Tài liệu Khảo sát xoắn khuẩn leptospira và leptospirosis trên chó ở một số tỉnh đồng bằng sông cửu long

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP NGUYỄN THỊ BÉ MƯỜI KHẢO SÁT XOẮN KHUẨN LEPTOSPIRA VÀ LEPTOSPIROSIS TRÊN CHÓ Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI MÃ SỐ: 62640102 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP NGUYỄN THỊ BÉ MƯỜI KHẢO SÁT XOẮN KHUẨN LEPTOSPIRA VÀ LEPTOSPIROSIS TRÊN CHÓ Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI MÃ SỐ: 62640102 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS. TS. HỒ THỊ VIỆT THU 2019 LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, khoa Sau đại học, ban Chủ nhiệm Khoa Nông Nghiệp, Bộ môn Thú y, các Quý thầy, cô đã giảng dạy, hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô hướng dẫn PGS.TS. Hồ Thị Việt Thu đã động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu, chăm bồi kiến thức và hoàn thành luận án. Xin cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. Trần Đình Từ và PGS. TS. Cao Thị Bảo Vân đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện nuôi cấy xoắn khuẩn tại Viện Vệ Sinh Dịch Tễ. Xin cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Nhựt Xuân Dung và PGS.TS Nguyễn Trọng Ngữ đã động viên và giúp đỡ trong việc xử lý số liệu và phân tích trình tự gene. Xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Hạnh Lan đã tận tình hướng dẫn trực tiếp kỹ thuật nuôi cấy xoắn khuẩn tại phòng Sinh Học Phân Tử 3 của Viện Vệ Sinh Dịch Tễ (Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh) và em Trần Văn Bé Năm phòng Sinh Học Phân Tử, Viện Công Nghệ Sinh Học Trường ĐHCT. Xin được bày tỏ lòng biết ơn các Quý thầy, cô trong hội đồng chấm luận án đã đóng góp cho tôi những ý kiến vô cùng quý giá để tôi có thể hoàn thiện hơn bản luận án của mình. Xin gởi lời cám ơn chân thành đến các bạn bè, đồng nghiệp của tôi đang công tác tại Bộ môn Thú y, Trường Đại học Cần Thơ, các anh chị em lớp NCS khóa 1 (2013-2017) đã động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin dành tất cả sự yêu thương và lời cám ơn tới gia đình, người thân yêu của tôi đã luôn ủng hộ, chia sẻ những buồn vui trong cuộc sống để tôi có thể an tâm và có thêm nghị lực hoàn thành luận án. Tác giả luận án Nguyễn Thị Bé Mười i TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát xoắn khuẩn Leptospira và Leptospirosis trên chó ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long” được thực hiện từ năm 2013 đến 2017, sử dụng phương pháp khảo sát huyết thanh học (MAT), lấy mẫu cắt ngang được thực hiện trên 4 tỉnh Cần Thơ, Vĩnh Long, An Giang và Cà Mau với 18 nhóm huyết thanh Leptospira phổ biến. Tổng số mẫu kiểm tra huyết thanh chó 1.433, chia thành: giống chó nội và giống chó ngoại; 3 nhóm tuổi: 4 tháng - 12 tháng tuổi, ≤ 1-6 năm và ≥ 6 năm tuổi; giới tính đực và cái; nuôi thả rong và nuôi nhốt. Tổng số mẫu huyết thanh chuột 647, với 3 loại chuột: chuột cống, chuột xạ và chuột nhắt. Đề tài thực hiện trên 4 nội dung là: (1) Điều tra tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó và chuột; (2) Phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu bằng kỹ thuật PCR và nuôi cấy, giải trình tự đoạn gene 16S rRNA của xoắn khuẩn Leptospira; (3) Khảo sát những biến đổi bệnh lý bệnh Leptospirosis trên chó thông qua xét nghiệm máu và nước tiểu và (4) nghiên cứu biện pháp điều trị bệnh Leptospirosis với 3 phác đồ điều trị bằng Shoptapen, Amoxicillin và Doxycycline. Việc phát hiện xoắn khuẩn Leptospira được thực hiện trên 63 mẫu nghi ngờ có Leptospira từ 111 mẫu nước tiểu của chó có MAT ≥ 1: 400. Các biến đổi về bệnh lý thực hiện trên 13 chó (6 con không có và 7 có triệu chứng lâm sàng) dương tính với Leptospira bằng kỹ thuật PCR và điều trị được thực hiện tại 3 phòng mạch thú y tại TPCT. Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm xoắn khuẩn Leptospira trung bình trên chó là 23,1%; cao nhất ở TP Vĩnh Long là 26,59%, kế đến là Cần Thơ (24,46%), An Giang (20,15%) và thấp nhất là Cà Mau (18,94%). Serogroup phổ biến là L. icteroheamorrhagiae (35,05%), L. canicola (18,34%), L. hurstbridge (12,69%), L. bataviae (12,08%) và L. grypptophosa (12,08%). Tỷ lệ nhiễm xoắn khuẩn Leptospira giữa nhóm giống chó nội (23,71%) và chó ngoại (22,24%) (P=0,51) cũng như các lứa tuổi chó khác nhau, từ 4 tháng đến 12 tháng tuổi (22,51%), ≤ 1-6 năm tuổi (22,52%) và ≥ 6 năm tuổi (26,04%) (P=0,32). Tỷ lệ nhiễm Leptospira giữa chó đực (24,20%) và con cái (22,01%) (P=0,33). Tuy nhiên, phương thức nuôi có ảnh hưởng rất có ý nghĩa đến tỷ lệ nhiễm Leptospira, chó thả rong là 25,92% trong khi nuôi nhốt là 17,56% (P<0,01). Chuột có tỷ lệ nhiễm Leptospira khá cao, chuột cống 46,32%, trong khi chuột xạ và chuột nhắt lần lượt là 26,32 và 27,14% (P<0,01). Serogroup nổi trội là L. icteroheamorrhagiae (40,61%), L. canicola (20,52%), L. bataviae (13,97%), L. panama (10,92%) và L. hurstbridge (10,92%). Tỷ lệ dương tính với Leptospira giữa chuột và chó có tương quan rất chặc chẻ (R2= 0,90). ii Kỹ thuật PCR đã phát hiện 13/63 mẫu nước tiểu dương tính với Leptospira (20,63%) và đã nuôi cấy thành công Leptospira từ 3/63 mẫu nước tiểu này (4,76%). Kết quả định danh xác định các mẫu phát hiện thuộc hai loài Leptospira interrogans (L. interrogans serovar icterohaemorrhagie) thuộc nhóm Leptospira gây bệnh và loài Leptospira fainei (L. fainei serovar hurstbridge) thuộc nhóm xoắn khuẩn trung gian gây bệnh cơ hội hiện diện trong nước tiểu chó ở TPCT. Mười ba chó dương tính với Leptospira có bạch cầu tổng số, bạch cầu trung tính, lâm ba cầu, urea, creatinin, AST, ALT và bilirubin tăng cao, trong khi hồng cầu, hemoglobin, hematocrit và tiểu cầu giảm so với chỉ số bình thường, ngoài ra trong nước tiểu còn xuất hiện hồng cầu và protein cao. Bảy chó có triệu chứng lâm sàng như lừ đừ, ăn ít hoặc bỏ ăn (100%), niêm mạc nhợt màu (85,71%) và tiêu chảy (14,28%). Sáu mươi ba chó được điều trị với ba phác đồ, kết quả Doxycycline có tỷ lệ khỏi bệnh cao nhất (61,90%), kế đến là Amoxicilline (50%) và thấp nhất Shotapen (40%) (P=0,37). Kết quả của đề tài chỉ rằng chó và chuột là hai động vật có mắc bệnh Leptospirois, tỷ lệ nhiễm Leptospira giữa chúng có quan hệ tuyến tính rất cao. Các số liệu thu được của đề tài là những dữ liệu cần thiết cho công tác phòng và chống bệnh trên chó cũng như góp phần làm hạn chế bệnh trên các động vật khác và trên người. Từ khóa: chó, chuột, Leptospira, serogroup, tỷ lệ nhiễm, điều trị. iii ABSTRACT The study of “Survey of Leptospira and Leptospirosis in dogs in some provinces in the Mekong Delta" was carried out from 2013 to 2017, using for a cross-sectional sero survey of the Leptospira prevalence by microscopic agglutination test (MAT) on four provinces: Can Tho, Vinh Long, An Giang and Ca Mau with live antigens of 18 common serogroups. A total of serum samples was 1,433, in which dogs were divided two breeds group: domestic and exotic dog’s breeds; three age groups, 4 months to 12 months, ≤ 1-6 years and ≥ 6 years-old dogs; male and female; free-raising dogs and captive dogs. A total of the tested serum samples was 647: three rat species: Rattus norvegicus, Suncus murinus and Mus musculus. The study consisted of four contents (1) Investigation the prevalence of Leptospira in dogs and rats; (2) Detection of Leptospira from urine by PCR technique and by culturing methods, sequence of the 16S rRNA of Leptospira; (3) Survey of the pathological changes of Leptospirosis on dogs through blood and urine tests and (4) examination of three antimicrobial therapies with Shoptapen, Amoxicillin and Doxycycline in the treatment of Leptospira on dogs. The detection of Leptospira was examined on 63 clinical suspicion cases of Leptospira from 111 urine samples of dogs, all were tested by MAT ≥ 1: 400. The pathological changes were conducted on 13 dogs (6 without and 7 had clinical symptoms) that were positive for Leptospira by PCR technique and the treatments were conducted at 3 veterinary clinics in Cantho city. Results showed that the average prevalence of Leptospira in dogs was 23.10%, the highest rate was reported in Vinh Long province (26.95%), followed by Can Tho city (24.46%), An Giang province (20.15%) and the lowest was in Ca Mau city (18.94%). The common serogroups were L. icterohaemorrhagiae (35.05%), L. canicola (18.43%), L. hurstbridge (12.69%), L. bataviae (12.08%) and L. gryppotyphosa (12.08%). The seroprevalence of Leptospira between domestic dog’s breeds group was (23.71%) and exotic dog’s breeds group (22.24%) (P=0.51) as well as among age groups of dogs: from 4 months to 12 months (21.51%), ≤ 1-6 years old (22.52%) and ≥ 6 year-old dogs (26.04%) (P=0.32). The prevalence of Leptospira between males dogs was 24.20% and 22.01% in female (P=0.33). Howerver, keeping methods had significantly influenced on the prevalence of Leptospira with 25.92% found in free-raising dogs, while in captive dogs was 17.56% (P<0.01). There was high positive prevalence of Leptospira observed in rats (35.40%), in which the highest percentage found in Rattus norvegicus (46.32%), while Suncus murinus and Mus musculus were 26.32% and 27.14%, respectively (P<0.01). The common serogroups were L. icterohaemorrhagiae iv (40.61%), L. canicola (20.52%), L. bataviae (13.97%), L. panama (10.92%), and L. hurstbridge (10.92%). The positive prevalence Leptospira between rats and dogs was highly correlated (R2=0.90). The PCR technique detected 13/63 Leptospira positive urine samples (20.63%) and Leptospira was successfully cultured from 3/63 urine samples (4.76%). Identification results based on homology and comparison of 16S rNRA gene nucleotic sequences had identified the Leptospira detected samples belonged to two species of Leptospira interrogans (L. interrogans serovar icterohaemorrhagiae), which is pathogenic Leptospira species and L. fainei (Leptospira fainei serovar hurstbridge) is the associated pathogenic spirochetes, occurred in dog urine in Can Tho city. Thirteen dogs positive for Leptospira had the white blood cell, neutrophil, lymphocyte counts, urea, creatinine, AST, ALT and bilirubin levels higher than normal ranges, whereas the red blood cell, hemoglobin, hematocrit and platelet counts were lower than those of normal; and there were the presence of red blood cell and protein in urine. Seven dogs with clinical symptoms of Leptospirosis included lethargy, reluctant to eat and anorexia (100%), colorless mucus (85.71%) and diarrhea (14.28%). Sixtythree infected dogs treated with Doxycycline had the highest recovery rate (61.90%), followed by Amoxicillin (50%) and the lowest was Shoptapen (40%) (P=0.37). The study indicated that canine and rodent were two infected animal species with Leptospirosis. There was a high linearly correlated in the prevalence of Leptospira between dogs and rats. This research is necessary for the prevention, against as well as contributes to limit the bacteria potential exposure of rodent to domestic animals and human. Keywords: dog, rat, Leptospira, serogroup, prevalence, treatment. v LỜI CAM KẾT KẾT QUẢ Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ ở bất kỳ nơi đâu. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Cán bộ hướng dẫn Tác giả luận án PGS.TS. Hồ Thị Việt Thu Nguyễn Thị Bé Mười vi MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ..................................................................................................... i TÓM TẮT .......................................................................................................... ii ABSTRACT...................................................................................................... iii LỜI CAM KẾT KẾT QUẢ .............................................................................. vi MỤC LỤC ....................................................................................................... vii DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................... x DANH SÁCH HÌNH ....................................................................................... xii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................ xiii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU................................................................................ 1 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3 2.1 Lịch sử phát hiện bệnh Leptospirosis và xoắn khuẩn Leptospira .............. 3 2.2 Đặc điểm vi sinh vật học của xoắn khuẩn Leptospira ....................................... 3 2.2.1 Phân loại học ............................................................................................. 3 2.2.2 Cấu trúc hình thái ...................................................................................... 7 2.2.3 Đặc tính nuôi cấy xoắn khuẩn Leptospira ................................................. 7 2.2.4 Sức đề kháng của mầm bệnh ................................................................... 9 2.4.5 Tính sinh miễn dịch ................................................................................. 9 2.3 Đặc điểm dịch tễ học ................................................................................ 10 2.3.1 Nguồn bệnh ............................................................................................. 10 2.3.2 Đường xâm nhập của mầm bệnh ........................................................... 11 2.3.3 Đặc tính gây bệnh của xoắn khuẩn Leptospira ..................................... 12 2.4 Đặc điểm bệnh học và lâm sàng ................................................................ 13 2.4.1 Bệnh Leptospirosis trên chó ................................................................... 13 2.4.2.Bệnh Leptospirosis trên người ................................................................ 18 2.5 Tình hình nghiên cứu Leptospirosis trên thế giới ..................................... 19 2.6 Tình hình nghiên cứu Leptospirosis trên gia súc và người ở Việt Nam ... 22 vii 2.7 Một số phương pháp chẩn đoán Leptospira .............................................. 24 2.7.1 Phương pháp kiểm tra xoắn khuẩn bằng kính hiển vi nền đen .............. 25 2.7.2 Phương pháp nuôi cấy xoắn khuẩn Leptospira ..................................... 25 2.7.3 Chẩn đoán huyết thanh học .................................................................... 26 2.8 Các biện pháp phòng và trị Leptospirosis.................................................. 29 2.8.1 Các biện pháp phòng ............................................................................. 29 2.8.2 Điều trị bệnh Leptospirosis .................................................................... 31 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................. 33 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................ 33 3.2 Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 34 3.3 Vật liệu thí nghiệm .................................................................................... 36 3.3.1 Phương tiện và dụng cụ dùng trong phản ứng huyết thanh học ............ 36 3.3.2 Phương tiện và dụng cụ dùng trong kỹ thuật PCR ................................. 38 3.4 Nội dung nghiên cứu.................................................................................. 39 3.4.1 Nội dung 1: Xác định tình hình nhiễm xoắn khuẩn Leptospira trên chó và chuột ở 4 tỉnh ĐBSCL................................................................................. 39 3.4.2 Nội dung 2: Phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu ................... 45 3.4.3 Nội dung 3: Khảo sát những biến đổi bệnh lý bệnh Leptospirosis......... 53 3.4.4 Nội dung 4: Nghiên cứu biện pháp điều trị bệnh Leptospirosis ............. 55 3.5 Phân tích và xử lý số liệu .......................................................................... 56 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 57 4.1 Kết quả khảo sát tình hình nhiễm Leptospira trên chó và chuột ............... 57 4.2 Phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu.. ........................................ 81 4.3. Khảo sát những biến đổi bệnh lý bệnh Leptospirosis trên chó ................. 92 4.4. Nghiên cứu biện pháp điều trị bệnh Leptospirosis trên chó .................... 99 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................... 103 5.1 Kết luận .................................................................................................... 103 5.2 Đề nghị ..................................................................................................... 103 viii DANH MỤC LIỆT KÊ CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ..................... 104 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 105 PHỤ LỤC MẪU PHIẾU ĐIỀU TRA ............................................................ 121 PHỤ LỤC THUỐC SỬ DỤNG ..................................................................... 122 PHỤ LỤC THỐNG KÊ ................................................................................. 124 KẾT QUẢ MỔ KHÁM BỆNH TÍCH .......................................................... 136 PHỤ LỤC HÌNH ........................................................................................... 143 ĐẶC ĐIỂM PHÂN BIỆT BA LOÀI CHUỘT .............................................. 146 PHỤ LỤC GIẢI TRÌNH TỰ GENE ............................................................. 148 ix DANH SÁCH BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Nhóm huyết thanh và một số serovar của L. interrogans ............. 5 Bảng 3.1 Danh mục bộ kháng nguyên dùng trong phản ứng MAT ........... 37 Bảng 3.2 Số lượng mẫu huyết thanh chó trong nghiên cứu ....................... 40 Bảng 3.3 Phân bố mẫu huyết thanh chuột trong nghiên cứu ...................... 43 Bảng 3.4 Phân loại chuột trong nghiên cứu................................................ 43 Bảng 3.5 Số mẫu nước tiểu dùng cho kỹ thuật PCR .................................. 45 Bảng 3.6 Trình tự nucleotide cặp mồi dùng khuếch đại vùng gene .......... 47 Bảng 3.7 Thành phần phản ứng PCR ........................................................ 47 Bảng 3.8 Quy trình nhiệt trong phản ứng PCR .......................................... 48 Bảng 3.9 Số mẫu nước tiểu dùng cho nuôi cấy .......................................... 49 Bảng 3.10 Phân bố mẫu khảo sát tại 3 địa điểm trên địa bàn TPCT ............ 53 Bảng 3.11 Các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa máu ........................................... 54 Bảng 3.12 Các chỉ tiêu sinh lý nước tiểu ...................................................... 54 Bảng 3.13 Số lượng chó được bố trí điều trị ................................................ 55 Bảng 3.14 Bố trí thí nghiệm ......................................................................... 56 Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó ................................................. 57 Bảng 4.2 Tần suất xuất hiện kháng thể kháng các nhóm huyết thanh ....... 61 Bảng 4.3 Cường độ nhiễm các serogroup Leptospira trên chó ................. 64 Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo giống chó ..................................... 65 Bảng 4.5 Tần suất xuất hiện kháng thể kháng các nhóm huyết thanh ...... 66 Bảng 4.6 Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo lứa tuổi chó .................................. 67 Bảng 4.7 Tần suất xuất hiện kháng thể kháng các nhóm huyết thanh ...... 69 Bảng 4.8 Tỷ lệ chó nhiễm Leptospira theo giới tính ................................. 70 x Bảng 4.9 Tần suất xuất hiện kháng thể kháng các nhóm huyết thanh ....... 71 Bảng 4.10 Tỷ lệ chó nhiễm Leptospira theo phương thức nuôi .................. 71 Bảng 4.11 Tần suất xuất hiện kháng thể kháng các nhóm huyết thanh ....... 73 Bảng 4.12 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột ở một số tỉnh ĐBSCL .......... 74 Bảng 4.13 Tần suất xuất hiện kháng thể kháng các nhóm huyết thanh ...... 76 Bảng 4.14 Cường độ nhiễm các serogroup Leptospira trên chuột .............. 78 Bảng 4.15 Tỷ lệ dương tính các serogroup Leptospira trên chuột và chó ... 79 Bảng 4.16 Tỷ lệ phát hiện Leptospira trực tiếp từ nước tiểu ....................... 81 Bảng 4.17 Tỷ lệ Leptospira phát hiện được theo các địa điểm lấy mẫu ..... 82 Bảng 4.18 Tỷ lệ chó nhiễm Leptospira theo độ tuổi, giới tính.................... 83 Bảng 4.19 Tỷ lệ chó nhiễm Leptospira theo hiệu giá ngưng kết ................. 86 Bảng 4.20 Kết quả định danh loài xoắn khuẩn Leptospira phát hiện .......... 87 Bảng 4.21 Xác định loài xoắn khuẩn Leptospira ........................................ 89 Bảng 4.22 Các chỉ tiêu sinh lý máu trên chó nhiễm Leptospira ................. 92 Bảng 4.23 Các chỉ tiêu sinh hóa máu trên chó nhiễm Leptospira ............... 94 Bảng 4.24 Các chỉ sinh lý nước tiểu trên chó nhiễm Leptospira ................ 96 Bảng 4.25 Triệu chứng lâm sàng trên chó dương tính với Leptospira........ 98 Bảng 4.26 Tỷ lệ điều trị khỏi bệnh ............................................................ 100 Bảng 4.27 Các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu trước và sau .... 101 xi DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 2.1 Hình dạng Leptospira interrogans dưới kính hiển vi ................... 7 Hình 2.2 Leptospira interrogans dưới KHV nền đen (x400) ..................... 8 Hình 2.3 Sơ đồ lây truyền Leptospira ...................................................... 12 Hình 2.4 Hoại tử đầu lưỡi với bệnh Leptospira cấp tính .......................... 14 Hình 2.5 Vàng niêm mạc mắt ở chó bệnh Leptospira ............................. 15 Hình 2.6 Vàng niêm mạc miệng ở chó bệnh Leptospira ......................... 15 Hình 2.7 Hiện tượng vàng da ở người bệnh Leptospira ........................... 19 Hình 2.8 Đáp ứng kháng thể kháng của Leptospira trong máu ............... 28 Hình 3.1 Các ống môi trường EMJH đang nuôi cấy ................................. 50 Hình 3.2 Xoắn khuẩn Leptospira đã phát triển trong môi trường EMJH . 50 Hình 4.1 Quan hệ tuyến tính giữa tỷ lệ dương tính Leptospira ................. 80 Hình 4.2 Leptospira soi dưới kính hiển vi nền đen (X40) ......................... 84 Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% .............. 84 Hình 4.4 Cây phả hệ phát sinh loài các serogroup Leptospira .................. 90 Hình 4.5 Xuất huyết da ............................................................................. 93 Hình 4.6 Vàng da ở chó bệnh Leptospirosis ............................................. 95 Hình 4.7 Màu sắc các ống nước tiểu ......................................................... 97 xii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nguyên văn AST Aspartate aminotransferase ALT Alanine aminotransferase DNA Deoxyribonucleic acid ĐBSCL Nghĩa tiếng việt Đồng bằng sông Cửu Long Enzyme Linked Immuno Sorbent Phản ứng hấp phụ Assay miễn dịch liên kết men EMJH Ellinghausen McCullough & Johnson Harris Môi trường nuôi cấy IFT Immuno Fluorescent Test. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang ELISA Kính hiển vi KHV MAT Microscopic Agglutination Test Phản ứng vi ngưng kết PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi nhân gene PLT Platelet count Số lượng tiểu cầu RNA Ribonucleic acid Thành phố Cần Thơ TPCT WHO World Health Organization xiii Tổ chức y tế thế giới CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài Bệnh xoắn khuẩn là bệnh truyền nhiễm chung cho nhiều loài gia súc và người gây ra bởi một số loài xoắn khuẩn gây bệnh (Pathogenic Leptospira species). Bệnh xảy ra phổ biến khắp thế giới, nhất là những vùng nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, thuận lợi cho sự tồn tại của xoắn khuẩn ở bên ngoài cơ thể (Evangelista and Coburn, 2010). Xoắn khuẩn gây bệnh tồn tại trong ống thận và bài thải qua nước tiểu làm vấy nhiễm môi trường (Adler and Moctezuma, 2010) và trong tự nhiên chuột cống là nguồn tàng trữ xoắn khuẩn và là nguồn truyền lây bệnh cho chó, con người và các loài động vật khác (Sykes et al., 2011). Ở Việt Nam trong thời gian qua có nhiều nghiên cứu về tình hình nhiễm Leptospira trên các loài động vật và kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm Leptospira khá biến động, phụ thuộc vào động vật khảo sát, thời gian và địa điểm khảo sát như một số tác giả Vũ Đình Hưng (1995), Nguyễn Thị Ngân (2000), Lê Huỳnh Thanh Phương (2001), Hoàng Mạnh Lâm (2002) và Hoàng Kim Loan (2013) đã khảo sát. Tuy nhiên nghiên cứu về bệnh này trên chó rất ít, đặc biệt là khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long chưa có nghiên cứu nào về Leptospira và bệnh Leptospirosis trên chó. Chó được xem là loài động vật cảm nhiễm nhất sau bò. Leptospira lây truyền qua tiếp xúc trực tiếp với nước tiểu bị nhiễm bệnh, qua đường sinh dục, qua những vết cắn trầy xước hay truyền gián tiếp thông qua thức ăn hay nước uống bị nhiễm xoắn khuẩn. Xoắn khuẩn Leptospira xuyên qua màng nhầy và nhân lên nhanh chóng khi vào hệ thống mạch máu, lây lan đến các mô khác làm ảnh hưởng đến các cơ quan như thận, gan, lách, hệ thống thần kinh, mắt và đường sinh dục (Sykes et al., 2011). Bệnh do Leptospira gây ra có rất nhiều triệu chứng lâm sàng phức tạp dễ nhầm lẫn với các bệnh khác như sốt, run, đau cơ, nôn mửa và mất nước nhanh chóng (Levett, 2001). Ở khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long chưa có nghiên cứu nào về tình hình nhiễm Leptospira trên chó do đó đề tài nghiên cứu “Khảo sát xoắn khuẩn Leptospira và Leptospirosis trên chó ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long” được thực hiện, để cung cấp thêm những thông tin khoa học về tình hình nhiễm cũng như khả năng gây bệnh của các serogroup này trên chó. Những hiểu biết 1 này giúp xây dựng các biện pháp phòng bệnh cho chó và góp phần hạn chế lây nhiễm sang người. Từ những vấn đề nói trên cho thấy nghiên cứu này rất có ý nghĩa khoa học trong lĩnh vực vi sinh vật học thú y, đồng thời góp phần bảo vệ đàn chó và sức khỏe cộng đồng ở khu vực ĐBSCL 1.2 Mục tiêu của đề tài - Khảo sát sự lưu hành của xoắn khuẩn Leptospira trên chó và chuột. - Nghiên cứu những biến đổi bệnh lý bệnh Leptospirosis trên chó. - Nghiên cứu biện pháp điều trị bệnh Leptospirosis trên chó. 1.3 Những đóng góp mới của luận án Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện 2 loài Leptospira interrogans và Leptospira fainei hiện diện trên chó chưa tiêm phòng Leptospirosis ở một số tỉnh ĐBSCL. 1.4 Ý nghĩa khoa học của luận án Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về tình hình dịch tễ bệnh Leptospirosis trên chó, là cơ sở khoa học cho việc xây dựng qui trình phòng và trị bệnh trên chó, hạn chế bệnh trên người và các loài động vật khác. 2 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. 1 Lịch sử phát hiện bệnh Leptospirosis và xoắn khuẩn Leptospira Leptospirosis là bệnh truyền nhiễm chung giữa nhiều loài động vật và người (Zoonosis), do xoắn khuẩn Leptospira thuộc họ Spirochetaceae gây ra. Năm 1886 lần đầu tiên Adolph Weil đã miêu tả những triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh, trong đó đặc biệt có một số bệnh nhân bị nhiễm Leptospira dạng cấp tính là vàng da nên bệnh được xếp vào bệnh truyền nhiễm. Sau công trình nghiên cứu của Adolph Weil, một số nhà nghiên cứu khác đã phát hiện ra nhiều ổ dịch có triệu chứng lâm sàng giống như Adolph Weil đã mô tả và từ đó gọi là Weil’s disease. Những năm sau này bệnh lại được phát hiện trên các loài gia súc và con người ở nhiều nước trên thế giới. Dựa theo tài liệu của Adler (2015), từ những nghiên cứu về lâm sàng và dịch tễ học, Vasiliep người Nga đã phân biệt được bệnh vàng da do nhiễm khuẩn với bệnh vàng da do những nguyên nhân khác như viêm gan hay rối loạn chuyển hóa sắc tố mật. Năm 1916, hai nhà nghiên cứu người Nhật là Do and Inada đã phát hiện được Leptospira gây bệnh cho người ở Nhật Bản. Đến năm 1917, Noguchi đã tìm thấy serovar Leptospira trên chuột hoang ở Mỹ có hình thái và đặc tính miễn dịch giống như các serovar Leptospira ở Nhật Bản và năm 1918 ông tiếp tục mô tả hình thái của serovar Leptospira này và gọi là Leptospira icterohaemorrhagiae. 2.2 Đặc điểm vi sinh vật học của xoắn khuẩn Leptospira 2.2.1 Phân loại học Theo khóa phân loại khoa học Leptospira được xếp vào Giới: Bacteria Ngành: Spirochaetes Lớp: Spirochaetes Bộ: Spirochaetales Họ: Leptospiraceae Giống: Leptospira. 3 Dựa trên sự tương đồng của bộ gene, các xoắn khuẩn thuộc giống Leptospira spp. đã được chia thành 20 loài khác nhau (Nalam et al., 2010), bao gồm những loài gây bệnh và không gây bệnh (hoại sinh): Những loài xoắn khuẩn gây bệnh: L. interrogans, L. kirschneri, L. borgpetersenii, L. santarosai, L. noguchii, L. weilii, L. alexanderi và L. alstonii. Những loài hoại sinh (không gây bệnh): L. biflexa, L. wolbachii, L. kmetyi, L. meyeri, L. vanthielii, L. terpstrae và L. yanagawae. Trước năm 1989, chi Leptospira được chia thành hai loài Leptospira interrogans bao gồm tất cả các chủng gây bệnh và Leptospira biflexa gồm các chủng hoại sinh (không gây bệnh). Sự phân chia này dựa trên các đặc tính kiểu hình và sự sinh trưởng của chúng như các chủng hoại sinh có khả năng mọc được ở nhiệt độ 11-13oC và sinh trưởng với sự có mặt của 8-azaguanine (225 μg/ml) (Sykes et al., 2011). Một số loài trung gian gây bệnh hoặc hoại sinh: L. inadai, L. broomii, L. fainei, L. wolffii và L. Licerasiae (Levett, 2001; Bharti et al., 2003). Tuy nhiên, cũng có một số loài lại bao gồm cả các chủng xoắn khuẩn gây bệnh và không gây bệnh. Ngày nay hệ thống phân loại mới dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử và khác hẳn với hệ thống phân loại trước đây dựa trên khảo sát huyết thanh học (Saito et al., 2013). Các serovar Leptospira gây bệnh được xếp vào các nhóm khác nhau dựa vào mối quan hệ kháng nguyên, thông qua việc xác định bằng phản ứng ngưng kết hay theo kiểu hấp phụ ngưng kết chéo với kháng nguyên tương đồng (Levett, 2001). Mặc dù không dựa vào nhóm huyết thanh để phân loại Leptospira nhưng chúng có rất ý nghĩa về mặt dịch tễ học. Các nhóm huyết thanh của L. interrogans và một số phân loài phổ biến được thể hiện qua Bảng 2.1 4 Bảng 2.1 Nhóm huyết thanh và một số serovar của L. interrogans Số TT Nhóm huyết thanh Serovar (s) 1 Icterohaemorrhagiae icterohaemorrhagiae, copenhageni, lai, zimbabwe 2 Hebdomadis hebdomadis, jules, kremastos 3 Autumnalis autumnalis, fortbragg, bim, weerasinghe Pyrogenes pyrogenes 5 Bataviae bataviae 6 Gryppotyphosa gryppotyphosa, canalzonae, ratnapura 7 Canicola canicola Australis australis, bratislava, lora 9 Pomona pomona 10 Javanica javanica 11 Sejroe sejroe, saxkoebing, hardjo 12 Panama panama, mangus 13 Cynopteri cynopteri 14 Djasiman djasiman 15 Sarmin sarmin 16 Mini mini, georgia Tarassovi tarassovi 18 Ballum ballum, aroborea 19 Celledoni celledoni 20 Louisiana louisiana, lanka 21 Ranarum ranarum 22 Manhao manhao 23 Shermani shermani 24 Hurstbridge hurstbridge 4 8 17 (Levett, 2001). 5