Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Giáo dục - Đào tạo Cao đẳng - Đại học Khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen ở 15 locus gen bằng hệ iden...

Tài liệu Khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen ở 15 locus gen bằng hệ identifiler từ quần thể người dân tộc nùng ứng dụng trong giám định adn​

.PDF
70
130
122

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LƢƠNG THỊ PHÚC KHẢO SÁT VÀ XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU TẦN SUẤT CÁC ALEN Ở 15 LOCUS GEN BẰNG HỆ IDENTIFILER TỪ QUẦN THỂ NGƢỜI DÂN TỘC NÙNG ỨNG DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH ADN LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC HÀ NỘI - NĂM 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LƢƠNG THỊ PHÚC KHẢO SÁT VÀ XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU TẦN SUẤT CÁC ALEN Ở 15 LOCUS GEN BẰNG HỆ IDENTIFILER TỪ QUẦN THỂ NGƢỜI DÂN TỘC NÙNG ỨNG DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH ADN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn: PGS, TS. Nguyễn Văn Hà HÀ NỘI - NĂM 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS Nguyễn Văn Hà - Phó giám đốc phụ trách Trung tâm Giám định Sinh học Pháp lý - Viện Khoa học hình sự -Bộ Công An là người thầy đã dẫn dắt, tạo mọi điều kiện giúp đỡ để tôi hoàn thành luận văn này. Đồng thời, tôi xin chân thành cảm ơn Trung tá Trịnh Tuấn Toàn – Phó Giám đốc Trung tâm Giám định Sinh học Pháp lý – Viện Khoa học hình sự và các thành viên trong dự án Xây dựng tàng thư gen tội phạm Quốc gia đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình làm luận văn. Tôi cũng gửi lời cảm ơn tới các cán bộ thuộc Trung tâm Giám định Sinh học Pháp lý – Viện Khoa học hình sự đã tạo điều kiện giúp đỡ về kỹ thuật và cơ sở vật chất cho tôi trong quá trình làm luận văn. Để hoàn thành luận văn này tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các giảng viên, CBCNV Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam đã tận tình truyền đạt kiến thức và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn thạc sĩ này. Hà nội ngày tháng Học viên Lƣơng Thị Phúc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn năm 2015 MỤC LỤC MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 5 1.1. Các phương pháp truy nguyên cá thể dùng trong Khoa học hình sự ........ 5 1.3. Mười lăm (15) locus gen hệ Identifiler trên các nhiễm sắc thể ................ 8 1.3.1 Các tiêu chuẩn cho locus STR dùng trong giám định ADN ................ 8 1.3.2. Ý nghĩa của cơ sở dữ liệu tần suất alen của các locus STR .............. 10 1.3.3. Cơ sở khoa học và thực tiễn của việc nghiên cứu đề tài ................... 11 1.4. Tình hình nghiên cứu và phát triển các bộ kit dùng trong giám định ADN nhân tế bào ............................................................................................. 12 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .................................................... 12 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ...................................................... 13 1.5. Dân tộc Nùng sinh sống trên lãnh thổ Việt Nam ..................................... 15 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................... 20 2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 20 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................... 20 2.1.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu .......................................... 20 2.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 22 2.2.1. Quy trình phân tích ADN .................................................................. 22 2.2.2. Xử lý thống kê số liệu và tính tần suất các locus gen ....................... 23 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ............................... 25 3.1. Phân tích kiểu gen của 15 locus gen từ 120 mẫu thu thập. ...................... 25 3.1.1 Kết quả thu, bảo quản mẫu và tách chiết ADN.................................. 25 3.1.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR, điện di và phân tích kiểu gen ...... 25 3.2. Tính tần suất của 15 locus gen từ 120 mẫu thu thập được ...................... 30 3.2.1. Kết quả tính tần suất các alen............................................................ 30 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 3.2.2. So sánh chỉ số kiểm định 2 giữa tính toán (2tt) với lý thuyết (2lt) và đánh giá sự phù hợp với định luật Hardy - Weinberg ............................ 30 3.2.3. So sánh tần suất alen của người Nùng với một số dân tộc ............... 31 3.3. Một số ví dụ về ứng dụng kết quả của đề tài trong công tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an .............................................. 47 KẾT LUẬN ........................................................................................................ 49 KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 51 PHỤ LỤC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN - Axit Deoxyribo Nucleic ARN - Axít ribonucleic A - Adenine T - Thymine G - Guanine C - Cytosine NST - Nhiễm sắc thể VNTR - Variable Number of Tandem Repeat - Các trình tự lặp ngắn STR - Short Tandem Repeat - Các trình tự lặp ngắn ID - Identifiler/Identify definition PCR - Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp FTA - Tên riêng của một vật mang thu mẫu máu (dạng thẻ) trong khoa học hình sự bp - Base pair KHHS - Khoa học hình sự Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU Hình vẽ Hình 3.1: Hình ảnh kiểu gen dạng peak từ mẫu ký hiệu N14 ............................. 27 Hình 3.2: Hình ảnh kiểu gen dạng peak từ mẫu ký hiệu N40............................. 28 Bảng biểu Bảng 3.2: So sánh 2TT và 2LT ............................................................................ 30 Bảng 3.3: Tần suất alen (%) của locus D8S1179................................................ 31 Bảng 3.4: Tần suất alen (%) của locus D21S11.................................................. 32 Bảng 3.5: Tần suất alen (%) của locus D7S820.................................................. 33 Bảng 3.6: Tần suất alen (%) của locus CSF1PO ................................................ 34 Bảng 3.7: Tần suất alen (%) của locus D3S1358................................................ 35 Bảng 3.8: Tần suất alen (%) của locus THO1 .................................................... 36 Bảng 3.9: Tần suất alen (%) của locus D13S317................................................ 37 Bảng 3.10: Tần suất alen (%) của locus D16S539.............................................. 38 Bảng 3.11: Tần suất alen (%) của locus D2S1338.............................................. 39 Bảng 3.12: Tần suất alen (%) của locus D19S433.............................................. 40 Bảng 3.13: Tần suất alen (%) của locus vWA .................................................... 41 Bảng 3.14: Tần suất alen (%) của locus TPOX .................................................. 42 Bảng 3.15: Tần suất alen (%) của locus D18S51................................................ 43 Bảng 3.16: Tần suất alen (%) của locus D5S818................................................ 44 Bảng 3.17: Tần suất alen (%) của locus FGA ..................................................... 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Viện Khoa học hình sự là một đơn vị đầu ngành của lực lượng kỹ thuật hình sự, một trung tâm khoa học của ngành Công an Việt Nam. Một trong những nhiệm vụ quan trọng của Viện Khoa học hình sự là công tác giám định phục vụ tố tụng hình sự, tố tụng dân sự và các yêu cầu cá nhân, trong đó nổi bật là lĩnh vực giám định ADN. Năm 2006 Viện Khoa học hình sự đã đưa vào ứng dụng hệ Identifiler (gồm 15 locus: D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, THO1, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818 và FGA) trong giám định ADN. Trong giám định ADN hình sự đòi hỏi bắt buộc phải tính xác suất một người ngẫu nhiên trong quần thể có cấu trúc di truyền trùng lặp với ADN của các mẫu vật giám định. Để tính toán được xác suất này thì phải có dữ liệu tần suất của từng alen [5]. Theo lý thuyết di truyền học, mỗi quần thể người (dân tộc) khác nhau có những đặc điểm di truyền đặc trưng, thể hiện bằng sự phân bố tần suất alen trong mỗi quần thể là khác nhau và không thể áp dụng cơ sở dữ liệu của quần thể này cho một quần thể khác. Do đó, bắt buộc phải tiến hành khảo sát tần suất các alen của các locus dùng trong giám định ADN hình sự đối với mỗi dân tộc để đảm bảo tính khoa học, chính xác và khách quan trong kết luận giám định. Việc khảo sát tần suất các alen của các locus đang sử dụng trong giám định ADN đối với các dân tộc trên toàn lãnh thổ Việt Nam là một việc làm mang tính cấp bách. Việt Nam có 54 dân tộc, trong đó dân tộc Kinh chiếm tỉ lệ lớn nhất (gần 90%) [1], còn lại là các dân tộc thiểu số. Tính đến năm 2014, Viện Khoa học 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn hình sự đã công bố bảng tần suất các alen hệ Identifiler đối với các dân tộc Kinh, H’mông, Tày và Khmer. Do điều kiện về cơ sở vật chất cũng như con người chưa đáp ứng được nên chưa thể tiến hành khảo sát tần suất alen cho tất cả các dân tộc. Theo Tổng điều tra dân số và nhà ở năm 2009, người Nùng ở Việt Nam có dân số 968.800 người, là dân tộc có dân số đứng thứ 7 tại Việt Nam, có mặt trên tất cả 63 tỉnh, thành phố. Người Nùng cư trú tập trung tại các tỉnh: Lạng Sơn (314.295 người, chiếm 42,9% dân số toàn tỉnh và 32,4% tổng số người Nùng tại Việt Nam), Cao Bằng (157.607 người, chiếm 31,1% dân số toàn tỉnh và 16,3% tổng số người Nùng tại Việt Nam), Bắc Giang (76.354 người), Đắk Lắk (71.461 người), Hà Giang (71.338 người), Thái Nguyên (63.816 người), Bắc Kạn (27.505 người), Đắk Nông (27.333 người), Lào Cai (25.591 người), Lâm Đồng (24.526 người), Bình Phước (23.198 người)... Người Nùng chủ yếu phân bố ở các tỉnh đông bắc Bắc Bộ như Lạng Sơn, Cao Bằng, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Bắc Giang, Tuyên Quang v.v (chiếm tới 84%). Đây là các tỉnh gần với biên giới Trung Quốc, là những điểm nóng về tình hình An ninh và trật tự an toàn xã hội. Hiện nay, số lượng vụ án có đối tượng là người dân tộc Nùng có xu hướng ngày càng tăng (số lượng vụ việc trong các năm gần đây được trưng cầu giám định AND tại Viện khoa học hình sự cụ thể như sau: Năm 2013 số vụ là 25 vụ, năm 2014 là 32 vụ, 6 tháng đầu năm của năm 2015 là 20 vụ). Tuy nhiên, ở Việt Nam cho đến nay chưa có một nghiên cứu hoàn chỉnh nào được công bố về khảo sát sự phân bố tần suất các alen của các gen hình sự hệ Identifiler (gồm 15 gen) đối với quần thể người dân tộc Nùng. Yêu cầu thực tế đặt ra đòi hỏi phải có tần suất các alen của các locus gen hệ Identifiler để dùng trong tính toán, đưa ra kết luận trong các vụ án có mẫu của đối tượng là người dân tộc Nùng ngày càng cấp bách. Đề tài “Khảo 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 15 locus gen hệ Identifiler từ quần thể người dân tộc Nùng ứng dụng trong giám định ADN” được hoàn thành sẽ đáp ứng yêu cầu cấp thiết của giám định ADN và đóng góp dữ liệu vào hệ thống gen hình sự quốc tế. Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học vững chắc để phân tích, đánh giá và kết luận giám định đối với những vụ án liên quan đến người thuộc dân tộc Nùng và là điều kiện để xây dựng cơ sở pháp lý cho quy trình giám định AND. 2. Mục tiêu của đề tài Khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 15 locus gen (ADN) hệ Identifiler từ dân tộc Nùng phục vụ cho công tác giám định ADN trong các vụ án liên quan đến người dân tộc Nùng. Trên cơ sở đó, tính tần suất xuất hiện của mỗi alen trong từng locus của dân tộc Nùng, làm cơ sở khoa học để phân tích, đánh giá và rút ra kết luận giám định xác định quan hệ huyết thống hoặc truy nguyên cá thể là người dân tộc Nùng. 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu tần suất các alen theo hệ Identifiler của 120 cá thể người Nùng không có quan hệ họ hàng, sống rải rác trên các tỉnh trung du và miền núi phía Bắc. 4. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu Để thực hện mục tiêu nghiên cứu đề tài sẽ bao gồm một số nội dung chính với các vấn dề cần giải quyết sau: - Thu mẫu máu của 120 cá thể người Nùng Theo nguyên tắc thu ngẫu nhiên từ những người không có quan hệ họ hàng huyết thống trực hệ ở các tỉnh khác nhau (có thông tin cá nhân) - Tách chiết AND bằng phương pháp tách chiết vô cơ, sử dụng chelex 100 ( hãng Bio – Rad, Mỹ). 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn - Định Lượng bằng phương pháp Real-time PCR sử dụng bộ Kít Quantifiler Human DNA Quantification Kit (hãng ABI, Mỹ). - Nhân bội AND trên máy tạo chu trình nhiệt ABI- 9700 bằng bộ Kit Identifiler ( hãng ABI, Mỹ). - Điện di và phân tích kết quả trên máy Phân tích gen ABI- 3130 với phần mềm GeneMapper ID của hãng ABI (Mỹ). - Phân tích kiểu gen (AND) của các locus hệ Identifiler (15 locus gen) của 120 cá thể người dân tộc Nùng. Từ cơ sở đó, tính tần suất xuất hiện của mỗi alen của từng locus trong quần thể, kiểm định tính chính xác của số lượng mẫu trong khảo sát với độ tin cậy p =0,05. - Tính tần suất các alen của mỗi locus theo số liệu thu được trong nghiên cứu. - Kết quả là bảng tần suất các alen của từng locus trong quần thể người Nùng làm cơ sở khoa học để các cơ quan giám định, các cơ quan tố tụng hình sự, dân sử dụng phân tích và đưa ra kết luận trong giám định gen. 5. Ý nghĩa Khoa học và thực tiễn của đề tài Đề tài này khi được hoàn thành sẽ đáp ứng yêu cầu giám định gen ở Việt Nam nói chung và đóng góp vào nhiệm vụ giám định AND cho các lực lượng thi pháp pháp luật trên toàn cầu nhất là trong bối cảnh toàn cầu hóa giữa cảnh sát các nước thông qua Iterpol.Thực tế quần thể người Nùng ở Việt Nam cho đến thời điểm này chưa có một công bố nào về tần suất các alen của các locus gen hệ Identifiler. Từ yêu cầu của thực tiễn, nhóm nghiên cứu sẽ tiến hành thu mẫu ngẫu nhiên của 120 cá thể người Nùng, phân tích kiểu gen hệ Identifiler, xây dựng bảng tần suất để sử dụng trong giám định gen. 6. Bố cục của luận văn Ngoaì phần mở đầu, kết luận, kiến nghị, danh mục tài liệu tham khảo và phụ lục, luận văn được kết cấu thành 3 chương. Chương 1: Tổng quan tài liệu 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Các phƣơng pháp truy nguyên cá thể dùng trong Khoa học hình sự Có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định cá thể người như: - Nhận biết qua vân tay, tiếng nói. - Nhận biết bằng các yếu tố huyết thanh như: xác định các nhóm kháng nguyên hồng cầu (nhóm máu), xác định một số yếu tố protein trong huyết thanh, xác định một số enzym, nhưng khả năng phân biệt còn thấp. 1.2. Phƣơng pháp phân tích ADN để xác định cá thể Những năm cuối thế kỷ 20, đặc biệt là thập kỷ 80, 90 các nhà khoa học hình sự ứng dụng công nghệ gen (DNA- Technology) vào trong xác định tội phạm. Trong nhân tế bào người (tế bào lưỡng bội) có 46 nhiễm sắc thể (NST) được xếp thành 23 cặp đồng dạng: 22 cặp nhiễm sắc thể thường và một cặp nhiễm sắc thể giới tính. Riêng tế bào trứng và tinh trùng có 23 nhiễm sắc thể (tế bào đơn bội). Thế hệ con cái, thông thường nhận từ mẹ 23 nhiễm sắc thể thông qua tế bào trứng và 23 nhiễm sắc thể từ cha thông qua tế bào tinh trùng. Sự kết hợp giữa trứng và tinh trùng đã duy trì được số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào thường là 46. Bộ nhiễm sắc thể được bảo tồn và truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác và mang tính đặc trưng cho người [25, 27] . Năm 1984 Alec Jeffreys và các cộng sự ở trường đại học Leicester (Anh) khi nghiên cứu các đoạn ADN mã hoá cho myoglobin trong máu người đã phát hiện ra trình tự của các bazơnitơ được lặp lại một số lần với chiều dài đoạn lặp từ 10-15 bp (base pair), các đoạn lặp này được gọi là tiểu vệ tinh 5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn (minisattelite). Ông cũng phân lập được hai đoạn và nhân bội chúng, sử dụng làm mẫu dò (probe) để phát hiện những vùng mà Jeffreys gọi là vùng siêu biến (hypervariable region) ở các vật liệu di truyền khác nhau [25]. Đây được coi là bước ngoặt lớn trong lịch sử phát triển của Khoa học hình sự thế giới nói chung và Sinh học pháp lý nói riêng. Các tiểu vệ tinh được phát hiện thấy trong mọi tế bào và ở những vị trí khác nhau trong hệ gen người. Điều đáng chú ý là số lần lặp lại các đoạn lặp này ở các cá thể khác nhau thì khác nhau. Alec Jeffreys coi đây là đặc điểm rất quan trọng để phân biệt sự khác nhau giữa các cá thể (truy nguyên cá thể). Giám định ADN cho mục đích tư pháp ra đời từ đây. Giám định ADN ra đời không chỉ khắc phục được những hạn chế của các phương pháp huyết thanh học mà còn giải quyết được những vụ án bế tắc trước đây- những vụ án mà ADN là bằng chứng duy nhất. Tính ưu việt của giám định ADN là truy nguyên được cá thể người, xác định quan hệ huyết thống cha - mẹ - con, xác định hài cốt...[17, 27]. Tháng 10 năm 1990, tại Mỹ, Dự án hệ gen người (Human Genome Project-HGP) chính thức được bắt đầu. Đến ngày 12 tháng 02 năm 2001, HGP và Celera đã công bố trình tự đầy đủ của hệ gen người - một sự kiện trọng đại trong sự phát triển của sinh học phân tử nói chung và trong việc nghiên cứu gen người nói riêng. Theo công bố này, số lượng gen trong bộ gen người có khoảng 35 000 gen, trong đó có hàng chục gen được nghiên cứu ứng dụng để xác định huyết thống và truy nguyên cá thể [25]. Cũng như ADN ở sinh vật nhân chuẩn khác, ADN nhân ở người gồm những trình tự mã hoá (các exon) xen kẽ với những trình tự không mã hoá (các intron) [10, 12]. Tuỳ mức độ hiện diện của chúng trong nhân, các trình tự ADN được chia làm 3 loại: 6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn - Các trình tự duy nhất: là các gen mã hoá cho các protein có trình tự đặc trưng cho từng gen. - Các trình tự có số lần lặp lại trung bình: chiếm khoảng 25- 40% bộ gen người, chúng có kích thước từ 100-1000 kb, đa dạng hơn các trình tự lặp lại nhiều lần. Các trình tự này không tập trung mà phân tán trên toàn bộ hệ gen. Chúng có thể là những trình tự không mã hoá với chức năng chưa rõ hoặc còng cã thÓ lµ nh÷ng tr×nh tù m· ho¸ (c¸c gen m· ho¸ cho ARN riboxom, ARN vËn chuyÓn...). - Các trình tự lặp lại nhiều lần: Chiếm 10-15% bộ gen. Đó là những trình tự ADN ngắn (10-200 kb), không mã hoá, thường tập trung ở những vùng chuyên biệt trên nhiễm sắc thể (vùng tâm động, vùng đầu nhiễm sắc thể). Các gen được sử dụng trong giám định hình sự là các gen nằm ở vùng không mã hoá (intron) của ADN. Ở giai đoạn phát triển đầu tiên của giám định gen, người ta áp dụng các kỹ thuật phân tích các gen có đoạn lặp trung bình (Variable Number of Tandem Repeat-VNTR hay Minisatellite). Nhưng những kỹ thuật này chỉ áp dụng được với từng gen riêng lẻ (single locus) và phụ thuộc vào thao tác kỹ thuật của người giám định nên dễ xảy ra sai sót. Từ năm 1990 tới nay các nhà Khoa học hình sự sử dụng các kỹ thuật phân tích các gen có trình tự lặp ngắn (Short Tandem Repeat-STR hay Microsatellite) vì chúng khá bền vững, có khả năng phân tích đồng thời nhiều gen, ít phụ thuộc vào thao tác kỹ thuật của người giám định. Các cấu trúc VNTR hay STR đều mang tính bảo thủ cao, được di truyền qua các thế hệ và mang tính đặc trưng cho cá thể. Đó là nền tảng khoa học cho giám định gen. Các gen này thường có tính đa hình cao, ít đột biến, tương đối bền vững và cho phép đồng thời thực hiện được phản ứng nhân gen của nhiều gen khác nhau [25]. 7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Tính đa hình của các gen này được thể hiện ở hai dạng: đa hình về trình tự các nucleotid và đa hình về chiều dài. - Đa hình về trình tự: các gốc nucleotide ngẫu nhiên trong đoạn ADN không theo một trình tự nào. Ví dụ: tại locus A, Ở cá thể thứ nhất có trình tự: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 - AGACTGCTAGỞ cá thể thứ hai có trình tự: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 - AGCCTGCGAGNhư vậy tại vị trí số 3 và vị trí số 8 của dãy thứ nhất đã được thay thế A bằng C và T bằng G ở dóy thứ 2 - Đa hình về chiều dài: Một số gốc nucleotid được lặp đi lặp lại nhiều lần trên chiều dài của đoạn ADN. Ví dụ: tại locus D7S820, Cá thể thứ nhất: GATA GATA... ............GATA  7 đoạn lặp GATA Cá thể thứ hai: GATA GATA GATA... GATA 12 đoạn lặp GATA 1.3. Mƣời lăm (15) locus gen hệ Identifiler trờn các nhiễm sắc thể 1.3.1 Các tiêu chuẩn cho locus STR dùng trong giám định ADN Giám định ADN hiện nay chủ yếu sử dụng các locus STR. Phương pháp giám định ADN có độ tin cậy rất cao bởi các locus STR có tính đa alen (tính đa hình) rất cao, mỗi alen chỉ xuất hiện trong quần thể với tần số rất thấp [17, 31]. Locus STR ngắn nên có thể đồng thời phân tích được nhiều STR trong cùng một thời điểm. Việc phân tích đa hệ rất có giá trị vì chúng có kết quả phân biệt lớn và thành công ngay cả một số trường hợp mẫu lẫn hoặc đó bị phân hủy phần nào [10, 12]. Một locus STR được sử dụng cho mục đích nhận dạng và xác định cá thể phải đảm bảo các thông số sau: 8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn - Có tính bền vững cao (tần suất đột biến thấp) - Locus STR phải có tính đa hình và mức độ dị hợp tử cao. Điều này giúp các nhà phân tích chỉ sử dụng một số locus tối thiểu đó đạt được sự phân biệt cá thể một cách tốt nhất. - Các locus STR có kích thước ngắn, trung bình từ 100 - 400 bp. Các đoạn ADN ngắn có độ bền vững cao, ít bị đứt gẫy dưới tác động của điều kiện ngoại cảnh. - Các locus chứa đoạn STR phải đảm bảo yếu tố di truyền độc lập, do vậy nên lựa chọn tổ hợp các locus nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau là rất quan trọng. Nhiều đoạn đa hình có trình tự lặp lại chứa các đơn vị lặp lại từ 4 nucleotide đã được nghiên cứu và đáp ứng được yêu cầu của quy trình phân tích cá thể người. Các đoạn này có đặc tính như sau: - Có tính đa hình và mức độ dị hợp tử cao (>70%). - Dễ dàng phối hợp thành bộ phức khi thực hiện PCR. - Sản phẩm PCR ổn định, ít xảy ra trường hợp khi PCR đoạn lặp bị thiếu. Năm 2006, Viện Khoa học hình sự đưa vào triển khai giám định ADN bằng bộ kit Identifiler (15 locus gen: D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, THO1, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818 và FGA). Với bộ kit mới này, công tác giám định đạt hiệu quả cao hơn so với bộ kit 9 locus gen Nineplex II được sử dụng trước đây. Bảng 1.1: Các locus gen hệ Identifiler [20] Tên locus Vị trí trên NST Trình tự đoạn lặp Các alen D8S1179 8q24.13 phức hợp TCTA/TCTG 6 - 20 D21S11 21q21.1 phức hợp TCTA/TCTG 12 - 43.2 D7S820 7q21.11 GATA 5 - 16 9 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn CSF1PO 5q33.3-34 AGAT 5 - 17 D3S1358 3p21.31 phức hợp TCTA/TCTG 6 - 26 TH01 11p15.5 TCAT 3 - 14 D13S317 13q22-31 TATC 5 - 17 D16S539 16q24.1 GATA 4 - 17 D2S1338 2q35 phức hợp TGCC/TTCC 10 - 31 D19S433 19q12 phức hợp AAGG/TAGG 5.2 - 20 vWA 12p12-pter phức hợp TCTA/TCTG 10 - 25 TPOX 2p23-2per AATG 4 - 16 D18S51 18q21.3 AGAA 5.3 - 40 Amelogenin X: p22.1-22.3 X, Y Y: p11.2 D5S818 5q21-31 AGAT 4 - 29 FGA 4q28 phức hợp CTTT/TTCC 12.2 - 51.2 1.3.2. Ý nghĩa của cơ sở dữ liệu tần suất alen của các locus STR Mỗi cá thể người có cấu trúc di truyền riêng biệt, trừ những trường hợp sinh ra cùng một trứng [5]. Nếu xét rộng trong cả một quần thể thì một số đặc điểm di truyền (ADN) ở các cá thể khác nhau vẫn có thể giống nhau (trùng lặp). Mặt khác mỗi một quần thể người (tộc người) khác nhau cũng có những đặc điểm di truyền đặc trưng thể hiện bằng sự phân bố tần suất alen trong mỗi quần thể [29, 36]. Do vậy, trong giám định ADN các nhà khoa học hình sự ngoài lựa chọn, nghiên cứu những locus (vị trí trên nhiễm sắc thể) có tính đa hình cao thì cần khảo sát tần suất phân bố các alen trong quần thể của từng locus để sử dụng. Quần thể được nghiên cứu khảo sát phải đạt được các yêu 10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn cầu trong thống kê là các mẫu dùng trong nghiên cứu phải đảm bảo tính ngẫu nhiên, không có quan hệ huyết thống trong 3 đời [20, 35]. Để có được tần suất của mỗi alen, trước hết phải tìm được số lần xuất hiện của mỗi alen trong quần thể nghiên cứu sau đó tính tần suất lý thuyết của alen đó theo quy luật di truyền quần thể [36]. Khi có được tần suất thực tế và tần suất lý thuyết của mỗi alen, chúng ta tiến hành kiểm định xem tần suất alen có phù hợp hay không với mức xác suất đã chọn. Giám định ADN đòi hỏi cơ sở khoa học vững chắc để tính toán xác suất một người ngẫu nhiên trong quần thể là người có cấu trúc di truyền đặc trưng trùng lặp với ADN trong các mẫu vật (thu thập trong quá trình điều tra, phá án). Nếu không có tần suất alen thì không tính toán được tần suất xuất hiện của một kiểu gen nào đó trong một quần thể nhất định [15, 28, 31]. Trong trường hợp cần xác định huyết thống, để kết luận một người có phải là cha đẻ hoặc mẹ đẻ của người con không, phải dựa vào khả năng cho nhận của các alen và phải căn cứ vào tần suất alen để tính ra chỉ số quan hệ huyết thống (Paternity Index - PI), từ đó tính độ tin cậy đạt được. Mặt khác, đó cũng là cơ sở khoa học để so sánh độ tin cậy trong trường hợp phân tích được nhiều locus gen hoặc ít locus gen hơn [30]. 1.3.3. Cơ sở khoa học và thực tiễn của việc nghiên cứu đề tài Mỗi một dân tộc có một phân bố tần suất kiểu gen khác nhau. Do nhu cầu sử dụng tần suất của mỗi dân tộc khi tính toán để đưa ra kết luận giám định ADN của các giám định viên về Sinh học, trong các vụ án có đối tượng là cá thể người dân tộc nào thì đều cần phải có tần suất phân bố các alen của các locus gen trong quần thể dân tộc đó để sử dụng. Việc khảo sát, xây dựng tần suất các alen cho mỗi dân tộc là nhu cầu cấp thiết cho công tác giám định ADN. Thực tế quần thể người Nùng ở Việt Nam cho đến thời điểm này chưa có một công bố nào về tần suất các alen của các locus gen hệ Identifiler. Từ 11 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn yêu cầu của thực tiễn, nhóm nghiên cứu sẽ tiến hành thu mẫu ngẫu nhiên của 120 cá thể người Nùng, phân tích kiểu gen hệ Identifiler, xây dựng bảng tần suất để sử dụng trong giám định gen. 1.4. Tình hình nghiên cứu và phát triển các bộ kit dùng trong giám định ADN nhân tế bào 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Từ những năm 1990, các nhà Khoa học hình sự trên thế giới sử dụng các kỹ thuật phân tích các gen có trình tự lặp ngắn (Short Tandem Repeat-STR hay Microsatellite) cho mục đích giám định ADN hình sự [22, 28]. Ứng dụng các thành tựu của Công nghệ sinh học nói chung và kết quả của Dự án hệ gen người (Human Genome Project-HGP) nói riêng, các tập đoàn nghiên cứu khoa học trên thế giới đã sản xuất các bộ kit phân tích tổ hợp các locus có trình tự lặp lại ngắn: - Kit 2 locus (TPOX/CSF1PO), - Kit 3 locus (THO1/F13A1/FES) - Kit 9 locus (hệ Profiler Plus của hãng Perkin-Elmer, Mỹ), - Kit 15 locus (hệ Identifiler của hãng AB, hệ Power Plex 16 của hãng Promega). - Kit 24 locus (hệ Golbalfiler của hãng AB, hệ PowerPlexđ Fusion System của hãng Promega[15] . Mỗi phòng thí nghiệm giám định gen (ADN) đều phải đạt những chỉ tiêu chất lượng trang thiết bị máy móc cũng như con người và đều phải có các nghiên cứu, khảo sát và công bố kết quả của mình về tần suất các alen trong hệ locus gen của từng quần thể người để ứng dụng trong giám định truy nguyên cá thể hay xác định quan hệ huyết thống. Để đảm bảo tính chính xác, các phòng thí nghiệm giám định gen thường dùng hệ thống phân tích 15 locus gen như hệ Identifiler hoặc hệ Power Plex 16. 12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Tại Mỹ, cảnh sát liên bang Mỹ đã khảo sát và sử dụng tần suất dữ liệu ADN theo hệ Identifiler của nhiều chủng tộc người khác nhau: 191 người gốc Mỹ, 290 người Mỹ gốc Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha, 349 người Mỹ da trắng và 357 người Mỹ gốc Phi [18, 21]. Với chủng tộc người lai Âu - Á (Eurasia), tại mỗi quốc gia khác nhau lại có những khảo sát khác nhau về tần suất các alen theo hệ Identifiler của cộng đồng người Eurasia tại quốc gia đó: 384 người tại Nga, 300 người tại Hy Lạp, 139 người tại Rumani...[37, 38] Tại Singapore, Cảnh sát Singapore sử dụng tần suất các alen theo hệ Identifiler của dân tộc người Hoa, dân tộc người Mã Lai, dân tộc người Ấn Độ... để phục vụ công tác giám định [5]. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam, giám định gen được triển khai từ tháng 4 năm 1999, tại Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an. Toàn bộ quy trình giám định gen được chuyển giao từ Viện Khoa học hình sự bang Victoria - Úc cùng đội ngũ giám định viên được đào tạo cơ bản tại Úc. Cho ®Õn nay, ®· triÓn khai 5 phßng thÝ nghiÖm gi¸m ®Þnh ADN: 03 phßng thÝ nghiÖm t¹i Hµ Néi (01 phßng thÝ nghiÖm cho tµng th­ ADN téi ph¹m Quèc gia, 01 phßng thÝ nghiÖm gi¸m ®Þnh ADN hµi cèt, 01 phßng thÝ nghiÖm gi¸m ®Þnh ADN phôc vô tè tông vµ c¸c yªu cÇu c¸ nh©n); 01 phßng thÝ nghiÖm t¹i Ph©n ViÖn KHHS t¹i §µ N½ng; 01 phßng thÝ nghiÖm t¹i Ph©n viÖn KHHS t¹i TP. Hå ChÝ Minh. Trong qua tr×nh ph¸t triÓn, tr×nh ®é n¨ng lùc c¸n bé ngµy cµng ®­îc n©ng cao, trang thiÕt bÞ ®­îc bæ sung vµ n©ng cÊp, ®· ®¸p øng vµ phôc vô h÷u hiÖu cho c«ng t¸c ®Êu tranh 13 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan