Tài liệu Khóa luận nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học dịch chiết ethyl acetate lá đu đủ đực (carica papaya l.) thu hái tại quảng nam đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA HÓA NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH CHIẾT ETHYL ACETATE LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA PAPAYA L.) THU HÁI TẠI QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC Sinh viên thực hiện Lớp Giáo viên hướng dẫn : Trần Nguyễn Xuân Trinh : 14CHD : GS.TS Đào Hùng Cƣờng Đà Nẵng-Năm 2018 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt đề tài khóa luận tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy GS.TS.Đào Hùng Cƣờng đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ và giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành báo cáo. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến cô ThS.Đỗ Thị Thúy Vân cùng các thầy cô giảng dạy cô và công tác tại phòng thí nghiệm Khoa Hóa - Đại học Sư phạm Đà Nẵng và Nhà trường đã hỗ trợ kiến thức, cơ sở vật chất, dụng cụ thí nghiệm giúp cho em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này. Cuối cùng em xin phép được cảm ơn các thầy cô trong hội đồng đã dành thời gian quý báu để nhận xét, tham gia và đánh giá khóa luận này. Đà Nẵng, ngày 20 tháng 04 năm 2018 Sinh viên thực hiện Trần Nguyễn Xuân Trinh MỤC LỤC MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ ............................................................................. 4 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ TRONG NƢỚC ............................................................................................................. 5 1.3. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ NGOÀI NƢỚC ............................................................................................................................. 5 1.4. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ ... 8 1.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO . 13 1.5.1. Phương pháp MTT ...........................................................................................................13 1.5.2. Phương pháp SRB ............................................................................................................14 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 15 2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ............................ 15 2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................................................15 2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu ....................................................................................15 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................... 16 2.2.1. Xác định một số chỉ tiêu hóa lí .....................................................................................16 2.2.1.1. Độ ẩm ....................................................................................................... 16 2.2.1.2. Hàm lượng tro .......................................................................................... 16 2.2.1.3. Xác định hàm lượng kim loại ................................................................... 17 2.2.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết hợp chất hóa học trong lá Đu đủ đực .......................................................................................................................................17 2.2.2.1. Phương pháp chiết mẫu thực vật ............................................................. 17 2.2.2.2. Phương pháp định danh thành phần hóa học các hợp chất .................... 18 2.2.3. Định tính một số hợp chất trong lá Đu đủ đực .........................................................18 2.2.3.1. Alcaloid .................................................................................................... 18 2.2.3.2. Flavonoid ................................................................................................. 19 2.2.3.3. Coumarin ................................................................................................ 19 2.2.3.4. Saponin .................................................................................................... 20 2.2.3.5. Đường khử ............................................................................................... 20 2.2.3.6. Polyphenol ............................................................................................... 21 2.2.3.7. Steroid ...................................................................................................... 21 2.2.3.8. Axit hữu cơ ............................................................................................... 21 2.2.3.9. Chất béo ................................................................................................... 22 2.2.3.10. Carotene ................................................................................................. 22 2.2.3.11. Polysaccarid .......................................................................................... 22 2.2.3.12. Iridoid .................................................................................................... 23 2.2.4. Sơ đồ điều chế các cao chiết .........................................................................................23 2.2.5. Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết ethyl acetace ...............................................24 2.2.5.1. Quy trình chiết xuất dịch chiết lá Đu đủ đực để nghiên cứu tác dụng ức chế tế bào ung thư ................................................................................................. 24 2.2.5.2. Các dòng tế bào ....................................................................................... 25 2.2.5.3. Phương pháp ............................................................................................ 25 2.2.5.4. Thử độc tế bào ......................................................................................... 25 2.2.6. Định danh sơ bộ một số hợp chất có trong cao chiết ethyl acetate .....................26 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 27 3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÍ CỦA LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC ........ 27 3.1.1. Độ ẩm ..................................................................................................................................27 3.1.2. Hàm lượng tro ...................................................................................................................27 3.1.3. Hàm lượng một số kim loại ...........................................................................................28 3.2. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT HỢP CHẤT HÓA HỌC LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC TRONG DUNG MÔI ETHYL ACETATE 29 3.2.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết ngâm dầm ..................29 3.2.1.1. Kết quả khảo sát thời gian chiết ngâm dầm trong dung môi ethyl acetate ........ 29 3.2.1.2. Kết quả khảo sát tỉ lệ Rắn/Lỏng (R/L) chiết trong dung môi ethyl acetate ........ 30 3.2.2. Kết quả khảo sát thời gian chiết soxhlet trong dung môi ethyl acetate. ............32 3.2.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết siêu âm .........................33 3.2.3.1. Kết quả khảo sát thời gian chiết siêu âm trong dung môi ethyl acetate .. 33 3.2.3.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết siêu âm trong dung môi ethyl acetate ... 35 3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC LỚP CHẤT TRONG LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC .......... 36 3.4. KẾT QUẢ ĐIỀU CHẾ CAO CHIẾT ................................................................. 38 3.5. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DỊCH CHIẾT ETHYL ACETATE TỪ LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC ............................................................................... 38 3.6. KẾT QUẢ KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC DỊCH CHIẾT ETHYL ACETATE LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC BẰNG PHƢƠNG PHÁP GC-MS ............. 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 43 1. KẾT LUẬN .............................................................................................................. 43 2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 43 O........................................................................................... 44 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT S : Singlet (NMR) ppm : Parts per million δ : Độ chuyển dịch hóa học (NMR) BuOH : Butanol CHCl3 : Chloroform EtOAc : Etylacetate EtOH : Ethanol GC-MS : Gas chromatography-Mass spectrometry MeOH : Methanol Me : Methyl NMR : Nuclear magnetic resonance SRB : Sulforhodamine B DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Số hiệu bảng 1.1 1.2 Tên bảng Trang Thành phần hóa học cây Đu đủ 8 Tác dụng của chất chiết từ Đu đủ lên các dòng tế bào ung thư khác nhau trong điều kiện in vitro 10 1.3 Hoạt tính chống ung thư của glucosinolate, phenolic, flavonoid, carotenoid và alcaloid trong Đu đủ 11 3.1 Kết quả xác định độ ẩm của nguyên liệu lá Đu đủ đực 27 3.2 Kết quả hàm lượng tro của nguyên liệu lá Đu đủ đực 28 3.3 Kết quả khảo sát hàm lượng một số kim loại trong lá Đu đủ đực 28 3.4 Kết quả khảo sát thời gian chiết ngâm dầm trong dung môi etylacetat 29 3.5 Kết quả khảo sát tỉ lệ Rắn/Lỏng chiết ngâm dầm trong dung môi ethyl acetate 31 3.6 3.7 3.8 Kết quả khảo sát thời gian chiết soxhlet tối ưu bằng dung môi ethyl acetate Kết quả khảo sát thời gian chiết siêu âm tối ưu bằng dung môi ethyl acetate Kết quả khảo sát nhiệt độ siêu âm tối ưu bằng dung môi ethyl acetate 32 34 35 3.9 Định tính các lớp chất trong lá Đu đủ đực 36 3.10 Khối lượng cao chiết từng phân đoạn 38 3.11 Hoạt tính độc tế bào của phân đoạn dịch chiết ethyl acetate 39 3.12 Thành phần hóa học trong dịch chiết ethyl acetate trong lá Đu đủ đực 40 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Số hiệu hình Tên hình 1.1 Trang 5 1.2 Công thiức cấu tạo cảu hợp chất trong cây Đu đủ 7 2.1 Lá Đu đủ đực và Bột lá Đu đủ đực 15 2.2 Sơ đồ điều chế các cao chiết 24 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 Mối quan hệ giữa khối lượng cao ethyl acetate theo thời gian chiết ngâm dầm Mối quan hệ giữa khối lượng cao ethyl acetate theo tỉ lệ Rắn/Lỏng chiết ngâm dầm Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết ethyl acetate theo thời gian chiết Soxhlet Mối quan hệ giữa khối lượng cao ethyl acetate theo thời gian chiết siêu âm Mối quan hệ giữa khối lượng cao chiết ethyl acetate theo nhiệt độ chiết siêu âm Sắc ký đồ GC-MS của dịch ethyl acetate lá Đu đủ đực 30 31 33 34 36 40 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ngày nay cùng với sự phát triển không ngừng về mọi mặt của xã hội, con người đang phải đối mặt với nguy cơ xuất hiện bệnh tật ngày càng nhiều hơn. Một trong những giải pháp hiện nay là xu hướng quay về với thiên nhiên, dùng những sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hơn là tổng hợp bằng con đường nhân tạo, nhất là hợp chất thiên nhiên từ các thực vật xung quanh chúng ta. Cây Đu đủ (Carica papaya Linn) là một loại cây ăn quả có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ. Hiện nay, Đu đủ được trồng ở các nước vùng nhiệt đới. Sản lượng Đu đủ trên thế giới khoảng trên 5 triệu tấn quả/năm [11]. Ở Việt Nam, cây Đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh miền Bắc và miền Nam. Diện tích trồng Đu đủ của cả nước ước khoảng 10000-17000 hecta với sản lượng khoảng 200-350 nghìn tấn quả [11]. Cây Đu đủ có lợi thế là loại cây dễ trồng, ra quả sớm, năng suất cao đồng thời toàn bộ thân, lá, quả đều được sử dụng với nhiều mục đích chữa bệnh khác nhau. Trong dân gian lá cây Đu đủ được sử dụng để sát khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chữa sốt rét, trừ giun sán,... Đã có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá Đu đủ. Lá Đu đủ được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa rất mạnh [29, 30]. Lá Đu đủ có hoạt tính kháng khuẩn tốt, có khả năng kháng nhiều loại vi khuẩn gram âm, gram dương, các loại nấm [1, 16]. Ngoài ra, lá Đu đủ còn có khả năng kháng viêm, giảm đau [21, 47]. Đặc biệt, người dân Việt Nam đã dùng lá Đu đủ chữa bệnh ung thư. Ở nước ta, cao chiết với cồn từ lá Đu đủ được nghiên cứu trong một số mô hình ung thư thực nghiệm và được chứng minh có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u gây ra bởi tế bào ung thư Sarcoma TG-180 ở chuột nhắt trắng [7]. Đầu năm 2010, một nhóm nghiên cứu Nhật Bản và Mỹ đã thông báo dịch chiết nước lá cây Đu đủ có tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư người như ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư máu,... Chính bởi công dụng chữa bệnh củ ều đề tài nghiên cứu đã tập trung xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học củ chủ yếu là bộ phận lá và quả cây Đu đủ cái. Thế nhưng vẫn còn rất ít nghiên cứu về lá của cây Đu đủ đực. Đối với việc sử dụng cây Đu đủ hiện nay để chữa bệnh vẫn chỉ theo kinh nghiệ ọ ứng minh. Vì 2 vậy, việc tìm hiểu thành phần hóa học và cao hơn nữa là chứng minh được thành phần hoạt chất cụ thể của cây Đu đủ là một việc làm hết sức cần thiết, tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam làm thuốc điều trị các căn bệnh hiểm nghèo, trong đó có bệnh ung thư. Do đó, tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học dịch chiết ethyl acetate cây Đu đủ đực (Carica papaya L.) thu hái tại Quảng Nam - Đà Nẵng”. 2. Mục tiêu nghiên cứu chiết ethyl acetate lá Đu đủ đực (Carica papaya L. 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu - Lá Đu đủ ảng Nam-Đà Nẵng. dung môi ethyl acetate. Từ dịch chiết này, tiến hành định danh các hợp chất hoá học ở quy mô phòng thí nghiệm. - Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết ethyl acetate trên 3 dòng tế bào ung thư phổi, ung thư gan, ung thư vú. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu 4.1. - Phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên. - Nghiên cứu trên mạng Internet, tham khảo các công trình nghiên cứu trên thế giới về loài cây này. - Tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học, ứng dụng của các bộ phận của cây Đu đủ. 4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm - Các phương pháp lựa chọn và xử lý mẫu thực nghiệm; - Các phương pháp chiết mẫu gồm ngâm dầm cổ điển, chiết soxhlet và chiết siêu âm; - Các phương pháp định danh thành phần hóa học; - gây độc tế bào; - Các phương pháp xử lý số liệu bằng toán học. 3 5. Bố cục của luận văn Khóa luận gồm 46 trang, 15 bảng, 10 hình ảnh, 36 tài liệu tham khảo. Với: Phần mở đầu ( 3 trang) Chương 1- Tổng quan ( 11 trang) Chương 2 – Những nghiên cứu thực nghiệm ( 12 trang) Chương 3 – Kết quả và thảo luận ( 13 trang) Kết luận và kiến nghị ( 1 trang) Tài liệu tham khảo (1 trang) 4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ Đu đủ (Carica Papaya L.), thuộc họ Đu đủ (Caricaceae). Nguồn gốc Châu Mỹ được trồng khắp nơi ở nước ta. Họ Đu đủ (Caricaceae) trên thế giới gồm có 4 chi và 45 loài [28]. Phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở nước ta có một chi và một loài [1]. Cây Đu đủ có tên khoa học là Carica papaya Linn. Cây nhỏ hoặc nhỡ, cao từ 2-4 mét, thân thẳng, không phân nhánh. Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn. Cuống lá rất dài, xẻ 5-7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành nhiều thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn [1]. Cây Đu đủ còn được gọi Thù đủ, Phiên mộc, Cà lào, Phiên qua, Phan qua thụ, Lô hong phlê (Campuchia), Mắc hung (Lào), Má hống (Thái). Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng Đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái. Vài cây Đu đủ cũng có thể thuộc cả ba loại nói trên. Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa (Hình 1.1). Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra như khô hạn và thay đổi nhiệt độ [8]. Ở Việt Nam, một số giống Đu đủ hiện nay đang được trồng bao gồm: - Giống Đu đủ ta: bao gồm các giống Đu đủ có từ lâu đời ở nước ta. Đặc tính chung của nhóm cây này là sinh trưởng khỏe, lá xanh đậm, song phiến lá mỏng, cuống lá dài, mảnh nhỏ và thường có màu xanh. Thịt quả màu vàng, mỏng, năng suất thấp. - Giống Đu đủ Trung Quốc: là giống nhập từ Quảng Đông, Quảng Tây Trung Quốc. Cây thấp, sinh trưởng trung bình, năng suất khá cao. Quả dài, thuôn dài, thịt quả dày trung bình, thịt quả có màu vàng đến đỏ. Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày. - Giống Đu đủ Đài Loan: là giống mới được nhập trồng trong thời gian gần đây. Cây thấp, sinh trưởng khỏe, ít nhiễm bệnh, cho năng suất cao, khoảng 60-70 kg quả/ cây. Thịt quả màu đỏ, ngọt, thơm, mềm mà không nát, vỏ quả cứng dễ bảo quản và vận chuyển. Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày [11]. A: hoa cái B: hoa lưỡng tính C: hoa đực 5 D: trái của cây cái E: trái lưỡng tính F: cây đực Đu 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ TRONG NƢỚC Năm 1983, Nguyễn Tường Vân và cộng sự đã chiết xuất và xác định được alcaloid carpaine trong lá Đu đủ [12]. Năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật HPLC phân tích các chất carotenoid trong lá Đu đủ. Kết quả cho thấy β-carotene, luteine chiếm tỷ lệ tương ứng là 57,050% và 11,864% so với tổng các chất carotenoid, tuy nhiên không xác định được lycopene [8]. Năm 2012, Trần Thanh Hà và Trịnh Thị Điệp đã phân lập được 4 chất từ phân đoạn chiết n-hexanee của lá Đu đủ. Bao gồm, β-sitosterol, daucosterol, cycloart-23ene-3β,25-diol (sterculin A) và cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol. Trong đó, sterculin A và cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol là 2 triterpene lần đầu tiên phân lập từ lá Đu đủ [5]. Theo nghiên cứu Nguyễn Văn Rư, Vũ Quang Thái đã tách chiết chymopapain từ nhựa quả Đu đủ xanh và chế thử thành dạng bột pha tiêm [9]. bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexanee, CH2Cl2, EtOAc, buthanol). Từ cặn chiết CH2Cl2 phân lập được 6 hợp chất: danielone, carpainone, acid pluchoic, ap 1.3. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ NGOÀI NƢỚC [30]. 6 Năm 1979, Chung-Shih Tang đã phân lập được 2 alcaloid piperideine là dehydrocarpaine I và dehydrocarpaine II từ lá Đu đủ [31]. [29]. t như sau: acid caffeic, acid p-coumaric, acid protocatechuic, kaempferol, quercetin và 5,7-dimethoxycoumair [18]. [25]: carotene, palmatic, stearic, lioleic, linolenic, benzylisothiocyanate, β-sitost alcaloid carpaine, pseudocarpain, glucose, fructose, xylitol, enzym proteolytic, papain, chemopapain, glutamine cyclotransferase, chymopapain A, lysozyme. Năm 2012, Adlin Afzan và cộng sự đã xác định được 12 hợp chất có trong lá Đu đủ [16] bao gồm alcaloid piperideine là carpaine; acid hữu cơ: acid malic, acid quinic; dẫn xuất của acid malic: caffeoyl malate, ρ-coumaroyl malate (isomer 1), ρ-coumaroyl malate (isomer 2), feruloyl malate (isomer 1), feruloyl malate (isomer 2); flavonol glycoside: quercetin-3-O-(2’’,6’’-di-O-rhamnopyranosyl) glucopyranoside (manghaslin), kaempferol-3-O- (2’’,6’’-di-O-rhamnopyranosyl) glucopyranoside (clitorin), quercetin-3-O-rutinoside (rutin), kaempferol-3-O-rutinoside (nicotiflorin). Năm 2013, Ikeyi Adachukwu và cộng sự đã phân tích thành phần hóa học trong lá Đu đủ. Kết quả cho thấy có sự xuất hiện của các hợp chất alcaloid, flavonoid, saponin, tannin và glycoside bằng các thuốc thử đặc trưng [15]. Năm 2015, Đu đủ ở Nigeria. Cho kết quả trong hoa chứa saponin (0.07%), alkaloid (0.05%), tannin (0.002%) và flavonoid (2.8%). Ngoài ra còn chứa các nguyên tố vô cơ Na, Ca, Mg, P và các vitamin như B1, B2, B3, C [19]. Năm 2017, Sunday Ahamefula Ezekwe và cộng sự đã xác định các hợp chất hóa học trong quả Đu đủ xanh bằng phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ GC-MS bao gồm: octadecanoic acid (23,84%), hexadecenoic acid (19,17%) và hexadecanoic acid, methyl ester (18,25%) [20]. Dưới đây là công thức cấu tạo các hợp chất hóa học trong cây Đu đủ: 7 β-sitosterol Daucosterol Sterculin A Cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol Carpaine Pseudocarpaine Dehydrocarpaine I Dehydrocarpaine II . Công thức cấu tạo các hợp chất trong cây Đu đủ 8 Bảng 1.1. Thành phần hóa học cây Đu đủ Nhóm chất Thành phần hóa học Phenolic, 5,7-dimetthoxy coumarin, Axit Protocatechui, Axit ρ-coumaric, Axit Flavonoid Caffeic, Kaempferol, Quercetin Choline Alcaloid Glycoside Prunasin, Sambunigrin Sterol β-sitosterol, Daucosterol Triterpene Sterculin A và Cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol Acid hữu cơ Acid malic, Acid quinic; dẫn xuất của Acid malic: caffeoyl malate, ρcoumaroyl malate (isomer 1), ρ-coumaroyl malate (isomer 2), feruloyl malate (isomer 1), feruloyl malate (isomer 2) Như vậy, thành phần hóa học các bộ phận của cây Đu đủ cái đã được nghiên cứu. Các công trình nghiên cứu chủ yếu là lá, quả và các bộ phận khác như rễ, thân, hạt,… cây Đu đủ cái. Tuy nhiên nghiên cứu về các bộ phận như hoa và lá cây Đu đủ đực lại rất ít. 1.4. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ Các phương pháp nghiên cứu về hoạt tính sinh học, dược lý của thực vật được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm [3, 39, 49]. Hoạt tính sinh học các bộ phận của cây Đu đủ như lá, quả được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới công bố khá phong phú.  có tác dụng kháng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T.rubrum và Staphylococcus aureus [1]. Năm 2012, Moses Alo và cộng sự đã chứng minh dịch chiết lá đu đủ bằng nước lạnh và ethanol đều có hoạt tính ức chế vi khuẩn Salmonella typhi [17]. Năm 2015, K. Kayalvizhi và cộng sự đã công bố hoạt tính kháng khuẩn của lá Đu đủ cái thu hái ở Ấn Độ đối với các vi khuẩn gram dương và gram âm. Kết quả cho 9 thấy dịch chiết ethanol lá Đu đủ cái ức chế các vi khuẩn gram dương: Staphylococcus aureus và Staphylococcus faecalis và các vi khuẩn gram âm: Escherichia coli, Klebsiella pneumonis, Enterobacter aerogenes, Salmonella paratyphi, Vibro chloreae [26]. Như vậy, kết quả các nghiên cứu khẳng định hầu hết các bộ phận cây Đu đủ cái có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm. Chưa có công bố về hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của cây Đu đủ đực.  .ết với cồn từ lá Đu đủ có tác dụng ức chế sự phát triển u báng gây bởi tế bào ung thư Sarcoma TG -180 ở chuột nhắt trắng. Làm giảm thể tích u, giảm mật độ tế bào ung thư, giảm sự tăng sinh khối u [7]. Theo Đỗ Thị Thảo (năm 2006), cặn chiết methanol của lá Đu đủ chỉ có tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi LU với IC50 = 19,2 μg/mL, và không có tác dụng gây độc các dòng tế bào ung thư khác như ung thư biểu mô KB, ung thư vú MCF-7, ung thư máu cấp tính HL-60, ung thư tiền liệt tuyến LNCaP, ung thư gan Hepa1c1c7. Đồng thời cặn chiết methanol cũng không gây độc với tế bào gốc tách từ phôi chuột [10]. = 2,8 μg/mL. Đồng thời nghiên cứu này đã chứng minh ảnh hưởng của protein có chứa RIPs lên gen p53 và Bcl-2, ảnh hưởng của 50 các protein đến quá trình phân bào của dòng tế bào ung thư vú T47D. Mức độ biểu hiện của p53 tăng lên đến 59,4% còn protein Bcl-2 giảm xuống còn 63%. Các kết quả này cho thấy RIPs có khả năng dẫn đến quá trình tự chết của tế bào ung thư [36]. ịnh được phân đoạn dịch chiết CH2Cl2 của lá Đu đủ có khả năng gây độc tế bào ung thư biểu mô KB (IC50 = 18,44 µg/mL), ung thư phổi LU-1 (IC50 = 18,21 µg/mL) và ung thư vú MCF-7 (IC50 ợp chất carpaine và pseudocarpaine phân lập từ phân đoạn CH2Cl2 của lá Đu đủ lần đầu tiên được chứng minh có hoạt tính gây độc mạnh trên cả bốn dòng tế bào ung thư người: ung thư biểu mô KB, ung thư máu HL-60, ung thư phổi LU-1, ung thư vú MCF-7 (IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/mL) [6]. Các nghiên cứu ở điều kiện in vitro về việc dùng Đu đủ để ức chế, tiêu diệt tế bào ung thư được tóm tắt trong Bảng 1.2: 10 Bảng 1.2. Tác dụng của chất chiết từ Đu đủ lên các dòng tế bào ung thƣ khác nhau trong điều kiện in vitro Dòng tế bào ung thƣ Tế bào ung thư vú T47D Phƣơng pháp xử lý Kết quả Phân mảnh - Các phân mảnh protein gây độc protein RIPS tế bào (IC50 = 2,8 µg/mL) phân lập từ lá - Kích thích quá trình tự chết với biểu hiện của p53 (tăng 59,4%) và BCl-2 (giảm 63%) - Tế bào ung thư dạ dày - Ung thư tuyến tụy - Ung thư buồng trứng Dịch chiết nước của lá Đu đủ (1,25-27 mg/mL) Tác dụng chống ung thư, nồng độ tác dụng phụ thuộc vào từng dòng tế bào ung thư và ngăn chặn sự tổng hợp AND - Tế bào lymphoma - Ung thư vú MCF-7 - Ung thư tử cung - Tế bào T - Tế bào lymphoma - Bệnh bạch cầu mãn tính - Ung thư gan Hep G2 - Ung thư phổi PC 14 - Ung thư tuyến tụy Dịch chiết Ức chế sự tăng sinh của các dòng nước của lá Đu tế bào khối u rắn và tế bào tạo máu đủ (0,625-20 Dịch chiết nước lá Đu đủ làm giảm mg/mL) cytokine IL-2 và IL-4, trong khi đó lại làm tăng cytokine Th1 như là IL-12p40, IL-12p70, INF-γ và TNF-α - Ung thư biểu mô H2452 - Ung thư vú MCF-7 - Ung thư phổi LU-1 - Ung thư vú MCF-7 - Ung thư biểu mô KB Phân đoạn dichloromethan từ dịch chiết methanol lá Đu đủ Ức chế đáng kể sự phát triển của tế bào ung thư phổi (IC50 tương ứng 18,21 µg/mL), tế bào ung thư vú (IC50 tương ứng 19,16 µg/mL) và tế bào ung thư biểu mô (IC50 tương ứng 18,44 µg/mL) 11 - Ung thư biểu mô KB Chất tinh khiết Carpaine và Pseudocarpaine ức - Ung thư máu HL-60 Carpaine và chế đáng kể sự phát triển của tế Pseudocarpaine bào ung thư biểu mô (IC50 lần lượt phân lập từ lá tương ứng 1,13 và 1,66 µg/mL), tế - Ung thư phổi LU-1 - Ung thư vú MCF-7 Đu đủ bào ung thư máu (IC50 lần lượt tương ứng 2,94 và 3,49 µg/mL), tế bào ung thư phổi (IC50 lần lượt tương ứng 1,29 và 2,17 µg/mL) và tế bào ung thư vú (IC50 lần lượt tương ứng 1,34 và 2,43 µg/mL) Tóm tắt các kết quả nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào ung thư, cơ chế tác dụng của các nhóm chất glucosinolate, phenolic, flavonoid, carotenoid và alcaloid đã được tìm thấy trong các phần khác nhau của cây Đu đủ được thể hiện ở bảng 1.3. Bảng 1.3. Hoạt tính chống ung thƣ của phenolic, flavonoid và alcaloid trong Đu đủ Các hợp chất đã đƣợc chiết tách Hoạt tính chống ung thƣ của các hợp chất tinh khiết Nhóm chất: Phenolic, Flavonoid - Ức chế sự tăng sinh tế bào - Cảm ứng biểu hiện gen ức chế khối u 5,7-dimetthoxy coumarin: 0,14 mg/g - Tăng cường chức năng miễn dịch Acid Protocatechui: 0,11 mg/g Acid ρ-coumaric: 0,33 mg/g - Ức chế enzyme ở pha I và II trong chu kỳ phân bào Acid Caffeic: 0,25 mg/g - Ức chế sự kết dính tế bào và xâm lấn Kaempferol: 0,03 mg/g - Cảm ứng quá trình tự chết Quercetin: 0,04 mg/g - Ức chế sự truyền tín hiệu - Ngăn chặn sự hình thành mạch máu trong khối u. 12 Nhóm chất: Alcaloid Nghiên cứu in vitro có tác dụng ức chế các tế bào ung thư: Carpaine - Ung thư biểu mô KB Pseudocarpaine - Ung thư máu HL-60 - Ung thư phổi LU-1 - Ung thư vú MCF-7 Như vậy, các kết quả nghiên cứu đã khẳng định trong cây Đu đủ cái có nhiều hợp chất có hoạt tính chống ung thư.  các bộ phận khác nhau của cây Đu đủ bao gồm: quả chín, quả xanh, hạt và lá non. Hai tác nhân được sử dụng để đánh giá là DPPH và β-carotene. Kết quả cho thấy hoạt tính chống oxy hóa giảm dần theo thứ tự: lá non → quả xanh → quả chín → hạt. Tuy nhiên, các hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa còn chưa được phân lập [14]. Như vậy, kết quả các nghiên cứu khẳng định các bộ phận cây Đu đủ cái có hoạt tính chống oxy hóa. Tuy nhiên, các nghiên cứu này chủ yếu tập trung ở dịch chiết thô, nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất tinh khiết phân lập từ cây Đu đủ cái còn rất hạn chế. Chưa có nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của cây Đu đủ đực.  Năm 2008, Bamidele V và cộng sự đã công bố hoạt tính kháng viêm của dịch chiết cồn từ lá cây Đu đủ [33]. Năm 2013, Swati Patil và cộng sự đã công bố chất chiết