Tài liệu Báo cáo thực hành hóa phân tích 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH KHOA HÓA HỌC ỨNG DỤNG -----(((((----- BÁO CÁO THỰC HÀNH HÓA PHÂN TÍCH 2 Người hướng dẫẫn: Huỳnh Thị Hồồng Hoa Sinh viên thực hiện: Nhóm 2 Lư Thị Thanh Hằồng Nguyêẫn Tr ọng H ữu Nguyêẫn Vằn Khang Nguyêẫn Th ảo Linh Trà Vinh Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích 2 NHẬN XÉT ................................................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................................... ................................................................. Trà Vinh, ngày tháng năm Người hướng dẫẫn GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 2 SVTH Nhóm 2 Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích 2 Mục Lục Bài 1: XÁC ĐỊNH TỈ LỆ HỆ DUNG MÔI CHẠY SẮC KÝ BẰNG TLC..........................4 I. Cơ sở lý thuyết....................................................................................................4 II. Tiến hành thí nghiệm......................................................................................8 III. Kết quả thí nghiệm........................................................................................11 IV. Tính toán.......................................................................................................11 Bài 2: PHÂN TÁCH SẮC TỐ CAROTEN VÀ LICOPEN BẰNG SẮC KÍ BẢN MỎNG ..................................................................................................................................... 14 I. Cơ sở lý thuyết..................................................................................................14 II. Tiến hành thí nghiệm....................................................................................17 III. Kết quả thí nghiệm.......................................................................................20 IV. Tiến hành thí nghiệm....................................................................................20 Bài 3:........................................................................................................................... 22 GIỚI THIỆU HỆ THỐNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)............22 Bài 4: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN C TRONG MẪU THUỐC.......................38 I. Các bước tiến hành..........................................................................................38 II. Quy trình vận hành máy HPLC..................................................................40 III. Quy trình đo mẫu..........................................................................................43 IV. Kết quả và thảo luận.....................................................................................44 V. Câu hỏi củng cố.............................................................................................44 Bài 5: GIỚI THIỆU VỀ HỆ THỐNG SẮC KÍ KHÍ - GC.................................................45 GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 3 SVTH Nhóm 2 Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích 2 Bài 1: XÁC ĐỊNH TỈ LỆ HỆ DUNG MÔI CHẠY SẮC KÝ BẰNG TLC I. Cơ sở lý thuyết Sắc ký lớp mỏng là hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất trơ (thí dụ như: silicagel). Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hay tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng. GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 4 SVTH Nhóm 2 Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích 2  Bình sắc ký: Một chậu, hủ, lọ bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy.  Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm của một loại hợp chất hấp thu (silicagel, alumin,..) được tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên tấm kiếng, tấm nhôm, hay tấm plastic. Chất hấp thu trên nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bột hay một lọai polymer hữu cơ.  Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1l dung dịch mẫu với nồng độ pha loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phải cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng chứa trong bình.  Pha động: dung môi hay hỗn hợp 2 dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng, và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển càng cao nhờ tính mao quản. Mỗi thành phần chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi. Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh và tùy thuộc vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi. GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 5 SVTH Nhóm 2 Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích 2  Ưu điểm:  Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích  Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích.  Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng. GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 6 SVTH Nhóm 2 Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích 2  Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi: Rf = Trong đó: a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm. b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm. Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l. GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 7 SVTH Nhóm 2 Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích 2 Các bước tiến hành trong sắc ký lớp mỏng II. - Tiến hành thí nghiệm Quy trình chung của sắc ký bản mỏng Chuẩn bị pha tĩnh, Chuẩn bị pha động phù hợp bản mỏng Chấm mẫu lên vạch xuất phát Triển khai sắc ký - Xử lý kết quả Chuẩn bị mẫu chạy sắc ký Mẫu lá chứa chất diệp lục GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 8 SVTH Nhóm 2 Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng 10 g lá cắt Báo cáo thực hành hóa phân tích 2 2g CaCO3 nhỏ Nghiền Lấy phần nhớt, cho 2ml toluen vào 15 ml ethannol Lấy phần xanh đậm ở phía trên để chạy sắc ký Quà trình lọc chất diệp lục để chạy sắc kí bản mỏng GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 9 SVTH Nhóm 2 Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích 2 Quá trình tách diệp lục để chạy sắc kí ð Ta thẫấy dung dịch được tách ra thành 3 lớp nh ưng ta ch ỉ lẫấy l ớp màu xanh đi ch ạy sằấc kí. - Chuẩn bị hệ dung môi: 5ml acetone 5ml dầu hỏa GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa Cho vào cốc 100ml có Đậy kín bằng chuẩn bị sẵn giấy lọc giấy paraphin 10 SVTH Nhóm 2 Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng III. Báo cáo thực hành hóa phân tích 2 Kết quả thí nghiệm Ảnh sắc kí bản mỏng IV. Tính toán Ta có: Rf = a= 0.9 cm b= 3.7cm ð Rf = = 0.2432 cm GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 11 SVTH Nhóm 2 Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng V. Báo cáo thực hành hóa phân tích 2 Trả lời câu hỏi 1. Nêu nguyên tắc chọn lựa dung môi trong sắc ký lớp mỏng Dung môi thích hợp dùng trong sắc kí lớp mỏng sẽ là một dung môi có tính phân cực khác với pha tĩnh. Nếu một dung môi phân cực được dùng để hòa tan mẫu thử trên một pha tĩnh phân cực, vệt nhỏ mẫu thử sẽ lan tròn do mao dẫẫn, và các vệt khác nhau có thể trộn lẫn vào nhau. Do đó, để hạn chế sự lan tròn của các vệt mẫu, dung môi được sử dụng để hòa tan mẫu thử phải không phân cực, hoặc phân cực một phần, nếu pha tĩnh phân cực, và ngược lại. 2. Tại sao khi triển khai sắc ký bản mỏng, phải cho hệ dung môi vào bình, đậy nắp bình lại và để yên cho dung môi thấm ướt hết giấy lọc? Khi triển khai sắc ký bản mỏng, phải cho hệ dung môi vào bình, đậy nắp bình lại và để yên cho dung môi thấm ướt hết giấy lọc vì để tránh dung môi bay hơi và coi hệ dung môi có đồng nhất hay không. Nếu hệ dung môi thấm ướt giấy lọc thì hệ dung môi đã đồng nhất 3. Hệ dung môi và tỉ lệ dung môi ảnh hưởng như thế nào đến tỉ lệ Rf? Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để có được chỗ liên kết với pha tĩnh. Thí dụ, nếu silicagel được dùng như pha tĩnh, nó được xem là phân cực. Cho trước 2 hợp chất có tính phân cực khác nhau, chất nào có tính phân cực lớn hơn sẽ có sự liên kết với silicagel lớn hơn và vì thế sẽ có khả năng đẩy pha động ra khỏi các chỗ liên kết. Do đó, hợp chất có tính phân cực nhỏ hơn sẽ di chuyển lên cao hơn trên bản sắc kí (kết quả là hệ số lưu Rf sẽ lớn hơn). Nếu pha động được thay bằng GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 12 SVTH Nhóm 2 Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích 2 một dung môi phân cực hơn hoặc là một hỗn hợp các dung môi, nó sẽ có khả năng để đẩy các chất tan ra khỏi chỗ liên kết với silica gel, và tất cả các hợp chất trên bản sắc kí sẽ dịch chuyển lên cao hơn. Trên thực tế, nếu chúng ta dùng một hỗn hợp ethyl acetate và heptanenhư là pha động, tăng thêm ethyl acetate sẽ cho hệ số lưu R f cao hơn cho tất cả các hợp chất trên bản sắc kí. Thay đổi độ phân cực của pha động sẽ không làm các hợp chất có thứ tự di chuyển ngược lại trên bản sắc kí. Nếu muốn có một thứ tự ngược lại trên bản sắc kí, một pha tĩnh không phân cực sẽ được sử dụng, như là C18-chức năng hóa silicagel GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 13 SVTH Nhóm 2 Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích 2 Bài 2: PHÂN TÁCH SẮC TỐ CAROTEN VÀ LICOPEN BẰNG SẮC KÍ BẢN MỎNG I. Cơ sở lý thuyết 1. Giới thiệu về đu đủ Là loại cây cao 6 – 7 m, thân đứng thẳng có phân nhánh hoặc không phân nhánh, vỏ mang nhiều sẹo của cuống lá. Lá chỉ có nhiều ở ngọn, lá chia 6 – 7 thùy, hình trứng, mép có răng cưa không đều. Lá to, cuống rỗng dài 30 – 50 cm, gân lá hình chân vịt. Hoa màu trắng nhạt hay xanh, mọc ở kẻ lá. Hoa cái có tràng nhiều hơn tràng của hoa đực mọc thành chùm ở kẻ lá. Cụm hoa ñực phân nhánh nhiều, cụm hoa cái chỉ có 2 đến 3 hoa. Sau 1 tháng hoa thụ phấn. Lá mang hoa rụng sẽ để lại sẹo trên cây. Quả thịt dầy mọng, ở giữa rỗng có nhiều hạt hình trứng. Đu đủ không chịu được xứ lạnh, thích hợp với đất khô xốp, nhiều mùn, phát triển rất tốt ở vùng nhiệt đới. a. Thành phần hóa học: Trong đu đủ chín có 19 loại carotenoit chủ yếu cryptoxanthin (48%), caroten(30%), cryptoflavine (13%). GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 14 SVTH Nhóm 2 Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích 2 Có thể tóm tắt thành phần hóa học của 100g đu đủ chín: Thành phần Nước Vitamin A Canxi Năng lượng Vitamin B1 Photpho Protein Vitamin B2 Kali Lipit Sắt Cacbonhydrat Vitamin C Kẽm Hàm lượng 90 (g) 120 (mcg) 40 (mg) 36 (calo ) 20 (mcg) 32 (mg) 1,0 (g ) 20 (mcg) 221 (mg) 0,1 (g ) 2.6 (mg ) 7.7 (g ) 64 ( mg ) 6.4 ( mg ) 2. Sơ lược về licopen và β-caroten - Licopen và β-caroten gọi chung là carotenoit là những hợp chất có màu phân bố rộng rãi trong giới động vật và thực vật. - - Licopen và β-caroten thuộc hợp chất xanthophylle Có nhiều phương pháp để làm sáng tỏ cấu trúc caroten là :  Hydro hóa.  Cộng hợp halogen, clorua iot hoặc cộng oxy để xác định các nối đôi. GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 15 SVTH Nhóm 2 Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích 2  Oxi hóa với axit cromic các nhóm metyl mạch nhánh thành các nhóm cacbonyl. I.1. β– caroten - Có công thức phân tử C40H56 - Công thức cấu tạo - β-caroten thuộc loại hợp chất không no. - Tan trong các dung môi không phân cực hoặc kém phân cực như ete dầu hỏa, n- hexan, heptan. - Điểm nóng chảy: 181 – 1830C - Được phát hiện từ những năm 1830 và được biết như nguồn cung cấp vitamin A cho cơ thể. - β-caroten ngăn chặn các gốc tự do có tác hại đến cơ thể và do đó ngăn ngừa được các bệnh mãn tính liên quan ñến các gốc tự do như bệnh ung thư, bệnh tim mạch. - Từ xưa người ta cho rằng ăn rau quả sống sẽ cung cấp nhiều vitamin hơn là nấu chín, thực ra ñiều này chỉ ñúng với các vitamin tan trong nước, còn đối với βcaroten là chất tan trong dầu và được bao bọc bởi các bao sợi cơ của tế bào rau quả GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 16 SVTH Nhóm 2 Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích 2 nên việc nấu chín sẽ giúp giải phóng nhiều β-caroten hơn. Kể từ năm 1980 các nhà dinh dưỡng nhận thấy β-caroten không chỉ đơn thuần là tiền vitamin A mà βcaroten còn được biết là một chất chống oxi hóa tế bào và chức năng này hoàn toàn ñộc lập với cơ thể cung cấp vitamin A. I.2. Licopen: - Công thức phân tử C40H56 - Công thức cấu tạo: - Cũng giống như β- caroten, licopen tan trong các dung môi không phân cực hoặc kém phân cực như ete dầu hỏa, heptan, n – hexan. - Về công thức của licopen là một chuỗi dài cấu trúc phân tử gồm có 13 nối đôi, lycopen được kiểm nghiệm là rất hữu hiệu trong việc ngăn chặn các oxygen đơn trong cơ thể của con người một cách rất hiệu quả. - Là một trong 600 hợp chất carotenoit nhưng lại là chất có hiệu quản trong chống ung thư phổi, dạ dày, trực tràng. GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 17 SVTH Nhóm 2 Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích 2 Trong quả cà chua màu đỏ licopen thường được tập trung ở vỏ, khi nấu chín cà - chua mới giải phóng được licopen. Vì vậy khi ăn cà chua chín không nên ăn sống mà phải nấu chín và ăn cả vỏ. Ngoài ra nó là carotenoit duy nhất có khả năng ngừa được chứng nhồi máu cơ tim - và bảo vệ gan khỏi bị tổn thương. Licopen là một caroten cơ thể con người không thể tự tổng hợp được mà phải lấy từ thức ăn. II. Tiến hành thí nghiệm 1. Chuẩn bị dịch các chất màu ( dịch đu đủ chín) - Đu đủ chín bổ ra bỏ vỏ và hạt, nghiền nhỏ thu được dịch đu đủ chín. Lấy 30g dịch đu đủ chín thêm 45ml etanol 96%. - -Khuấy mạnh trong 4-5 phút. - Lọc lấy bã đu đủ chín trên giấy lọc cho vào cốc them 30ml ete dầu hỏa khuấy mạnh trong 2-3 phút cho sắc tố tan vào ete dầu hỏa. - Lọc lấy dung dịch bằng bình lọc chân không. - Chuyển dịch lọc sang cốc cho bay hơi dung môi ete dầu hỏa 12 giờ được chất màu carotene của đu đủ chín. 2. Chạy sắc kí bản mỏng với dịch chất màu của đu đủ chín a. Chuẩn bị bản mỏng - Cắt bản mỏng ra thành những bản nhỏ có kích thước 2 x 8 cm từ bản mỏng mua trên thi trường đã được tráng silicagel có kích thước 20 x 29 cm để phân tích nhanh. - Dùng bút chì vót nhọn vạch mức xuất phát cách mép dưới bản mỏng 1,5cm mức tiền tuyến dung môi cách mép trên bản mỏng 1cm. GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 18 SVTH Nhóm 2 Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích 2 b. Lựa chọn dung môi - Một số hệ dung môi chạy bản mỏng với dịch đu đủ chín, cà chua chín, cà rốt ( dịch chưa tinh khiết) Dung môi hòa tan mẫu Ete dầu hỏa Hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng Ete dầu hỏa: Toluen:acetone Ete dầu hỏa: Toluen:acetone Toluen:acetone Ete dầu hỏa: Toluen Ete dầu hỏa: Acetone Tỉ lệ 45:1:5 45:5:1 45:5 45:5 45:5 c. Chuẩn bị mao quản - Mao quản có chiều dài 7cm, đường kính 1,5-1,6 mm, mao quả dung để hút dung dịch chấm lên bản mỏng yêu cầu mao quản phải có đường kính bé hơn, với kích thước này quá lớn để lấy mẫu đu đủ chạy bản mỏng các vết mẫu sẽ rất to làm cho kết quả không chính xác. - Để có đầu mao quản nhỏ cần phải vuốt nhọn mao quản bằng cách: Hai tay cầm hai đầu ống, đặt phần giữa ống lên ngọn lửa đèn cồn, vừa hơ vừa xoay tròn đều ống đến khi đoạn giữa mao quản trở nên mềm dẻo, đưa ống ra khỏi ngọn lửa, dùng hai tay kéo hai đầu ống dang ra hai phía. - Khi đó phần ống mao quản ở giữa trở nên nhỏ và hẹp hơn. Ống mao quản cứng lại, bẻ ống ra làm đôi ở chỗ đã được kéo nhỏ. d. Đưa mẫu lên bản mỏng - Hòa tan hết lượng dịch chất màu của đu đủ bằng 1 ml ete dầu hỏa. Dùng mao quản đã vuốt nhọn nhúng nhẹ phần đầu nhọ vào dung dịch mẫu đu đủ chín, lực GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 19 SVTH Nhóm 2 Trường Đại học Trà Vinh Khoa Hóa Học Ứng Dụng Báo cáo thực hành hóa phân tích 2 mao quản sẽ hút dung dịch đủ đủ chín vào mao quản, khi dung dich lên khoảng 6 mm thì lấy ra. - Cẩn thận nhẹ nhàng chấm phần đầu nhọn có chứa mẫu đu đủ chín lên bản mỏng tại vạch xuất phát. Chạm vào và lấy mao quản ra khỏi bề mặt bản mỏng thật nhanh để dung dịch mẫu đu đủ chín thấm vào bản mỏng tạo thành một điểm tròn nhỏ vì nếu chậm lâu điểm này sẽ lan to. - Để khô dung môi ete dầu hỏa ngoài không khí khoảng 5 phút. Lặp lại 3 lần như trên được một bản mỏng có chấm mẫu đu đủ chín dùng để chạy sắc ký. e. Chuẩn bị bình - Cho dung môi giải li vào cốc 250ml, dung môi ete dầu hỏa: toluene : axeton trộn theo tỉ lệ 45:1:5, sau đó dùng pipet hút 30ml vào cốc, để yên 5-10 phút để bão hòa dung môi trong bình. - Bản mỏng được cầm thẳng đứng và được nhúng vào cốc chứa dung môi trong bình, khi nhúng phải cẩn thận để hai cạnh của bản mỏng không chạm vào thành cốc, sau đó nhẹ nhàng để bản mỏng tựa vào thành cốc nghiêng khoảng 1 góc 15 độ. Vị trí vết chấm dịch đu đủ nằm trên cao cách mặt thoáng của dung môi khoảng 0,5cm. - Đậy nắp cốc thật kín bằng parafine để đảm bảo không cho không khí lọt vào, theo dõi quá trình chạy sắc kí, khi dung môi lên cách tuyến dung môi 1 cm thì lấy bản mỏng ra, để bay hơi dung môi ngoài không khí 10 phút. f. Hiện hình các vết chấm sau khi triển khai GVHD Huỳnh Thị Hồng Hoa 20 SVTH Nhóm 2