Tài liệu đề tài xác định aflatoxin trong nông sản thực phẩm

Xác định Aflatoxin trong nông sản thực phẩm Chương 1. GVHD: Thái Thị Ánh Ngọc ĐẶT VẤN ĐỀ Aflatoxin là một trong những nhóm chất độc mạnh nhất hình thành trong tự nhiên. Chúng bao gồm một họ độc tố sinh ra từ nấm aspergillus flavus và aspergillus paraticus do khí hậu nóng ẩm rất phù hợp cho điều kiện phát triển mà aspergillus flavus được tìm thấy rất nhiều ở khắp nơi trên Việt Nam. Những thực phẩm thường nhiễm aspergillus flavus như đậu Phộng, lúa mì và do đó đây là nhóm bị nhiễm aflatoxin.Aflatoxin gây tổn thương gan, gây ung thư, gây giảm sức đề kháng cho cơ thể. Trong rất nhiều loại aflatoxin trong tự nhiên thì aflatoxin B1 được coi là chất độc nguy hiểm nhất. Mặt dù sự hiện diện của aspergillus flavus không phải lúc nào cũng gắn liền với việc tồn tại aflatoxin với hàm lượng gây độc, nhưng nó cũng thể hiện nguy cơ lớn về việc có thể nhiễm aflatoxin. Do đó việc kiểm soát dư lượng aflatoxin là cần thiết và quan trọng. Sắc kí là một trong những lĩnh vực quan trọng và hiện đại nhất của hóa học. Sắc kí được ứng dụng rộng rãi trong nghành công nghiệp liên quan tới hóa học, phân tích định tính và định lượng, tinh chế các chất, Thông thường nồng độ nhiễm độc tố aflatoxin trong thực phẩm rất thấp. Do đó để xác định chính xác độc tố aflatoxin có trong thực phẩm cần chọn phương pháp phù hợp. Các phương pháp thông thường dùng nhiều dung môi độc hại cho con người và rất tốn kém. Trong những năm gần đây, người ta sử dụng phương pháp mới như sắc kí, ái lực miễn dịch, sắc kí lỏng hiệu quả nâng cao, và ngày càng được áp dụng rộng rãi để thay thế các phương pháp cũ . Xác định aflatoxin trong thực phẩm bằng các phương pháp sắc kí nhằm định lượng được hàm lượng aflatoxin có trong thực phẩm và chiết tách aflatoxin ra khỏi thực phẩm. Việc xác định aflatoxin có trong thực phẩm nhằm đảm bảo giá trị kinh tế trong sản xuất và bảo vệ sức khỏe cộng đồng nhất là ở nước ta là nước có khí hậu nhiệt đới thích hợp cho sự phát triển của các loài vi nấm. Việc xác định hàm lượng aflatoxin có trong thực phẩm có ý nghĩa: SVTH: Võ Văn Thanh Lớp: 05C1 1 Xác định Aflatoxin trong nông sản thực phẩm GVHD: Thái Thị Ánh Ngọc + Xác định hàm lượng aflatoxin để hạn chế gây độc cho con người. + Loại bỏ bớt chất độc aflatoxin. + Đề ra phương pháp chế biến và bảo quản thực phẩm an toàn. Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.Độc tố nấm mốc trong thực phẩm. Aflatoxin thường có trong các loại hạt có dầu như lạc đậu nành, hạt điều, hạt hướng dương, vừng, kẹo lạc, kẹo hạt điều, lạc muối, lạc ranghay trên các loại hạt ngũ cốc, bột dinh dưỡng, thức ăn gia súc có nguồn gốc từ hạt ngũ cốc 1.1.Nguồn gốc aflatoxin. Aspergillus flavus và aspergillus parasiticus thuộc họ nấm cúc, là loại nấm sản sinh ra aflatoxin trong tự nhiên và trong môi trường nuôi cấy nhân tạo. Đây là loài nấm khá phổ biến, có thể tìm thấy trên khắp địa cầu, đặc biệt là các nước nhiệt đới. Hai loài nấm mốc này có thể phát triển trên nhiều loại cơ chất, các lọai hạt có dầu, thậm chí có trên cả bột cá và thịt giàu protein. Thức ăn chăn nuôi, Nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi là những đối tượng thích hợp nhất cho sự phát triển và sản sinh độc tố. 1.2 Các loài nấm có khả năng sản sinh aflatoxin. - Có hai loài Aspergillus flavus và aspergillus parasiticus sản sinh aflatoxin với các lượng khác nhau tùy thuộc vào chủng nấm, cơ chất, điều kiện khí hậu và môi trường. SVTH: Võ Văn Thanh Lớp: 05C1 2 Xác định Aflatoxin trong nông sản thực phẩm GVHD: Thái Thị Ánh Ngọc - Một số loài nấm mốc khác cũng có khả năng sinh aflatoxin với lượng rất ít như loài: Penicillium puberulum Bai, các chủng thuộc aspergillus như aspergillus tamariikita, aspergillus niger tiegh, aspergillus ostiamis wehmen, aspergillus ruper - Tuy nhiên cũng còn nhiều tranh cải vì trong quá trình phát triển, aspergillus flavus thường lẫn với nhiều loài nấm khác, đặc biệt là với penicillium rubrum stoll và khi đó có thể nhầm aflatoxin là do penicillium sản sinh ra . - Trong một số trường hợp khác cũng có nhầm lẫn độc tố sterigmatoxistin và avecsin có cấu tạo hóa học gần giống với aflatoxin 1.3. Điều kiện sản sinh aflatoxin. Khả năng sinh độc tố của các chủng aspergillus flavus và aspergillus parasiticus rất khác nhau. Điều đó phụ thuộc vào các yếu tố như chủng nấm mốc, các cơ chất, các yếu tố nhiệt độ, độ ẩm của cơ chất và môi trường. 1.3.1. Chủng sinh độc tố . - Aflatoxin được sản sinh từ hai chủng nấm aspergillus flavus và aspergillus parasiticus aspergillus. Ngoài ra còn có chủng penicillium và parasium tiết ra độc tố vi nấm ochratoxin , patulin và fumonisin. - Không phải tất cả các chủng aspergillus flavus được khảo sát đều sản sinh ra aflatoxin, chỉ có 73% có khả năng sản sinh aflatoxin, trong 23% sản sinh aflatoxxin ở mức cao nhất. - Nấm mốc sản sinh ra một loại độc tố vi nấm có tên là aflatoxin B1. Loại độc tố này tích lũy trong cơ thể người và gia súc, là nguồn nguy cơ gây ra ung thư gan. Aflatoxin B1 được tìm thấy hầu hết các chủng thử nghiệm. - Ngoài ra, aflatoxin G1, B2, G2 cũng được tìm thấy ở nhiều chủng, trong đó aflatoxin G2 rất ít gặp và ít nguy hiểm hơn. 1.3.2.Cơ chất và môi trường. - Cơ chất là các hạt có dầu, đặc biệt là hạt lạc và các sản phẩm từ lạc. Lượng độc tố chứa trong lạc cao nhất. Các chủng phân lập từ các hạt khác nhau SVTH: Võ Văn Thanh Lớp: 05C1 3 Xác định Aflatoxin trong nông sản thực phẩm GVHD: Thái Thị Ánh Ngọc thường không thấy hoặc rất ít khả năng sinh độc tố. Ngay cả trên cùng một cơ chất, khả năng sản sinh aflatoxin của các chủng aspergillius flavus cũng khác nhau. Nguyên nhân của hiện tường này cũng có thể do một số giống lạc có tính kháng với aspergillius flavus sinh độc tố aflatoxin. Các nhà tạo giống đã dựa vào cơ sở phát hiện trên nhằm tạo ra những giống lạc không bị nhiễm aflatoxin. Đây là hướng nghiên cứu nhiều nhà khoa học sử dụng nhằm loại bỏ aflatoxin theo cách có lợi nhất. - Sự hình thành aflatoxin phụ thuộc vào sinh khối sợi nấm và thời gian phát triển khối lượng sợi nấm càng nhiều thì sản sinh độc tố càng nhiều và ngược lại. Thời gian sản sinh cực đại để sản sinh aflatoxin thường từ ngày thứ sáu đến ngày thứ bảy sau đó giảm đi. Lí do của sự giảm lượng aflatoxin trong những ngày tiếo theo là do quá trình tự phân giải của chính bản thân nấm mốc. - Nhiệt độ thích hợp nhất để sản sinh aflatoxin của các chủng nấm mốc là từ 25-28oc. Nếu nuôi cấy aspergillius flavus ở 45 oc thì khả năng sản sinh aflatoxin sẽ bị ức chế. - Hàm lượng trong cơ thể đóng vài trò quan trọng trong quá trình hình thành aflatoxin. Ở lạc nhân có lượng nước từ 15-30%. Sự hình thành aflatoxin xuất hiện sau 2 ngày, trên gạo cần lượng nước là 24-26% và ở ngô là 19-24%. Như vậy có thể nói sự sản sinh aflatoxin diễn ra rất nhanh. Đặc biệt là sau thu hoạch. Cơ chất có hàm lượng nước khá cao, thời gian làm khô kéo dài là nguyên nhân dẫn đến nhiễm aflatoxin. 1.4.Cấu tạo và tính chất vật lí, hóa học của aflatoxin. Các aflatoxin B1, B2, G1, G2 đã được nhiều phòng nghiên cứu xác định cấu tạo hóa học. Thoạt đầu các nhà hóa học đã xác định được hai aflatoxin có công thức là C17H12O6 và C17H12O7 với trọng lượng phân tử tương ứng 321 và 328. Hiện nay được biết là aflatoxin B1, G1. Trong cấu trúc phân tử có nhóm lacton và metoxyl, không có nhóm hidroxyl tự do . SVTH: Võ Văn Thanh Lớp: 05C1 4 Xác định Aflatoxin trong nông sản thực phẩm GVHD: Thái Thị Ánh Ngọc Aflatoxin B1 có màu huỳnh quang xanh da trời, aflatoxin G1 có màu huỳnh quang xanh lá cây. Aflatoxin G1 có chứa hai vòng lacton, aflatoxin B1có chứa 1 vòng lacton. Sau đó, hai aflatoxin B1, G2 cũng được phát hiện. Chúng có công thức hóa học hoàn toàn giống aflatoxin B1, G1, chỉ khác là nối đôi trong vòng hidrofuran đã bị khử. Năm 1966, Dutton và Heathcote đã phát hiện thấy trong môi trường nuôi cấy có hai dẫn xuất hydroxi-2 của aflatoxin B2 và aflatoxin G2 là aflatoxin B2a và aflatoxin G2a. Allcroft và Carnaaghan đã nhận thấy trong sữa và thịt bò cũng có dẫn xuất của aflatoxin B1và B2, được đặt tên là aflatoxin M1và M2. Cả hai chất này đều bắt màu huỳnh quang màu xanh tím. Ở gan, thận và nước tiểu của cừu cũng tìm được hợp chất như vậy. Theo Dalezios và Wogan, trong nước tiểu của khỉ có aflatoxin P1, dẫn chất của aflatoxin B1. Một aflatoxin khác cũng được phát hiện gọi là aflatoxin 3B hay parasiticol . -Tính chất lí hóa của các aflatoxin (Townsend, Stubblefied, Beljiccans) aflatoxin Công thức SVTH: Võ Văn Thanh Trọng lượng phân tử Lớp: 05C1 Điểm nóng chảy Huỳnh quang 5 Xác định Aflatoxin trong nông sản thực phẩm GVHD: Thái Thị Ánh Ngọc AflatoxinB1 C17H12O6 321 AflatoxinB2 C17H14O6 314 AflatoxinG1 C17H12O7 328 AflatoxinG2 C17H34O7 330 AflatoxinM1 C17H12O7 328 AflatoxinM2 C17H14O7 330 268269 Xanhlam Xanhlam 286289 Xanhlục Xanhlục 244246 Xanhtím Xanhtím 229231 299 293 II. Phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc kí. 2.1.Phương pháp sắc kí lớp mỏng (Thin layer chromato graphi-TLC ) Phương pháp sắc kí lớp mỏng được sử dụng rộng rãi để xác định hàm lượng aflatoxin lần đầu tiên vào những năm 1960. Người ta sử dụng các bản mỏng được tráng bởi silicagel, để xác định aflatoxin. Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng là chloroforin: methnol và choloroform: aceton. Việc thêm nước vào hệ thống dung môi sẽ làm tăng khả năng hòa tan aflatoxin. Hệ dung môi gồm nước: aceton; chloroform( 1.5;12;88v/v) được đánh giá có khả năng hòa tan aflatoxin tốt nhất. Các bản mỏng đã được chảy qua các dung môi chạy được đưa vào bởi đèn tử ngoại(uv)365mm. Các vết mẫu phân tích tạo màu huỳnh quang xanh da trời hay xanh lá cây. Và có độ dài R f được so sánh với các vết của aflatoxin tiêu chuẩn. Phương pháp này có thể được xác định lượng từ 3-4.10-4micromet(0.3-0.4mg). Nhược điểm của phương pháp là phụ thuộc vào người phân tích. Khi so sánh giữa mẫu và các vết của độc tố chuẩn có thể có sự sai lệch kết quả từ 20-30%. * Phương pháp đó mật độ huỳnh quang trên máy Fluroclensytometer. SVTH: Võ Văn Thanh Lớp: 05C1 6 Xác định Aflatoxin trong nông sản thực phẩm GVHD: Thái Thị Ánh Ngọc Fluroclensytometer có nhiều tiến bộ hơn, chính xác hơn so với nhìn bằng mắt thường. Tuy nhiên có nhiều phòng thí nghiệm hiện đại vẫn sử dụng phương pháp nhìn để so sánh trực tiếp các vết trên bản mỏng vì dễ hơn nhiều khi sử dụng qua máy Densitometer. Hội hóa học phân tích (A.O.A.C-1980) đã lưu ý tới phương pháp phân tích định lượng sử dụng TLC. Phương pháp này được mở rộng thành chương trình phân tích mẫu của tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới. Các kết quả của chương trình phân tích trên đã chứng nhận sự chính xác của phân tích bằng TLC ví sai số rất cao. Hiện có 4 phương pháp phân tích bằng TLC, phổ biến nhất là CB( Contiamintion Branch), BF( the beft foods), EFC( the Eropean Economic Cmmunity) và Pon’s(Pons methods). Phương pháp CB có nhiều ưu điểm hơn cả và thường xuyên được sử dụng. Tuy nhiên phương pháp CB đắt tiền và sử dụng quá nhiều dung môi phân tích. Phương pháp BF có tính thực tế hơn nhiều, dể làm và tiêu thụ ít dung môi, dung môi sử dụng la nước và metanol ít độc hơn chloroform. Phương pháp Pon’s có nhiều ưu điểm, sử dụng hệ dung môi là aceton và nước, dung môi này không hòa tan mỡ. * Khẳng định sự có mặt của aflatoxin: Một số chất được tách ra từ mẫu đôi khi dễ nhầm lẫn với aflatoxin, dẫn đến sự khẳng định sai lệch. Phương pháp khẳng định sự có mặt của aflatoxin trực tiếp thực hiện trên bản sắc kí. Dựa vào sự biến đổi của aflatoxin thành các đồng phân có màu huỳnh quang khác so với huỳnh quang ban đầu, cả aflatoxin chuẩn và aflatoxin có trong mẫu phân tích đều chuyển sang cùng một đồng phân. Thử nghiệm khẳng định sự có mặt của aflatoxin trong mẫu phân tích được phát hiện bởi Przybylski(1975) và Verhulsdonk (1977) và được hội phân tích hóa học Hoa Kì (A.O.A.C) công nhận. Aflatoxin B1 được được acid hóa để trở thành đồng phân aflatoxin B2a. Đồng phân này có nàu huỳnh quang màu xanh và có độ dài R f thấp hơn so với độ dài Rf của aflatoxinB1. Theo phương pháp của Przybylski, aflatoxin Bi được SVTH: Võ Văn Thanh Lớp: 05C1 7 Xác định Aflatoxin trong nông sản thực phẩm GVHD: Thái Thị Ánh Ngọc chuyển thành aflatoxin B2a nhờ acid Tryloacetic( TFA) phun trực tiếp lên các bản mỏng trước khi chạy trong dung môi chạy. Acid sufuric làm thay đổi màu huỳnh quang xanh da trời của aflatoxin B1 thành màu vàng. Thử nghiệm này nhằm khẳng định sự không có mặt của aflatoxin nếu vết nghi ngờ không chuyển thành màu vàng. 2.2. Sắc kí lớp mỏng hiệu suất cao(high ferformane thin layer chromatography-HPTLC): Do những khiếm khuyết trong phương pháp sắc kí lớp mỏng đơn thuần ở các khâu như chiết tách mẫu phân tích, chạy mẫu trong dung môi, phương pháp HPTLC có tính thuyết phục cao hơn ở 3 khía cạnh sau: đưa mẫu lên bản mỏng một cách tự động, cải thiện được sự đồng nhất cả lớp hấp phụ, chạy bản mỏng trong dung môi có kiểm soát. Quá trình đưa mẫu vào bản mỏng được tự động hóa, do đó các vết được định đúng vị trí và đo lường độ huỳnh quang của vết cũng bằng máy densitometess. Thể tích mẫu được dùng trong HPTLC có thể băng 1microlits so với 510l mẫu trong phương pháp TLC, như vậy sẽ làm giảm đi rất nhiều diện tích của vết (=1mm). Nồng độ chất chuẩn có thể cần 5pg trong phân tích bằng HPTLC, do đó có thể xác định tới 30pg (0.03microgam) aflatoxin B1 ở lạc. Sử dụng kĩ thuật HPTLC làm tăng tính thuyết phục của phương pháp TLC như một phương pháp định lượng aflatoxin có hiệu quả nhất. 2.3. Phương pháp sắc kí lỏng cao áp(high ferformane liquid chromatỏgaphy-HPLC): Hệ thống phân tích high ferformane tự động HPLC là hệ thông phân tích đát tiền, chọn lọc, dùng định lượng Aflatoxin. Phương pháp HPLC sử dụng cả hai pha: Pha bình thường và pha phản. Hệ thống này dựa trên sự hấp thụ tia tím (uv) và xác định cường độ huỳnh quang. SVTH: Võ Văn Thanh Lớp: 05C1 8 Xác định Aflatoxin trong nông sản thực phẩm GVHD: Thái Thị Ánh Ngọc Mẫu phân tích được tác bằng chloroform: nước. Ly tâm chất tác dụng làm sạch qua silicagel pha bình thường sử dụng cột nhối silicagel 0.5m và pha động sử dụng bezen: acetonitrit: acid formic. Giới hạn xác định là 0.5micromet/kg. Husst ( 1984) đã sử dụng pha phản kết hợp với TFA đồng phân để xác định được các Aflatoxin B1, B2, G1, G2 ở nồng độ 5pg. Davis(1980) cũng sử dụng pha phản để xác định huỳnh quang của đồng phân iot của Aflatoxin B1. Kết quả dẫn đén việc phát triển phương pháp đồng phân cột . 2.4. Phương pháp sắc kí cột. Phương pháp cột mini nhằm xác định nhanh aflatoxin có trong mẫu. Phương pháp này đơn giản, ít tốn kém, chỉ xác định định tính. Kĩ thuật nhồi cột mini là cột sắc kí bằng thủy tinh hay chất dẻo có kích thước khoảng 3-6mm chiều rộng và 20cm chiều dài. Dung dịch chiết tách được làm sạch bằng dung môi, dung môi và hòa tan trong một lượng nhỏ benzen hay chloroform. Cột được nhồi silicagel như một chất hấp thụ và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại(uv) để xác định màu huỳnh quang xanh chỉ ra sự có mặt của aflatoxin. Nhiều tác giả như Davis và cộng sự(1981), Holaday(1976), Holaday và Lansden(1975) đã cải tiến phương pháp này nhằm phát hiện nhanh aflatoxin trong mẫu. Phương pháp cột mini của Romes(1975) đã được A.O.A.C (1980) công nhận. Aflatoxin được tách bằng aceton và nước (85: 45), các chất tạp được loại trên gel cacbonat đồng và chloric sắt. Sau đó, aflatoxin được tách ra băng một pha nước với chloroform. Chloroform tách được đưa vào cột có chứa một lớp bột nhôm trung tính, silicagel và florisil ở phía dưới, sunfat canxi khô ở cả trên và dưới. Cột được chạy trong choloroform và aceton(9:1) để giữ aflatoxin trên đỉnh của lớp flosisil. Chương III: Đối tượng và phướng pháp nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu: Thiết bị sắc kí bản mỏng và và sắc kí cột. Mẫu phân tích từ nông sản thực phẩm thủy sản. SVTH: Võ Văn Thanh Lớp: 05C1 9 Xác định Aflatoxin trong nông sản thực phẩm GVHD: Thái Thị Ánh Ngọc 3.2 Phương pháp nghiên cứu: Tham khảo tài liệu. Chương 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU I.Phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc ký: 1.1Nguyên tắc: Trên những hạt gel kháng thể đặc hiệu đối với aflatoxin được gắn đồng trị một cách bền vững nhưng không mất hoạt tính. Các gel này được gắn vào những cột nhỏ. Khi cho dịch chiết dẫn mẩu đi qua các cột, Aflatoxin sẽ bị kháng thể giữ lại. Sau khi toàn bộ mẫu đã qua cột, rửa cột trong điều kiện nhẹ nhàng bằng nước cất để loại bỏ tất cả những thành phần không đặc hiệu bám lại. Sau đó Aflatoxinsex được giải hấp ra khỏi cột bằng methanol. Định lượng Aflatoxin bằng sắc ký bản mỏng. 1.2 Tiến hành: 1.2.1 Chuẩn bị mẫu: Xay 1kg mẫu đủ lọc sàng 1mm. Trộn đều, cân 25g mẫu, 5g NaCl và 125ml dung dịch chiết mẫu Methanol 75% cho vào bình định mức. Lắc đều trong 30 phút. Để lắng trong vòng 10- 15 phút . Lọc dịch chiết qua giấy lọc . SVTH: Võ Văn Thanh Lớp: 05C1 10 Xác định Aflatoxin trong nông sản thực phẩm GVHD: Thái Thị Ánh Ngọc Lấy 15 ml dịch lọc pha loãng 1/3 với nước lọc lại lần nữa, lấy 15 ml dịch lọc (tương đương 1g mẫu). 1.2.2Phân tích mẫu: Qua cột sắc ký ái lực miễn dịch :  Gắn xiranh 20-30ml lên giá đỡ. Mở nắp cột sắc ký ái lực miễn dịch cho đầy nước vào trong ống (để tránh tạo bọt khí trong cột ) và gắn vào xiranh .  Cho 20ml PBS qua cột để rửa cột .  Khi lớp nước vừa tới đầu cột cho 15 ml dịch chiết mẫu đã lọc vào xiranh (tránh có bọt khí trong cột).  Cho dịch lỏng chảy qua cột với tốt độ khoảng 1 giọt/giây. Dùng bơm tay để điều chỉnh tốc độ dòng chảy.  Khi dịch mẫu tới đầu cột ,cho 10ml nước cất vào xiranh để rửa cột. Lặp lại một lần nữa với 10ml nước cất.  Khi toàn bộ nước rửa đã ra khỏi cột, bơm 2-3ml không khí qua cột để cột ráo nước. Tháo cột ra khỏi xiranh, lau nước bám ở đầu cột và xiranh. Gõ nhẹ cột lên khăn giấy để hoàn toàn ráo nước .  Cho 1ml methanol (LC grade) rửa giải qua cột, hứng lấy dịc chảy ra. Để methanol chảy từ từ qua cột, cuối cùng dùng xiranh thổi 2-3ml không khí đẩy hết những giọt cuối cùng ra khỏi cột . 1.2.3. Định lượng bằng sắcký bản mỏng(TLC)  Làm khô dịch giải hấp thu trong N 2 ở 40-45oc.Hoà tan cặn lại trong 200l Benzen-Acetonitrit (98:2).  Trên tấm bản silicagelkẻ một đường cách đáy 1,5cm, trên đó chấm nhẹ bằng bút chì cách nhau 1cm trở lên.  Chuẩn bị Aflatoxin B1 0,5ppm pha trong Benzen –Acetonitril(98:2)  Dùng Microsyringe chấm lên bản silicagel từ trái sang phải theo thứ tự sau : + 3 chấm mẫu: 2, 5, 10l + 1 nội chuẩn: 10l mẫu và 10l chuẩn (0,5ppm Aflatoxin B1) SVTH: Võ Văn Thanh Lớp: 05C1 11 Xác định Aflatoxin trong nông sản thực phẩm GVHD: Thái Thị Ánh Ngọc + 3 chấm chuẩn: 10, 5, 2l chuẩn (0,5ppm Aflatoxin B1) Lưu ý: Chấm trong tủ hút để dung môi bay hơi nhanh, chấm từ từ để các chấm thật nhỏ, kích thước chỉ khoảng 1mm/chấm .  Pha dung dịch triển khai: Chloroform- Aceton (9:10. Cho khoảng 20ml dịch triển khai vào bình triển khai. Cho bản silicagel vào bình, đậy kín .Chờ cho dung dịch triển khai lên đến cách mép trên của bản khoảng 0,5cm .  Lấy bản ra, làm khô tại nhiệt độ phòng. Soi trên đèn UV. Các chấm Aflatoxin B1 sẽ phát sáng .  So sánh các chấm chuẩn với các chấm mẫu. Để khẳng định mẫu có nhiễm Alatoxin B1 thì Rf của các chấm chuẩn phải bằng Rf của các chấm mẫu.  So sánh độ sáng của các chấm chuẩn và chấm mẫu, chọn một thể tích là Xl mẫu có độ phát sáng bằng S l chuẩn.  Tính toán nồng độ Alatoxin B1 có trong mẫu . 1.3 Kết quả và tính toán : Nồng độ Afatoxin B1 có trong mẫu : S.Y.V X.W Trong đó S : thể tích của Aflatoxin chuẩn có độ sáng bằng X l mẫu () Y : nồng độ Aflatoxin B1 chuẩn (0,5g/ml hoặc 0,5ppm) V : thể tích hoà cặn (200 l) X : Thể tích của mẫu có độ sáng bằng S l chuẩn W : số gam mẫu đi qua cột (1g) Chú ý an toàn khi tiếp xúc với Aflatoxin :  Đeo găng tay khi làm thí nghiệm .  Các vết Aflatoxin phải dược lau sạch bằng nước javen 10% Dụng cụ thuỷ tinh hay nhựa đã tiếp xúc với Aflatoxin phải dược ngâm trong nước javen 10% tói thiểu là 30 phút trước khi rửa. SVTH: Võ Văn Thanh Lớp: 05C1 12 Xác định Aflatoxin trong nông sản thực phẩm GVHD: Thái Thị Ánh Ngọc II. PHÂN TÍCH AFLATOXIN B1 DÙNG CỘT SẮC KÍ ÁI LỰC MIỄN DỊCH KẾT HỢP SẮC KÍ BẢN MỎNG. 2.1. Nguyên lý: Trên những hạt gel kháng thể đặc hiệu đối với aflatoxin được gắn đồng trị một cách bền vững nhưng không mất hoạt tính. Các gel này được đóng vào những cột nhỏ. Khi cho dịch chiết mẫu đi qua các cột aflatoxin sẽ bị kháng thể giữ lại. Sau khi toàn bộ mẫu đi qua cột, cột sẽ được rửa bằng nước cất để loại bỏ tất cả những thành phần bám một cách yếu ớt. Sau đó aflatoxin sẽ được giải hấp ra khỏi cột bằng methanol. Định lượng aflatoxin bằng sắc kí lỏng cao áp, sắc kí bản mỏng. 2.2. Chiết mẫu. *Xay 1kg mẫu đủ lọt sàng 1 mm. Cân 25g to vào bình Erlen meyer 500ml, cho 5g NaCl và 125ml dung dịch chiết mẫu(75% methanol). Lắc trong 30 phút. *Lọc dịch chiết qua giá lọc. *Lấy 15ml dịch lọc pha loãng 1/3 với nước lọc lại một lần nữa lấy 15 ml dịch lọc(tương đương 1g mẫu). 2.3.Quy trình phân tích : *Qua cột sắc kí ái lực miễn dịch. - Gắn xylanh 20-30 ml lên giá đỡ. Mỡ nắp cột sắc kí ái lực miễn dịch cho đầy nước vào trong ống(để tránh bọt khí trong cột ) và gắn vào xylanh - Cho 20ml PBS qua cột để rửa cột - Khi lớp vừa nước tới đầu cột cho 15ml dịch chiết mẫu đã lọc vào xylanh - Cho dịch lọc chảy qua cột với tốc độ khoảng 1 giọt/s. Dùng bơm tay để điều chỉnh tốc độ dòng chảy - Khi dịch mẫu tới đầu cột, cho 10ml nước cất vào xylanh để rửa cột . Lặp lại một lần nữa với 10 ml nước cất. SVTH: Võ Văn Thanh Lớp: 05C1 13 Xác định Aflatoxin trong nông sản thực phẩm GVHD: Thái Thị Ánh Ngọc - Khi toàn bộ nước rửa đã ra khỏi cột, bơm 2-3ml không khí qua cột để cột ráo nước. Tháo cột khỏi xylanh lau nước bám ở đầu cột và xylanh. Gõ nhẹ cột lên khăn giấy để hoàn toàn ráo nước. - Cho 1ml methanol rữa giải qua cột hứng lấy dịch chảy ra. Để methanol chảy từ từ qua cột, cuối cùng dùng xylanh thổi 2-3 ml không khí để đẩy hết những giọt cuối cùng ra khỏi cột . *Phân tích nồng độ aflatoxin: +Bán định lượng bằng florifil tip: Cho dung dịch giải hấp qua cột florifil. Quan sát nó dưới đèn UV 365nm. So sánh độ phát huỳnh quang của mẫu với những tip aflatoxin chuẩn 10-20-50 ppb để ước lượng nồng độ aflatoxin trong mẫu. + Định lượng bằng sắc kí lỏng cao áp: Pha loãng ½ dịch giải hấp thu được với nước (cho thêm 1 ml nước HPLC vào, lắc đều) Tiêm vào máy HPLC Thời gian chạy 20s. Tốc độ dòng 1ml/s. Thể tích tiêm 20microlit. Cột Supelcosil LC –18,150x4.6 mmID,5 micromet Particle size. Detector fluorescent Excitation:360nm Emission :440nm Dựng đường chuẩn và tính toán nồng độ aflatoxin dựa trên đường chuẩn. + Định lượng bằng sắc kí bản mỏng : -Làm khô dịch giãi hấp thu được trong N 2 ở 40-45oC. Hòa cặn lại trong 20l Benzen-acetonitril(98/2) -Trên tấm bản silicagel kẻ một đường cách cạnh đáy 1.5cm, trên đó chấm nhẹ kèm bút chì cách nhau 1cm trở lên. -Chuẩn bị aflatoxin B1 0.5ppm pha trong benzen- acetonitril -Dùng micro siringe chấm trên bảng silicagel từ trái sang phải theo thứ tự sau: SVTH: Võ Văn Thanh Lớp: 05C1 14 Xác định Aflatoxin trong nông sản thực phẩm GVHD: Thái Thị Ánh Ngọc 3 chấm mẫu: 2, 5, 10 l 1 nội chuẩn 10l mẫu và l 3 chấm chuẩn: 10, 5, 2 l chuẩn. -Pha dịch triển khai: chloroform-aceton(9:1). Cho khoãng 20ml dịch triển khai vào bình triển khai. Cho bản silicagel vào bình đậy kín. Chờ cho dung dịch triển khai lên đến cách mép trên bản khoảng 0.5cm. -Lấy bản ra làm khô tại nhiệt độ phòng. Soi trên đèn UV, aflatoxin B1 sẽ phát sáng . - So sánh các chấm chuẩn với các chấm mẫu. Để khẳng định mẫu có nhiễm aflatoxin thì Rf của các chấm chuẩn phải bằng Rf của các chấm mẫu . - So sánh độ sáng của các chấm chuẩn và mẫu, chọn một thể tích là x mẫu có độ phát sáng bằng S chuẩn. -Tính toán nồng độ aflatoxin có trong mẫu như sau: S.Y.V X.W Trong đó : S : thể tích của Aflatoxin chuẩn có độ sáng bằng X l mẫu Y : nồng độ Aflatoxin B1 chuẩn (0,5 g/ml hoặc 0,5ppm) V : thể tích hoà cặn (200 l) X : Thể tích của mẫu có độ sáng bằng S l chuẩn W : số gam mẫu đi qua cột (1g) III.Kỹ thuật định tính và bán định lượng độc tố vi nấm mốc 3.1 Nguyên lý của phương pháp: Aflatoxin được chiết tách từ mẫu thử bằng clorofoc. Dịch chiết được lọc và một phần dịch lọc được làm sạch qua cột silicagen. Làm bay hơi dung dịch rửa giải và hoà cặn với clorofoc hoặc hỗn hợp benzen – axetonitril. Sau đó chấm một phần xác định mẫu thử lên bản mỏng,chạy sắc ký và so sánh Rf, màu sắc vết sắc ký của mẫu phân tích với vết aflatoxin chuẩn dưới đèn tử ngoại có bước sóng 365nm. Lượng aflatoxin có thể xác định bằng mắt hay bằng máy đo mật độ huỳnh quang. SVTH: Võ Văn Thanh Lớp: 05C1 15 Xác định Aflatoxin trong nông sản thực phẩm GVHD: Thái Thị Ánh Ngọc 3.2. Đối tượng áp dụng của phương pháp: Dùng để xác định hàm lượng aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong các sản phẩm ngũ cốc, đậu đỗ, hạt có dầu. Silicagel G – 60 dùng cho sắc ký cột, cỡ hạt 0,063¸ 0,2 mm. Hoạt hoá bằng cách sấy khô ở 105 o C trong một giờ, sau đó trút vào bình tam giác nút nhám, thêm nước với tỷ lệ 1ml nước cho 100g silicagel, đậy nút, lắc đến khi trộn hoàn toàn đều, bảo quản 15 giờ trong bình kín. Chuẩn bị dung dịch aflatoxin chuẩn (điều kiện tiến hành: trong phòng mát, tránh ánh sáng): Dung dịch aflatoxin chuẩn gốc (dung dịch A): Dùng ống chuẩn 1 mg, mỗi loại aflatoxin chuẩn B1, B2, G1, G2 lần lượt cho vào 4 bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng hỗn hợp toluen – axetonitril 98: 2 (v/v) (nồng độ dung dịch aflatoxin chuẩn là 10 m g/ml). Cho vào một bình định mức 10ml lần lượt 0,5 ml aflatoxin B1; 0,5 ml aflatoxin G1; 0,1 ml aflatoxin B2, 0,1 ml aflatoxin G2 (từ dung dịch A ở trên), định mức đến 10ml bằng hỗn hợp toluen – axetonitril 98: 2 (v/v), nồng độ dung dịch là 0,5 m g/ml đối với B1, G1, và 0,1 m g/ ml đối với B2, G2. Cần kiểm tra lại nồng độ dung dịch aflatoxin chuẩn (dung dịch A mg/ml) bằng quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS, bước sóng 350nm, tính kết quả theo công thức: C ( m g/ml) = 1000.m.A / e Trong đó: m – Khối lượng phân tử aflatoxin SVTH: Võ Văn Thanh Lớp: 05C1 16 Xác định Aflatoxin trong nông sản thực phẩm GVHD: Thái Thị Ánh Ngọc A – Mật độ quang ở bước sóng hấp thụ. e - Độ hấp thụ phân tử của aflatoxin Aflatoxin B1 B2 G1 G2 m Dung môi l max (nm) 312 314 328 330 benzen – axetonitril (v/v) 98: 2 98: 2 98: 2 98: 2 350 350 350 350 e 19800 20900 17100 18200 Bảo quản: Bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn 0 0C, dung dịch A để được 6 tháng và dung dịch B để được hai tuần trước khi dùng hoạt hoá ở 1100C trong 1 giờ. 3.3. Phương pháp tiến hành: (Điều kiện tiến hành: ở phòng mát, tránh ánh nắng ) 3.3.1. Chuẩn bị mẫu: Nghiền mẫu sao cho có thể qua được rây có lỗ cỡ 1mm. Chú thích: Với các mẫu thử có hàm lượng chất béo lớn hơn 5%, cần loại chất béo bằng cách chiết với dung môi ête dầu hoả (độ sôi 40 – 600C ) sau khi đã hoàn thành công đoạn nghiền mẫu. 3.3.2. Tiến hành thí nghiệm: 3.3.2.1. Chiết xuất: Cân 50g mẫu đã nghìên nhỏ cho vào bình nút mài 500ml. Cho tiếp 25ml nước, 25g celite 545, 250ml clorofoc, đậy nút chặt. Lắc trong 30 phút bằng máy lắc quay tròn hay máy khuấy từ (hoặc lắc kỹ bằng tay) rồi lọc qua giấy lọc gấp cạnh, bỏ 10ml dịch lọc đầu, sau đó lấy 50ml dịch lọc tiếp theo (tương đương 10g mẫu thử). Nếu tốc độ dịch lọc xuống chậm, chuyển sang phểu Bucher có chứa 1 lớp celite 545 dày 5mm trên giấy lọc và lọc hút chân không. SVTH: Võ Văn Thanh Lớp: 05C1 17 Xác định Aflatoxin trong nông sản thực phẩm GVHD: Thái Thị Ánh Ngọc 3.3.2.2. Làm sạch mẫu bằng cột sắc ký: Kỹ thuật nhồi cột sắc ký: Cho một ít bông vào đáy cột sắc ký, thêm 5g natri sunfat khan. Đổ clorofoc đến 2/3 cột, sau đó cho 10 g silicagel dùng cho sắc ký cột (3 - 15), vừa cho vừa gõ nhẹ thành cột cho silicagel lắng đều, dùng đũa thuỷ tinh khuấy nhẹ để tránh bọt khí. Mở khoá cho clorofoc chảy xuống từ từ. Khi tốc độ lắng của silicagel chậm lại, rút hết clorofoc chỉ để lại một lớp 5cm phía trên lớp silicagel. Thêm từ từ 15g natri sunfat khan, sau đó rút bớt clorofoc đến gần sát lớp natri sunfat khan trên. Cột silicagel thu được phải mịn, không có bọt khí và chú ý không để cột bị khô kể từ lớp natri sunfat khan trên. Trộn 50ml dịch lọc trên (5 - 2) với 150ml n – hexan, đổ cẩn thận vào cột sắc ký đã chuẩn bị như trên. Loại bỏ dung dịch chảy ra. Cho tiếp 150ml ête êtylic khan, loại bỏ dung dịch chảy ra. Chú ý không để cột bị khô, lưu lượng dòng chảy khoảng 8 – 12ml /phút. Dung dịch rửa giải aflatoxin trên bằng 150ml hỗn hợp metanol – clorofoc (3 : 97). Lấy toàn bộ dịch chảy ra từ khi bắt đầu cho dung dịch rửa giải cho đến hết. Lưu lượng dòng chảy như trên. Làm bay hơi dung dịch rửa bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ thấp hơn 50 oC cho đến khi còn khoảng 2 – 3 ml. Chuyển sang ống nghiệm 10ml, tráng rửa bình cầu bằng clorofoc và làm bay hơi đến khô trên nồi cách thuỷ ở nhiệt độ thấp hơn 50 0C, tốt nhất dưới luồn khí nitơ nhẹ cặn còn lại trong ống nghiệm là mẫu phân tích. Đậy kín ống nghiệm có cặn để chạy sắc ký lớp mỏng. 3.3.2.3. Sắc ký lớp mỏng một chiều: SVTH: Võ Văn Thanh Lớp: 05C1 18 Xác định Aflatoxin trong nông sản thực phẩm GVHD: Thái Thị Ánh Ngọc Chuẩn bị: Hoà cặn thu được ở trên bằng 0,5ml hỗn hợp benzen – axetonitril (98: 2) và lấy dịch này để chấm lên bản sắc ký. Với bản mỏng tráng sẵn trước khi chấm sắc ký phải cạo sạch lớp silicagel ở hai cạnh bên tấm sắc ký với chiều rộng 0,5cm. Sau đó cách cạnh đáy 2 cm, dùng mao quản hay micropipet chấm các vết dung dịch chuẩn aflatoxin và dung dịch mẫu thử như sau: 1. Lấy 2; 5;10; 20 m l dung dịch chuẩn B ( 3.17. 2). 2. Lấy 10 m l dịch chiết với 10 m l dung dịch chuẩn B (3 .17.2). 3. Lấy 10, 20 m l dịch chiết. - Với từng thể tích như trên, 4 dung dịch aflatoxin B1, B2, G1, G2 chuẩn có thể được chấm chồng lên nhau. Khai triển bản sắc ký ở chỗ tối với hệ dung môi clorofoc – axeton (9: 1). Sau khi tiếp tuyến dung môi chạy lên khoảng 10cm (khoảng 30 phút), lấy bản sắc ký ra để bay hơi dung môi ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Sau đó soi dưới đèn tử ngoại với bước sóng 365 nm. Các vết aflatoxin B1, B2 có huỳnh quang màu xanh da trời; G1, G2 có huỳnh quang màu xanh lá cây. Nếu mẫu thử có aflatoxin sẽ xuất hiện các vết cùng giá trị Rf với các vết aflatoxin chuẩn. Rf của các vết aflatoxin trong hệ dung môi clorofóc - axêtôn (9-1) có trị số trung bình như sau: Aflatoxin B 1 : 0,72 Aflatoxin B 2 : 0,67 SVTH: Võ Văn Thanh Lớp: 05C1 19 Xác định Aflatoxin trong nông sản thực phẩm GVHD: Thái Thị Ánh Ngọc Aflatoxin G 1 : 0,59 Aflatoxin G 2 : 0,54 3.3.2.4. Thử nghiệm khẳng định sự có mặt của aflatoxin: -Phun dung dịch axit sunfuric 50% (v/v) lên bản sắc ký, huỳnh quang của các vết aflatoxin sẽ chuyển sang màu vàng dưới tia tử ngoại có bước sóng 365nm. -Rót dung dịch iốt 5 – 10% trong ête lên một tấm thuỷ tinh 20 x 20cm, dàn đều ở khu vực giữa, để cho ête bay hơi hết còn lại một lớp iốt mỏng. Đặt úp tấm thuỷ tinh này lên bản sắc ký đã triển khai, cách khoảng 1 cm trong thời gian 20 – 30 giây. Lấy bản sắc ký ra quan sát dưới đèn tử ngoại, nếu huỳnh quang của chất chuẩn và dung dịch thử không mất đi, chứng tỏ sự có mặt của aflatoxin. -Chia bản mỏng silicagel 20 x 20 cm làm hai phần bằng nhau (cách 10cm ở giữa), chấm các vết dịch chiết mẫu thửvà dung dịch aflatoxin chuẩn như sau: Phần 1: Bên trái, chấm 4 vết như sau. - 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2) - 10 m l dịch chiết - 10 m l dịch chiết với10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2) - 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2) Phần 2: Bên phải,chấm 4 vết như sau. - 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2) - 10 m l dịch chiết - 10 m l dịch chiết với 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2) - 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2) Chấm xong dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay hết. Nhỏ lên 4 vết chấm ở phần 1 bên trái, mỗi vết một giọt axít trifluoraxetic. Che phần 1 (bên trái) SVTH: Võ Văn Thanh Lớp: 05C1 20