối phổ
Hình 1.6. Sơ đồ hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ
Bộ phận kết nối (interface) ở đây đóng vai trò quan trọng vì nó là kỹ thuật
chìa khoá của một máy sắc ký lỏng - khối phổ. Chức năng của bộ kết nối là loại
dung môi rửa giải và đưa mẫu chất vào buồng ion hóa của máy khối phổ. Bộ kết
nối bao gồm nhiều loại khác nhau và ra đời ở các thời điểm khác nhau như:
- Bộ kết nối băng chuyền (Moving Belt Interface): 1977.
- Bộ kết nối nạp chất lỏng trực tiếp (DLI, Direct Liquid Introduction Interface):
1980
- Bộ kết nối phun nhiệt (Thermospray Interface): 1983
- Bộ kết nối bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục (CF-FBA, Continuous Flow
Fast Atom Bombardment Interface): 1985/1986.
- Bộ kết nối ion hoá hoá học áp suất khí quyển (APCI, Atmospheric-Pressure
Chemical Ionization Interface): 1986.
- Bộ kết nối ion hóa phun điện (ESI, Electrospray Ionization Interface): 1988.
1.2.3. Phương pháp phổ khối lượng (MS)
Phương pháp phổ khối lượng là một trong những phương pháp phân tích
công cụ quan trọng. Phổ khối lượng cung cấp các thông tin về phân tích định tính,
định lượng các nguyên tố, thành phần và cấu trúc của các hợp chất vô cơ và hữu cơ.
a. Nguyên tắc chung của phương pháp
Cơ sở của phương pháp phổ khối lượng đối với các hợp chất hữu cơ là sự
bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hoà thành ion phân tử mang điện tích
8
dương hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc theo sơ đồ sau bằng các phần tử
mang năng lượng cao:
Sự hình thành các ion mang điện tích +1 chiếm hơn 95%, còn lại các ion
mang điện tích +2 hoặc ion âm (-). Năng lượng bắn phá các phân tử thành ion phân
tử khoảng 10 ev. Nhưng với năng lượng cao thì ion phân tử có thể phá vỡ thành
mảnh ion dương (+), hoặc các ion gốc, các gốc hoặc các phân tử trung hoà nhỏ hơn:
Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phương pháp bắn phá và năng
lượng bắnphá. Quá trình này gọi là quá trình ion hóa.
Ion phân tử và các ion mảnh là các phần tử có khối lượng. Nếu gọi khối
lượng của một ion là m và điện tích của nó là e thì tỷ số z=m/e được gọi là số khối.
Hiển nhiên các ion có khối lượng là m, 2m, 3m… và điện tích tương ứng bằng e, 2e,
3e, … có số khối z bằng nhau. Ion phân tử có số khối ký hiệu là M+..
b. Thiết bị khối phổ
Thiết bị phổ khối đầu tiên được chế tạo bởi J. Thomspon (1912) và F. W.
Aston (1919). Thiết bị hoàn thiện được chế tạo năm 1932.
9
1.2.4. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký
Trong các mẫu sinh học, mẫu môi trường thường có thành phần rất phức tạp,
hàm lượng chất cần phân tích khá thấp nên không tương thích cho việc phân tích
trực tiếp trên hệ sắc ký. Do vậy, trước khi phân tích mẫu chúng ta cần phải tách, làm
giàu các hợp phần của mẫu cần phân tích. Có rất nhiều phương pháp xử lý mẫu như:
lọc, bay hơi, làm khô, ly tâm, chiết lỏng-lỏng, sắc ký cột, chiết Soxhlet, SPE, xung
siêu âm, vi sóng.... nhưng tất cả các phương pháp này đều phải đáp ứng được các
tiêu chí:
- Làm sạch mẫu một cách chọn lọc.
- Tăng nồng độ lên nhiều lần.
- Lượng mẫu không cần nhiều.
- Lượng dung môi cần ít.
- Độ thu hồi cao, không gây nhiễu.
- Đơn giản, nhanh, giá thành thấp.
Dựa trên các mối liên hệ giữa độ chọn lọc, độc tính dung môi, giá thành, thời
gian... mà chúng ta chọn phương pháp chiết mẫu sao cho hiệu quả nhất.
a. Chiết lỏng - lỏng
Phương pháp chiết lỏng - lỏng là phương pháp làm sạch mẫu thông dụng,
dụng cụ thiết bị khá đơn giản nhưng hiệu quả chiết khá cao. Quá trình chiết lỏng lỏng dựa trên định luật phân bố Nernst: bất cứ một hợp phần trung tính nào cũng sẽ
phân bố giữa hai dung môi không trộn lẫn với tỷ số nồng độ trong hai pha là một
hằng số.
10
KA =
[Ahc ]
[An ]
KA: hằng số phân bố
[Ahc]: nồng độ của chất A trong pha hữu cơ.
[An]: nồng độ của chất A trong pha nước.
b. Chiết pha rắn SPE
Ngày nay, để làm sạch mẫu trong kỹ thuật sắc ký người ta thường sử dụng
phương pháp chiết pha rắn SPE (chiếm hơn 50% các phương pháp làm sạch mẫu).
Phương pháp chiết pha rắn ứng dụng cho nhiều nền mẫu (matrix) như các loại
mẫu môi trường, các loại mẫu dược phẩm, mẫu sinh hóa, mẫu hữu cơ và mẫu thực
phẩm. Có 6 bước chính trong quá trình chiết pha rắn:
Bước 1. Chuẩn bị dịch mẫu: Mẫu phải ở dạng dung dịch và tương tác được
với chất hấp phụ. Dịch mẫu khi cần thiết phải được lọc hoặc ly tâm trước khi cho
vào cột SPE để tránh làm tắc cột.
Bước 2. Hoạt hóa cột: làm ướt pha rắn, tạo môi trường thích hợp cho việc
hấp phụ chất phân tích. Thể tích dung môi cần sử dụng khoảng 1mL/100mg chất
hấp phụ. Nếu thể tích dung môi sử dụng ít hơn thể tích quy định này sẽ làm tăng
nguy cơ pha rắn không được solvat hóa hoàn toàn, kết quả độ thu hồi của mẫu
thấp.
Bước 3. Cân bằng cột: Trước khi cho mẫu vào, cột phải có điều kiện tương
đương với điều kiện chạy của mẫu (ví dụ: pH) bằng cách cho thêm dung môi có
điều kiện tương đương dung môi chứa mẫu.
Bước 4. Nạp mẫu: mẫu được cho qua cột SPE. Tốc độ dòng chảy của mẫu
qua cột khoảng 3ml/phút.
Bước 5. Rửa pha rắn: dùng dung môi thích hợp để loại các tạp chất ra khỏi
cột nhưng vẫn giữ lại được chất cần phân tích.
Bước 6. Rửa giải: sử dụng dung môi thích hợp để tách chất cần phân tích ra
khỏi cột, tốc độ dòng chảy khi rửa giải không được quá nhanh. Tốc độ này phụ
thuộc vào đường kính cột và khối lượng chất hấp phụ, người ta thường rửa với tốc
độ khoảng 1ml/phút.
11
- Xem thêm -