i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang đã tạo
một môi trường học tập và cơ hội quý báu cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo của Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công
nghệ sinh học và Môi trường đã tận tình dìu dắt, dạy bảo tôi trong suốt khóa học
2007 – 2011.
Đặc biệt, để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của:
TS. Nguyễn Văn Duy, thầy Lê Đình Đức đã nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn
cho tôi.
Chị Nguyễn Minh Nhật – Cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học,
đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian làm luận văn tại
phòng thí nghiệm.
Chị Lưu Thị Thúy học viên cao học và các bạn trong nhóm sinh viên thực
tập tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học của khóa 49, 50 Viện Công nghệ sinh
học và Môi trường, đã giúp đỡ cho tôi. Các bạn lớp 49 SH – những người bạn đồng
hành luôn bên cạnh và giúp đỡ tôi trong suốt 4 năm học tập và sống tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó!
Cuối cùng, gia đình và người thân luôn là những người tôi khắc ghi sự biết
ơn vô hạn vì công lao sinh thành, nuôi dưỡng, và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi.
Nha Trang, tháng 07 năm 2011
Sinh viên thực hiện
Hoàng Thị Giang
ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... i
MỤC LỤC .............................................................................................................. ii
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................iv
DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................v
DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................vi
LỜI MỞ ĐẦU ..........................................................................................................1
Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3
1.1. Vi khuẩn lactic...................................................................................................3
1.1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic................................................................3
1.1.2. Phân loại lactic ...............................................................................................3
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic .........................5
1.1.4. Vi khuẩn lactic sinh bacteriocin ......................................................................6
1.2. Cá giò và các phương pháp bảo quản cá giò.......................................................8
1.2.1. Đặc điểm chung về cá giò ...............................................................................8
1.2.2. Các phương pháp bảo quản cá giò...................................................................9
1.3. Tình hình nghiên cứu về sinh trưởng và sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic
trong thực phẩm .....................................................................................................14
1.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước ......................................................................14
1.3.2.Những nghiên cứu trong nước .......................................................................16
Chương II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................18
2.1. Vật liệu............................................................................................................18
2.1.1. Vi sinh vật ...................................................................................................18
iii
2.1.2. Nguyên liệu cá giò ........................................................................................19
2.1.3. Hóa chất và môi trường ................................................................................19
2.1.4. Thiết bị chuyên dụng ....................................................................................21
2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................21
2.2.1. Xác định khả năng sinh trưởng .....................................................................21
2.2.2. Xác định hoạt tính sinh bacteriocin ...............................................................22
2.2.3. Thí nghiệm nhúng da cá giò trong dịch tế bào vi khuẩn lactic .......................22
2.2.4. Thí nghiệm bảo quản cá giò nguyên liệu tươi nguyên con bằng dịch tế bào vi
khuẩn lactic kết hợp bảo quản lạnh.........................................................................24
2.2.5. Xác định tổng vi khuẩn hiếu khí ...................................................................24
2.2.6. Xác định tổng vi khuẩn lactic........................................................................26
Chương III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................27
3.1. Khả năng sinh trưởng và sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic T8...........27
3.1. Tổng số vi khuẩn lactic trên da cá giò nguyên liệu tươi...................................31
3.2. Tổng số vi khuẩn hiếu khí trên da cá giò nguyên liệu tươi ...............................33
3.4. Tổng số vi khuẩn lactic trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con .....................36
3.5. Tổng số vi khuẩn hiếu khí trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con .................41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................47
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................48
iv
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Stt
Ký hiệu
Nghĩa
Colony forming unit
1
CFU
2
LAB
(Đơn vị hình thành khuẩn lạc)
Lactic acid bacteria
(Vi khuẩn lactic)
3
MRS
de Man, Rogosa and Shatpe
(Môi trường nuôi cấy LactoBacillus)
4
PCA
Plate Count Agar
(Môi trường nuôi cấy vi khuẩn tổng số)
5
OD
Optical Density
(Mật độ quang)
6
TSA
Trypton soy agar
(Môi trường rắn nuôi cấy vi khuẩn tổng số)
7
TSB
Trypton soy broth
(Môi trường lỏng nuôi cấy vi khuẩn tổng số)
v
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Thành phần môi trường MRS ................................................................... 20
Bảng 2. Thành phần môi trường TSB .................................................................... 20
Bảng 3. Khả năng sinh trưởng, đường kính vòng kháng khuẩn, hoạt độ riêng của
chủng T8 trên môi trường MRS............................................................................. 29
Bảng 4. Sự phát triển của tổng vi khuẩn lactic trên da cá giò ................................. 31
Bảng 5. Sự phát triển tổng vi khuẩn hiếu khí trên da cá giò .................................. 33
Bảng 6. Tổng vi khuẩn lactic trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con .................. 36
Bảng 7. Khả năng sinh bacteriocin của tổng vi khuẩn lactic................................... 36
Bảng 8. Tổng vi khuẩn hiếu khí trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con .............. 42
vi
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Vi khuẩn lactic T8 nuôi trên môi trường MRS sau 48 giờ ở nhiệt độ 370C.
.............................................................................................................................. 18
Hình 2. Vi khuẩn Bacillus trên môi trường TSA sau 24 giờ nuôi ở nhiệt độ 370C.. 19
Hình 3. Cá giò nguyên liệu tươi............................................................................ 19
Hình 4. Mặt ngoài da cá......................................................................................... 23
Hình 5. Mặt trong da cá ......................................................................................... 23
Hình 6. Mẫu 1: Mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 cho vào túi PE ............. 23
Hình 7. Mẫu 2: Mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic không cho vào túi PE........ 24
Hình 8. Mẫu 3: Mẫu đối chứng.............................................................................. 24
Hình 9. Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với Bacillus B1.1 sau 6 -18
giờ nuôi ................................................................................................................. 27
Hình 10. Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với Bacillus B1.1 sau 15 19 giờ nuôi ............................................................................................................ 28
Hình 11. Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với Bacillus B1.1 sau 12 24 giờ nuôi ............................................................................................................ 28
Hình 12. Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với Bacillus B1.1 sau 12 27 giờ nuôi ............................................................................................................ 29
Hình 13. Đường cong sinh trưởng và sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic T8
.............................................................................................................................. 30
Hình 14. Vi khuẩn lactic trên môi trường thạch MRS, nuôi ở nhiệt độ 370C sau 48
giờ nuôi cấy........................................................................................................... 31
Hình 15. Sự phát triển của tổng vi khuẩn lactic trên da cá giò............................... 32
Hình 16. Sự phát triển tổng vi sinh vật hiếu khí trên da cá giò ............................... 33
Hình 17. Tổng vi khuẩn hiếu khí trên môi trường PCA sau 48 giờ ........................ 34
Hình 18. Tổng vi khuẩn lactic trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con ................. 36
Hình 19. Khả năng sinh trưởng và sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic ở mẫu 1 ... 37
Hình 20. Khả năng kháng Bacillus của vi khuẩn lactic T8 theo thời gian bảo quản 3
ngày, 5 ngày, 7 ngày.............................................................................................. 37
vii
Hình 21. Vi khuẩn lactic T8 sau 3 ngày bảo quản ở mẫu đối chứng và mẫu nhúng
dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 ................................................................................ 39
Hình 22. Vi khuẩn lactic T8 sau 5 ngày bảo quản ở mẫu đối chứng và mẫu nhúng
dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 ............................................................................... 40
Hình 23. Vi khuẩn lactic T8 sau 7 ngày bảo quản ở mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn
lactic T8 ................................................................................................................ 40
Hình 24. Tổng vi khuẩn hiếu khí trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con............. 41
Hình 25. Tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn
lactic T8 lúc 0 ngày ............................................................................................... 43
Hình 26. Tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn
lactic T8 lúc 3 ngày ............................................................................................... 44
Hình 27. Tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn
lactic T8 lúc 5 ngày ............................................................................................... 45
Hình 28. Tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn
lactic T8 lúc 5 ngày và 7 ngày ............................................................................... 46
1
LỜI MỞ ĐẦU
Nuôi trồng thủy sản thủy sản trước kia vốn chỉ góp phần nhỏ bé trong
tổng sản lượng thủy sản toàn cầu, tuy nhiên từ những năm 1950 đến năm 2008 đã
tăng 50 lần và hiện nay chiếm gần 50% trong tổng sản lượng sản xuất trên toàn
thế giới. Ở Việt Nam, diện tích và sản lượng nuôi trồng thủy sản tăng: năm 2004
đạt 1,4 triệu tấn, chiếm 68% tổng sản lượng thủy sản, năm 2010 sản lượng thủy
sản đạt 2706,8 nghìn tấn bằng 105,4% so với cùng kỳ năm 2009 và 102,1% so
với kế hoạch năm 2010. Kỳ vọng năm 2011, theo kế hoạch nghành thủy sản phấn
đấu mức tăng trưởng chung là 7% so với năm 2010. Tổng sản lượng năm 2011
phấn đấu đạt khoảng 5,3 triệu tấn, trong đó khai thác là 2,3 triệu tấn và nuôi
trồng là 3 triệu tấn. Mặc dù, nghành nuôi trồng đạt được nhiều kết quả nhưng nó
đang đối mặt với những thách thức về môi trường nuôi, dịch bệnh, công nghệ sau
thu hoạch…
Nguyên liệu thủy sản nói chung là loại nguyên liệu dễ bị hư hỏng nếu
không được bảo quản hợp lý. Hiện nay, các loại nguyên liệu sau đánh bắt và thu
hoạch của người dân chủ yếu bảo quản bằng phương pháp ướp đá lạnh. Ngoài ra,
để giữ nguyên liệu thủy sản tươi lâu người dân sử dụng các loại hóa chất độc hại
như ure, borit, nitrat, hàn the, chất kháng sinh để bảo quản. Những chất bảo quản
này nếu sử dụng không hợp lý sẽ gây nên tình trạng mất an toàn thực phẩm, ảnh
hưởng trực tiếp đến sức khỏe của người tiêu dùng. Do đó, việc sử dụng hóa chất
để bảo quản nguyên liệu ít được sử dụng và một số chất bảo quản độc hại bị cấm.
Yêu cầu đặt ra phải tìm được phương pháp bảo quản nguyên liệu an toàn và kinh
tế. Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã và đang nghiên cứu thay thế những chất
bảo quản hóa học bằng phương pháp sinh học an toàn hơn cho người sử dụng và
người tiêu dùng. Phương pháp sử dụng chế phẩm sinh học có chứa những vi sinh
vật mang những đặc tính: ức chế sự sinh trưởng của nhiều loại vi sinh vật gây hư
hỏng, gây thối nguyên liệu, an toàn cho người tiêu dùng. Một trong những nhóm
vi khuẩn có những đặc tính này là vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic được công
nhận là an toàn để sử dụng, nó được sử dụng trong quá trình bảo quản như lên
2
men dưa chua, nem chua, sữa chua…vì trong quá trình sống vi khuẩn lactic ngoài
việc sinh bacteriocin còn sinh acid lactic là tác nhân ức chế nhiều vi sinh vật.
Cá giò (Rachycentron canadum) hay còn gọi là cá bớp (Cobia/Black King
fish) là đối tượng nuôi có giá trị kinh tế cao nên nó được nuôi phổ biến trong lồng
bè ở các vùng biển tại các địa phương như: Hải Phòng, Nghệ An, Quảng Ninh,
Vũng Tàu, Huế, Phú Yên, Khánh Hoà, Kiên Giang. Hiện nay, cá giò được tiêu
thụ ở các thành phố lớn trong nước và xuất khẩu ra nước ngoài ở dạng cá tươi
hoặc chế biến đông lạnh. Trên thị trường, sự chênh lệch giữa cá giò tươi và cá
giò ươn lớn có thể tới 60.000đ/kg. Do đó việc nghiên cứu bảo quản cá giò có ý
nghĩa kinh tế cao.
Sự sinh trưởng và trao đổi chất của vi sinh vật liên quan chặt chẽ với các
điều kiện bên ngoài, môi trường nuôi cấy. Đa số mỗi sinh vật có môi trường nuôi
cấy đặc hiệu, MRS là môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic nói chung, ở đó vi
khuẩn lactic sinh trưởng và phát triển tốt nhưng khi ứng dụng vi khuẩn này bảo
quản nguyên liệu thủy sản như cá giò thì sao?
Để trả lời cho câu hỏi đó chúng tôi tiến hành đề tài “Đặc điểm sinh trưởng của vi
khuẩn lactic sinh bacteriocin trên môi trường MRS và trên cá giò nguyên liệu
tươi”.
Mục tiêu của đề tài:
- Xác định khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin
trên môi trường MRS.
- Xác định khả năng sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic sinh
bacteriocin trên môi trường MRS.
- Xác định khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin
trên cá giò nguyên liệu tươi.
3
Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khuẩn lactic
1.1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, bất động, không sinh bào
tử, có khả năng lên men đường thành acid lactic. Nhóm vi khuẩn lactic được xếp
chung vào họ Lactobacteriaccae. Nhóm vi khuẩn này có rất nhiều hình dạng khác
nhau như: trực khuẩn hoặc cầu khuẩn. Cầu khuẩn xếp các giống Streptococcus và
Leuconostoc, còn trực khuẩn thành một giống Lactobacillus. MRS là môi trường để
phân lập và nuôi cấy chủng lactic. Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic tròn nhỏ, trong
bóng, có màu môi trường, màu trắng đục hoặc màu vàng kem, đôi khi khuẩn lạc có
màu trắng đục, tròn lồi. Đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid.
Vi khuẩn lactic là vi khuẩn kỵ khí, vi hiếu khí. Vi khuẩn lactic có nhu cầu
về chất dinh dưỡng phức tạp, không một đại diện nào của nhóm này có thể phát
triển trong môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucose. Đa số chúng cần
các loại vitamin như: Lactoflavin, tiamin, pantotenic acid, folic acid, và các
amino acid… Các vi khuẩn lactic lên men được đường monno và disaccharide
nhưng không lên men được tinh bột và các polysaccharide khác, ngoại trừ
L.delbrueckiin đồng hóa được tinh bột. Đa số vi khuẩn lên men lactic dị hình có
khả năng sử dụng pentose và acid citric, một số có hoạt tính protease (Lương
Đức Phẩm, 2002).
1.1.2. Phân loại lactic
Dựa vào khả năng lên men lactic từ các nguyên liệu chứa đường, người ta
chia thành hai nhóm vi khuẩn lactic: vi khuẩn lactic dị hình và vi khuẩn lactic
đồng hình.
Vi khuẩn lactic lên men đồng hình
Vi khuẩn lactic đồng hình là những vi khuẩn trong tế bào của chúng chứa
enzym aldolase và enzym triosophotphatizomerase. Khi lên men các loại đường
chúng sinh ra chủ yếu là acid lactic. Vi khuẩn lactic lên men đồng hình như:
Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casein,
Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum...
4
Một số vi khuẩn lactic điển hình:
Streptococcus lactic - cầu khuẩn hoặc trực khuẩn rất ngắn khi còn non, kết
song đôi hoặc thành chuỗi ngắn. Giống này ưa ấm, phát triển tốt ở 30 - 350C, làm
đông tụ sữa sau 10 - 12 giờ. Trong môi trường nó tích tụ được 0,8 - 1% acid.
Nhiệt độ tối thiểu cho phát triển là 100C, tối đa là 40 - 450C. Một số chủng tạo
thành bacteriocin ở dạng nizin.
Steptococcus lactic - liên cầu khuẩn lacitic được sử dụng rộng rãi trong
chế biến các sản phẩn sữa như sữa chua, crem - bơ chua, phomat...Khi đông tụ
sữa các cục vón chặt và nhẵn được tạo thành.
Streptococcus cremoris - tế bào hình cầu và kết thành chuỗi dài, ưa ấm và
tạo acid trong môi trường. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 250C, tối thiểu
là 100C, tối đa là 36 - 380C. Khi sử dụng phải phối trộn với Str. lactic. Một số
chủng thuộc giống Diplococus sinh bacterioxin ở dạng diplocoxin (Lương Đức
Phẩm, 2002).
Vi khuẩn lactic lên men dị hình
Vi khuẩn lactic lên men dị hình là vi khuẩn khi lên men các loại đường
chúng không chỉ tạo ra acid lactic mà còn tạo ra các sản phẩm khác như acid
acetic, acid propionic, ethanol...Vi khẩn lactic dị hình như: Lactobacillus
pasterianus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus lycopessici, Streptococcus
cumoris, Streptococcus lactic...
Một số vi khuẩn lactic lên men dị hình điển hình:
Lactobacillus brevis (tên cũ là L. brassica fermeentati) tìm thấy chủ yếu
trong muối chua cải bắp, rau cải, dưa chuột. Vì vậy nó được gọi là trực khuẩn cải
bắp. Trong lên men, ngoài acid lactic nó còn tạo ra acid axetic, rượu etylic và
CO2, nó còn tạo cho sản phẩm có hương thơm dễ chụi.
Lactobacillus lycopersici - trực khuẩn sinh hơi, đứng riêng lẻ hoặc liên kết
thành chuỗi, gây hư hỏng cà chua (thối nhũn cuống) cũng như cà chua đóng hộp,
nước cà chua thanh trùng chưa triệt để. Ngày nay, giống này được coi như là biến
chủng của L.brevis.
5
Streptococcus lactic thuộc chuỗi cầu khuẩn Gram (+), nhiệt độ phát triển
từ 10 - 450C, có khả năng chụi được nồng độ muối 4%. Khi lên men đường như
maltose, lactose, xylose...chúng tạo ra acid lactic, acid acetic, CO2 và diacetyl.
Chúng không có khả năng lên men insulin, glycerol, sorbitol, raffinose.
Streptococcus falcalis thường sống thành chuỗi tế bào hình cầu, nhiệt độ
sinh trưởng 10 - 450C. Chúng có khả năng chụi được nồng độ muối 5% và có khả
năng lên men đường glucose, maltose, trehalose và silicin.
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic
Nguồn cacbon
Vi sinh vật là giới sinh vật duy nhất có khả năng đồng hóa được nhiều
nguồn cacbon khác nhau. Khả năng sử dụng các nguồn cacbon của vi sinh vật
không phải là giống nhau ở nhiều nguồn cacbon khác nhau: có những nguồn
cacbon dễ sử dụng và những nguồn cacbon khó sử dụng, thậm chí phải huy động
nhiều vi sinh vật cùng tham gia phân hủy từ từ. Thông thường vi sinh vật trong
tự nhiên hay trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo sẽ tiến hành phân hủy nguồn
cacbon có cấu tạo đơn giản có mức độ oxy hóa mạnh sau đó mới phân hủy nguồn
cacbon phức tạp và có mức độ oxy hóa thấp. Nhìn chung vi sinh vật dễ hấp thu
cacbon từ hydratcacbon, trong đó glucose là chất được đa số vi sinh vật sử dụng.
Đối với vi khuẩn lactic thì đường mono và disaccharide là nguồn cacbon
tốt nhất, còn các polysaccharide hầu như không thể lên men được. Tốc độ lên
men của các loại đường khác nhau là khác nhau nhưng khi nhân giống ta dùng
một loại đường cố định thì vi khuẩn có thể thích nghi với loại đường đó và về sau
chúng phát triển hiệu quả trên môi trường chứa loại đường này.
Nguồn nitơ
Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất chứa
nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng
nguồn nitơ có sẵn trong môi trường.
Các nguồn nitơ được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật thường ở hai dạng:
nguồn nitơ hữu cơ và nguồn nitơ vô cơ. Trong đó nguồn nitơ được sử dụng chủ
yếu trong nuôi cấy vi sinh vật là protein như: Cao thịt, cao nấm men, trypton,
6
dịch thủy phân casein từ sữa… Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được sử
dụng nhiều và có hiệu quả nhất trong phòng thí nghiệm.
Vitamin
Hàm lượng vitamin của môi trường giữ một vai trò quan trọng trong sinh
trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic. Vitamin B6 là vitamin rất quan trọng
trong sự sinh tổng hợp các amino acid ở vi khuẩn lactic.
Muối khoáng
Các chất khoáng có vai trò quan trọng trong qua trình trao đổi chất ở vi
sinh vật. Các chất khoáng được sử dụng trong môi trường nuôi cấy có thể là
những chất khoáng ở dạng hợp chất, đơn chất, có thể ở dạng vô cơ hay hợp chất
hữu cơ. Một số muối khoáng được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật là:
K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, CaSO4,…
Trong các loại muối khoáng đó photpho là loại muối quan trọng nhất mà
các vi khuẩn lactic cần. Số lượng photpho trong môi trường nuôi cấy có ảnh
hưởng rất lớn đến sự phát triển của vi sinh vật. Nếu hàm lượng quá cao vi sinh
vật khó phát triển, nếu quá ít sẽ không đủ cho quá trình trao đổi chất và như vậy
sẽ ảnh hưởng rất lớn đến sự đồng hóa hydratcacbon.
Nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh
trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic. Tùy thuộc vào nhiệt độ tối ưu cho lên
men và cho sinh trưởng vi khuẩn lactic được chia làm hai loại: loại ưa nhiệt và
loại ưa ấm. Loại ưa nhiệt bao gồm: L. bulgaricus, L. thermophilus, L.
delbrueckii…phát triển tốt ở 45 - 600C. Loại ưa ấm gồm: L. causasicus, L. lactic,
L. acidophilus…phát triển tốt ở 37 - 450C và L. brevis, L. buchner và
L.pastorianus phát triển tốt ở 28 - 32 0C.
1.1.4. Vi khuẩn lactic sinh bacteriocin
Trong những năm gần đây, khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi sinh
vật khá phổ biến trong điều trị bệnh cho người cũng như động vật. Nguyên nhân
là do con người lạm dụng thuốc kháng sinh để điều trị một số bệnh cho vật nuôi
cũng như bảo quản thực phẩm. Để hạn chế sử dụng thuốc kháng sinh trong thực
7
phẩm và chăn nuôi người ta đã nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học từ vi
sinh vật để ức chế lại vi sinh vật gần gũi với chúng.
Bacteriocin có bản chất là những peptide hoặc là những protein có hoạt tính
kháng khuẩn và là sản phẩm của nhiều nhóm vi khuẩn khác nhau (Antonio Gálvez
và cs, 2007). Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra các loài bacteriocin nào thì có khả năng
chống lại chính bacteriocin đó. Ngoài ra không gây phản ứng dị ứng cho con
người và các vấn đề về sức khỏe, phân hủy nhanh bởi protease, lipase. Đa số
bacteriocin có tính kháng nguyên cao nhưng có phổ ức chế hẹp, hoạt động tốt
dưới những khoảng pH, nhiệt độ nhất định. Ví dụ như ST28MS và ST26MS được
sản xuất bởi Lactobacillus plantarum có thể hoạt động chống vi khuẩn sau 90 phút
tại 1000C hay 20 phút ở 1210C (Torodov và Dicks, 2005). Hầu hết bacteriocin sinh
tổng hợp từ vi khuẩn Gram (-), có hoạt tính ức chế các loại cùng họ hàng tuy nhiên
một số loài vi khuẩn Gram (-) bị ức chế bởi bacteriocin được sinh ra bởi vi khuẩn
Gram (+). Những vi khuẩn Gram (+) sinh bacteriocin có khả năng ức chế vi
khuẩn
Gram
(-)
như:
Lactobacillus,
Bacillus
crecus,
Streptococci,
Staphylococci…Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram (+) có hoạt
tính ức chế các loại vi khuẩn Gram (+). Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi
sinh vật khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào vi
sinh vật, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công
vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào.
Hiện nay, người ta đã tìm được nhiều chủng sinh bacteriocin như Vibrio,
Bacillus…Trong đó lactic là nhóm vi khuẩn được quan tâm nhiều do chúng sinh
bacteriocin có phổ ức chế rộng hơn các nhóm vi khuẩn khác, đồng thời nó được
xem là nhóm vi khuẩn an toàn cho con người. Ngày nay, người ta ứng dụng
bacteriocin từ vi khuẩn lactic trong nhiều lĩnh vực khác nhau: công nghiệp, y
dược, thức ăn động vật, chế biến thực phẩm…
Bacteriocin của nhóm vi khuẩn lactic sử dụng trong quy trình chế biến
thực phẩm để rửa sạch rau quả trước khi dùng, nó tác động và làm giảm lượng vi
khuẩn gây bệnh, gây thối rửa (Allende và cs, 2007). Bacteriocin được thêm vào
trong thành phần của thực phẩm, lúc này chúng sẽ chống lại sự hư hỏng thực
8
phẩm và vi sinh vật gây bệnh (Cleveland và cs, 2001). Trong việc tìm ra các loại
thuốc cho con người, bacteriocin có thể sử dụng để chống các loài gây bệnh
nghiêm trọng cho người, ví dụ như MRSA và VRE (Lawton và cs, 2007). Trong
sản xuất thuốc thú y chứa bacteriocin, nó ức chế sự phát triển tác nhân gây bệnh
viêm vú ở bò (Ryan và cs, 1999)…Trong những năm gần đây, bacteriocin được
chý ý hơn trong công nghệ ứng dụng bảo quản thực phẩm. Nó thay thế chất bảo
quản hóa học và chất kháng sinh đồng thời giữ cho thực phẩm ở trạng thái tự
nhiên, tươi ngon và đặc biệt là không độc với con người. Ngoài bacteriocin có
tính thương mại như nisin và pediocin PA-1/AcH thì sử dụng các bacteriocin
khác từ nhóm vi khuẩn lactic (lactisin 3147, enterocin AS-48 hoặc variancin)
cũng có tác dụng bảo vệ thực phẩm tránh khỏi sự hư hỏng. Chẳng hạn
bacteriocin bảo quản thực phẩm kháng chọn lọc đối với Listeria monocytogenes
mà không ảnh hưởng đến vi sinh vật khác. Để nâng cao hiệu quả của quá trình
bảo quản nguyên liệu người ta kết hợp bổ sung bacteriocin với phương pháp xử
lý vật lý áp suất cao hoặc xung điện từ trường, bacteriocin kết hợp áp suất thủy
tĩnh cao, bacteriocin với phương pháp bảo quản lạnh…Hiệu quả tác động của
bacteriocin thường bị ảnh hưởng bởi nhân tố môi trường như pH, nhiệt độ, cấu
trúc và thành phần thực phẩm cũng như hệ vi sinh vật của thực phẩm. Sự phát
triển gần đây trong lĩnh vực vi sinh vật phân tử, đồng thời những nghiên cứu về
sinh học phân tử của bộ gen vi khuẩn có thể tiết lộ các nguồn sinh bacteriocin
mới (Gálvez và cs, 2007).
1.2. Cá giò và các phương pháp bảo quản cá giò
1.2.1. Đặc điểm chung về cá giò
Cá giò (Rachycentron canadum) hay còn gọi là cá bớp (Cobia/Black King
fish) phân bố ở vùng biển nhiệt đới, cận nhiệt đới và vùng nước ấm của biển ôn
đới. Trong tự nhiên, cá giò sống ở vùng nước mặn hoặc nước lợ ven biển, rạn
san hô cho đến vùng biển khơi. Cá giò thuộc loại cá dữ, ăn thịt động vật, thức ăn
tự nhiên gồm cua, tôm, ốc và các loại cá con. Tốc độ sinh trưởng của cá nhanh,
có thể đạt cỡ 4 - 6 kg sau một năm nuôi. Cá giò thành thục lần đầu tiên sau 2
năm tuổi, mùa sinh sản của cá giò ở miền Bắc từ tháng 4 đến tháng 7 hằng năm.
9
Quy trình sản xuất cá giò tương đối ổn định và được đơn giản hóa để áp
dụng rộng rãi, kể cả các cơ sở không có điều kiện đầu tư. Kỹ thuật này bao gồm
sinh sản nhân tạo đại trà bằng cách cho đẻ tự nhiên, cá bố mẹ được nuôi vỗ,
ương nuôi ấu trùng, ương cá giống trên bể, ao và lồng gần bờ, nuôi cá thương
phẩm trong lồng ngoài khơi. Cá giò có giá trị kinh tế cao nên nó được nuôi phổ
biến trong lồng bè ở các vùng biển tại các địa phương như Hải Phòng, Nghệ An,
Quảng Ninh, Vũng Tàu, Huế, Phú Yên, Khánh Hoà, Vũng Tàu, Kiên Giang.
Hiện nay, cá giò được tiêu thụ ở các thành phố lớn trong nước và xuất khẩu ra
nước ngoài ở dạng cá tươi hoặc chế biến đông lạnh. Trên thị trường, sự chênh
lệch giữa cá giò tươi và cá giò ươn lớn có thể tới 60.000 đ/kg. Do đó việc nghiên
cứu phòng và chữa bệnh cũng như bảo quản cá giò có ý nghĩa kinh tế cao.
1.2.2. Các phương pháp bảo quản cá giò
Nguyên liệu thủy sản nói chung và cá giò rất dễ bị biến chất và hư hỏng.
Nguyên nhân gây hư hỏng do tự bản thân trong tế bào có sẵn enzym thúc đẩy quá
trình oxy hóa xảy ra, do vi sinh vật và các yếu tố bên ngoài (như nhiệt độ và độ ẩm).
Chính vì những lẽ đó cần có những phương pháp xử lý, bảo quản để giữ được chất
lượng, hạn chế tổn hao dinh dưỡng và an toàn vệ sinh thực phẩm cho nguyên liệu
thủy sản cũng như cá giò.
Những năm gần đây, xuất khẩu thủy sản Việt Nam có những bước tiến nhảy
vọt. Năm 2002, lần đâu tiên kim ngạch xuất khẩu vượt qua con số 2 tỷ đô la. Chất
lượng hàng thủy sản tiêu thụ nội địa cũng không ngừng được cải thiện, đáp ứng yêu
cầu ngày một cao của nhân dân. Đạt được những thành công đó, một trong những
yếu tố quan trọng là nhờ những người làm công việc khai thác và nuôi trồng thủy
sản đã bảo quản tốt nguyên liệu cho khâu chế biến, tạo thành một dây chuyền đồng
bộ, khép kín, giữ cho sản phẩm luôn được tươi tốt.
Tùy từng điều kiện cụ thể của từng ngư dân, doanh nghiệp sản xuất thủy sản
mà có phương pháp bảo quản cá và nguyên liệu thủy sản khác nhau: bảo quản cá ở
nhệt độ thấp, hóa chất bảo quản, chất kháng sinh, xung điện trường…
a. Bảo quản cá nguyên liệu ở nhiệt độ thấp
10
Dựa vào nguyên lý chung là khi nhiệt độ hạ thấp thì enzym và vi sinh vật
trong nguyên liệu bị giảm hoạt động hoặc có thể bị đình chỉ sự sống, như vậy
nguyên liệu có thể giữ tươi được một thời gian. Trong phạm vi nhiệt độ bình
thường, cứ nhiệt độ hạ xuống 100C thì phản ứng sinh hóa giảm xuống 1/2 đến 1/3,
khi nhiệt độ hạ xuống thấp sẽ làm ức chế hoạt động về sinh lý của vi sinh vật cũng
như enzym. Ví dụ như nhiệt độ nhỏ hơn 100C vi khuẩn gây thối rữa và vi khuẩn gây
bệnh bị kìm chế phần nào, ở 00C thì tỷ lệ phát triển của chủng rất thấp, -50C đến 100C thì hầu như không phát triển được. Nhưng vẫn có loài vi khuẩn khi nhiệt độ hạ
xuống -150C vẫn phát triển được: Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium…
Giữ tươi ở nhiệt độ thấp có hai phương pháp là ướp lạnh và ướp đông.
Phương pháp ướp lạnh sơ bộ
Ướp lạnh sơ bộ được ngư dân sử dụng phổ biến để bảo quản nguyên liệu
mới đánh bắt. Đây là phương pháp đơn giản, dễ làm nhưng giữ tươi trong thời gian
ngắn. Phương pháp ướp lạnh là hạ nhiệt độ xuống 00C hoặc -10C có thể sử dụng kho
lạnh, nước biển lạnh hoặc nước đá để bảo quản. Trong đó bảo quản bằng nước đá là
phổ biến nhất, người ta sử dụng nước đá vảy hoặc nước đá vụn kết hợp với muối ăn
để tăng khả năng làm lạnh. Tỷ lệ muối ăn dùng 15 - 20 % so với lượng nước đá và
lượng nước đá là 100 - 128% so với lượng cá như vậy có thể làm cho nhiệt độ hạ
xuống -8 ÷ -100C. Tiến hành bảo quản bằng cách cứ một lớp muối đá rồi một lớp cá
ướp cho vào thùng gỗ, dung tích thùng chứa 25 - 30 kg và chiều cao lớp nguyên liệu
không nên quá 30 cm (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 2006).
Phương pháp làm lạnh đông
Phương pháp làm lạnh đông là hạ thấp nhiệt độ của nguyên liệu xuống -80C.
Như vậy một lượng nước lớn ở trong nguyên liệu sẽ bị đông kết lại làm ngừng đến
mức tối đa hoặc đình chỉ hoàn toàn hoạt động của enzym nội tại, vi sinh vật sẵn có
và vi sinh nhật xâm nhập vào gây thối rữa. Hiện nay, đây là phương pháp giữ tươi
nguyên liệu tốt nhất, đảm bảo được tính chất, mùi vị và giá trị dinh dưỡng của
nguyên liệu. Mặc dù vậy trong quá trình bảo quản chất lượng của nguyên liệu cũng
có sự biến đổi như protid bị đông đặc biến tính, chất béo bị thủy phân hoặc bị oxy
11
hóa, đặc biệt là các biến đổi về vật lý và cấu trúc của nguyên liệu. Nguyên liệu làm
lạnh đông trước khi đưa vào chế biến hoặc tiêu thụ phải được tiến hành giải đông.
Tùy vào mục đích và thời gian bảo quản mà người ta chọn nhiệt độ bảo
quản khác nhau có thể -180C, -250C…Phương pháp này chỉ áp dụng với các nhà
máy chế biến với quy mô lớn, sử dụng các kho, tủ cấp đông. Để tăng hiệu quả bảo
quản trước khi cấp đông nguyên liệu có thể được lấy hết ruột rửa sạch nội tạng.
b. Bảo quản cá nguyên liệu bằng hóa chất
Cho đến nay người ta đã nghiên cứu nhiều loại hóa chất dùng trong bảo
quản nguyên liệu rất có hiệu quả. Dùng hóa chất bảo quản tốt nhất là kết hợp với
nhiệt độ thấp thì giữ được tươi hơn.
Yêu cầu của hóa chất dùng để bảo quản là không độc với con người, không
có mùi vị lạ, tính chất hóa học phải ổn dịnh, dễ hòa tan trong nước, không làm cho
nguyên liệu biến mùi, không làm mục dụng cụ bảo quản, phải có hiệu lực sát trùng
mạnh, giá thành hạ và cách sử dụng đơn giản.
Các hóa chất thường được dùng trong bảo quản nguyên liệu thủy sản: muối vô cơ,
acid chất hữu cơ.
Tùy từng loại hóa chất mà có cách sử dụng khac nhau:
Muối vô cơ
Bảo quản nguyên liệu bằng muối vô cơ như: Calcium hypochlorite
(Ca(OCl)2), natri nitrit (NaNO2), natri chlorua (NaCl) bằng cách chế thành nước đá
hoặc pha thành dung dịch. Nếu chế thành nước đá thì cứ một lớp đá rồi một lớp cá
ướp, còn khi pha thành dung dịch ta ngâm cá nguyên liệu trong thời gian 2 - 5 phút
sau đó mang bảo quản lạnh.
Loại acid
Các loại acid thường dùng để bảo quản nguyên liệu thủy sản là: Acib boric,
acid chlohytric, acid acetic, acid lactic…
Dùng acid để giữ tươi nguyên liệu có 3 cách: thứ nhất là pha acid thành
dung dịch có nồng độ thích hợp rồi đem phun hoặc ngâm lên nguyên liệu, cá sau khi
được ngâm hoặc phun xong trong thời gian ngắn thì đem bảo quản lạnh hoặc bằng
muối ăn. Cách thứ hai là chế thành nước đá có acid để bảo quản. Cách thứ ba là
12
dùng hỗn hợp acid với chất hóa học phòng thối khác để nâng cao hiệu quả bảo
quản. Ngoài ra, người ta dùng rơm, cỏ khô, mùn cưa… được tẩm acid để bảo quản.
Loại chất hữu cơ
Nói chung các chất hữu cơ thường được sử dụng hạn chế trong bảo quản
nguyên liệu tùy theo quy định của các nước.
Các chất hữu cơ thường dùng như: Acid dehydro acetic (DHA) và muối
natri của nó, formaldehyt và sulfathiazol…và chúng được sử dụng dưới dạng chế
thành nước đá hoặc pha thành dung dịch.
c. Bảo quản bằng cách dùng thuốc chống oxy hóa
Trong quá trình bảo quản nguyên liệu cá và các sản phẩm thủy sản khác hay
sinh ra sản phẩm ôi khét, ôi thối nguyên nhân là do hiện tượng oxy hóa, đốt cháy
mỡ sinh ra. Để ngăn chặn hiện tượng đó người ta tiến hành bảo quản lạnh kết hợp
với chất chống oxy hóa.
Các chất chống oxy hóa được dùng như: Acid citric, acid tactric, tocopherol
(vitamin E), butyl hydroxyanizol (BHA), butylhydroxytoluen (BHT)…Chúng
không có khả năng phục hồi lại các chất béo đã hỏng mà có tác dụng chống sự oxy
hóa hoặc để chống oxy.
Chất chống oxy hóa được sử dụng dưới dạng dung dịch, nước đá (Nguyễn Trọng
Cẩn và cs, 2006).
d. Bảo quản bằng phương pháp sinh học kết hợp bảo quản lạnh
Sử dụng phương pháp sinh học để làm chậm thời điểm bắt đầu tê cứng hoặc
kéo dài quá trình tê cứng của cá để giữ cá được tươi, có nghĩa là làm chậm sự phân
giải ATP. Muốn làm giảm sự phân giải ATP trong tổ chức cơ thịt cá thì tìm mọi
cách làm cho cá chết ngay, không để cho cá giãy giụa hoạt động. Có nhiều cách làm
cho cá ngừng hoạt động như thả cá vào nước 20C, dùng điện trường, các chất gây
mê cho cá ngủ trong một thời gian nhất định. Cá sau khi chết phải thả ngay vào
nước biển hoặc nước muối pha loãng 1 - 2 giờ để rửa sạch máu, nhiệt độ nước rửa
phải thấp hơn nhiệt độ cá sống 2 - 30C, không được thấp quá sẽ làm cơ thịt co rút lại
và mau tê cứng. Cá sau khi rửa xong vớt ra bảo quản 100C. Khi vận chuyển cá đi
nơi khác dùng nước đá để bảo quản. Cá được xếp trong bao polyethylene và xếp
13
thành từng con vào thùng gỗ, nước đá chỉ phủ phần đầu không ướp nước đá xuống
thân để phòng hạ thấp nhiệt độ. Trong quá trình vận chuyển tránh mọi va chạm, giữ
cá được yên tĩnh (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 2006).
e. Bảo quản cá nguyên liệu bằng chất kháng sinh
Truớc đây chất kháng sinh được phát triển và sử dụng rộng rãi trong bảo
quản nguyên liệu. Nhưng thời gian gần đây người ta phát hiện thấy chất kháng sinh
có khả năng gây ra các phản ứng có hại cho người sử dụng, vì vậy nó được nghiên
cứu và sử dụng thận trọng hơn. Chất kháng sinh là chất hữu cơ do vi sinh vật hoặc
động thực vật cao đẳng sinh ra hoặc dùng phương pháp tổng hợp như
chloromyxetin.
Aureomycin và teramycin là chất kháng sinh được sử dụng để bảo quản hải
sản nhiều nhất, ngoài ra người ta nghiên cứu sử dụng các chất như penicillin, nizin,
tylozin…
Chất kháng sinh được sử dụng trong bảo quản bởi vì nó làm cho một vài cơ năng
nào đó trong vi sinh vật không hoạt động được và làm rối loạn sự trao đổi chất, do
đó làm vi sinh vật bị yếu hoặc bị chết. Tác dụng đó của chất kháng sinh rất mạnh
cho nên chỉ dùng liều nhỏ đã có hiệu lực bảo quản.
Có 3 phương pháp sử dụng chất kháng sinh: ngâm, phun và chế thành nước
đá.
Phương pháp ngâm: nguyên liệu đem rửa sạch ngâm vào dung dịch chất
kháng sinh từ 5 - 10 phút, sau đó đem bảo quản, nồng độ kháng sinh thường dùng là
5 - 20ppm, bảo quản cá thường dùng chất kháng sinh có nồng độ 10ppm.
Phương pháp phun: nguyên liệu rửa sạch sau đó dùng dung dịch khánh sinh
có nồng độ hơi cao để phun đều trên nguyên liệu. Phương pháp này thích hợp với
các loại cá to.
Phương pháp chế thành nước đá: dùng chất kháng sinh hòa thành dung dịch
sau đó làm lạnh cho đóng băng rồi đem nghiền nhỏ ra để bảo quản nguyên liệu, khi
bảo quản chất kháng sinh sẽ tan ra ngấm vào nguyên liệu. Dùng dung dịch chất
kháng sinh để chế thành nước đá sẽ làm chất kháng sinh phân bố không đều trong
- Xem thêm -