Tài liệu Khảo sát thành phần hóa học cây đại bi (blumea balsamifera) họ cúc (asteraceae)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -----o0o----- NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY ĐẠI BI (BLUMEA BALSAMIFERA) HỌ CÚC (ASTERACEAE) Chuyên ngành: Hóa Lý Thuyết và Hóa Lý Mã số: 604431 LUẬN VĂN THẠC SỸ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ THANH MAI Tp.Hồ Chí Minh – 2010 Con xin chân thành cảm ơn Bố, Mẹ đã sinh con ra, nuôi nấng, dạy dỗ con và đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để con theo đuổi và hoàn thành khóa học. Đặc biệt xin kính tặng thành quả này cho Mẹ của con, Mẹ đã giúp đỡ, lo lắng cho con rất nhiều trong suốt thời gian con đi học và kể cả lúc con đi làm, lập gia đình riêng. Xin cảm ơn công ơn sinh thành và nuôi dưỡng của Bố Mẹ Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến hai cô hướng dẫn, Cô Nguyễn Thị Thanh Mai và Cô Nguyễn Anh Thy đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ em rất nhiều về vật chất, về tinh thần, đã truyền đạt rất nhiều kinh nghiệm quý báu cho em. Xin chân thành cảm ơn Thầy Nguyễn Trung Nhân đã giúp đỡ, chỉ bảo, đóng góp nhiều ý kiến để hoàn thiện quyển luận văn, cảm ơn Thầy đã cho em mượn dụng cụ trong suốt quá trình làm thực nghiệm. Trong quá trình làm đề tài em cũng đã nhận được nhiều sự giúp đỡ của các Thầy Cô trong khoa hóa và bộ môn hóa lý. Xin cảm ơn Thầy Tôn Thất Quang đã chỉ bảo những kinh nghiệm giải phổ. Cảm ơn Cô Hồ Thị Cẩm Hoài đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi trong quá trình em làm thực nghiệm ở phòng Hóa Lý Hữu Cơ. Xin gửi lời cảm ơn đến lãnh đạo trường CĐ GTVT III, nơi tôi đang công tác, đã hỗ trợ về mặt vật chất, cảm ơn các thầy cô, đồng nghiệp của tôi ở khoa cơ bản - cơ sở đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi về thời gian, động viên ủng hộ tinh thần tôi rất nhiều. Cảm ơn các em Nguyễn Xuân Hải, Vũ Năng An đã qua lại giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn. Xin cảm ơn em gái tôi đã động viên, giúp đỡ chị rất nhiều.Và sau cùng xin dành lời cảm ơn đến người Thầy, người bạn đời của tôi (giờ đang đi học ở xa) đã giúp tôi tìm kiếm tài liệu và có những chỉ dẫn quý báu trong việc hoàn thành quyển luận văn này. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ MỞ ĐẦU 1. TỔNG QUAN 1.1 Mô tả thực vật .......................................................................................... 1 1.1.1 Tên gọi............................................................................................ 1 1.1.2 Mô tả thực vật................................................................................. 1 1.1.3 Phân bố sinh thái ............................................................................ 4 1.1.4 Tính vị và công năng ...................................................................... 4 1.2 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ....... 6 1.3 Hoạt tính ức chế enzym XO (Xanthine oxidase)................................. 16 1.3.1 Enzym XO .................................................................................... 16 1.3.2 Vai trò enzym XO trong bệnh gút và các bệnh lý khác ............... 16 1.3.3 Triệu chứng bệnh gút.................................................................... 18 1.3.4 Điều trị bệnh gút........................................................................... 19 2. NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 21 2.1 Giới thiệu chung .................................................................................... 21 2.2 Biện luận và kết quả ............................................................................. 21 2.2.1 Khảo sát phổ của hợp chất (1) .................................................. 23 2.2.2 Khảo sát phổ của hợp chất (2) .................................................. 27 2.2.3 Khảo sát phổ của hợp chất (3) .................................................. 30 2.2.4 Khảo sát phổ của hợp chất (4) .................................................. 34 2.2.5 Khảo sát phổ của hợp chất (5) .................................................. 37 2.2.6 Khảo sát phổ của hợp chất (6) .................................................. 40 2.2.7 Khảo sát phổ của hợp chất (7) .................................................. 44 2.3 Kết quả thử hoạt tính enzym XO ......................................................... 47 2.3.1 Hoạt tính ức chế enzym XO của các mẫu cao thô........................ 47 2.3.2 Hoạt tính ức chế enzym XO của các phân đoạn từ cao EtOAc.... 48 2.3.3 Hoạt tính ức chế enzym XO của các phân đoạn từ cao CHCl3 .... 49 2.3.4 Hoạt tính ức chế enzym XO của các hợp chất cô lập................... 50 3. THỰC NGHIỆM ........................................................................................... 53 3.1 Điều kiện thực nghiệm........................................................................... 53 3.2 Ly trích cao thô ...................................................................................... 54 3.3 Quá trình cô lập ..................................................................................... 56 3.3.1 Cao CHCl3 .............................................................................. 56 3.3.2 Cao EtOAc .............................................................................. 58 3.4 Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym XO.......................................... 60 3.4.1 Nguyên tắc ............................................................................. 60 3.4.2 Chuẩn bị hóa chất.................................................................... 60 3.4.3 Chuẩn bị mẫu .......................................................................... 62 3.4.4 IC50 và cách xác định ........................................................................62 4. KẾT LUẬN...............................................................................................................64 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT s : Singlet, mũi đơn d : Doublet, mũi đôi dd : Doublet of doublet, mũi đôi đôi J : Coupling constant, hằng số ghép spin SKC : Sắc ký cột NMR : Nuclear Magnetic Resonance (cộng hưởng từ hạt nhân) DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation BHA : Butylated hydroxyanisole BHT : Butylated hydroxytoluene DPPH : 2,2-Diphenyl-1- picryhydrazyl CHCl3 : Cloroform MeOH : Metanol DMSO : Dimetyl sulfoxid EtOAc : Etyl acetat ROIs : Reactive oxygen intermediates XO : Xanthine Oxidase I : Inhibitory (ức chế) IC50 : Inhibitory concentration (nồng độ ức chế 50%) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1- Thành phần hóa học của lá cây đại bi................................................... 15 Bảng 2.1 - Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13 C-NMR (125 MHz) và tương quan HMBC của hợp chất (1) trong dung môi DMSO-d6 .......................... 25 Bảng 2.2 - So sánh phổ 13C-NMR của hợp chất (1) trong dung môi DMSO-d6 và hợp chất quercetin 3,7,3’- trimetyl eter trong dung môi DMSO-d6 .............. ............................................................................................................ 26 Bảng 2.3 - Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13 C-NMR (125 MHz) và tương quan HMBC của hợp chất (2) trong dung môi CDCl3 và CD3OD.............. 28 Bảng 2.4 - So sánh phổ 1H-NMR của hợp chất (2) trong dung môi CDCl3 và CD3OD và hợp chất quercetin-3,3’,4’-trimetyl eter trong dung môi CCl4 và C6D6 .......................................................................................................... 29 Bảng 2.5 - Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13 C-NMR (125 MHz) và tương quan HMBC của hợp chất (3) trong dung môi DMSO-d6........................... 32 Bảng 2.6 - So sánh phổ 1H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất (3) trong dung môi DMSO-d6 và hợp chất 5,7,3’,5’-tetrahydroxyflavanon trong dung môi DMSO-d6 ............................................................................................ 33 Bảng 2.7 - Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13 C-NMR (125 MHz) và tương quan HMBC của hợp chất (4) trong dung môi CDCl3 và CD3OD............. 35 Bảng 2.8 - So sánh phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất (4) trong dung môi CDCl3 và CD3OD và hợp chất dihydroquercetin-7,4’-dimetyl eter trong dung môi DMSO-d6 . .......................................................................................... 36 Bảng 2.9 - Số liệu phổ 1H-NMR (400 MHz), 13 C-NMR (100 MHz) và tương quan HMBC của hợp chất (5) trong dung môi DMSO-d6........................... 38 Bảng 2.10 - So sánh phổ 13C-NMR của hợp chất (5) trong dung môi DMSO-d6 và hợp chất dihydroquercetin trong dung môi DMSO-d6 ............................. 39 Bảng 2.11 - Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13 C-NMR (125 MHz) và tương quan HMBC của hợp chất (6) trong dung môi CDCl3 và CD3OD...... .......................................................................................................... 42 Bảng 2.12 - So sánh phổ 1H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất (6) trong dung môi CDCl3 và CD3OD và hợp chất (2R,3R)-4’-O-metyldihydroquercetin trong dung môi aceton - d6 .............................................................. 43 Bảng 2.13 - Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13 C-NMR (125 MHz) và tương quan HMBC của hợp chất (7) trong dung môi CDCl3 và CD3OD...... ......................................................................................................... 45 Bảng 2.14 - Kết quả hoạt tính ức chế enzym XO của các mẫu cao thô ................ 47 Bảng 2.15 - Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym XO từ các phân đoạn cao EtOAc.. ............................................................................................................ 48 Bảng 2.16 - Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym XO từ các phân đoạn cao CHCl3.. ............................................................................................................ 49 Bảng 2.17 - Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym XO của các hợp chất (3), (4), (6) và (7) ..................................................................................................... 51 Bảng 2.18 - Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym XO của hợp chất (6) và (7). ..... 51 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 - Cây đại bi ............................................................................................... 2 Hình 1.2 - Hoa cây đại bi......................................................................................... 3 Hình 1.3 - Công thức cấu tạo của cryptomeridiol ................................................... 6 Hình 1.4 - Công thức cấu tạo các sesquiterpen ....................................................... 7 Hình 1.5 - Công thức cấu tạo của 5-hydroxy-7-metoxychromon ........................... 8 Hình 1.6 - Công thức cấu tạo của 5-hydroxy-3,7,3’,4’-tetrametoxyflavon ............ 8 Hình 1.7 - Công thức cấu tạo của (2R,3R)-3,5,3’-trihydroxy-7,4’- dimetoxydihydroflavonol ............................................................. 8 Hình 1.8 - Công thức cấu tạo của 3-O-7’’-biluteolin .............................................. 9 Hình 1.9 - Công thức cấu tạo của dihydroflavonol ............................................... 11 Hình 1.10 - Công thức cấu tạo của 2 ester sesquiterpenoid .................................. 13 Hình 1.11- Các flavonoid cô lập từ cây đại bi và giá trị IC50 của chúng .............. 14 Hình 1.12 - Công thức cấu tạo của luteolin........................................................... 14 Hình 1.13 - Tinh thể urat đóng ở các khớp xương của người mắc bệnh gút......... 19 Hình 1.14 - Tổn thương ở tay của người mắc bệnh gút ........................................ 19 Hình 2.1 - Công thức cấu tạo của hợp chất (1)...................................................... 23 Hình 2.2 - Một số tương quan HMBC của hợp chất (1) ....................................... 24 Hình 2.3 - Công thức cấu tạo hợp chất (2) ............................................................ 27 Hình 2.4 - Một số tương quan HMBC của hợp chất (2) ....................................... 28 Hình 2.5 - Công thức cấu tạo hợp chất (3) ............................................................ 30 Hình 2.6 - Hóa học lập thể của C-2 và C-3 trong hợp chất (3) ............................. 31 Hình 2.7 - Một số tương quan HMBC của hợp chất (3) ....................................... 32 Hình 2.8 - Công thức cấu tạo hợp chất (4) ............................................................ 34 Hình 2.9 - Một số tương quan HMBC của hợp chất (4) ....................................... 35 Hình 2.10 - Công thức cấu tạo của hợp chất (5). .................................................. 37 Hình 2.11 - Một số tương quan HMBC của hợp chất (5). .................................... 38 Hình 2.12 - Công thức cấu tạo của hợp chất (6). .................................................. 40 Hình 2.13 - Hóa học lập thể của C-2 và C-3 trong hợp chất (6). .......................... 41 Hình 2.14 - Một số tương quan HMBC của hợp chất (6). .................................... 41 Hình 2.15 - Công thức cấu tạo của hợp chất (7) ................................................... 44 Hình 2.16 - Hóa học lập thể của C-2 và C-3 trong hợp chất (7) ........................... 45 Hình 2.17- Một số tương quan HMBC của hợp chất (7) ...................................... 46 Hình 2.18 - Đồ thị biểu diễn phần trăm ức chế (%I) enzym XO theo nồng độ của các cao....................................................................................................... 47 Hình 2.19 - Đồ thị biểu diễn phần trăm ức chế (%I) enzym XO theo nồng độ của các phân đoạn F2, F3, F4, F5 và F6 từ cao EtOAc................................... 49 Hình 2.20 - Đồ thị biểu diễn phần trăm ức chế (%I) enzym XO theo nồng độ của các phân đoạn F2, F3 và F4 từ cao CHCl3 ............................................ 50 Hình 2.21 - Đồ thị biểu diễn phần trăm ức chế (%I) enzym XO theo nồng độ của các hợp chất (3), (4), (6) và (7) ................................................................. 52 Hình 3.1 - Phản ứng tạo acid uric.......................................................................... 60 Hình 3.2 - Công thức cấu tạo của allopurinol ....................................................... 62 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1 - Quá trình oxy hóa của hypoxanthine và xanthine bằng xúc tác XO... 16 Sơ đồ 1.2 - Tác nhân oxy hóa trung gian (ROIs) và sự tấn công lên các phân tử sinh học.................................................................................................... 17 Sơ đồ 3.1 - Quy trình ly trích các cao từ cây đại bi ............................................... 55 Sơ đồ 3.2 - Quy trình cô lập hợp chất (1) và (2) từ cao CHCl3 ............................ 57 Sơ đồ 3.3 - Quy trình cô lập hợp chất (4 ) từ cao CHCl3 ...................................... 58 Sơ đồ 3.4 - Quy trình cô lập hợp chất (3), (6), (7) từ cao EtOAc......................... 59 Sơ đồ 3.5 - Quy trình cô lập hợp chất (5) từ cao EtOAc ....................................... 59 Sơ đồ 3.6 - Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym XO.......................................... 61 MỞ ĐẦU Việt Nam là một nước nhiệt đới có hệ động thực vật phong phú và đa dạng, đặc biệt là có nhiều cây cỏ với dược tính quý giá. Từ ngàn đời, nhân dân ta đã biết vận dụng những dược tính từ nguồn dược liệu tự nhiên trong phòng ngừa và điều trị những bệnh thông thường cho đến những bệnh nan y. Với ưu điểm ít tác dụng phụ đi kèm, những bài thuốc từ thảo mộc vẫn chiếm ưu thế đáng kể trong thời đại Tây y phát triển như hiện nay. Ngày nay, cùng với việc nghiên cứu ly trích các hoạt chất có dược tính từ các nguồn dược thảo để bào chế thành các chế phẩm có hàm lượng hoạt chất cao nhằm đáp ứng và nâng cao hiệu quả trong điều trị bệnh, các nhà khoa học vẫn không ngừng khảo sát và nghiên cứu thành phần hoá học của nguồn tài nguyên thiên nhiên quý giá này, nhằm tìm tòi phát hiện những tính năng mới có thể ứng dụng trong y học. Cây đại bi (Blumea balsamifera) từ lâu đã được biết đến như là một thần dược trong chữa trị bệnh ho, viêm họng, đau lưng, thấp khớp, xông hơi giải cảm. Ngoài ra, cây đại bi còn có đặc tính chữa bệnh viêm nhiễm, viêm gan... Bên cạnh đó, thử nghiệm trên khả năng ức chế enzym XO, enzym đóng vai trò quan trọng trong việc gây ra bệnh gút, cho kết quả rất khả quan... Điều này đã thôi thúc chúng tôi mong muốn tìm hiểu thêm về thành phần hóa học của cây đại bi, nhằm góp phần đi sâu vào ứng dụng trong chữa trị căn bệnh thời đại phổ biến hiện nay - bệnh gút. PHẦN TỔNG QUAN 9 CHƯƠNG 1: PHẦN TỔNG QUAN 1.1- Giới thiệu các hợp chầt Phenol và dẫn xuất. Phenol có nhiều dẫn xuất phụ thuộc vào nhóm thế gắn lên vòng hương phương của Phenol. Các dẫn xuất họ Phenol vừa do các phản ứng phân huỷ của thực vật, các hợp chất hữu cơ có trong tự nhiên , vừa do hoạt động sản suất của các nhà máy tạo ra. Theo Tổ chức bảo vệ môi trường của Mỹ - ( EPA ) [ 24] hiện có 11 hợp chất Phenol gây ô nhiễm môi trường chủ yếu hiện nay là: 4-Cloro-3-Methylphenol, 2Clorophenol, 2,4-Diclorophenol, 2,4-Dimethylphenol, 2,4-Dinitrophenol, 2-Methyl4,6-Dinitrophenol, 2-Nitrophenol, 4-Nitrophenol, Pentaclorophenol, 2,4,6- Triclorophenol và Phenol. Ngoài ra, còn nhiều dẫn xuất họ Phenol khác như : Pyrocatechol, Resorcinol, 3-NitroPhenol, 1,3-Diclorophenol, 2,3,4,6-Tetraclorophenol …. Các dẫn xuất họ Phenol đều rất độc, chỉ một lượng rất nhỏ trong nước ( > 1 ppb ) cũng đã ảnh hưởng rất lớn đến sức khoẻ của con người cũng như các loài sinh vật sống trong môi trường nước. Khi nồng độ của Phenol và các dẫn xuất nhỏ hơn 1 ppb tuy có độc tính thấp cũng ảnh hưởng nhiều đến mùi vị, màu sắc của nước và đời sống của các loài sinh vật trong nước. 1.1.1- Tính chất vật lí và tính chất hóa học của các hợp chất Phenol[1-2,24] 1.1.1.1- Tính chất vật lí của các hợp chất Phenol. Phenol có công thức phân tử là C6H5OH. Đa số các hợp chất Phenol tồn tại dạng rắn ở nhiệt độ phòng như Phenol, Nitrophenol, các dẫn xuất Clorophenol ( gồm 2 nhóm thế –Cl trở lên) …, một số hợp chất Phenol khác tồn tại ở dạng lỏng như Cresol, mono-Clorophenol ( gồm chỉ một nhóm thế –Cl ). Bảng 1.1: Tính chất vật lí của một vài hợp chất Phenol. Khối STT Công thức lượng phân tử phân tử Tính tan Trạng thái vật lý Điểm Điểm trong chảy sôi nước (20oC) 10 OH 1 94 chất lỏng hoặc chất rắn 43oC 181oC 9.3g/100g - C6H5OH Phenol OH 2 OH 110,1 chất rắn màu vàng 110oC 182oC 110,1 chất rắn màu trắng 105oC 245.5oC 43g/100g 139,11 tinh thể màu vàng 114oC 279.0oC - C6H4(OH)2 Resorcinol OH OH 3 C6H4(OH)2 Pyrocatechol OH 4 NO2 C6H5NO3 p-nitrophenol 1.1.1.2- Tính Chất Hoá Học Của Các Hợp Chất Phenol Phenol là dẫn xuất của Hydrocarbon thơm do sự thế một nguyên tử -H trong nhân bằng một nhóm -OH. Tuỳ theo các nhóm thế gắn lên vòng hương phương của Phenol mà có các dẫn xuất khác nhau. Hầu hết các hợp chất Phenol đều có tính acid. 11 Các nhóm thế thường được gắn lên vòng hương phương của Phenol là: nhóm –Nitro, nhóm – Methyl hoặc nhóm –Cloro …. Vòng hương phương của Phenol có thể gắn đồng thời nhiều nhóm thế giống nhau hoặc khác nhau. Một vài loại phản ứng mà các hợp chất Phenol thường tham gia : - Phản ứng Eter hoá. OH -H O- CH3Cl O-CH3 Phenol PhenylMetyl Eter - Phản ứng Ester hoá. OH CH3-CO-Cl Phenol OOC-CH3 + HCl Phenylacetate - Phản ứng tạo thành muối trong môi trường kiềm. OH + OH- O- Phenol + H2O Ion Phenolate - Phản ứng trên vòng hương phương như phản ứng Nitro hoá, Halogen hoá, Alkil hoá, Sulfon hóa …. Phản ứng Nitro hoá: MonoNitro hóa Phenol có thể thực hiện với acid Nitric loãng tại nhiệt độ phòng. NO2 OH Phenol HNO3 OH O-Nitrophenol 12 Với acid Nitric đậm đặc, sự đa Nitro hóa Phenol tạo thành 2,4,6Trinitrophenol. NO2 HNO3đđ O 2N OH OH NO2 Phenol 2,4,6-Trinitrophenol Phản ứng Halogen hóa: Phenol dễ dàng cho phản ứng trí hoán với nước brom ở vị trí orto và para để tạo trầm hiện màu trắng là 2,4,6-Tribromophenol. Đây cũng là phản ứng biểu tánh thông dụng để nhận biết Phenol. Br + 3 Br2 ( H2O ) OH Br OH Br Phenol 2,4,6-Tribromophenol Phản ứng Alkil hoá: Phenol phản ứng với halogenur alkil với xúc tác là AlCl3 hoặc AlBr3 OH CH3 CH3Cl / AlCl3 + HCL OH o-Methylphenol Phenol Phản ứng Sulfon hóa: Phenol dễ dàng cho phản ứng sulfon hoá tạo thành sản phẩm trí hoán orto hoặc para. Sản phẩm chính tuỳ thuộc vào điều kiện nhiệt độ phản ứng. SO3H 250C OH Phenol OH o-Sulfonphenol H2SO4 đđ , 100 0C H2SO4 đđ 1000C HO3S OH p-Sulfonphenol 13 Phản ứng Oxid hoá. Các hợp chất Phenol dễ bị Oxid hoá tạo thành các hợp chất Quinon như Benzoquinon. Tác nhân Oxid hoá có thể là Oxi trong không khí. OH Phenol O2 O O + H2 O Benzoquinon 1.1.2- Nguồn gốc, độc tính, ảnh hưởng, liều lượng cho phép của Phenol và dẫn xuất trong môi trường nước .[9 – 10, 23 – 28, 38 ] 1.1.2.1- Nguồn gốc, độc tính và ảnh hưởng của các hợp chất Phenol và dẫn xuất. Phenol và dẫn xuất có trong các ngành công nghiệp như dệt, nhuộm, nhựa, thuốc, thuốc trừ sâu, chất chống oxi hoá, giấy, công nghệ dầu hoả …. Ngoài ra, hợp chất Phenol cũng được sinh ra tự nhiên như sự phân hủy của thực vật, các hợp chất hữu cơ …. Hầu hết các hợp chất Phenol khi được thải rửa từ các nhà máy đều đi vào môi trường nước. Chúng không những gây ô nhiễm môi trường sinh thái mà còn gây hại đến con người và các loài sinh vật sống trong nước. Con người nếu tiếp xúc trong thời gian dài với các hợp chất Phenol có thể bị bệnh ung thư. Các kết quả nghiên cứu [ 38 ] cho thấy Phenol và dẫn xuất có độc tính cao. Giá trị LC50 ( nồng độ gây chết 50 % số cơ thể người hay động vật khi cơ thể đó được đưa vào một lượng nhất định chất độc ) và EC50 ( nồng độ gây hại 50 % quần thể trong điều kiện thực nghiệm quan sát rõ ràng ) đối với giáp xác và cá vào khoảng 3 – 7 mg/l. Những ảnh hưởng chính đến cơ thể con người gồm tác động đến tim, gây đau hệ hô hấp, gây nhiễm acid trong quá trình trao đổi chất, hỏng thận, sự tuần hoàn máu, ảnh hưởng hệ thần kinh…. Liều thấp nhất có thể gây tử vong bằng đường tiêu hoá là khoảng 4.8 g và trong thời gian không quá 19 phút. Những triệu chứng do hít phải Phenol như chán ăn, giảm cân, nhức đầu, chóng mặt…. Các hợp chất Phenol rất dễ bị phân hủy khi để ở nhiệt độ phòng, trong môi trường tự nhiên ( từ vài ngày đến một tuần ) và phân huỷ rất nhanh dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời. Do vậy, trong quá trình xác định hay cất trữ, các hợp chất 14 Phenol cần được bảo quản trong bình chứa xẫm màu, để trong môi trường kín và có nhiệt độ nhỏ hơn 4oC. 1.1.2.2- Hàm lượng cho phép của Phenol và dẫn xuất trong nước. Bảng 1.2: Giá trị giới hạn cho phép của tổng nồng độ Phenol và dẫn xuất Hàm lượng Phenol tổng Đối tượng (mg/l) Nước sinh hoạt Nước bề mặt 0.001 mg/l Nước dùng cho nông nghiệp và nuôi trồng thủy 0.02 mg/l sản Nước ngầm 0.001 mg/l Đổ vào các khu vực dùng làm nguồn nước cấp cho ≤ 1 mg/l sinh hoạt Nước thải Dùng làm nguồn nước tưới tiêu, bơi lội, nuôi ≤ 2 mg/l trồng thủy sản Không được phép đổ ra môi trường ≥ 5 mg/l Theo điều luật 80/778/EC do cộng đồng Châu Âu ban hành thì hàm lượng Phenol tổng cộng được phép hiện diện trong nước uống là 0.5 μg/l và 0.1 μg/l cho mỗi chất 1.2- Một sồ phương pháp được dùng để xác định các hợp chất Phenol. 1.2.1- Phương pháp sắc kí [3-4, 8, 12, 17– 37 ] 1.2.1.1- Nguyên tắc. Sắc ký là một kỹ thuật tách những hỗn hợp gồm nhiều chất thành các thành phần đơn giản và định lượng từng chất. Dựa vào ái lực của các cấu tử với pha động và pha tĩnh. Pha động có thể là chất lỏng hoặc khí có tác dụng lôi kéo các chất cần tách di chuyển trong cột sắc ký 15 có chứa pha tĩnh. Pha tĩnh là chất được phủ trên bề mặt bên trong của cột mao quản hoặc là những hạt nhỏ được nhồi vào cột có tác dụng giữ chất cần phân tích ở lại. Để tách được các chất từ một hỗn hợp cần có sự tác động của cả pha tĩnh và pha động. Sự tác động này đối với từng chất khác nhau do đó chất cần phân tích có thể ra nhanh hay chậm. Ngoài ra cột sắc ký phải đủ dài để sự tiếp xúc giữa chất cần xác định và pha tĩnh được lặp lại nhiều lần. Quá trình di chuyển của pha động bên trong cột sắc ký gọi là quá trình rửa giải. 1.2.1.2- Phương pháp sắc ký khí với đầu dò khối phổ (GC-MS) Dẫn xuất t-butyldimethylsilyl giữa các chất họ Phenol với N-(tbutyldimethylsilyl) - N- methyl-trifluoroacetamid được xác định bằng phương pháp sắc ký khí với đầu dò khối phổ bẫy ion (IT-MS). Ở chế độ tiêm không chia dòng, 2μL mẫu xác định được cho vào cột DB-5 MS 30 m × 0.25 μm cùng với chương trình nhiệt thích hợp cho phép xác định 11 hợp chất Phenol trong nước sông và nước biển ở giới hạn phát hiện từ 0.010 μg/l đến 0.045 μg/l. Tuy nhiên, phương pháp này không cho phép xác định 2,4-Dinitrophenol và hợp chất methyl Phenol ở hàm lượng vết. 1.2.1.3- Phương pháp sắc ký lỏng với dầu dò khối phổ (LC-MS) Các hợp chất Phenol thường được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao theo cơ chế sắc ký phân bố pha đảo. 15 hợp chất họ Phenol trong nước và bùn được xác định bằng phương pháp LC-MS ở chế độ ion hóa hóa học tại áp suất thường (APCI) dưới dạng ion âm. Với chương trình gradient dòng thích hợp cho pha động gồm Metanol, Acetonitrin, acid Acetic 0.005%, việc tách và định lượng đồng thời 15 hợp chất Phenol được tiến hành ở chế độ quét chọn lọc ion (SIM). Phương pháp này có ưu điểm là cho phép nhận danh chính xác các hợp chất Phenol nhờ đầu dò khối phổ, giới hạn phát hiện thấp trong khoảng từ 10-50 ng/l. Tuy nhiên thiết bị phân tích lại đắc tiền. 1.2.1.4- Phương pháp sắc ký lỏng với đầu dò UV o-Cresol, m-Cresol, Phenol, Resorcinol, Cathechol và Hidroquinon trong nước tham gia phản ứng tạo dẫn xuất với Benzoyl clorua trong vòng 15 phút. Các dẫn xuất Benzoyl này được chiết bằng dung môi Diethylether, sau đó được xác định 16 bằng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo ở bước sóng 232 nm với pha động gồm Acetonitrin-Tetrahydrofuran-nước (54:6:40,v:v:v). Phương pháp đơn giản này cho phép xác định hàm lượng Phenol trong rượu và nước uống với giới hạn phát hiện từ 0.05 đến 0.50 μg/l, hiệu suất thu hồi trong khoảng 81 - 94%, độ lập lại của phương pháp cao, thời gian phân tích ngắn. 1.2.1.5-. Phương pháp sắc ký lỏng với đầu dò điện hóa Đầu dò điện hóa là một trong những đầu dò rất chọn lọc do mỗi chất có khả năng oxi hóa hoặc khử tại mỗi thế khác nhau. Đầu dò điện hóa được ứng dụng rộng rãi vì chúng đơn giản, không đắt tiền. Tuy nhiên chúng có khuyết điểm là khó sử dụng, thời gian cân bằng rất dài, nhạy đối với tốc độ dòng và pH. Bề mặt điện cực dễ bị nhiễm bẩn nên cần hoạt hóa lại điện cực sau một thời gian ngắn sử dụng. Nguyên tắc hoạt động của đầu dò điện hóa là tại một giá trị thế áp thích hợp, quá trình oxi hóa hay khử của chất điện hoạt tại bề mặt điện cực làm việc sẽ sinh ra dòng điện. Dòng điện đó được sử dụng như tín hiệu phân tích và tín hiệu tỷ lệ trực tiếp với nồng độ chất điện hoạt đi qua đầu dò. Dòng điện sinh ra trong pin điện hóa được tính theo định luật Faraday: Q = nFN Q: Số Coulomb n: số điện tử bị mất đi hoặc nhận được. N: số phân tử chất phân tích F: 96500 C / 1 mol electron Đầu dò điện hóa có gồm ba điện cực: điện cực chỉ thị, điện cực so sánh và điện cực hỗ trợ. Thế làm việc được đo giữa điện cực chỉ thị và điện cực so sánh. Nhờ vào hoạt tính điện cực của các hợp chất Phenol, phương pháp sắc ký lỏng pha đảo với cột C18 và đầu dò điện hóa thường được sử dụng để xác định hàm lượng vết các chất họ Phenol bằng các loại điện cực khác nhau. Với thành phần pha động gồm dung dịch đệm có pH thích hợp và Acetonitrin hoặc Metanol, giá trị thế áp ở điện cực làm việc lớn hơn +1V, cho phép xác định hàm lượng vết của các hợp chất Phenol trong nước và trong thực phẩm. Các phương pháp này có ưu điểm là độ nhạy cao và ít chất gây nhiễu. 17