i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đề tài: “Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và tạo chế phẩm thô
của vi sinh vật sinh enzyme phytase từ đất thuộc địa bàn huyện Hòa Vang- thành
phố Đà Nẵng” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu nghiên cứu, kết quả điều tra, kết quả phân tích trung thực, chƣa
từng đƣợc công bố. Các số liệu liên quan đƣợc trích dẫn có ghi chú nguồn gốc, đã
công bố theo đúng quy định.
Đà Nẵng, tháng 05 năm 2018
Lê Trần Diệu Linh
ii
LỜI CẢM ƠN
Em xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô PGS.TS Đỗ Thu Hà
ngƣời đã luôn quan tâm và tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức, kinh
nghiệm quý báu cho em trong quá trình thực hiện khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô Khoa -Môi trƣờng - Đại học Sƣ PhạmĐại học Đà Nẵng đã quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất có thể giúp cho em hoàn
thành khóa luận.
Cuối cùng, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và anh chị
khóa trên đã luôn nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian
làm khóa luận.
Xin chân thành cảm ơn!
Lê Trần Diệu Linh
iii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii
MỤC LỤC ................................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ẢNH .........................................................................................vi
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... viii
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
1. ĐẶT VẤN ĐỀ......................................................................................................... 1
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU.................................................................................... 2
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI ..................................... 2
CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................... 3
1.1. AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE ........................................................................... 3
1.2. ENZYME PHYTASE .......................................................................................... 4
1.2.1. Nguốc gốc enzyme phytase .............................................................................. 6
1.2.2. Đặc điểm enzyme phytase ................................................................................ 7
1.2.3. Ứng dụng của enzyme phytase ......................................................................... 9
1.3. LÊN MEN XỐP ................................................................................................. 12
1.3.1. Khái niệm lên men xốp ................................................................................... 12
1.3.2. Ƣu điểm và nhƣợc điểm của kỹ thuật lên men xốp ........................................ 12
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở
VIỆT NAM ............................................................................................................... 13
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.................................................................. 13
1.4.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ................................................................ 14
1.5. ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI SINH VẬT BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC
PHÂN TỬ ................................................................................................................. 15
1.6. ĐẶC ĐIỂM TỰ NHIÊN KHU VỰC NGHIÊN CỨU ....................................... 16
1.6.1. Địa hình và đất đai .......................................................................................... 16
1.6.2. Đặc điểm khí hậu và thổ nhƣỡng .................................................................... 16
CHƢƠNG II ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 17
2. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .............................................................................. 17
2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .............................................................................. 17
iv
2.2. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU ................................ 17
2.2.1. Địa điểm thu mẫu ngoài thực địa .................................................................... 17
2.2.2. Địa điểm và phạm vi nghiên cứu thí nghiệm .................................................. 17
2.2.3. Thời gian nghiên cứu ...................................................................................... 18
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................... 18
2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu và xử lí mẫu đất........................................................... 18
2.3.2. Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật có khả năng sinh phytase ngoại bào ......... 19
2.3.3. Phƣơng pháp xác định mật độ vi sinh vật (theo phƣơng pháp Koch) ............ 20
2.3.4. Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme phytase ............................................. 21
2.3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy và hình thái các chủng tuyển
chọn ......................................................................................................................... 23
2.3.6. Giữ giống VSV ............................................................................................... 24
2.3.7. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử .................................... 24
2.3.8. Phƣơng pháp tạo chế phẩm enzyme phytase .................................................. 27
CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 32
3.1. PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE ........ 32
3.3. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ NUÔI CẤY CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT
SINH ENZYME PHYTASE TUYỂN CHỌN .......................................................... 38
3.4. ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE
ĐƢỢC TUYỂN CHỌN ............................................................................................ 44
3.4.1. Nhân trình tự gen 18S rRNA của các mẫu nấm NM1 và NM4 ...................... 44
3.4.2. Giải trình tự và lập cây phân loại .................................................................... 45
3.5. KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ
NĂNG SINH ENZYME PHYTASE TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN XỐP ....... 46
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 57
1. KẾT LUẬN ........................................................................................................... 57
2.KIẾN NGHỊ ........................................................................................................... 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 59
v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CFU
: Colony Foming Unit (Đơn vị khuẩn lạc)
CT
: Công thức
KL
: Khuẩn lạc
KLTB
HSCC
: Khối lƣợng trung bình
: Hệ sợi cơ chất
HSKS
: Hệ sợi khí sinh
MT
: Môi trƣờng
NM
: Nấm mốc
STT
: Số thứ tự
TB
: Trung bình
TP
: Thành phố
VK
: Vi khuẩn
VSV
: Vi sinh vật
PSM
: Phytase screening media
vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Số hiệu
Tên hình
hình
Trang
Hình 1.1
Cấu trúc của inositol
3
Hình 1.2
Muối phytate và các liên kết với ion kim loại và protein
3
Hình 1.3
Phản ứng xúc tác của enzyme phytase
5
Hình 2.1
Mối tƣơng quan giữa nồng độ K2HPO4 với OD
23
Hình 2.2.
Chu trình gia nhiệt chƣơng trình chạy PCR
25
Hình 2.3.
Hình 3.1.
Hình 3.2.
Hình 3.3
Hình 3.4.
Hình 3.5.
Hình 3.6.
Hình 3.7.
Hình 3.8.
Hình 3.9.
Hình 3.10.
Hình 3.11.
Sơ đồ quy trình lên men xốp tạo chế phẩm enzyme
phytase
Một số chủng nấm mốc phân lập đƣợc trên môi trƣờng
PSM
Một số chủng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng
PSM
Tỉ lệ % các chủng vi khuẩn, nấm mốc có khả năng sinh
phytase mạnh
Hình ảnh phân giải acid phytate của VK-1 và VK-4 trên
môi trƣờng PSM
Hình ảnh phân giải acid phytate của NM-1 và NM-4 trên
môi trƣờng
Khuẩn lạc và hình thái tế bào vi khuẩn VK-1
Chủng nấm mốc NM-1trên môi trƣờng PDA và Cơ quan
sinh sản của chủng nấm mốc NM-1 dƣới kính hiển vi
Chủng nấm mốc NM-4 trên môi trƣờng và cơ quan sinh
sản của chủng nấm mốc NM-4 dƣới kính hiển vi
Dịch nuôi cấy lỏng qua 120 giờ nuôi cấy
Thu dịch lỏng nuôi cấy các chủng tuyển chọn qua thời
gian nuôi cấy
Kết quả phản ứng PCR nhân gen mã hóa18S rARN của
28
35
35
37
38
38
39
41
42
43
44
44
vii
mẫu NM1
Hình 3.12
Hình 3.13
Kết quả phản ứng PCR nhân gen mã hóa18S rARN của
mẫu NM4
Giản đồ phả hệ chủng nấm NM1, NM4 và một số chủng
nấm khác
45
45
Hình 3.14
Giống cấp 2 chủng VK-1 sau 3 ngày nuôi cấy dịch thể
47
Hình 3.15
Sơ đồ quy trình lên men xốp chủng vi khuẩn VK-1
47
Hình 3.16
Hình3.17
Hình 3.18.
Hình 3.19.
Hình 3.20.
Hình 3.21.
Khảo cơ chất thích hợp cho lên men xốp chế phẩm
phytase thô
Khảo sát cơ chất thích hợp cho lên men xốp của chủng vi
khuẩn VK-1
Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enzyme
phytase của chủng VK-1 tuyển chọn
Ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh enzyme
phytase trên môi trƣờng xốp của chủng VK-1.
Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của pH môi trƣờng
thích hợp
Ảnh hƣởng pH đến khả năng sinh hoạt tính enzyme
phytasecủa cung VK-1
48
49
51
53
54
55
viii
DANH MỤC BẢNG
Số hiệu
Tên Bảng
bảng
Trang
Bảng 1.1.
Sự phân bố của Phytate ở hạt của một số cây trồng
4
Bảng 2.1.
Tƣơng quan giữa hàm lƣợng phốt pho vô cơ và OD 700 nm
22
Bảng 2.2.
Thành phần phản ứng PCR
25
Bảng 2.3.
Mã số trình tự 18S rARN của một số loài nấm mốc
27
Bảng 2.4.
Bảng 2.5.
Bảng 2.6.
Bảng 2.7.
Khảo sát ảnh hƣởng của nguồn cơ chất lên men đến hoạt tính
enzyme của chủng VSV tuyển chọn
Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả
năng sinh enzyme phytase của chủng VSV tuyển chọn
Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh enzyme
phytase của VSV trên môi trƣờng bán rắn.
Khảo sát ảnh hƣởng của pH môi trƣờng lên men đến hoạt
tính enzyme của chủng vi sinh vật tuyển chọn
29
29
30
31
Số chủng vi sinh vật sinh trƣởng trên môi trƣờng sàng lọc
Bảng 3.1
đƣợc phân lập từ đất tại các xã thuộc H.Hòa Vang -TP.Đà
33
Nẵng
Khả năng sinh enzyme phytase của một số chủng nấm mốc
Bảng 3.2
Bảng 3.3
và vi khuẩn trên môi trƣờng PSM có bổ sung CaCl2
Đặc điểm nuôi cấy và hình thái chủng VK-2 sinh phytase
mạnh
36
39
Bảng 3.4
Đặc điểm hình thái chủng nấm mốc NM-1, NM-4
40
Bảng 3.5
Hoạt độ enzyme của chủng MN-1, MN-4 và VK-2 qua các
42
ix
thời gian nuôi cấy dựa trên so sánh trình tự nucleotide của
gen mã hóa 18S rARN
Kết quả ảnh hƣởng của cơ chất lên men đến khả năng hoạt
Bảng 3.6
tính enzyme của chủng VK-1 tuyển chọn
49
Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enzyme phytase
Bảng 3.7
Bảng 3.8
Bảng 3.9
.
của chủng VK-1 tuyển chọn
Ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh enzyme phytase
và sinh trƣởng của VSV trên môi trƣờng bán rắn.
Ảnh hƣởng của điều kiện pH đến khả năng sinh hoạt tính
enzyme phytase
51
52
55
1
MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, việc ứng dụng công nghệ sinh học để nâng cao chất lƣợng, hiệu
quả sản phẩm và chất lƣợng môi trƣờng trong nuôi trồng đang là hƣớng đi chủ đạo,
mang tính khoa học và có ý nghĩa rất lớn đến việc phát triển bền vững. Công nghệ
enzyme đƣợc xem nhƣ là phƣơng án thích hợp, tham gia vào việc giải quyết, nâng
cao hiệu quả thức ăn và giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng từ hoạt động chăn nuôi
[17]. Nhiều nghiên cứu về vai trò của enzyme tiêu hóa nhƣ lipase, protease, amylase
và phytase bổ sung vào thức ăn vật nuôi. Đặc biệt trong các enzyme trên thì phytase
là một trong những enzyme có rất nhiều ứng dụng trong thực tiễn. Sử dụng phytase
vào thức ăn chăn nuôi, giúp vật nuôi tăng trọng lƣợng rất hiệu quả. Do enzyme có
tác dụng thủy phân chất kháng dinh dƣỡng axit phytic (chiếm 50-80% phospho
trong các loại hạt ngũ cốc), giúp vật nuôi tăng cƣờng hấp thu hiệu quả các protein
và khoáng chất nhƣ: Ca, Zn, Fe… trong thức ăn chăn nuôi[15]. Mặt khác sử dụng
enzyme còn giúp làm giảm lƣợng phospho dƣ thừa thải qua phân của vật nuôi, hạn
chế tình trạng ô nhiễm phân, góp phần quan trọng vào ngành chăn nuôi sạch và bền
vững. Ngoài ra, phytase bắt đầu đƣợc sử dụng trong thực phẩm của ngƣời, điều chế
các dẫn xuất myo-inositol phosphate cho ngành dƣợc phẩm, sử dụng trong công
nghiệp giấy, ứng dụng cải tạo đất trồng [26].
Chính vì những lợi ích của enzyme phytase mang lại, mà trên thế giới đã có
nhiều công trình nghiên cứu về enzyme phytase và các nhà khoa học vẫn không
ngừng nghiên cứu, tìm tòi enzyme phytase từ những chủng vi sinh vật sinh phytase
chƣa ai nghiên cứu tới. Để tìm ra các ƣu thế vƣợt trội hoặc tìm ra các giải pháp thay
thế, vƣớng mắc trong việc mua bán bản quyền, vần đề cạnh tranh giữa các công ty.
Tuy nhiên, ở Việt Nam các nghiên cứu về enzyme phytase vẫn còn nhiều hạn chế,
việc sản xuất các chế phẩm phytase cũng chƣa đƣợc quan tâm. Vì vậy, phần lớn chế
phẩm enzyme phytase trên thị trƣờng hiện nay, chủ yếu là đƣợc nhập khẩu từ các
nƣớc Trung Quốc, Hoa kì, Nhật Bản…với giá thành rất cao[17].
Trong tự nhiên, enzyme phytase phân bố rất rộng rãi, có thể đƣợc tìm thấy
trong mô thực vật, một số mô động vật và vi sinh vật. Trong đó, phytase từ vi sinh
2
vật có tiềm năng lớn trong ứng dụng sản xuất ở quy mô công nghiệp . Một số loài vi
khuẩn sinh phytase đã đƣợc nghiên cứu nhƣ Bacillus sp, Escherichia.coli,
Enterobacter, Lactobacillus, Klebsiella, Pseudomonas, Citrobacter… Và một số
chủng nấm mốc, đặc biệt là các chủng thuộc chi Aspergillus, Penicillium, Mucor và
Rhizopus[7],[15],[24].
Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, đa dạng về địa hình và hệ sinh thái
đã tạo nên sự đa dạng về các loài vi sinh vật, cũng nhƣ do nhu cầu và tầm quan
trọng của các sản phẩm phytase thƣơng mại, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên
cứu “Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và tạo chế phẩm thô của vi sinh vật sinh
enzyme phytase từ đất thuộc địa bàn huyện Hòa Vang- thành phố Đà Nẵng”
nhằm tìm kiếm các loài vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phytase cao và an toàn,
đáp ứng nhu cầu sử dụng chế phẩm enzyme trong nông nghiệp hiện nay.
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh enzyme phytase
ngoại bào mạnh từ đất tại một số xã thuộc huyện Hòa Vang- thành phố Đà Nẵng,
khảo sát và lựa chọn các điều kiện môi trƣờng tối ƣu cho quá trình lên men xốp tạo
chế phẩm enzyme phytase thô.
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
- Tuyển chọn và lƣu trữ một số chủng vi sinh vật sinh enzyme phytase ngoại
bào có hoạt tính mạnh tại địa bàn huyện Hòa Vang – TP Đà Nẵng.
- Xác định một số điều kiện và môi trƣờng tối ƣu cho quy trình lên men xốp
tạo chế phẩm enzyme thô. Góp phần tạo chế phẩm sinh học ứng dụng vào các lĩnh
vực khác nhau của nghành nông nghiệp, đặc biệt là chăn nuôi.
3
CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE
Axit Phytic là este photphate của inositol, có công thức phân tử là myoinositol 1,2,3,4,5,6 hexakisphotphat ( IP6 ) là thành phần chính của phopho ( P )
trong thực vật đƣợc dự trữ chủ yếu ở các cây ngũ cốc, cây họ đậu và các loại hạt
chứa dầu và đƣợc phát hiện năm 1903.
Hình 1.1. Cấu trúc của inositol
Axit phytic trong thực vật không tồn tại tự do mà thƣờng tạo muối phytate
với một số nguyên tố khoáng nhƣ Mg, K, Ca, cũng nhƣ tham gia liên kết với các
protein. Và tạo phức với protein thành hợp chất gọi là Phytin hay phytate. Axit
phytic đƣợc coi là một hợp chất kháng dinh dƣỡng (an anti-nutritional compound)
do khả năng tạo phức chặt chẽ với các ion kim loại và các hợp chất khác nhƣ tinh
bột, protein làm giảm khả năng tiêu hóa và hấp thu các chất này.
Hình 1.2. Muối phytate và các liên kết với ion kim loại và protein
4
Muối này gọi là phytate (hay phytin), thông thƣờng chiếm khoảng 1 đến vài
phần trăm trọng lƣợng khô của nhiều hạt và trong vài trƣờng hợp nó chiếm khoảng
50-80% lƣợng photpho tổng của hạt . Không có hạt trƣởng thành nào mà không có
phytate mặc dù nó có thể không có ở một số mô hạt nhất định nào đó nhƣ nội nhũ
chứa tinh bột của những hạt ngũ cốc. Phytate cũng có ở hạt phấn , bào tử túi và mô
sinh dƣỡng nhƣ rễ, cuống và lá. Phytate hầu nhƣ không có mặt trong nội nhũ của
lúa mỳ và lúa nƣớc mà tập trung trong mầm và trong lớp vỏ Alơron của tế bào hạt.
Ở đậu Hà Lan, 99% phytate của hạt tìm đƣợc trong lá mầm và 1% trong phôi mầm.
Ngô là loại ngũ cốc có hàm lƣợng phytate cao nhất (chiếm 0.83 – 2.22% khối lƣợng
hạt). Trong số các cây họ đậu, đậu dolique (dolique beans) có hàm lƣợng phytate
cao nhất (5.92 – 9.15% khối lƣợng hạt)[15].
Bảng 1.1. Sự phân bố của Phytate ở hạt của một số cây trồng
Axit phytic có hiệu ứng kháng dinh dƣỡng rất mạnh đối với động vật. Do cấu
trúc phân tử đặc biệt (hình 1.1), axit phytic có thể liên kết chặt chẽ với protein, các
nguyên tố khoáng và tạo thành phức hợp không tan trong đƣờng tiêu hóa. Hiệu ứng
này dẫn đến ức chế quá trình tiêu hoá protein và hạn chế khả năng hấp thụ các ion
khoáng nhƣ Ca, Mg, Zn…Kẽm là một nguyên tố vi lƣợng mà hoạt tính sinh học của
nó bị ảnh hƣởng lớn nhất bởi axit phytic. Thử nghiệm trên chuột cho thấy axit
phytic bổ sung vào thức ăn làm giảm mạnh khả năng hấp thụ ion Zn2+ và trọng
lƣợng của chuột [17].
1.2. ENZYME PHYTASE
Phytase (myo-inositol hexakisphosphate hydrolases) là một nhóm enzyme
đặc biệt trong số các enzyme phosphatase, có khả năng xúc tác cho phản ứng thủy
phân từng bƣớc acid phytic thành myo-inositol, các nhóm phosphate (Pi) và các
5
myo-inositol phosphate trung gian (IP5, IP4, IP3, IP2, IP1) [25]. Trong một vài
trƣờng hợp phản ứng có thể giải phóng myo-inositol tự do (hình 1.3).
Hình 1.3. Phản ứng xúc tác của enzyme phytase
Ủy ban danh pháp enzyme thuộc Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (The Enzyme
Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry) phân loại
phytase thành hai dạng là:
Dạng 1: kí hiệu (EC 3.1.3.8)
Tên đề xuất: 3-phytase
Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate 3 phosphohydrolase
Tên khác: phytase; phytate-3-phosphatase
Dạng 2: kí hiệu (EC 3.1.3.26)
Tên đề xuất: 6-phytase
Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate 6 phosphohydrolase
Tên khác: phytase; phytate-6-phosphatase
Sự phân loại này dựa trên cơ sở vị trí nhóm phosphat đầu tiên bị phytase tấn
công. Enzyme 3-phytase (EC 3.1.3.8) tấn công vào nhóm phosphat ở vị trí thứ 3;
đây là dạng phytase điển hình của vi sinh vật và enzyme 6-phytase (EC 3.1.3.26)
tấn công đầu tiên vào nhóm phốt phát số 6; đây là dạng điển hình cho phytase từ
thực vật [26].
Dựa trên pH hoạt động tối ƣu, phytase đƣợc chia thành 3 loại: phytase ƣa acid,
6
ƣa kiềm và trung tính.
Ngoài ra, dựa vào cấu hình trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác, phytase
đƣợc phân thành 3 loại khác nhau là: histidine acid phosphatase (HAP) phytases, ßpropeller phytase (BPP) và purple acid phosphatase (PAP) phytase [21].
Phytase đƣợc phân bố rộng rãi trong tự nhiên bao gồm ở thực vật, động vật và
các loài vi sinh vật. Phytase có mặt ở nhiều loài vi sinh vật bao gồm cả vi khuẩn,
nấm, nấm men và động vật nguyên sinh [11]. Từ các nguồn thu enzyme khiến điều
kiện hoạt động của phytase không giống nhau. Các enzyme phytase từ thực vật
thƣờng hoạt động tốt ở nhiệt độ 45-60oC, trong khi phytase thu từ vi sinh vật hoạt
động ở phạm vi nhiệt độ rộng hơn, từ 35oC đến 63oC [19].
Khối lƣợng phân tử phytase của vi khuẩn biến thiên từ 35-50 kDa (trừ phytase
từ Klebsiella aerogenes là có 2 dạng phân tử cảm ứng). Phytase từ eukaryote nhƣ
nấm men, nấm sợi, thực vật và động vật thƣờng đƣợc glycosyl hóa và có khối lƣợng
phân tử cao hơn, nằm trong khoảng từ 85-150 kDa đối với nấm mốc, khoảng 500
kDa đối với phytase của nấm men và từ 50-150 kDa đối với phytase của thực vật và
động vật [22].
1.2.1. Nguốc gốc enzyme phytase
Phytase rất phổ biến trong tự nhiên, nó đã đƣợc tìm thấy từ mô thực vật,
động vật và rất nhiều loài vi sinh vật.
a. Phytase từ vi sinh vật
Phytase đƣợc tìm thấy trong các nhóm vi khuẩn nhƣ: Aerobacter aerogenes,
Pseudomonas sp, Bacillus subtilis, Klebsiella sp, B. subtilis, Escherichia coli,
Enterobacter sp. và B. amyloliquefaciens. Những vi khuẩn sinh phytase ngoại bào
là những chủng thuộc về chi Bacillus và Enterobacter. Còn phytase từ E. coli lại là
enzyme nội bào (periplasmic enzyme). Ngoài ra, phytase còn có trong các chủng
nấm mốc đặc biệt ở các loài A.ficuum, A.carbonarius, A.oryzae, A.niger và
A.fumigatus thuộc chi Aspergillus và một số nấm men nhƣ Saccharomyces
cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida, Debaryomyces castelii,
7
Debaryomyces occidentalis, Kluyveromyces fragilis và Schwanniomyces castelii,
cũng có khả năng sản sinh phytase [7], [18], [31].
Phytase đƣợc thu từ các loài nấm mốc thuộc chi Aspergillus đƣợc sử dụng nhƣ
một chế phẩm vi sinh trong việc cải tạo đất trồng. Sự tăng trƣởng đáng kể về kích
thƣớc, chiều dài rễ cũng nhƣ chiều cao cây của các cây gieo trồng khi đƣợc bổ sung
chế phẩm vi sinh chứa enzyme phytase cho thấy đây là một tiềm năng ứng dụng to
lớn [7].
Trong một số loài khác của chi Aspergillus nhƣ A.rugulosus cho thấy việc sử
dụng hiệu quả enzyme phytase trong việc cải thiện hàm lƣợng chất chất khô và sản
lƣợng các các loại ngũ cốc. Ngoài ra phytase từ các nguồn vi sinh vật đã đƣợc bổ
sung vào thức ăn gia súc, gia cầm nhằm giúp vật nuôi có thể hấp thụ đƣợc
phosphoric. Việc bổ sung phytase từ nấm mốc trong chế độ ăn của heo đã giúp việc
hấp thụ phospho tăng từ 52% đến 64% [43]. Một nghiên cứu khác lại cho thấy,
phytase từ nấm mốc bổ sung vào thức ăn của gà giúp chúng hấp thụ phospho tăng
từ 50 đến 60% [15].
Hiện nay công nghệ ADN tái tổ hợp phát triển càng giúp cho chất lƣợng
enzyme phytase thu từ nguồn này cải thiện đáng kể. Việc bổ sung các đoạn gen giúp
cho enzyme phytase tăng khả năng chống chịu với các điều kiện từ môi trƣờng bên
ngoài và chống lại sự phân hủy enzyme tiêu hóa trong dạ dày [34].
b. Phytase từ động vật
Các nhà khoa học đã chứng minh có sự tồn tại phytase trong cơ thể động vật
dạ dày đơn Tuy nhiên, phytase này trong ruột non động vật dạ dày đơn không có vai
trò rõ ràng trong việc phân giải muối phytate từ thức ăn. Một enzyme giống nhƣ
phytase cũng đã đƣợc tìm thấy trong động vật nguyên sinh Paramecium [15].
1.2.2. Đặc điểm enzyme phytase
a. Cấu tạo phân tử của enzyme phytase
Hầu hết các loại phytase đƣợc biết đều là enzyme monome, điển hình nhƣ
phytase từ nấm, từ E. coli và K. terrigena và từ B. subtilis .Tuy vậy, một số phytase
8
từ thực vật và động vật đƣợc tạo thành từ nhiều tiểu đơn vị. Một loại phytase đƣợc
tổng hợp ở hạt ngô trong giai đoạn nảy mầm là enzyme dime bao gồm hai tiểu đơn
vị kích cỡ 38 kDa. Trong khi đó, phytase tinh sạch từ ruột non của chuột thể hiện
hai băng (band) protein trên SDS-PAGE với trọng lƣợng phân tử ƣớc tính là 70 và
90 kDa. Tuy vậy, chỉ có tiểu đơn vị 90 kDa có hoạt tính thuỷ phân axit phytic, có
thể hai băng protein là đại diện cho hai enzyme khác nhau (phosphatase kiềm và
phytase). Đặc biệt enzyme từ động vật nguyên sinh Paramecium có cấu trúc
hexame[15].
Phytase vi khuẩn thƣờng nhỏ hơn phytase từ nấm. Kết quả nghiên cứu cho
thấy, phytase nấm có khối lƣợng khoảng 65 và 70 kDa và đã đƣợc glycosyl hóa
(glycosylation). Phytase từ A. niger NRRL 3135 đƣợc glycosyl hóa 27%. Nó có đầu
N liên kết với chuỗi manose và galactose nghiên cứu chỉ ra rằng mức độ glycosyl
của phytase tái tổ hợp là không ổn định. Ở Hansenula polymorpha và S. cerevisiae
quá trình glycosyl hóa rất hay thay đổi. Ngƣợc lại, quá trình này của enzyme trong
A. niger khá ổn định. Điểm đáng chú ý là, sự glycosyl hóa không chỉ khác nhau
giữa các loài mà còn khác nhau giữa những lần lên men khác nhau của cùng một
chủng. Nhìn chung, mức độ glycosyl hóa có thể có vài tác động lên đặc tính của
enzyme. Đầu tiên, nó có thể ảnh hƣởng đến đặc tính xúc tác hoặc tác động đến sự
ổn định của enzyme. Thứ hai, nó có thể ảnh hƣởng đến điểm đẳng điện của protein
(pI). Thứ ba, nó có thể làm giảm mức độ biểu hiện của protein thông qua sự chi
phối năng lƣợng trao đổi[15].
b. Đặc tính nhiệt độ và pH ảnh hưởng đến enzyme phytase
pH tối ƣu của phytase dao động từ 2.2 đến 8. Hầu hết các phytase từ vi sinh
vật, điển hình phytase có nguồn gốc từ nấm có pH tối ƣu ở khoảng 4.5 – 5.6. Đặc
biệt, khác với hầu hết phytase từ nấm, phytase từ A. fumigatus có dải pH tối thích từ
4.0 – 7.3 (còn giữ đƣợc ít nhất 80% hoạt tính). Một vài phytase từ vi khuẩn, đặc biệt
từ các loài Bacillus có pH tối ƣu từ 6.5 – 7.5. pH tối thích của enzyme tách ra từ hạt
thực vật dao động từ 4.0 – 7.0, còn hầu hết có pH tối thích ở 4.0 – 5.6. Hai phytase
9
kiềm từ thực vật có pH tối ƣu vào khoảng 8.0 đã đƣợc nghiên cứu từ hạt ngũ cốc và
ở hạt phấn hoa huệ tây [15]
Nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của các phytase dao động từ 45 đến 75°C.
Nghiên cứu sự ổn định nhiệt độ của ba phosphatase có nguồn gốc từ nấm và đã kết
luận rằng phytase từ A. niger không bền với nhiệt độ hoặc không có khả năng hồi
lại hoạt tính sau khi đun nóng gây biến tính. Tại nhiệt độ 50 và 55 °C nó mất
khoảng 70-80% hoạt tính. Phytase từ A. fumigatus cũng không bền với nhiệt độ
nhƣng có một đặc tính đáng quý là có khả năng hồi lại hoạt tính ban đầu sau 20 phút
làm biến tính ở 90°C. So với hai phytase trên thì axit phosphatase từ A. niger pH 2.5
có khả năng ổn định với nhiệt độ rất cao; ở nhiệt độ tới 80°C enzyme chƣa bị biến
tính. Tuy nhiên khi ở 90°C, nó mất hoàn toàn hoạt tính. Phytase từ chủng Bacillus
sp. DS11 có nhiệt độ tối ƣu ở 70°C, cao hơn nhiệt độ tối ƣu của những phytase
thông thƣờng. Phytase này cũng rất bền với nhiệt: 100% hoạt tính còn lại sau 10
phút ủ tại 70°C (với sự có mặt của CaCl2). Khi không có CaCl2 khả năng bền với
nhiệt của phytase từ Bacillus sp. DS11 giảm mạnh, hoạt tính bị mất khi nhiệt độ
trên 60°C. Ngƣợc lại khi có mặt của CaCl2 nó có thể bền với nhiệt độ lên tới 90°C,
sau 10 phút lƣợng enzyme mất đi khoảng 50% hoạt tính. Nghiên cứu này chỉ ra rằng
ion Ca2+ có khả năng giúp phytase ổn định chống chịu với nhiệt độ cao [15].
1.2.3. Ứng dụng của enzyme phytase
a. Ứng dụng trong chăn nuôi
Động vật nhai lại tiêu hóa đƣợc muối phytate là nhờ phytase do hệ vi sinh vật
sống trong dạ cỏ tiết ra. Phốt phát vô cơ giải phóng trong dạ cỏ sẽ đƣợc khu hệ vi
sinh vật ở đó và bản thân động vật chủ sử dụng. Tuy nhiên, động vật dạ dày đơn
nhƣ lợn, gia cầm và cá không có khả năng tiêu hóa axit phytic vì chúng không có
hoặc có rất ít phytase trong đƣờng tiêu hóa. Do đó, để đáp ứng nhu cầu phốt pho
cho cơ thể vật nuôi, ngƣời ta đã bổ sung phốt pho vô cơ vào thức ăn. Điều này sẽ
làm tăng chi phí thức ăn và gây ra môi trƣờng bị ô nhiễm phốt phát, đặc biệt đối với
ngành nuôi trồng thủy sản. Phospho dƣ thừa trong thức ăn dành cho tôm cá sẽ
nhanh chóng hòa tan vào môi trƣờng nƣớc, cộng với muối phytate không đƣợc tiêu
10
hoá thải qua phân động vật sẽ bị vi sinh vật sống trong đất phân giải thành phốt phát
vô cơ. Đây là điều kiện hết sức thuận lợi cho các loài tảo vì phốt pho là nhân tố rất
phù hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của sinh vật này. Tảo phát triển quá mức
sẽ gây hiện tƣợng "nƣớc nở hoa", khi đó tảo sử dụng hầu hết oxy hòa tan trong nƣớc
khiến các sinh vật thủy sinh (động vật và thực vật) chết hàng loạt [15]. Khi bổ sung
vào thức ăn chăn nuôi, phytase làm tăng khả năng đồng hóa phốt phát ngay trong
chính thành phần của thức ăn, đồng thời làm giảm lƣợng phốt phát thải qua phân từ
đó sẽ có những đóng góp tích cực cho môi trƣờng sinh thái. Đáng chú ý, ở Việt
Nam đã bắt đầu có những công trình nghiên cứu ảnh hƣởng của phytase đến sinh
trƣởng của vật nuôi. Trần Quốc Việt và Ninh Thị Len (Viện Chăn nuôi) đã nghiên
cứu sử dụng chế phẩm phytase thƣơng mại (Natuphos, BASF) đến năng suất và
hiệu quả sử dụng thức ăn của lợn con cai sữa và lợn nuôi thịt. Theo các tác giả, sử
dụng phytase giúp lợn tăng trọng 16.4% và giúp giảm chi phí thức ăn đƣợc 8% so
với lô đối chứng. Tƣơng tự nhƣ vậy, năm 2002, Nguyễn Thị Hoài Trâm và CS
(Viện Công nghiệp Thực phẩm) đã khảo sát khả năng ứng dụng enzyme phytase
thƣơng phẩm trong chăn nuôi gà và cho thấy việc sử dụng phytase làm tăng 2% tỷ
lệ đẻ trứng, làm giảm 8.4 -11.6% chi phí thức ăn cho gà con [17].
Ngƣời ta dự tính, nếu phytase đƣợc sử dụng cho chăn nuôi động vật dạ dày
đơn ở Mỹ thì enzyme này sẽ giải phóng lƣợng phốt phát có trong thức ăn với giá trị
tƣơng đƣơng 168 triệu USD và tránh đƣợc 8.23×104 tấn phốt phát dƣ thừa thải ra
môi trƣờng hàng năm. Việc ứng dụng phytase trong chăn nuôi đã đƣợc 22 quốc gia
thực hiện. Tổ chức FDA (The Food and Drug Administration) đã coi phytase là
enzyme an toàn GRAS (Generally Regarded As Safe). Enzyme Finase® phytase đã
đƣợc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi lợn có thành phần là ngô và đậu tƣơng đã giúp
cải thiện 1/3 lƣợng phốt phát khó tiêu trong thức ăn thành lƣợng phốt phát dễ tiêu.
Thí nghiệm tƣơng tự với Allzyme Phytase® và Natuphos® phytase bổ sung vào
khẩu phẩn ăn cho lợn và gà, kết quả thu đƣợc cũng chỉ ra rằng phytase cải thiện
đƣợc giá trị sinh học của muối phytate đối với lợn và gà thịt Một vài thí nghiệm
11
khác cũng khẳng định rằng có thể thay thế phốt phát vô cơ bằng cách bổ sung
phytase từ vi sinh vật vào thành phần của thức ăn cho động vật dạ dày đơn. Ở Hà
Lan, phytase từ A. niger đã đƣợc thử nghiệm thành công vào thức ăn chăn nuôi và
làm giảm từ 30 - 40% lƣợng phốt phát thải qua phân ra môi trƣờng. Thị trƣờng
phytase vào những năm cuối thế kỷ 20 ƣớc tính đạt 500 triệu USD [17].
b. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
Khẩu phần ăn hàng ngày của ngƣời chứa nhiều thành phần có nguồn gốc từ
các cây ngũ cốc và cây họ đậu. Những ngƣời ăn chay thƣờng gặp phải vấn đề mất
cân bằng dinh dƣỡng do ăn quá nhiều ngũ cốc. Những cƣ dân ở các quốc gia kém
phát triển thƣờng ăn bánh mỳ chay (loại bánh mỳ không đƣợc bổ sung nấm men) và
trẻ em thƣờng hay sử dụng nhiều sản phẩm từ đậu nành. Những thức phẩm này đều
có chứa một lƣợng lớn muối phytate. Muối phytate không những không thể tiêu hóa
đƣợc trong đƣờng tiêu hoá của ngƣời mà còn gây cản trở sự hấp thụ các nguyên tố
khoáng nhƣ: kẽm, caxi, magiê và sắt. Nó cũng làm giảm khả năng tiêu hóa protein
trong khẩu phần cũng nhƣ ức chế các enzyme tiêu hóa khác.
Anno và CS. (1985) đã loại bỏ muối phytate trong sữa đậu nành bằng cách sử
dụng phytase từ lúa mỳ. Bổ sung phytase từ nấm mốc A. niger vào bột mỳ có chứa
cám lúa mỳ đã làm tăng khả năng hấp thụ sắt ở ngƣời[15]. Nhƣ vậy, vai trò quan
trọng của phytase với thực phẩm dành cho con ngƣời đã khá rõ ràng. Phytase không
những làm tăng khả năng tiêu hóa protein mà còn tăng hấp thụ khoáng. Có lẽ trong
tƣơng lai không xa enzyme này sẽ đƣợc dùng phổ biến nhƣ một chất phụ gia cho
thực phẩm [15].
c. Ứng dụng trong cải tạo đất
Ở một số vùng, axit phytic và dẫn xuất của nó chiếm tới 50% tổng lƣợng
phốt pho hữu cơ trong đất. Nghiên cứu của Findenegg và Nelemans (1993) cho thấy
khả năng sinh trƣởng của ngô tỷ lệ thuận với mức độ phân giải axit phytic khi bổ
sung phytase vào đất trồng. Nghiên cứu này cũng mở ra một hƣớng trong tƣơng lai
- Xem thêm -
.PDF 
84 
215 
121 
