Tài liệu Khảo sát thành phần hoá học cây cỏ the

LỜI CẢM ƠN  Khoá luận được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hợp chất thiên nhiên, thuộc Khoa Hóa, Trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh, đến nay đã được hoàn thành. Em xin cảm ơn thầy Bùi Xuân Hào, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt khóa luận này. Thầy đã hướng dẫn cũng như truyền đạt những kinh nghiệm cần thiết khi làm thực nghiệm và nghiên cứu. Em cũng xin cảm ơn thầy Dương Thúc Huy, cô Lê Thị Ánh Tuyết và cô Lê Thị Thu Hương đã giúp đỡ và cho em những ý kiến quý báu để em có thể hoàn tất đề tài của mình. Em xin cảm ơn quý Thầy Cô Bộ môn Hóa hữu cơ, khoa Hóa – Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh, các thầy cô đã hết lòng hướng dẫn, giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian em học tại trường. Cuối cùng em cũng xin cảm ơn tất cả các bạn trong phòng thí nghiệm Hợp chất thiên nhiên trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình trao đổi những kinh nghiệm, đoàn kết, gắn bó và tạo mọi điều kiện giúp đỡ nhau trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn! MỤC LỤC MỞ ĐẦU.......................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN........................................................................................2 1.1. Vài nét về Họ Cúc – Asteraceae[2]...................................................................2 1.2. Các chi trong họ Cúc – Asteraceae..................................................................4 1.3. Đặc điểm thực vật cây cỏ the[3]........................................................................4 1.3.1. Phân bố, thu hái và chế biến......................................................................5 1.3.2. Công dụng.................................................................................................5 1.3.3. Thành phần hóa học có trong cây cỏ the...................................................6 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP............................................10 2.1. Đối tượng nghiên cứu....................................................................................10 2.2. Phương pháp nghiên cứu...............................................................................10 2.2.1. Phương pháp cô lập các hợp chất............................................................10 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất..........................................10 2.3.Thực nghiệm..................................................................................................10 2.3.1. Các điều kiện thí nghiệm........................................................................10 2.3.2. Điều chế các loại cao và cô lập các hợp chất trong cao ethyl acetate......11 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN...............................................................16 3.1. Hợp chất CTC16...........................................................................................16 3.2 Hợp chất CTT2..............................................................................................22 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................24 TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................25 PHỤ LỤC.................................................................................................................... 26 DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU Trang HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cây cỏ the...................................................................................................4 Hình 1.2. Hoa cỏ the..................................................................................................4 Hình 3.1. Phân mảnh vòng A của hợp chất CTC16..................................................17 Hình 3.2. Phân mảnh II của hợp chất CTC16...........................................................18 Hình 3.3. Cấu trúc phẳng ba vòng A, B, C của hợp chất CTC16.............................18 Hình 3.4. Tương quan HMBC và 1H-1HCOSY của hợp chất CTC16.......................18 Hình 3.5. Cấu trúc hoá học của hợp chất CTC16 và Minimosid..............................19 SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Quy trình điều chế các loại cao...............................................................12 Sơ đồ 2.2. Quy trình sắc ký cột silica gel cao ethyl acetate......................................13 Sơ đồ 2.3. Quy trình sắc ký cột silica gel phân đoạn A4 .........................................14 Sơ đồ 2.4. Quy trình sắc ký cột silica gel phân đoạn A2..........................................15 BẢNG BIỂU Bảng 2.1. Khối lượng của các loại cao và thu suất so với bột mẫu nguyên liệu ban đầu ban đầu......................................................................11 Bảng 2.2. Kết quả sắc ký cột trên cao ethyl acetate của cây cỏ the..........................13 Bảng 3.1. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất CTC16 ........................19 Bảng 3.2. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất CTC16 và Minimosid ............................................................................................................... 20 Bảng 3.3. Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất CTT2................................................21 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT brs broad singlet (mũi đơn rộng) COSY Correlation Spectroscopy d doublet (mũi đôi) dd doublet of doublet (mũi đôi đôi) HSQC Heteronuclear Multiple Quantum Correlation HMBC Heteronuclear Multiple Bonds Correlation J coupling constant (hằng số ghép spin) m multiplet (mũi đa) NMR Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (phổ cộng hưởng từ hạt nhân) s singlet (mũi đơn) SKC sắc ký cột SKĐC sắc ký lớp mỏng điều chế Khoá luận tốt nghiệp Trần Thị Loan MỞ ĐẦU Cây cỏ từ lâu đã được dùng nhiều trong các bài thuốc y học cổ truyền dân gian ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Đây là nguồn tài nguyên thực vâ ̣t có giá trị thiết thực trong viê ̣c phòng chữa bê ̣nh cho nhân dân. Từ cây cỏ, các nhà khoa học trên thế giới đã chiết xuất được nhiều hợp chất hóa học được dùng để chữa trị nhiều căn bệnh hiểm nghèo, như hợp chất taxol được cô lập từ cây thông đỏ, hợp chất vinblastin từ cây dừa cạn, dùng điều trị ung thư ngực ở phụ nữ. Ngày nay, sự kết hợp của ngành hóa học các hợp chất tự nhiên với các ngành y dược học, sinh học, đã không ngừng nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loại dược thảo có trong các bài thuốc cổ truyền, để ứng dụng vào việc chữa bệnh cho con người. Việt Nam thuộc vùng khí hậu cận nhiệt đới, với hê ̣ thực vâ ̣t rất phong phú, đa dạng. Nhiều cây thuốc có giá trị ṣ dụng cao như cây sâm Ngọc Linh mọc ở tỉnh Quảng Nam, cây thông đỏ mọc ở Lâm Đồng... Đây là mô ̣t thuâ ̣n lợi lớn cho việc nghiên cứu của các nhà hóa học các hợp chất thiên nhiên ở nước ta. Cây cỏ the từ lâu đã được dùng trong y học dân tộc để điều trị các chứng bệnh như viêm họng cấp, viêm mũi dị ứng, viêm phế quản mãn tính, ho gà, trị chấn thương, đau mắt đỏ, viêm mắt có mủ…Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có công trình khoa học nào công bố về nghiên cứu thành phần hóa học của cây cỏ the. Vì lý do đó, chúng tôi chọn cây cỏ the là đối tượng nghiên cứu trong đề tài này, với mong muốn làm sáng tỏ thành phần hóa học của cây cỏ the, góp phần vào việc nghiên cứu các hợp chất tự nhiên, tìm ra những hợp chất có hoạt tính sinh học nhằm nâng cao giá trị ṣ dụng của dược thảo Việt Nam. 1 Khoá luận tốt nghiệp Trần Thị Loan CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Vài nét về Họ Cúc – Asteraceae[2] Họ Cúc (Asteraceae) còn được gọi là họ Hướng dương hay họ Cúc tây, là một họ thực vật có hai lá mầm. Họ Cúc là họ lớn nhất trong ngành thực vật có hoa, với khoảng 25.000 loài, gồm 2 phân họ: - Phân họ hoa ống (Tubuliforae, Asteroideae): trên cụm hoa chỉ có hoa hình ống, hoặc hoa hình ống ở giữa, hoa hình lưỡi nhỏ ở xung quanh đầu. - Phân họ hoa lưỡi nhỏ (Liguiiflorae, Cichorioideae): tất cả các hoa trong cụm hoa đầu là hoa lưỡi nhỏ, không bao giờ có hoa ống. Cây có nhựa mủ. Họ Cúc phân bố rộng khắp thế giới, nhưng phổ biến nhất tại các khu vực ôn đới và miền núi nhiệt đới. Ở Việt Nam, họ Cúc có khoảng 125 chi, trên 350 loài, chủ yếu là cỏ dại, một số được trồng làm cảnh (các loại hoa cúc), rau ăn (ngải cứu, cải cúc, rau diếp), gia vị (cúc tần)… Một số đặc điểm thực vật của họ Cúc: Thân cỏ hay bụi, sống một năm hay nhiều năm, ít khi là dây leo hay cây gỗ. Rễ có thể phù lên thành củ, nhưng chất dự trữ ở đây không phải là tinh bột mà là inulin (thược dược). Lá có hình dạng biến thiên, không có lá kèm, thường mọc đối hoặc tụ thành hình hoa ở gốc, có những loại lá có gai. Thông thường phiến lá nguyên, xẻ sâu, hình dạng lá kép hình lông chim hay hình chân vịt hiếm gặp. Cụm hoa: Đầu, có thể mang nhiều hoa hay ít hoa. Đầu có thể đứng riêng lẻ hay tụ thành chùm, gié, xim, nhưng thông thường nhất là tụ thành ngù. Có thể xem hoa tự đầu như một gié thu ngắn, trong đó các hoa đính theo một đường xoắn ốc hay liên tục, hoa già ở bìa, hoa non ở giữa. Dạng thông thường của hoa tự đầu là hình nón, nhưng cũng có thể phẳng hoặc có khi lõm hình chén. Đầu mang hai loại lá bắc: lá bắc ngoài bất thụ, tạo thành một tổng bao. Các lá bắc này có thể đính trên một hàng (Seneciio, Tagetes) hoặc đính trên nhiều hàng kết hợp. Hình dạng và kích 2 Khoá luận tốt nghiệp Trần Thị Loan thước của lá bắc ngoài rất biến thiên. Ở actisô, các lá bắc ngoài nạc và phần này ăn được. Lá bắc ngoài có thể nguyên hay có răng, có gai, có những loại có màu như cánh. Lá bắc thật có mang hoa ở nách, là những phiến mỏng hẹp, đôi có lông. Lá bắc thật có thể phẳng hay cong xung quanh hoa, chúng có thể không có. Hoa: lưỡng tính, mẫu năm, bầu dưới, không có lá bắc con. Các hoa trên một đầu có thể giống nhau, có cùng cách cấu tạo, cùng chức năng. Kiểu đầu này gọi là đồng giao với toàn những hoa hình ống hoặc toàn hoa hình lưỡi nhỏ có năm răng hoặc đôi khi toàn hoa hình môi. Hoa tự đầu có thể gồm hai loại hoa: hoa đều hình ống ở giữa có nhiệm vụ sinh sản và hoa không đều hình lưỡi nhỏ có ba răng ở bìa, đóng vai trò của tràng để thu hút côn trùng. Kiểu đầu này gọi là dị giao. Bao hoa: lá đài thường giảm vì nhiệm vụ bảo vệ đã được đảm nhiệm bởi các lá bắc của tổng bao. Đài có thể biến mất, đôi khi chỉ còn một gờ nhỏ, nguyên hay có thùy, gờ có thể mang những vẩy hoặc một vòng lông tơ. Sau khi thụ tinh, đài có thể phát triển thành một mào lông, có thể láng hay có gai, có nhiệm vụ trong sự phát tán của quả. Tràng do cánh hoa dính, có thể đều hình ống (trường hợp hia giữa của các đầu dị giao) hoặc không đều có dạng lưỡi nhỏ có ba răng hay răng hoặc hình môi 2/3 hoặc hình ống dài hơi cong. Bộ nhị: năm nhị bằng nhau, đính trên ống tràng và xen kẽ với cánh hoa. Chỉ nhị rời nhau từ tông Cynareae. Bao phấn mở dọc, hướng trong, dính nhau thành một ống bao quanh vòi. Chung đới thường kéo dài trên bao phấn thành bộ. Ngoài ra bao phấn còn mang ở gốc những phụ bộ choãi ra tạo thành những tai nhỏ, che chở cho mật hoa ở gốc vòi khỏi bị nước mưa. Bộ nhụy: hai lá noãn ở vị trí trước và sau, tạo thành bầu dưới một ô, đựng một noãn, đính đáy. Đĩa mật ở trên bầu. Ở hoa lưỡng tính và hoa cái, vòi xuyên qua đĩa mật và chia thành hai nhánh đầu nhụy (vòi không chia thành ở hoa bất thụ). Các nhánh đầu nhụy mang ở mặt dưới những lông để quét hạt phấn khi vòi mọc xuyên qua ống cấu tạo bởi các bao phấn. Sự thụ phấn nhờ côn trùng. Quả bế, thường mang một mào lông do đài biến đổi, có khi mào lông được mang bởi một cuống dài hay ngắn. Đôi khi quả trần hoặc có móc hay có gai. Hạt không có nội nhũ, lá mầm to, nhiều khi chứa đầy dầu. 3 Khoá luận tốt nghiệp Trần Thị Loan Họ Cúc là họ có số loài được dùng làm thuốc lớn nhất trong giới thực vật. Có khoảng 51 loài của họ Cúc được dùng làm thuốc, trong đó có 18 loài được dùng trong công nghiệp dược như các loài: atisô, bạch truật, cỏ nhọ nồi, cỏ ngọt, cúc hoa, cúc tần, hồng hoa, hy thiêm, ké đầu ngựa, khoản đông hoa, mần tưới, mộc hương, ngải cứu, ngưu bàng, sài đất, thương truật, thanh hao hoa vàng, ṭ uyển. 1.2. Các chi trong họ Cúc – Asteraceae Ở Việt Nam, họ Cúc có khoảng 125 chi, trong đó có một số chi tiêu biểu, thường gặp như chi Gerbera, chi Helianthus L, chi Cynara. Cây cỏ the là một loài thuộc chi Centipeda. 1.3. Đặc điểm thực vật cây cỏ the[3] Hình 1.1. Cây cỏ the Hình 1.2. Hoa cỏ the Cây cỏ the thuộc họ Cúc, chi Centipeda. Tên khoa học: Centipeda minima (L). Tên thông thường: nga bất thực thảo, địa hồ tiêu, cầu ṭ thảo, cóc mẳn, cúc mẩn, thạch hồ tuy.[3] Cỏ the là một loại cỏ mềm, mọc bò lan trên mặt đất ẩm, thân rất nhiều cành, ở ngọn có lông mịn trắng, nhưng toàn thân trông nhẵn bóng. Lá đơn mọc so le, hình ba lá cạnh, đầu tù, phía cuống hẹp lại, mép có một, hai hoặc ba răng cưa; dài 10-18 mm, rộng 6-10 mm, gân chính hơi nổi ở mặt dưới lá, gân phụ không rõ, không có cuống. Cụm hoa hình đầu mọc ở nách lá, hoa cái gồm nhiều lớp, cánh hoa hình ống màu trắng, trên có răng cưa, hoa lưỡng tính ít hơn. Tràng hoa hình chuông, có bốn răng, hình trứng rộng, màu hơi tím. Quả bế bốn cạnh, trên cạnh có lông mịn nhỏ. 4 Khoá luận tốt nghiệp Trần Thị Loan Mùa hoa tháng 2 - 5, mùa quả tháng 4 - 7. Để dùng làm thuốc, thường hái toàn cây, gồm cả rễ, dùng tươi hay phơi hoặc sấy khô. Cây mọc hoang khắp nơi ở vùng đồng ruộng ẩm thấp, ruộng bỏ hoang, bờ rãnh, ven đường… Ngay cả trong các thành phố, chỗ những chân tường ẩm, khe gạch vỡ hở đất cũng thường hay gặp cây này. 1.3.1. Phân bố, thu hái và chế biến Cỏ the mọc hoang ở nơi ẩm thấp hoặc ruộng bỏ hoang ở Việt Nam, Trung Quốc (Quảng Tây, Giang Tô, Quảng Châu), Malaysia, Indonesia, Ấn Độ, Nhật Bản, Châu Úc, Mangat, mọc phổ biến sau vụ gặt, mọc nhiều vào tháng giêng.… Thu hái toàn cây vào mùa khô, ṛa sạch, dùng tươi hoặc phơi, sấy khô. 1.3.2. Công dụng Cây cỏ the có vị cay, mùi hắc, tính ấm, có tác dụng thông khiếu, tán thấp, khu phong, tiêu thũng, tiêu viêm, tiêu sung. Cỏ the còn thường dùng làm thuốc chữa ho, viêm phế quản, mắt đau đỏ sưng, chảy nước dãi, đau màng mộng mắt, viêm mũi dị ứng, hay dùng ngoài để chữa bệnh mẫn ngứa (eczema), trị rắn cắn, đắp bó gãy xương.[2] Phần thân, lá và hoa của cây cỏ the còn được ṣ dụng phổ biến trong các bài thuốc dân gian. Ví dụ như trong các bài thuốc dân gian của Trung Quốc, cây cỏ the được dùng để chữa bệnh đau đầu, cảm lạnh, viêm kết mạc và bệnh sốt rét. Ở Đài Loan, cỏ the được nấu lấy nước để tắm cho trẻ em bị bệnh ghẻ lở, hay uống để trị các bệnh về hệ tiêu hóa.[11]  Một số bài thuốc dân gian sử dụng cây cỏ the:  Chữa mẩn ngứa (eczema): cỏ the hai phần, đậu xanh một phần, muối vài hạt. Cả ba thứ giã nhỏ đắp lên nơi bị mẩn ngứa đã được ṛa sạch.  Chữa ho: cỏ the khô 20 g hoặc tươi 30 g, nước 500 ml sắc còn 100 ml chia ba lần uống trong ngày.  Chữa viêm mũi, nghẹt mũi: dùng cỏ the, hoa mộc lan (mỗi vị 6 g), ké đầu ngựa (10 g), sắc lấy nước uống. Nếu dùng ngoài, nghiền cỏ the, tế tân và bạch chỉ rồi đặt mỗi lần một ít vào trong mũi. 5 Khoá luận tốt nghiệp Trần Thị Loan 1.3.3. Thành phần hóa học có trong cây cỏ the Năm 1989, Dipti Gupta và J Singh công bố bốn triterpenoid saponin mới từ cây cỏ the là acid lα,3β,19α,23-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic-28-O-β-D- xylopyranosid (1), acid lβ,2α,3β,19α,23-pentahydroxyurs-12-en-28-oic-28-O-β-Dxylopyranosid (2), 3α,2lα,22α,28-tetrahydroxyolean-l2-en-28-O-β-D-xylopyranosid (3), 3α,l6α,2lα,22α,28-pentahydroxyolean-l2-en-3-O-β-D-xylopyranosyl-28-O-β-Dxylopyranosid (4).[4] Năm 1990, cũng Dipti Gupta và J Singh đã nghiên cứu và tìm ra một số chất trong cây cỏ the, gồm: tetratriacontanyl nonadecanoat (5), sitosterol (6), 3,3,5,5tetramethoxy stilben (7), 2-isopropyl-5-methylhydroquinon-4-O-β-D-xylopyranosid (8), acid 2α,3β,23,19α-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic-28-O-β-D-xylopyranosid (9), 6 Khoá luận tốt nghiệp Trần Thị Loan 3α,21β,22α,28-tetrahydroxyolean-12-en-28-O-β-D-xylopyranosid (10), 3β,16α,2lβ,22α,28-pentahydroxyolean-12-en-28-O-β-D-xylopyranosid (11).[5] CH3-(CH2)17COO-(CH2)33-CH3 (5) H OH H Me OH Me H H H O HO OH HO O Me (6) H (7) OH OMe O MeO C HO O H OMe HO HO MeO HOH2C (8) O H H (9) H H H OH HO OH OH OH O OH OH O H HO H HO O H HO H H H H (10) O HO H OH HO H (11) 7 H H OH HO H Khoá luận tốt nghiệp Trần Thị Loan Năm 1998, Robin s. L Taylor và g. H. Neil Towers đã cô lập được ba sesquiterpen lacton có hoạt tính kháng khuẩn là 6-O-methylacrylylplenolin (12), 6O-isobutyroylplenolin (13), 6-O-angeloylplenolin (14).[8] Năm 2007, Heng-Xing Liang và cộng sự đã cô lập được được các sesquiterpen lacton là 12,8β-olid (15), 4,5β-dihydroxy-2β-(isobutyryloxy)-10βH-guai-11(13)-en4-hydroxy-1βH-guaia-9,11(13)-dien-12,8α-olid (16), 2β- (isobutyryloxy)florilenalin (17), pulchellin-2α-O-tiglat (18), florilenalin-2α-O-tiglat (19).[6] 8 Khoá luận tốt nghiệp Trần Thị Loan Năm 2012, Peng Wu và các cộng sự đã cô lập được các chất sau: 4-oxo-2bhydroxy-6a-angeloyloxy-pesudoguaia-8b,12-olid (20), 4-oxo-2b-ethoxy-6a- angeloyloxy-pesudoguaia-8b, 12-olid (21), 4,6a-dihydroxy-2a -angeloyloxypesudoguaia-11(13)-en-8a,12-olid (22), 4-hydroxy-2a-angeloyloxy-pesudoguaia11(13)-en-8a,12-olid (23), 4,5-epoxy-2a-angeloyloxy-guaia-11(13)-en-8b,12-olid (24), 4,5-epoxy-2a-isobutyryloxy-guaia-11(13)-en-8b,12-olid (25), plenolin (26), arnicolid D (27), pulchellin-2a-O-isovalerat (28), florilenalin-2a-O-isovalerat (29), florilenalin-2a-O-isobutyrat (30), florilenalin-2a-O-angelat (31) và helenalin (32). [10] 9 Khoá luận tốt nghiệp Trần Thị Loan 10 Khoá luận tốt nghiệp Trần Thị Loan CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi chọn khảo sát cao ethyl acetate của cây cỏ the được thu hái tại tỉnh Vĩnh Long vào tháng 07 năm 2013. Cây được nhận danh tên khoa học bởi TS. Hoàng Viê ̣t, khoa Sinh, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. Thực hiện sắc kí cột cao ethyl acetate với chất hấp phụ silica gel, ṣ dụng hệ dung môi giải ly n-hexane-ethyl acetate với độ phân cực tăng dần, thu được 5 phân đoạn (được ký hiệu từ A1 đến A5). Do giới hạn về thời gian, chúng tôi chỉ khảo sát phân đoạn A4. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp cô lập các hợp chất Để cô lập các hợp chất hữu cơ, trong đề tài này đã dùng các phương pháp sắc ký, bao gồm sắc ký lớp mỏng silica gel, sắc ký lớp mỏng pha đảo RP-18, sắc ký lớp mỏng silica gel điều chế, sắc ký cột silica gel, sắc ký cột pha đảo RP-18. 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học các hợp chất cô lập được là dùng các phương pháp quang phổ hiện đại, bao gồm phổ khối lượng phân giải cao, phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1D-NMR và 2D-NMR). 2.3.Thực nghiệm 2.3.1. Các điều kiện thí nghiệm Dung môi dùng trong sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng là n-hexane, chloroform, methanol, n-buthanol, ethyl acetate. Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) và bản mỏng tráng sẵn RP-18 F 254 (Merck). Các chất trên bản mỏng được phát hiện bằng đèn UV hoặc dùng dung dịch H 2SO4. Bản mỏng sau khi khai 11 Khoá luận tốt nghiệp Trần Thị Loan triển bằng hệ dung môi giải ly thích hợp được phun đều dung dịch H 2SO4 25%, sấy khô và sấy nóng từ từ cho đến khi hiện màu. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được ghi trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer (tần số 500 MHz đối với phổ 1H-NMR và 125 MHz đối với phổ 13CNMR) với TMS là chất nội chuẩn, CD3OD và C5D5N là dung môi. Khối phổ phân giải cao đo trên máy Bruker MicroTOF-QII. 2.3.2. Điều chế các loại cao và cô lập các hợp chất trong cao ethyl acetate 2.3.2.1. Điều chế các loại cao Cây tươi sau khi thu hái về được ṛa sạch và sấy ở 60 0C cho đến khi khối lượng không đổi, sau đó mẫu nguyên liệu được xay nghiền thành bột thô thu được 3,3 kg. Đun hoàn lưu 3,2 kg bột thô với dung môi methanol (3 lần x 3 giờ), lọc nóng, cô quay ở áp suất thấp, thu hồi dung môi được cao methanol. Chiết phân bố lỏng - lỏng cao methanol này lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần là: eter dầu hoả, ethyl acetate và n-buthanol. Cô quay các dịch chiết, thu được các loại cao: cao eter dầu hỏa (320,2 gam), cao ethyl acetate (36,5 gam), cao n-buthanol (13,6 gam). Quy trình điều chế các loại cao được trình bày trong sơ đồ 2.1. Thu suất các loại cao được trình bày trong bảng 2.1. Bảng 2.1. Khối lượng của các loại cao và thu suất so với bột mẫu nguyên liệu ban đầu Bột thô cây cỏ the (3,20 kg) Thu suất (%) Loại cao Khối lượng (g) Methanol 412,5 12,89 Eter dầu hỏa 320,2 10,01 Ethyl acetate 36,5 1,14 n-Buthanol 13,6 0,43 (tính trên bột mẫu nguyên liệu) Bột cây khô (3,20 kg) - Đun hoàn lưu với MeOH (40 lít), 3 giờ x 3 lần, lọc nóng. 12 Cao methanol (412,5 g) - Cô quay đến - Chiết phân bố lỏng – lỏng với eter dầu hoả Khoá luận tốt nghiệp Trần Thị Loan Cô quay thu hồi dung môi Cao eter dầu hỏa (320,2g) Phần dịch còn lại (97,1g) - Chiết phân bố lỏng – lỏng với ethyl acetate Cô quay thu hồi dung môi Phần dịch còn lại (59,8 g) Cao ethyl acetate (36,5g) - Chiết phân bố lỏng – lỏng với buthanol bão hòa nước. - Cô quay thu hồi dung môi Cao n-butanol (13,6 g) ` Sơ đồ 2.1. Quy trình điều chế các loại cao 2.3.2.2. Cô lập các hợp chất trong cao ethyl acetate Tiến hành sắc ký cột silica gel trên cao ethyl acetate với hệ dung môi nhexane – ethyl acetate với độ phân cực tăng dần, mỗi lần thu 500 ml, cô quay thu hồi dung môi thu được năm phân đoạn tương ứng được ký hiệu từ A1 đến A5. Toàn bộ quá trình được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng, với thuốc tḥ hiện hình là dung dịch acid sulfuric 25% (phun đều lên bản mỏng silica gel và sấy nóng), hoặc phát hiện vết bằng đèn UV. Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate được trình bày trong bảng 2.2. Bảng 2.2. Kết quả sắc ký cột trên cao ethyl acetate (36,5 g) của cây cỏ the 13 Khoá luận tốt nghiệp Phân đoạn 1 2 3 4 5 Trần Thị Loan Ký hiệu A1 A2 A3 A4 A5 Khối lượng (g) 1,45 11,0 15,0 8,04 0,96 Cao ethyl acetate (36,5 g) - SKC (600 g silica gel). – n-hexane:EA (9:1; 8:2....); 100%MeOH Phân đoạn A1 (1,45Phân g) đoạn A2 (11,0 Phân g) đoạn A3 (15,0Phân g) đoạn A4 (8,04 g) đoạn A5 (0,96g) Phân Sơ đồ 2.2. Quy trình sắc ký cột silica gel trên cao ethyl acetate 2.3.2.3. Khảo sát phân đoạn A4 Thực hiện sắc ký cột phân đoạn A4 (8,04 g) trên silica gel pha thường, hệ dung môi giải ly chloroform-methanol, với độ phân cực tăng dần, dựa trên kết quả sắc ký lớp mỏng, gộp được năm phân đoạn và kí hiệu: CT-I, CT-II, CT-III, CT-IV và CT-V. Phân đoạn CT-V (1,49 g) chạy sắc ký cột trên silica gel pha thường với hệ chloroform-methanol (98:2), dựa trên sắc ký lớp mỏng gộp lại được năm phân đoạn (CT-V.1 đến CT-V.5). Phân đoạn CT-V.1 (0,13 mg) chạy sắc ký cột trên silica gel pha thường với hệ chloroform-acetone (8:2), dựa trên sắc ký lớp mỏng gộp lại được 2 phân đoạn CT-V.1.1 và CT-V.1.2. Thực hiện sắc ký cột CT-V.1.1 (75 mg) trên silica gel pha thường với hệ chloroform-acetone (6:4) thu được hợp chất CTC16 (6,41 mg). Phân đoạn A4 (8,04g) 14 SKC silica gel, CHCl3:MeOH (10:08:2) CT-I (2,56 g) CT-II (0,82 g) CT-III (1,79 g) CT-IV (1,38 g) CT-V (1,49 g) Khoá luận tốt nghiệp Trần Thị Loan SKC, CHCl3:MeOH (98:2) CT-V.1 (127 mg)CT-V.2 (167 g) CT-V.3 (210 g) CT-V.4 (475 g) CT-V.5 (511 g) SKC, CHCl3:Acetone (8:2) CT-V.1.1 (73 mg) CT-V.1.2 (49 mg) SKC, CHCl3:Acetone (6:4) CTC16 (6,41 mg) mg) Sơ đồ 2.3. Quy trình sắc ký cột silica gel phân đoạn A4 2.3.2.4. Khảo sát phân đoạn A2 Thực hiện sắc ký cột phân đoạn A2 (11,0 g) trên silica gel pha thường, hệ CHạ 22Cl Phân Phân CH đo nC n l2:Me :Me 2 OH:H OH: CT-IX CT-X H2O 2O (1, 93g) (10:5 (14: 6:1) :1) dung môi giải ly n-hexane-ethyl acetate-methanol (7:1:5 giọt), dựa trên kết quả sắc ký lớp mỏng, gộp được bốn phân đoạn và kí hiệu: CT-V.1, CT-V.2, CT-V.3 và CTV.4. 15 CT-V.2 CT- Khoá luận tốt nghiệp Trần Thị Loan Phân đoạn CT-V.2 (0,52 g) chạy sắc ký cột trên silica gel pha thường với hệ nhexane-chloroform (1:1), dựa trên sắc ký lớp mỏng gộp lại được hai phân đoạn (CT-V.2.1 và CT-V.2.2). Phân đoạn CT-V.2.2 (82 mg) được thực hiện sắc ký lớp mỏng điều chế khai triển nhiều lần trên bản silica gel, với hệ dung môi giải ly là hỗn hợp n-hexanechloroform (1:1), thu được hợp chất CTT2 (5,0 mg). Phân đoạn A2 (11,0 g) SKC silica gel, n-hexane:EA:MeOH (7:1:5 giọt) CT-V.1 (3,06 g)CT-V.2 (0,52 g) CT-V.3 (4,17 g)CT-V.4 (2,28 g) SKC silica gel, n-hexane:CHCl3 (1:1) CT-V.2.1 (103 mg)CT-V.2.2 (82 mg) SK lớp mỏng, n-hexane:CHCl3 (1:1) CTT2 (5,0 mg) Sơ đồ 2.4. Quy trình sắc ký cột silica gel phân đoạn A4 16