Tài liệu Khóa luận nghiên cứu phân lập chất β sitosterol glucosid từ phân đoạn dịch chiết chloroform của hoa đu đủ đực thu hái tại quảng nam – đà nẵng

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin chân cảm ơn đến cô giáo PGS.TS Giang Thị Kim Liên đã giúp đỡ và hướng dẫn em nhiệt tình trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Hóa, đặc biệt là các thầy cô công tác tại phòng thí nghiệm trường Đại học Sư phạm – đại học Đà Nẵng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình nghiên cứu thực hiện để tài. Trong quá trình thực hiện, do bước đầu làm quen với việc nghiên cứu nên không tránh khỏi sự thiếu sót, vì vậy em rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô để bài khóa luận được hoàn thiện hơn. Đà Nẵng, ngày 20 tháng 04 năm 2018 Tác giả luận văn Nguyễn Nhật Tuyến MỤC LỤC 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................... 1 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ ................................................................. 1 1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Đu đủ trong nước ................ 2 1.3. Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Đu đủ ngoài nước...................... 4 1.4. Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây Đu đủ ............................... 6 1.5. Các phương pháp nghiên cứu tính gây độc tế bào ........................................ 9 1.5.1 Phương pháp MTT ............................................................................. 9 1.5.2 Phương pháp SRB ............................................................................ 10 2. CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 11 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu ................................................ 11 2.1.1 Nguyên liệu ..................................................................................... 11 2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu ......................................................... 11 2.2. Phương pháp nghiên cứu......................................................................... 12 2.2.1 Phương pháp chiết mẫu thực vật ....................................................... 12 2.2.2 Phương pháp tách và tinh chế chất .................................................... 13 2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất ................... 13 2.3. Định tính một số lớp chất trong hoa Đu đủ đực ......................................... 13 2.3.1 Alkaloid .......................................................................................... 13 2.3.2 Flavonoid........................................................................................ 13 2.3.3 Coumarin ........................................................................................ 14 2.3.4 Saponin........................................................................................... 14 2.3.5 Đường khử ...................................................................................... 14 2.3.6 Polyphenol ...................................................................................... 14 2.3.7 Steroid ............................................................................................ 15 2.3.8 Axit hữu cơ ..................................................................................... 15 2.3.9 Chất béo.......................................................................................... 15 2.3.10 Carotene.......................................................................................... 15 2.3.11 Polysaccairid ................................................................................... 15 2.3.12 Iridoid ............................................................................................. 16 2.4. Sơ đồ điều chế các cao chiết .................................................................... 16 2.5. Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết chloroform ...................................... 18 2.5.1 Quy trình chiết xuất dịch chiết hoa Đu đủ đực để nghiên cứu tác dụng ức chế tế bào ung thư ........................................................................................ 18 2.5.2 Các dòng tế bào............................................................................... 18 2.5.3 Phương pháp ................................................................................... 18 2.5.4 Thử độc tế bào ................................................................................. 19 2.7. Chạy cột sắc ký phần cao chloroform ....................................................... 19 3. CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 21 3.1. Kết quả định tính các lớp chất trong hoa Đu đủ đực................................... 21 3.2. Thử hoạt tính sinh học của các dịch chiết chloroform từ hoa Đu đủ đực ...... 22 3.3. Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa học dịch chiết chloroform hoa Đu đủ đực bằng phương pháp GC-MS ........................................................................ 24 3.4. Phân lập các chất trong phân đoạn dịch chiết chloroform ........................... 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................... 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................. 36 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT d: Doublet (NMR) J(Hz): Hằng số tương tác (NMR) Rf: Retention factor s: Singlet (NMR) ppm: Parts per million δ: Độ chuyển dịch hóa học (NMR) BuOH: Butanol CD3OD: Methanol- D CHCl3: chloroform D: Dichlomethane DMSO: Dimethyl sunfoxide DEPT: Distortionless enhancement by polarisation transfer EtOAc: Ethyl acetate EtOH: Ethanol GC-MS: Gas chromatography-Mass spectrometry HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC: Heteronuclear Single Quantum Corelation MeOH: Methanol Me: Methyl NMR: Nuclear magnetic resonance UV: Ultraviolet DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Số hiệu Tên bảng Trang 3.1. Định tính các lớp chất trong hoa Đu đủ đực 22 3.2. Hoạt tính độc tế bào của phân đoạn dịch chiết chloroform 23 3.3. Thành phần hóa học trong dịch chiết chloroform hoa Đu đủ đực 26 bảng 3.4. Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và13C-NMR (125 MHz) của β-sitosterol glucoside và chất so sánh DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH 34 Số hiệu Tên hình Trang 1.1. Hình ảnh Đu đủ 2 1.2. β- sitosterol 3 1.3. Daucosterol 3 1.4. Sterculin A 3 1.5. Cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)-diol 3 1.6. Carpaine 4 1.7. Pseudocarpaine 4 1.8. Dehydrocarpaine I 4 1.9. Dehydrocarpaine II 4 1.10. Prunasin 4 1.11. Sambunigrin 4 1.12. 5,7-dimethoxycoumair 4 1.13. Axit protocatechuic 4 1.14. Axit chlorogenic 5 2.1. Hoa Đu đủ đực và Bột hoa Đu đủ đực 11 2.2. Sơ đồ điều chế các cao chiết 16 hình 2.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn dịch chiết chloroform hoa Đu đủ đực 20 3.1. Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết chloroform hoa Đu đủ đực 25 3.2. Phổ MS của 2(3H)-Furanonedihydro-3-hydroxy-4,4-dimetyl 27 3.3. Phổ MS của 3,3,5,5-tetrametylcyclohexanol 28 3.4. Phổ MS của 2H-Quinolizine-1-metanol, octahydro 28 3.5. Phổ IR của chất β-sitosterol glucoside 29 3.6. Phổ 1H-NMR của β-sitosterol glucoside 30 3.7. Phổ 13C-NMR của β-sitosterol glucoside 31 3.8. Phổ HSQC của β-sitosterol glucoside 32 3.9. Phổ HMBC của β-sitosterol glucoside 33 MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết của đề tài Cây Đu đủ (Carica papaya Linn) là một loại cây ăn quả có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ. Hiện nay, Đu đủ được trồng ở các nước vùng nhiệt đới, những nơi có nhiệt độ bình quân trong năm không thấp hơn 150C. Sản lượng Đu đủ trên thế giới khoảng trên 5 triệu tấn quả/năm. Ở Việt Nam, cây Đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh miền Bắc và miền Nam. Tuy nhiên, chúng được trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên các loại đất phù sa. Các tỉnh trồng nhiều Đu đủ như: Hà Nội, Hưng Yên, Hà Nam, Vĩnh Phúc, Tiền Giang, Cần Thơ, các tỉnh Tây Nguyên,… Diện tích trồng Đu đủ của cả nước ước khoảng 10000 – 17000 hecta với sản lượng khoảng 200 – 350 nghìn tấn quả. Cây Đu đủ có lợi thế là loại cây dễ trồng, ra quả sớm, năng suất cao đồng thời toàn bộ thân, lá, quả đều được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau. Ngoài việc lấy quả tươi, dùng làm nguyên liệu cho chế biến, Đu đủ còn được trồng để lấy nhựa, dùng làm thức ăn chăn nuôi. Trong dân gian lá cây Đu đủ được sử dụng để sát khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chữa sốt rét, trừ giun sán… Đã có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá Đu đủ. Lá Đu đủ được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa rất mạnh. Hoạt tính chống oxy hóa này do các hợp chất phenol gây ra. Lá Đu đủ có hoạt tính kháng khuẩn tốt, có khả năng kháng nhiều loại vi khuẩn gram âm, gram dương, các loại nấm. Ngoài ra, lá Đu đủ còn có khả năng kháng viêm, giảm đau. Ở nước ta, cao chiết với cồn từ lá Đu đủ được nghiên cứu trong một số mô hình ung thư thực nghiệm và được chứng minh có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u gây bởi tế bào ung thư Sarcoma TG-180 ở chuột nhắt trắng. Người dân nước Úc đã dùng lá Đu đủ chữa trị bệnh ung thư. Đầu năm 2010, một nhóm nghiên cứu Nhật Bản và Mỹ đã thông báo dịch chiết nước lá cây Đu đủ có tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư người như ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư máu,… Ngoài ra, dịch chiết từ lá Đu đủ còn có tác dụng hỗ trợ hệ miễn dịch để tấn công vào các tế bào ung thư. Bằng cách thúc đẩy sự gia tăng các sản phẩm cytokine dạng Th1 như là IL-12p40, IL-12p70, INF-γ và TNF-α, các cytokine này có khả năng chống lại khối u. Gần đây, người dân địa phương ở Quảng Nam – Đà Nẵng còn sử dụng hoa cây Đu đủ đực để điều trị các bệnh về đường hô hấp như viêm họng, ho… Ngoài ra, hoa Đu đủ đực còn được coi như thần dược để hỗ trợ điều trị bệnh ung thư như: ung thư phổi, ung thư vú và ung thư gan… Chính bởi công dụng chữa bệnh của cây Đu đủ như trên, có rất nhiều đề tài nghiên cứu đã tập trung xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài cây này. Thế nhưng vẫn còn rất ít nghiên cứu về bộ phận hoa của chúng. Việc sử dụng hoa đủ đực hiện nay vẫn chỉ theo kinh nghiệm dân gian. Vì vậy, việc tìm hiểu thành phần hóa học và cao hơn nữa là chứng minh được thành phần hoạt chất cụ thể của hoa Đu đủ đực là một việc làm hết sức cần thiết, tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam làm thuốc điều trị các căn bệnh hiểm nghèo, trong đó có bệnh ung thư. Trong điều kiện cho phép của luận văn tốt nghiệp tôi chọn đề tài “Nghiên cứu phân lập chất β-sitosterol glucosid từ phân đoạn dịch chiết chloroform của hoa Đu đủ đực thu hái tại Quảng Nam – Đà Nẵng” làm đề tài luận văn của mình. 2. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập β-sitosterol glucoside từ phân đoạn dịch chiết chloroform của hoa Đu đủ đực, xác định cấu trúc hoá học, góp phần cung cấp các thông tin có ý nghĩa khoa học về thành phần hóa học của hoa Đu đủ, nâng cao giá trị sử dụng của loài thực vật này trong thực tiễn. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu -Hoa Đu đủ đực được thu hái tại Quảng Nam-Đà Nẵng. -Phân đoạn dịch chiết từ loài hoa trên với dung môi chloroform. -Hợp chất β-sitosterol glucoside phân lập từ dịch chiết nghiên cứu. 4. Phương pháp nghiên cứu 4.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết - Phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên. - Nghiên cứu trên mạng Internet, tham khảo các công trình nghiên cứu trên thế giới về loài cây này. - Tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học, ứng dụng của các bộ phận của cây Đu đủ. 4.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm -Các phương pháp xử lý mẫu thực nghiệm -Các phương pháp chiết mẫu, phân lập các hợp chất hữu cơ -Các phương pháp phân tích sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột -Các phương pháp nghiên cứu cấu tạo hợp chất hóa học: kết hợp các phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), sắc ký lỏng – khối phổ (LC-MS) và các phương pháp khác. 5. Bố cục của luận văn Luận văn gồm: 40 trang, 4 bảng, 26 hình, ảnh, 46 tài liệu tham khảo và 19 phụ lục. Với: -Phần mở đầu (3 trang) -Chương 1- Tổng quan (11 trang) -Chương 2 – Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (10 trang) -Chương 3 – Kết quả và thảo luận (14 trang) -Kết luận và kiến nghị (1 trang) -Tài liệu tham khảo (5 trang) 1. CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ 1.1. Đu đủ (Carica Papaya L), thuộc họ Đu đủ (Caricaceae), nguồn gốc Châu Mỹ được trồng khắp nơi ở nước ta.Họ Đu đủ (Caricaceae) trên thế giới gồm có 4 chi và 45 loài [16]. Cây Đu đủ có tên khoa học là Carica papaya Linn. Cây nhỏ hoặc nhỡ, cao từ 2 4 mét, thân thẳng, không phân nhánh. Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn. Cuống lá rất dài, xẻ 5 - 7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành nhiều thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn [1]. Cây Đu đủ còn được gọi thù đủ ở Huế, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan qua thụ, lô hong phlê (Campuchia), mắc hung (Lào), má hống (Thái). Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng Đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái. Vài cây Đu đủ cũng có thể trổ cả ba loại hoa nói trên. Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa. Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra như khô hạn và thay đổi nhiệt độ [7]. Ở Việt Nam, một số giống Đu đủ hiện nay đang được trồng bao gồm: * Giống Đu đủ ta: bao gồm các giống Đu đủ có từ lâu đời ở nước ta. Đặc tính chung của nhóm cây này là sinh trưởng khỏe, lá xanh đậm, song phiến lá mỏng, cuống lá dài, mảnh nhỏ và thường có màu xanh. Thịt quả màu vàng, mỏng, năng suất thấp. * Giống Đu đủ Mêhico: là giống nhập nội trong những năm 70 của thế kỷ 20. Quả dài, tương đối đặc ruột, thịt quả màu vàng, năng suất cao. Lá xanh đậm, phiến lá dày, cuống lá to, màu xanh. * Giống Đu đủ So Lo: còn có tên gọi khác là Đu đủ Mỹ, thân cây cao trung bình, sinh trưởng khỏe. Quả hình quả lê, to, thịt quả màu vàng, chất lượng tốt, năng suất cao, là giống yêu cầu nhiệt cao nên được trồng chủ yếu ở các tỉnh phía Nam. * Giống Đu đủ Trung Quốc: là giống nhập từ Quảng Đông, Quảng Tây Trung Quốc. Cây thấp, sinh trưởng trung bình, năng suất khá cao. Quả dài, thuôn dài, thịt quả dày trung bình, thịt quả có màu vàng đến đỏ. Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày. * Giống Đu đủ Thái Lan: là giống được nhập trồng trong thời gian gần đây. Cây thấp, năng suất cao, quả to, ruột quả màu vàng, chất lượng tốt. Tuy nhiên giống này dễ bị nhiễm bệnh khảm lá. 1 * Giống Đu đủ Đài Loan: là giống mới được nhập trồng trong thời gian gần đây. Cây thấp, sinh trưởng khỏe, ít nhiễm bệnh, cho năng suất cao, khoảng 60 – 70 kg quả/ cây. Thịt quả màu đỏ, ngọt, thơm, mềm mà không nát, vỏ quả cứng dễ bảo quản và vận chuyển. Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày [11]. A: hoa cái D: trái của cây cái B: hoa lưỡng tính E: trái lưỡng tính C: hoa đực F: cây đực Hình 1.1. Hình ảnh Đu đủ 1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Đu đủ trong nước Năm 1983, Nguyễn Tường Vân và cộng sự đã chiết xuất và xác định được alkaloid carpaine trong lá Đu đủ [13]. Năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc đã sử dụng kỹ thuật HPLC phân tích các chất carotenoid trong lá Đu đủ. Kết quả cho thấy β-carotene, luteine chiếm tỷ lệ tương ứng là 57,05 và 11,864% so với tổng các chất carotenoid, tuy nhiên không xác định được lycopene [9]. Năm 2012, Trần Thanh Hà đã phân lập được 4 chất từ phân đoạn chiết n-hexan của lá Đu đủ. Bao gồm, β- sitosterol, daucosterol, cycloart -23-ene-3β,25-diol (sterculin A) và cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)-diol. Trong đó, sterculin A và cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)- diol là 2 tritecpen lần đầu tiên phân lập từ lá Đu đủ [4]. 2 Theo nghiên cứu Nguyễn Văn Rư, Vũ Quang Thái đã tách chiết chymopapain từ nhựa quả Đu đủ xanh và chế thử thành dạng bột pha tiêm [10]. Hình 1.2.β- sitosterol Hình 1.4. Sterculin A Hình 1.3. Daucosterol Hình 1.5.Cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)-diol Năm 2014, Hồ Thị Hà đã tiến hành chiết phân đoạn dịch chiết MeOH từ lá Đu đủ bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan, CH2Cl2, EtOAc, buthanol). Từ cặn chiết CH2Cl2 phân lập được 6 hợp chất: danielone, carpainone, axit pluchoic, apocynol A, carpaine, pseudocarpaine. Trong đó, carpainone là hợp chất mới và 2 chất danielone và apocynol A lần đầu tiên được chiết ra từ lá Đu đủ [5]. Năm 2015, Giang Thị Kim Liên và Đỗ Thị Lệ Uyên khảo sát thành phần hóa học của hoa Đu đủ đực. Kết quả cho thấy sự có mặt của alkaloid, este, acid béo, một số sterol trong hoa Đu đủ đực thu hái tại Đà Nẵng [6]. 3 1.3. Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Đu đủ ngoài nước Trên thế giới, năm 1965, Govindachari Go, Nagarajan và Viswanathan đã xác định được cấu trúc của carpaine và pseudocarpaine là alkaloid được chiết xuất từ lá Đu đủ [27]. Hình 1.6. Carpaine Hình 1.7. Pseudocarpaine Năm 1979, Chung – Shih Tang đã phân lập được 2 alkaloid piperideine là dehydrocarpaine I và dehydrocarpaine II từ lá Đu đủ [22]. Cấu trúc của chúng. N N H Hình 1.8.Dehydrocarpaine I Hình 1.9. Dehydrocarpaine II Năm 2002, David và cộng sự đã xác định được glycosid là prunasin và sambunigrin trong lá và thân Đu đủ [23]. Hình 1.10.Prunasin Hình 1.11.Sambunigrin Năm 2007, Antonella Canini và cộng sự nghiên cứu các hợp chất phenol trong lá Đu đủ cho kết quả các hợp chất như sau: axit caffeic: axit p - coumarin; axit protocatechuic; kaempferol; quercetin và 5,7- dimethoxycoumair. Cấu trúc phân tử của một số phenolic trong lá Đu đủ như sau [19]. 4 Hình 1.12. 5,7-dimethoxycoumair Hình 1.13. Axit protocatechuic Hình 1.14. Axit chlorogenic Năm 2008 Krishna K.L và cộng sự đã tổng hợp các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học các bộ phân cây Đu đủ [30]. • Quả: protein, chất béo, xenluloza, carbohydrate, chất khoáng, Ca, P, Fe, vitamin C, B, B2, niacin và carotene, amino axit, acit citric, acid malic(quả xanh), linalool, benzylisothiocyanate, cis và trans 2,6-dimethyl -3,6 epoxy-7 octen-2-ol, alkaloid, carpain, benzy–β-D-glucoside, 2-phenylethyl–β-D-glucoside, 4-hydroxyphenyl-2 ethyl –β-D-glucoside và 4 đồng phân benzyl-β-D-glucoside. • Nước ép quả: N-butyric, n-haxanoic và n-octanoic acid, lipid, các acid myristic, palmatic, stearic, lioleic, linolenic, cis-vaccenic và oleic. • Hạt: protein, chất xơ, dầu, carpaine, benzylisothiocyanate, benzylglucosinolate, glucotropacolin, benzylthiourea, hentriacontane, β-sitosterol, caricin và enzym myrosin, acid fatty. • Rễ: carposide và enzym myrosin. • Lá: alkaloid carpain, pseudocarpain và dehydrocarpain I và II, choline, carposide, vitamin C, E. • Vỏ cây: β-sitosterol, glucose, fructose, sucrose, galactose và xylitol. • Nhựa mủ: papain và chemopapain, glutamine cyclotransferase, chymopapain A, B và C, peptid A và B và lysozyme, enzym proteolytic. 5 Năm 2015, Stephen Chinwendu và cộng sự công bố “Nghiên cứu thành phần hóa học của hoa Đu đủ ở Nigeria”. Cho kết quả trong hoa chứa saponin(0.07%), alkaloid(0.05%), tannin(0.002%) và flavonoid(2.8%). Ngoài ra còn chứa các nguyên tố vô cơ Na, Ca, Mg, P và các vitamin như B1, B2, B3, C [40]. Cũng trong năm 2015, Marline Nainggolan, Kasmirulcông bố kết quả trong hoa Đu đủ đực có chứa các thành phần gồm triterpenoids / steroid, flavonoid, tannin, và glycosides, saponin [33]. 1.4. Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây Đu đủ Các phương pháp nghiên cứu về hoạt tính sinh học, dược lý của thực vậy được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm [2], [3], [18], [29]. Hoạt tính sinh học của các bộ phận của cây Đu đủ như lá, quả, nhựa được các nhà khoa học trên thế giới công bố khá phong phú.  Tác dụng trị giun sán Năm 1994, Satrija và cộng sự nghiên cứu tác dụng trị giun sán của nhựa Đu đủ đã được thử nghiệm để diệt giun sán ở súc vật [40]. Năm 2001, Kermanshai và cộng sự nghiên cứu dịch chiết từ hạt Đu đủ được thử nghiệm để trị sán Caenorhabdi tiselegans. Kết quả cho thấy trong hạt có benzyl isothiocynat (BITC) là hoạt chất chính có tác dụng diệt giun sán. Các phần khác nhau của cây cũng đã được thử nghiệm về hoạt tính diệt giun Ascaridia galli nhiễm ở gia cầm [31].  Tác dụng hạ huyết áp Năm 2000, Eno AE và cộng sự nghiên cứu dịch chiết ethanol từ trái Đu đủ xanh được thử nghiệm trên chuột cống trắng đực. Các kết quả nghiên cứu cho rằng nước ép từ quả Đu đủ gây hạ huyết áp do hoạt tính trên các thụ thể α-adrenoceptive [24].  Tác dụng kháng sinh, kháng nấm Năm 1997, Giordani và cộng sự nghiên cứu tác dụng của nhựa Đu đủ ức chế sự tăng trưởng của nấm Candida albicans khi thêm vào môi trường cấy nấm [26]. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2006) công bố nghiên cứu cao lá Đu đủ có tác dụng kháng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T. rubrum và Staphylococcus aureus. Cao chiết từ vỏ và hạt có tác dụng kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Shigella flexneri. Benzyl isothiocyanate phân lập từ Đu đủ, ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn gram 6 dương, gram âm như Escherichia coli, Penicillium notatum và Shigella. Rễ Đu đủ có tác dụng kháng khuẩn yếu [1]. Năm 2011, Rahman và cộng sự nghiên cứu dịch chiết bằng ethanol 95% của lá và thân Đu đủ được thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn gram âm và gram dương tại nồng độ 5 và 10 mg/ml [38]. Năm 2014, Hồ Thị Hà đã chứng minh hợp chất pseudocarpaine có khả năng kháng vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus với IC50 = 80 µg/ml, không thể hiện hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn gram dương, gram âm và nấm khác ở nồng độ chất thử cao nhất là 128 µg/ml (với IC50 > 128 µg/ml) [5].  Tác dụng trị u bướu, ung thư Năm 2001, Tác giả Phạm Kim Mãn và cộng sự đã chứng minh cao chiết với cồn từ lá Đu đủ có tác dụng ức chế sự phát triển u báng gây bởi tế bào ung thư Sarcoma TG -180 ở chuột nhắt trắng, làm giảm thể tích u, giảm mật độ tế bào ung thư, giảm sự tăng sinh khối u [8]. Theo Đỗ Thị Thảo (năm 2006), cặn chiết methanol của lá Đu đủ chỉ có tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi LU với IC50 = 19,2 μg/ml, và không có tác dụng gây độc các dòng tế bào ung thư khác như ung thư biểu mô KB, ung thư vú MCF-7, ung thư máu cấp tính HL-60, ung thư tiền liệt tuyến LNCaP, ung thư gan Hepa1c1c7. Đồng thời cặn chiết methanol cũng không gây độc với tế bào gốc tách từ phôi chuột [12]. Năm 2002, Rahmat và cộng sự đã kiểm tra khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư vú, ung thư gan bằng lycopene tinh khiết, lycopene tách chiết từ quả Đu đủ và dưa hấu, và nước ép quả Đu đủ [17]. Năm 2006, Rumiyati và cộng sự đã chứng minh trong lá Đu đủ có chứa protein bất hoạt ribosome (RIPs). Các kết quả nghiên cứu cho thấy RIPs có khả năng dẫn đến quá trình tự chết của tế bào ung thư [39]. Năm 2014, Hồ Thị Hà đã xác định được phân đoạn cặn chiết CH2Cl2 của lá Đu đủ có khả năng gây độc tế bào ung thư biểu mô KB (IC50 = 18,44 µg/ml), ung thư phổi LU1 (IC50 = 18,21 µg/ml) và ung thư vú MCF-7 (IC50 = 19,16 µg/ml). Đồng thời hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine phân lập từ cặn CH2Cl2 của lá Đu đủ lần đầu tiên được chứng minh có hoạt tính gây độc mạnh trên cả bốn dòng tế bào ung thư người: ung thư biểu mô KB, ung thư máu HL-60, ung thư phổi LU-1, ung thư vú MCF-7 (IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/ml) [5]. 7 Năm 2015, Marline Nainggolan và Kasmiru công bố nghiên cứu dịch chiết ethanol của hoa Đu đủ đực có tác dụng gây độc tế bào trên MCF-7 dòng tế bào ung thư vú [20].  Tác dụng chống oxi hóa Gốc tự do là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây ra nhiều loại bệnh trong cơ thể, trong đó có ung thư. Gốc tự do được tạo ra trong cơ thể bởi nhiều cách khác nhau như: ô nhiểm môi trường, chất phóng xạ, thuốc-hóa chất, căng thẳng thần kinh…. Năm 2010, Srikanth và cộng sự dùng nước để chiết các chất có trong lá Đu đủ. Chất chiết thu được đem thử hoạt tính chống oxy hóa bằng các phương pháp khác nhau [40]. Năm 2013, Maisarah và cộng sự nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa từ các bộ phận khác nhau của cây Đu đủ bao gồm: quả chín, quả xanh, hạt và lá non. Hai tác nhân được sử dụng để đánh giá là DPPH và β - carotene. Kết quả cho thấy hoạt tính chống oxy hóa giảm dần theo thứ tự: lá non →quả xanh → quả chín → hạt. Tuy nhiên, các hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa còn chưa được phân lập [35].  Các tác dụng dược lý khác Ngoài những hoạt tính sinh học trên, các bộ phận khác nhau của cây Đu đủ cũng đã được chứng minh có tác dụng như kháng virus sốt xuất huyết, tác dụng giảm thời gian đông máu, kháng viêm… Năm 2008, Bamidele V và cộng sự đã công bố hoạt tính kháng viêm của dịch chiết cồn từ lá cây Đu đủ [21].Năm 2013, Swati Patil và cộng sự đã công bố chất chiết lá Đu đủ bằng nước làm tăng số lượng tiểu cầu và làm giảm thời gian đông máu ở chuột [46]. Năm 2014, Hồ Thị Hà lần đầu tiên được chứng minh khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine (tương ứng là 386,5 và 778 RFU) ở nồng độ thử nghiệm cao nhất (tương ứng 20 và 30 µg/ml) nhưng không mạnh khi so với chất đối chứng là tamoxifen (là 3100 RFU ở nồng độ thử 20 µg/ml) [5].  Công dụng trong dân gian - Quả Đu đủ chín là món ăn bồi bổ và giúp sự tiêu hóa các chất thịt, các chất lòng trắng trứng. - Đu đủ xanh được nấu kỹ với thịt gà chữa viêm loét dạ dày. - Nhựa Đu đủ được dùng làm thuốc giun. - Lá Đu đủ được sử dụng làm mềm thịt khi nấu. 8 - Trong dân gian hoa Đu đủ đực tươi hoặc phơi khô hấp với đường phèn dùng chữa bệnh ho, viêm cuống phổi, khàn tiếng hoặc mất tiếng ở người lớn,nhất là ở trẻ em. Ngoài ra hoa Đu đủ đực được dùng để chửa sỏi thận hiệu quả [2], [7], [11], [16]. Nhận xét chung: Như vậy, hoạt tính dược lý và thành phần hóa học của cây Đu đủ đã được nghiên cứu. Tuy nhiên các công trình nghiên cứu chủ yếu là lá và quả Đu đủ, các công trình nghiên cứu hoa Đu đủ đực hầu như rất ít. 1.5. Các phương pháp nghiên cứu tính gây độc tế bào Hoạt tính gây độc tế bào được thử theo phương pháp của Scudiero D.A. và cộng sự [41]. Đây là phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được viện Ung thư Quốc gia (NIC) Maryland, Hoa kỳ xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn, nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Trong những năm gần đây, một số phương pháp so màu nhanh đã được miêu tả trong thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư ở mức độ in vitro, hiện nay hai phương pháp thường được sử dụng là: phương pháp MTT và phương pháp SRB. Trong đó, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phổ biến. 1.5.1 Phương pháp MTT Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí Immunological Methods năm 1983 [14]. Theo tác giả, muối tetrazolium được dùng để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào động vật. Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan. Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính xác cao. Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt động của tế bào. Tetrazolium (màu vàng) Formaran (màu tím) 9 1.5.2 Phương pháp SRB Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 để đánh giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứng dụng sàng lọc thuốc ở quy mô lớn. Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màu của SRB lên protein SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào, những mảnh vỡ tế bào không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm. Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào pH của các dư lượng amino acid của các protein. Dưới các điều kiện môi trường axit nhẹ, SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào đã được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như Tris-base để hòa tan và đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng. 10 2. CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 2.1. 2.1.1 Nguyên liệu Nguyên liệu hoa của cây Đu đủ đực được thu hái tại Quảng Nam- Đà Nẵng vào tháng 01 năm 2017. Hoa Đu đủ đực đã được định danh, sau khi được thu hái sẽ được rửa sạch, phơi, sấy khô và xay nhỏ thành bột để sử dụng cho nghiên cứu. Cây Đu đủ đực được chọn lấy hoa cao khoảng 1,5 m – 2,0 m có nhiều lá và hoa. Hoa Đu đủ đực nở theo chùm, màu trắng, hoa nở nhiều, còn nhiều nụ, không bị sâu. Cuống hoa hình trụ, màu xanh lục, thân xốp. Bột hoa Đu đủ đực hơi thô, màu vàng nhạt, được bảo quản trong bình hút ẩm. Hình 2.1. Hoa Đu đủ đực và Bột hoa Đu đủ đực 2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu Sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60GF254, độ dày 0,2mm. Phân lập các chất bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là silicagel cỡ hạt 0,040 – 0,063mm Merck và silicagel pha đảo RP-18. Các thiết bị xác định cấu trúc chất: Phổ khối GC-MS đo máy GCMS 2010 plusShimadzu. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H – NMR, 13C – NMR, HSQC và HMBC đo trên máy Bruker Avance – 500 MHz, chất chuẩn nội là TMS cho 1H – NMR và tín hiệu dung môi (CDCl3) cho 13C – NMR. Đèn tử ngoại (UV BIOBLOCK) bước sóng λ = 254nm và 365nm dùng để soi bản mỏng. Ngoài ra còn dùng một số trang thiết bị khác như máy quay cất chân không, máy sấy, máy nung, máy siêu âm, cân phân tích, cốc thủy tinh, bình tam giác, các loại pipet, bình định mức, giấy lọc, cột sắc kí,… 11