Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Báo cáo thực hành vi sinh học đại cương...

Tài liệu Báo cáo thực hành vi sinh học đại cương

.DOCX
19
133
93

Mô tả:

Báo cáo thực hành vi sinh học đại cương
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG Nhóm: I Sinh viên thực hiện: Giảng viên hướng dẫn: TP.HCM, ngày 25 tháng 6 năm 2020 MỤC LỤC HÌNH ẢNH CỦA BÀI BÁO CÁO....................................................................3 BÀI 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG, PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG.....4 1.1 Các thiết bị trong PTN vi sinh......................................................................4 1.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật...................................................................4 1.3 Phương pháp khử trùng................................................................................6 BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ CẤY TRUYỀN VI SINH VẬT.....7 2.1 Phân lập........................................................................................................7 2.2 Phương pháp cấy truyền...............................................................................8 2.3 Kết quả thực hành........................................................................................9 BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN VÀ QUAN SÁT TẾ BÀO VSV 10 3.1 Quan sát đại thể..........................................................................................10 3.2 Quan sát vi thể............................................................................................10 BÀI 4: ĐẾM TRỰC TIẾP NẤM MEN BẰNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU 13 4.1 Giới thiệu buồng đếm hồng cầu.................................................................13 4.2 Quy trình đếm nấm men.............................................................................13 4.3 Tính kết quả................................................................................................13 4.4 Ưu điểm của phương pháp đếm trực tiếp tế bào nấm men bằng BĐHC....14 4.5 Nhược điểm của pp đếm trực tiếp nấm men bằng BĐHC.........................14 4.6 Ứng dụng của đếm trực tiếp nấm men bằng BĐHC..................................14 BÀI 5: KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH HÓA CỦA VSV...............................15 5.1 Mục đích.....................................................................................................15 5.2 Yêu cầu khi thực hiện phản ứng sinh hóa..................................................15 5.3 Một số phản ứng cơ bản.............................................................................15 2 HÌNH ẢNH CỦA BÀI BÁO CÁO Hình bài 2 2.3 Kết quả thực hành Phương pháp phân lập • Nấm men – M6 phân lập trên đĩa petri môi trường Sab. Vi khuẩn Phương pháp cấy truyền • Vi khuẩn – Bacillus cereus cấy truyền trên ống nghiệm môi trường TSA (trái). • Nấm men – M6 cấy truyền trên ống nghiệm môi trường PDA (phải). Hình bài 3 3.2 Quan sát vi thể: • Nấm men – M6 quan sát trên kính hiển vi. Hình bài 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 3 Nấm men BÀI 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG, PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG 1.1 Các thiết bị trong PTN vi sinh Thiết bị Nồi hấp tiệt trùng Cân Tủ ủ Bếp khuấy từ Kính hiển vi Tủ sấy Máy ly tâm Máy đồng nhất mẫu Mục đích Khử trùng môi trường dụng cụ. Cân hóa chất, môi trường. Ủ, nuôi cấy vi sinh vật ở các nhiệt độ mong muốn. Nấu môi trường và giúp quấy đều môi trường. Quan sát vi sinh vật. Sấy khô hoặc khử trùng dụng cụ ( thủy tinh, kim loại ). Ở nhiệt độ 160 độ C thời gian là 2 tiếng, nhiệt độ 180 độ C thời gian là 30 phút. Thu sinh khối. Đồng nhất mẫu ( chất rắn ). Stomacher 400 Máy đếm khuẩn lạc Đếm các khuẩn lạc. Tủ lạnh Máy rung ống nghiệm Lò vi sóng 1.2 Bảo quản hợp chất và môi trường, vi sinh vật và mẫu. Dùng đồng nhất chất lỏng trong ống nghiệm. Làm lỏng môi trường. Môi trường nuôi cấy VSV 1.2.1 Khái niệm: Môi trường là nơi có điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển, cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng, và có nồng độ pH thích hợp. 1.2.2 Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng nuôi cấy VSV Môi trường cần phải đủ lượng và đủ chất mới đảm bảo được sự phát triển vủa vi sinh vật là trạng thái tốt nhất. 1.2.3 Phân loại 1.2.3.1 Phân loại môi trường theo công dụng 4 Phân lập, cấy truyền… 1.2.3.2 Phân loại môi trường theo thành phần hoá học 1.2.3.3 Phân loại môi trường theo trạng thái vật lý Ảnh hưởng của agar tới trạng thái vật lý của môi trường: Trạng thái Hàm lượng agar/lit Công dụng của môi trường vật lý Đặc Hơi sệt sệt ( bán 15-20 g/l lỏng ) Lỏng 4-5 g/l Phân lập, nhân giống. Kiểm tra khả năng di động của vi sinh vật. 0 g/l Nhân giống. 1.2.4 Công thức môi trường Môi trường P.D.A (Potato Dextrose Agar): dùng để nuôi cấy men, mốc Thôn có Khoai tây: 200 g Dextrose: 40 g Agar: 20 g H2O: 1 L pH: 4.5 - 5 121 ℃ /15’/ 0.1 Mpa trong công thức môi trường: • Tên môi trường: P.D.A (Potato Dextrose Agar) • Công dụng: nuôi cấy men, mốc • pH: 4.5 – 5 • Chế độ khử trùng: 121 ℃ /15’/ 0.1 Mpa • Thành phần hóa học: 5 g tin Khoai tây: 200 g Dextrose: 40 g Agar: 20 g 1.2.5 Các bước để nấu môi trường Chuẩn bị môi trường Bước 1: Cân, đong ( bằng ống đong ) môi trường theo công thức. Bước 2: Đun ( nếu cần ), kiểm tra pH. Bước 3: Phân phối môi trường vào dụng cụ vô trùng. Bước 4: Khử trùng theo yêu cầu. 1.3 Phương pháp khử trùng 1.3.1.Khử trùng môi trường  Phương pháp khử trùng môi trường: nhiệt ẩm, lọc, dùng tia U.V .....  Khử trùng môi trường bằng phương pháp nhiệt ẩm: Phương Nhiệt độ/ thời gian pháp Nhiệt ẩm Nhiệt độ: 121 ℃ Nguyên lý khả năng diệt VSV Dựa vào hơi nước bão hòa Thời gian: khoảng 10-15 phút ở nhiệt độ cao, áp suất cao. 1.3.2 Khử trùng dụng cụ • Dụng cụ thủy tinh: sử dụng nhiệt ẩm ( nồi hấp tiệt trùng ), nhiệt khô ( tủ sấy ). • Dụng cụ nhựa: sử dụng nhiệt ẩm ( nồi hấp tiệt trùng ). • Khử trùng phòng thí nghiệm: phun hơi độc, đèn UV. 6 BÀI 2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ CẤY CHUYỀN VSV 2.1 Phân lập 2.1.1.Khái niệm Chuyển từ quần thể qua khuẩn lạc. 2.1.2.Mục đích phân lập Tạo dòng thuần. 2.1.3.Phương pháp phân lập Phương pháp phân lập vi sinh vật: Lưu ý : Dán nhãn ghi tên giống vi sinh vật, tên môi trường nuôi cấy, ngày cấy vào thành ống nghiệm và tên người thực nghiệm trên đĩa pitre .  Với nấm men, vi khuẩn : dùng que cấy vòng. Bước 1:Hơ nóng khử trùng que cấy dưới đèn cồn. Bước 2: Dùng que cấy lấy vi sinh vật trong ống môi trường nuôi cấy nấm men hoặc vi khuẩn. Bước 3: Một tay hé mở nắp đĩa pêtri vừa đủ để cho que cấy vào ( để kế bên đèn cồn để không bị nhiễm vi sinh vật từ môi trường ngoài ). Sau đó lướt que cấy lên mặt thạch theo phương pháp sau: VSV Que cấy Men Que , VK cấy Phương pháp vòng 2.2 Phương pháp cấy chuyền 7 2.2.1.Khái niệm Truyền vi sinh vật từ môi trường này sang môi trường khác. 2.2.2.Mục đích Giúp bảo quản, nhân giống và khảo soát sinh hóa. 2.2.3 Phương pháp cấy chuyền Phương pháp cấy chuyền VSV: + Lưu ý : Dán nhãn ghi tên giống vi sinh vật, tên môi trường nuôi cấy, ngày cấy vào thành ống nghiệm và tên người thực nghiệm trên đĩa pitre . Bước 1:Hơ nóng khử trùng que cấy dưới đèn cồn. Bước 2: Dùng que cấy lấy vi sinh vật trong ống môi trường nuôi cấy nấm men hoặc vi khuẩn. Bước 3: Tay khác lấy ống môi trường để nuôi cấy hơ qua ống dưới đèn cồn để khử trùng (để kế bên đèn cồn để không bị nhiễm vi sinh vật từ môi trường ngoài ). Sau đó đưa que cấy chứa vi sinh vật vô môi trường theo phương pháp sau: 8 Môi VSV trường Que cấy Phương pháp Q 2.3 Lỏng ue cấy Thạch nghiêng vò ng. Men, VK Q Thạch nghiêng sâu ue cấy Thạch đứng thẳ ng Q ue Thạch nghiêng Mốc cấy mó c Kết quả thực hành Hình trang 3 ( HÌNH CHUNG ). Hình ảnh kết quả của:  Phương pháp phân lập nấm men – M6 trên môi trường SAD trong đĩa petri.  Phương pháp cấy truyền nấm men – M6 trên môi trường PAD trong ống nghiệm thạch nghiêng.  Phương pháp cấy truyền vi khuẩn – Bacillus cereus trên môi trường TSA trong ống nghiệm thạch nghiêng 9 BÀI 3. PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN VÀ QUAN SÁT TẾ BÀO VSV 3.1 Quan sát đại thể • Quan sát khuẩn lạc bằng mắt để thấy được đặc điểm của khuẩn lạc như màu sắc, hình dạng, đường kính, độ vun, bóng, nhăn, có sợi...... • Việc quan sát đại thể các khuẩn lạc điển hình trên môi trường phân lập chọn lọc giúp dự đoán được đó là VSV nào. • Mô tả khuẩn lạc cuả VSV đã phân lập ở Bài 2: Khuẩn lạc của nấm men - M6, trên môi trường Sab Hình dạng: tròn Bờ, mép khuẩn lạc: bóng Đường kính: Màu sắc: trắng đục 3.2 Quan sát vi thể Làm tiêu bản và quan sát tiêu bản đó dưới kính hiển vi (KHV) để thấy được: Hình dạng, cách sắp xếp, kích thước của tế bào. Ví dụ: Hình ảnh quan sát nấm men - M6: Hình ở trang 3 ( hình chung ) 3.2.1 Làm tiêu bản nấm mốc (phương pháp giọt ép) 3.2.2 Làm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm đơn 3.2.3 Làm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm kép Bước 1: Ghi tên VSV. Làm vết bôi Bước 2: Cố định vết bôi: hơ trên ngọn lửa đèn cồn đến khi vết bôi khô. Mục đích cố định vết bôi: + Giết chết VSV + Giúp VSV dễ bắt màu thuốc nhuộm + Gắn chặt VSV trên lame + Giúp VSV không bị trôi khi rửa nước Bước 3: Nhuộm màu. Nhỏ thuốc nhuộm Gentiant Violet (Crystal violet). Để 1 phút. Rửa nước. Nhỏ Lugol. Để 1 phút. Rửa nước. Tấy cồn. Rửa nước. Nhỏ thuốc nhuộm Fuschin (hoặc Safranin). Để 30 giây. Rửa nước. 10 Bước 4: Quan sát KHV vật kính 100 (vật kính dầu). Vẽ hình quan sát được. Miêu tả hình dạng 1 tế bào, cách sắp xếp tế bào, tế bào bắt màu thuôc nhuộm nào. 11 Bài tập ở nhà: So sánh phương pháp nhuộm đơn và nhuộm kép. Nhuộm đơn Giống Quy trình Nhuộm kép Đều phải cố định vết bôi rồi mới nhuộm để quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi. Chỉ cần nhuộm màu 1 lần (sử Phải nhuộm màu 2 lần. Đầu tiên nhỏ dụng 1 trong các loại thuốc thuốc nhuộm Gentiant Violet nhuộm sau: Gentiant violet, (Crystal violet). Sau đó nhỏ Lugol. Fuschin, Xanh metylen, Xanh Nhuộm them 1 lần nữa bằng thuốc coton). nhuộm Fuschin (hoặc Safranin). Khác Giúp phân biệt hai nhóm vi Mục khuẩn (gram dương và gram đích âm) dựa trên sự khác nhau về đặc điểm thành tế bào. Giúp ta quan sát và phân biệt cấu trúc tế bào dễ dàng hơn so với việc nhuộm đơn. 3.2.2.1 Tại sao phải nhỏ dầu xem kính lên tiêu bản khi quan sát KHV ở vật kính 100? Vì dầu soi kính hiển vi là dầu trong suốt, có chỉ số khúc xạ cao, nên nó hỗ trợ làm tăng độ phân giải hình ảnh, cho chất lượng hình ảnh khi quan sát rõ nét hơn. 3.2.2.2 Giải thích cơ chế bắt màu tím của VK Gram + và màu hồng của VK Gram- ? Vi khuẩn Gram dương và Gram âm có cấu tạo vách tế bào khác nhau, do đó khi thực hiện nhuộm thì chúng sẽ bắt màu các thuốc nhuộm khác nhau. + Vi khuẩn Gram (+): có màu tím. + Vi khuẩn Gram (-): có màu hồng. - Với vi khuẩn Gram dương: chúng có lớp vách tế bào peptidoglycan dày, dạng lưới có khả năng bắt màu tím của thuốc nhuộm tím gentian tinh thể. Cũng vì lớp vách dày nên việc tẩy cồn sẽ khó khăn hơn do đó vi khuẩn giữ được màu tím của thuốc nhuộm tím Gentian. - Với vi khuẩn Gram âm: lớp vách peptidoglycan mỏng hơn và nó có thêm lớp màng lipopolysaccharide phía ngoài, khi tẩy cồn cồn hòa tan lớp màng và do lớp vách mỏng bị cồn tẩy dễ dàng nên nó không giữ được màu tím của thuốc nhuộm mà sẽ bắt màu thuốc nhuộm sau là dung dịch Fushin kiềm. BÀI 4. ĐẾM TRỰC TIẾP NẤM MEN BẰNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU 4.1. Giới thiệu buồng đếm hồng cầu Buồng đếm hồng cầu là phiến kính thuỷ tinh hình chữ nhật, trên đó có khắc lưới đếm. Lưới đếm là 1 hình vuông, có cạnh 1mm gồm 25 ô vuông lớn, 1 ô vuông lớn có 16 ô vuông nhỏ; các ô vuông lớn chia cắt nhau bởi 3 đường kẻ song song, chiều cao đường khắc trên lưới đếm là 0,1 mm. S lưới đếm = 1mm2 S ô vuông nhỏ = 1/ 400mm2 S ô vuông lớn = 1/25 mm2 V ô vuông nhỏ = 1/ 4000 mm3 4.2. Quy trình đếm nấm men Bước 1. Pha loãng dịch mẫu Bước 2. Đưa dịch mẫu vào lưới đếm Bước 3. Đếm tế bào nấm men Quan sát lưới đếm ở vật kính 10, chuyển qua vật kính 40 để đếm các tế bào trong 5 ô vuông lớn theo vị trí đường chéo góc. Ghi lại kết quả. Cách đếm: Đếm tất cả tế bào trong ô vuông lớn và tế bào nằm trên 2 cạnh liên tiếp. 4.3 Tính kết quả A: Tổng tế bào đếm được ở 5 ô vuông lớn V: thể tích ô vuông nhỏ 10–n: nồng độ pha loãng được đếm 1000: hệ số chuyển mm3 thành mL Số tế bào trong 5 ô vuông lớn: Ô 1: 10 Ô 2: 18 Ô 3: 19 Ô 4: 26 Tổng: A = 87 tế bào. Kết quả: Tổng số tế bào Số vuông nhỏ Số tế bào /ml = .100 = Thể tích ô vuông nhỏ . Nồngđộ pha loãngđược đếm A 5.16 .100 1 0 . 10 4000 87 5.16 .100 = 435000. = 1 0 . 10 4000 4.4 Ưu điểm của pp đếm trực tiếp tế bào nấm men bằng BĐHC Đếm dễ dàng, nhanh, tiết kiệm được thời gian. 4.5 Nhược điểm của phương pháp đếm trực tiếp nấm men bằng BĐHC Tỉ lệ sai số cao: 10% 4.6 Ứng dụng của đếm trực tiếp nấm men trên BĐHC Dùng để đếm tế bào hồng cầu trong máu, nấm men và vẽ đường cong sinh trưởng. BÀI 5. KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH HOÁ CỦA VSV 5.1. Mục đích Góp phần định danh VK 5.2. Yêu cầu khi thực hiện phản ứng sinh hoá Yêu cầu về VSV: • Còn non (nếu già vsv sẽ chuyển hóa chậm). • Dòng thuần, không bị tạp nhiễm. • Đọc kết quả đúng thời gian quy định ( thời gian đọc kết quả: sau 24 – 4 giờ nuôi cấy). 5.3. Một số phản ứng cơ bản Đối với vi khuẩn E.coli Một số phản ứng sinh hoá cơ bản: Phản Mục ứng đích CIT Kiểm tra vi (số 6) khuẩn có Simmon sử dụng citrate citrate như nguồn carbohydra te duy nhất trong môi trường các chất vô cơ tổng hợp Môi trường Cách thực hiện -Tên: Simmons citrate Cấy vi agar. sinh vật -pH:6.9+/- 0.2, 25℃ . vào ống -Chỉ thị màu: nghiệm Bromothymol Blue (môi -Đặc điểm đổi màu: trường +ph<7 (axit): màu vàng thạch +pH=6.9: xanh lá nghiêng) +pH>7 (kiềm):xanh theo dương đường zich -Thành phần và tỷ lệ các zag. Sau Nguyên lý Đọc kết quả Khi vi khuẩn sử dụng Dương citrate, muối tính. ammonium chuyển Dung dịch thành ammoniac, do màu xanh đó tăng tính kiềm. biển, cho Sự chuyển đổi pH thấy vi (pH>7.6) dẫn tới sinh vật chuyển chất chỉ thị đã sử Bromthymol dụng bluechuyển từ xanh citrate. lá thành xanh da trời. ESC (số 7) hay không. chất quan trọng: đó ủ 24 + Sodium giờ ở 37℃ Citrate (dehydrate) – . nguồn carbohydrate duy nhất :2g +Bromothymol Blue: 0,08g Giúp phân -Tên môi trường: Kligler Cấy vi biệt các Iron Agar (KIA) sinh vật loài - pH : 7.4 +/- 0.2 ở 25ºC vào môi bacillus -Chỉ thị màu: Phenol trường. đường Red Sau đó ủ ruột. -Đặc điểm đổi màu: 24 giời ở +pH=7.4 (kiềm): màu đỏ 37℃ . +pH<7 (axit): màu vàng -Thành phần và tỷ lệ các chất quan trọng: + Dextrose: 1g + Lactose: 10g + Peptone: 15g + Phenol Red: 0,024g Lên men glucose Âm tính. (dextrose), làm giảm Dung dịch pH môi trường, chỉ có màu thị phenol red vàng. chuyển từ đỏ sang Không lên vàng. men Lên men lactose (nếu glucose thuộc nhóm lên men lẫn lactose lactose) sau khi sử giữ dụng hết glucose, tạo nguyên sản phẩm có tính pH môi acid, nên vẫn giữ pH ở mức thấp và giữ trường. nguyên màu vàng của thạch Lên men glucose và biến dưỡng acid amin, tạo NH3, làm pH môi trường tăng, chỉ thị phenol red chuyển từ vàng sang đỏ. Môi trường chia 2 phần (đỏ/vàng) sau 18 – 24h nuôi cấy. IND (số 8) Thử nghiệm sinh indole, được sử -Tên môi trường: Trytophan broth -pH: 7.5+/-0.2 ,25℃ -Chỉ thị màu: Kovac -Thành phần và tỷ lệ các Cấy vi sinh vật vào môi trường. Sau đó ủ Khi vi khuẩn có Dương trytophan sẽ phân tính. hủy trytone thành Sau khi indole, sau đó nhỏ nhỏ 1 giọt thêm 1 giọt Kovac, Kovac ta VP (số 9) MLO (số 10) dụng trong việc khẳng định E.coli, Shigella và Salmonell. Xác định khả năng sinh acetylmeth ylcarbinol (acetoin) trong quá trình lên men glucose của một số vi sinh vật. Từ đó xác định nhóm trực khuẩn gram âm đường ruột. chất quan trọng: +Tryptone: 10,0 g +DL-Tryptophan: 1,0 g 24 giờ ở 37℃ . -Tên môi trường: MRVP broth -pH: 6.8 – 7.0 (17 g/l, H₂O, 37 °C) (sau khử trùng ướt). -Chỉ thị màu: + KOH 40%, (chất oxi hóa). + α −¿naphtol, (chất tăng cường màu). -Đặc điểm đổi màu: +pH 6.8-7 (trung tính): màu vàng +pH>7(kiềm): màu đỏ -Thành phần và tỷ lệ các chất quan trọng: +Dextrose: 5g Cấy vi sinh vật vào môi trường. Sau đó ủ 24 giờ ở 37℃ . Xác định khả năng sử dụng Sodium malonate là nguồn carbon duy nhất cùa vi sinh vật và kết quả là tạo môi -Tên môi trường: Malonate broth. -pH: 6.7 ± 0.2, 25 ° C -Chỉ thị màu: Bromthymol blue – chất chỉ thị pH. -Đặc điểm đổi màu: +pH 6.7 (axit): màu xanh lá +pH>7 (kiềm): màu xanh dương -Thành phần và tỷ lệ các Cấy vi sinh vật vào môi trường. Sau đó ủ 24 giờ ở 37℃ . nếu xuất hiện vòng thấy xuất đỏ chứng tỏ vi sinh hiện vòng vật là E.coli. tròn đỏ cho thấy vi sinh vật là E.coli. Vi sinh vật lên men Âm tính. glucose sau đó Dung dich chuyển hoá axit màu vàng pyruvic để tạo thành cam trên acetyl-methyl bề mặt carbinol (acetoin). môi Sau khi ta cho α −¿ trường naphtol, cho thêm (như màu KOH 40% thì của thuốc acetion chuyển thành thử), cho diacetyl (do KOH) thấy vi sau đó được chuyển sinh vật là thành một phức hợp E.coli. màu đỏ (do α −¿ naphtol). Escherichia coli (âm tính), Klebsiella– Enterobacter (dương tính). Malonate phá vỡ tạm Âm tính. thời chu trình Krebs Dung dịch khiến vi sinh vật màu xanh không phát triển lá cho được. trừ khi vi sinh thấy vi vật phải sử dụng sinh vật malonate là nguồn không sử carbon để phát triển. dụng malonate. trường kiềm chất quan trọng: + Natri malonate nguồn carbon duy nhất: 3g + Bromo thymol màu xanh: 0,025g
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan