Tài liệu Khóa luận nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất sulfat hóa từ pectin phân lập từ cây cúc quỳ tithonia diversifolia

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA HÓA NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP DẪN XUẤT SULFAT HÓA TỪ PECTIN PHÂN LẬP TỪ CÂY CÚC QUỲ TITHONIA DIVERSIFOLIA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC Sinh viên thực hiện: ĐẶNG THỊ THÁI THẢO Lớp: 14CHD Giáo viên hƣớng dẫn: TS. GIANG THỊ KIM LIÊN Đà Nẵng, 2018 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐHSP Độc lập - Tự do - Hạnh phúc KHOA HÓA NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Đặng Thị Thái Thảo Lớp: 14CHD 1. Tên đề tài: Nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất Sulfat hóa từ pectin phân lập từ cây cúc quỳ Tithonia Diversifolia 2. Nguyên liệu, dụng cụ và thiết bị: - Nguyên liệu: pectin phân lập từ cây cúc quỳ (TDP), Sulfuric acid, N-butanol. - Dụng cụ và thiết bị:  Cân kỹ thuật  Máy khuấy từ điều nhiệt  Phổ hồng ngoại được đo trên máy FT-IR Affinity-1S SHIMADZU tại Bộ môn Hóa vô cơ – Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.  Phổ NMR của mẫu nghiên cứu được đo ở nhiệt độ 70ºC, với dung môi D2O, trên máy Bruker AVANCE 500MHz tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sử dụng D2O làm dung môi, DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane1-sulfonic acid) làm chất chuẩn nội. Với chế độ đo khử tín hiệu của nước..  Phép đo khối lượng phân tử GPC được thực hiện ở Phòng Thí Nghiệm Phân tích Trung Tâm - ÐH Khoa học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, trên máy HPLC Agilent 1100. Pha động 0.1N NaNO3, tốc độ dòng 1ml/phút. Đầu dò RID.  Cốc thủy tinh, các loại pipet, giấy lọc, túi thẩm tách, phễu lọc, máy ly tâm, con khuấy, giấy chỉ thị, màng thẩm tách MWCO 14000... 3. Nội dung nghiên cứu: Bán tổng hợp dẫn xuất Sulfat hóa. Các sản phẩm sẽ được chứng minh cấu trúc bằng các phương pháp phổ IR và NMR, khảo sát hoạt tính sinh học. Qua đó lựa chọn được điều kiện và quy trình tối ưu cho quá trình bán tổng hợp dẫn xuất Sulfat hóa. 4. Giáo viên hướng dẫn: 5. Ngày giao đề tài: 3/2017 6. Ngày hoàn thành: 3/2018 TS. Giang Thị Kim Liên Chủ nhiệm Khoa Giáo viên hướng dẫn (Ký và ghi rõ họ, tên) (Ký và ghi rõ họ, tên) Sinh viên đã hoàn thành và nộp báo cáo cho Khoa ngày ….. tháng…..năm….. Kết quả điểm đánh giá: Ngày….tháng….năm…. CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (Ký và ghi rõ họ, tên) LỜI CẢM ƠN Giá trị của đề tài là một phần công lao và sự giúp đỡ tận tình mà thầy cô đã hết lòng truyền dạy cho em trong suốt 4 năm qua. Nhân dịp này em xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến: Quý thầy cô trong ban chủ nhiệm khoa Hóa trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng cùng toàn thể thầy cô trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng. Đặc biệt cô Giang Thị Kim Liên và chị Bùi Vũ Thục Uyên, người đã hướng dẫn em hoàn thành khóa luận này. Trong thời gian tiến hành nghiên cứu nếu không có sự chỉ bảo tận tình của cô và chị từ việc tìm tư liệu đến những lúc sửa chữa, bổ sung, động viên khích lệ tinh thần cho chúng em thì đề tài đã không được hoàn thành như ngày hôm nay. Nhân dịp này em xin trân trọng gửi đến cô và chị lời cảm ơn sâu sắc nhất. Do kiến thức và kinh nghiệm còn hạn chế nên khóa luận không tránh khỏi những thiếu sót. Vì vậy em xin ghi nhận và biết ơn những ý kiến đóng góp quý báu từ quí Thầy, Cô và các bạn để đề tài được hoàn thiện và có ý nghĩa hơn. Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106-NN.02-2013.49 Kính chúc quý thầy cô, các bạn lời chúc sức khỏe, lời cảm ơn chân thành nhất! Đà Nẵng, ngày tháng năm 2018 Sinh viên thực hiện Đặng Thị Thái Thảo MỤC LỤC MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài .................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu .............................................................................................. 2 3. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu ............................................................................. 2 4. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 2 4.1. Thu thập tài liệu............................................................................................... 2 4.2. Tiến hành thực nghiệm .................................................................................... 2 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................... 2 6. Bố cục khóa luận .................................................................................................... 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 4 1.1. Cây cúc quỳ ( Tithonia Diversifolia) ..................................................................... 4 1.1.1. Đặc điểm hình thái ....................................................................................... 4 1.1.2. Nguồn ngốc và phân bố ............................................................................... 4 1.1.3. Khai thác sử dụng ........................................................................................ 5 1.2. Pectin ...................................................................................................................... 6 1.2.1. Khái niệm ..................................................................................................... 6 1.2.2. Cấu trúc ........................................................................................................ 6 1.2.3. Ứng dụng ..................................................................................................... 8 1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ............................................................ 9 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 11 2.1. Nguyên liệu .......................................................................................................... 11 2.2. Hóa chất và thiết bị .............................................................................................. 12 2.3. Các phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 12 2.3.1. Phương pháp bán tổng hợp hợp chất hữu cơ ............................................. 12 2.3.2. Phương pháp tinh chế ................................................................................ 12 2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ ................... 14 2.3.4. Phương pháp xác định hàm lượng Sulfate ................................................. 17 2.3.5. Phương pháp khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ........................................ 18 2.4. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................................. 20 2.5. Quy trình tổng hợp ............................................................................................... 21 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................. 24 3.1. Xác định cấu trúc của dẫn xuất Sulfat hóa ........................................................... 24 3.1.1. Sắc ký thẩm thấu gel GPC của dẫn xuất Sulfat hóa .................................. 24 3.1.2. Phổ hồng ngoại FT-IR của dẫn xuất Sulfat hóa ......................................... 27 3.1.3. Phổ 13C-NMR của dẫn xuất Sulfat hóa ...................................................... 28 3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của dẫn xuất ................................................................. 30 3.3. Xác định khả năng gây độc tế bào ung thư của dẫn xuất Sulfat hóa ................... 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 33 Kết luận ....................................................................................................................... 33 Kiến nghị..................................................................................................................... 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 34 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Các ký hiệu δ :Dao động biến dạng λ :Bước sóng Các chữ viết tắt 13 C-NMR : Phổ cộng hưởng từ Cacbon-13 GPC : Sắc ký gel FT-IR : Phổ hồng ngoại 1 : Phổ cộng hưởng từ proton H-NMR IC50 : Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50) IR : Phổ hồng ngoại LDL : Lipoprotein mật độ thấp MKN7 : Tế bào ung thư dạ dày MWCO : Molecular Weight Cut Offs NCI : Viện Ung thư Quốc Gia Hoa Kỳ (Nation Cancer Institue) TDP : Pectin phân lập từ cây cúc quỳ Tithonia Diversifolia TDP-S : Dẫn xuất pectin Sulfat hóa DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Khối lượng phân tử của pectin và các dẫn suất Sulfat hóa và hàm lượng Sulfat .............................................................................................................................. 26 Bảng 3.2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư MKN7 của các mẫu TDP và TDP-S ........ 32 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây cúc quỳ (Tithonia diversifolia) ................................................................. 4 Hình 1.2. Cấu trúc phân tử acid D- galacturonic ............................................................. 7 Hình 1.3. Các nhóm chức của pectin. .............................................................................. 7 Hình 1.4. Cấu trúc chung của pectin ................................................................................ 8 Hình 2.1. Pectin đã được phân lập và tinh chế ............................................................... 11 Hình 2.2. Màng thẩm tách MWCO 14000. .................................................................... 13 Hình 2.3. Quá trình thẩm tách mẫu. ............................................................................... 13 Hình 2.4. Mô hình hoạt động của máy đo quang phổ FT-IR ......................................... 15 Hình 2.5. Mô hình máy đo GPC .................................................................................... 17 Hình 2.6. Quy trình tổng hợp dẫn xuất Sulfat hóa từ pectin .......................................... 20 Hình 2.7. Hỗn hợp Sulfuric acid và n-butanol đã được chuẩn bị trong bể nước đá. ..... 21 Hình 2.8. Bộ thiết bị tổng hợp dẫn xuất pectin sulfat hóa ............................................. 21 Hình 2.9. Hỗn hợp sau khi cho pectin vào. .................................................................... 22 Hình 2.10. Dung dịch được kết tủa với Ethanol 95% .................................................... 22 Hình 2.11. Kết tủa tan trong nước .................................................................................. 23 Hình 2.12. Dung dịch cho vào màng thẩm tách ............................................................. 23 Hình 3.1. Sắc ký đồ thẩm thấu gel GPC của mẫu TDP ................................................ 24 Hình 3.2. Sắc ký đồ thẩm thấu gel GPC của mẫu TDP-S1 ............................................ 25 Hình 3.3. Sắc ký đồ thẩm thấu gel GPC của mẫu TDP-S2 ............................................ 25 Hình 3.4. Phổ FT-IR của mẫu TDP ............................................................................... 27 Hình 3.5. Phổ FT-IR của mẫu TDP-S1 .......................................................................... 27 Hình 3.6. Phổ FT-IR của mẫu TDP-S2 .......................................................................... 28 Hình 3.7. Phổ 13C-NMR của các mẫu TDP ................................................................... 29 Hình 3.8. Phổ 13C-NMR của các mẫu TDP-S ................................................................ 29 Hình 3.9. Khả năng quét gốc hydroxyl tự do của pectin và các dẫn xuất Sulfat hóa .... 31 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật nói chung và Hóa học nói riêng, trong đó Hóa học về tổng hợp các hợp chất hữu cơ ngày càng phát triển nhằm tạo ra các hợp chất phục vụ đời sống con người. Trước đây, khi ngành Hóa học hữu cơ phát triển và đạt được nhiều thành tựu như tổng hợp được nhiều nhóm thuốc hóa học mới, có hiệu quả điều trị cao. Nhưng chủ yếu là các thuốc tổng hợp hóa học toàn phần từ các nguyên liệu cơ bản có trong than đá, dầu mỏ,…và nhiều thuốc này đã sinh ra nhiều tác dụng phụ độc hại cho cơ thể. Vì thế, ngày nay việc nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên lại đóng vai trò vô cùng quan trọng trong việc cung cấp các dược chất mới hoặc chất dẫn đường để tạo ra dược chất mới. Polysaccharide là một trong những cấu trúc chính của carbohydrate được tìm thấy trong hệ thống sống. Polysaccharide được biết đến rộng rãi trong cộng đồng khoa học là chất kích thích miễn dịch mạnh, là một chất phòng chống rất mạnh mẽ khối u lành tính và ác tính, làm giảm cholesterol và chất béo trung tính, điều hòa lượng đường trong máu, chữa lành vết thương, trẻ hóa làn da và có nhiều lợi ích khác. Polysaccharide giúp tăng cường tác dụng của nhiều loại thuốc. Khi sử dụng Polysaccharide, các tế bào miễn dịch trở nên chủ động hơn, mạnh hơn, hiệu quả trong tấn công và tiêu diệt những gì xâm nhập vào cơ thể. Đặc biệt nó lại không gây tác dụng phụ kể cả khi dùng ở liều cao. Do đó, việc tìm kiếm các nguồn polysaccharide từ thực vật và các dẫn xuất mới có hoạt tính sinh học hiện đang là vấn đề rất được quan tâm. Gần đây sự biến đổi hóa học của nhiều polysaccharide bao gồm pectin đã cho thấy các hoạt tính sinh học mới như chống đông máu, chống oxy hóa, kháng virus, chống uốn ván. Trong số những biến đổi hóa học này, các nhóm hydroxyl dọc theo cấu trúc của polysaccharide được thay bằng các nhóm Sulfat, được sử dụng để tăng cường các đặc tính sinh học nội tại hoặc sinh ra các đặc tính mới như chống đông máu và chống ung thư. 2 Khóa luận này tập trung giải quyết nội dung: “Nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất Sulfat hóa từ pectin phân lập từ cây cúc quỳ Tithonia Diversifolia”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Bán tổng hợp dẫn xuất Sulfat hóa từ pectin phân lập từ cây cúc quỳ Tithonia Diversifolia có hoạt tính gây độc tế bào. Tạo cơ sở khoa học để có thể đề xuất khả năng ứng dụng và khai thác loài này phục vụ ngành y, dược, thực phẩm chức năng. 3. Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu Tổng hợp dẫn xuất pectin Sulfat hoá. Các sản phẩm sẽ được chứng minh cấu trúc bằng các phương pháp phổ IR, MS và NMR, hoạt tính sinh học xác định phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI). 4. Nội dung nghiên cứu 4.1. Thu thập tài liệu Thu thập các tài liệu đã công bố trong nước và trên thế giới liên quan đến bán tổng hợp dẫn xuất Sulfat hóa và hoạt tính sinh học của chúng. Tổng quan các tài liệu về cây cúc quỳ Tithonia Diversifolia, pectin, và ứng dụng. 4.2. Tiến hành thực nghiệm Trên cơ sở so sánh các phương pháp tổng hợp, dựa trên những khảo sát về các tác nhân, điều kiện và hiệu suất phản ứng với những điều kiện khả thi về thiết bị, phòng thí nghiệm chúng tôi đã lựa chọn phương pháp thích hợp để bán tổng hợp dẫn xuất Sulfat hóa. Các sản phẩm sẽ được chứng minh cấu trúc bằng các phương pháp phổ IR và NMR, khảo sát hoạt tính sinh học. Qua đó lựa chọn được điều kiện và quy trình tối ưu cho quá trình bán tổng hợp dẫn xuất Sulfat hóa. - Tổng hợp các dẫn xuất Sulfat hóa của pectin. - Thử hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất tổng hợp được. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Tổng hợp được hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguyên liệu là pectin được phân lập từ câu cúc quỳ (Tithonia Diversifolia) tạo cơ sở cho việc ứng dụng vào thực tế. 3 Đóng góp vào kho tàng hóa học các hợp chất thiên nhiên của Việt Nam nói chung và thế giới nói riêng. 6. Bố cục khóa luận Khóa luận gồm trang; được bố cục như sau: Mở đầu 03 trang Chương 1. Tổng quan tài liệu 08 trang Chương 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 13 trang Chương 3. Kết quả và bàn luận 09 trang Kết luận và kiến nghị 01 trang Tài liệu tham khảo 02 trang 4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cây cúc quỳ ( Tithonia Diversifolia) 1.1.1. Đặc điểm hình thái Cây cúc quỳ hay còn gọi là dã quỳ, sơn quỳ, quỳ dại, hướng dương dại, hướng dương Mexico, cúc Nitobe là một loài thực vật trong họ Cúc (Asteraceae), dạng cây bụi cao tới 1-2 m với thân cây mọc thẳng và đôi khi hóa gỗ. Thân có lông sát, phân thành nhiều cành, lá thuôn, phiến có thùy, bìa có răng nằm. Hoa ở đầu ngọn trên cuống dai. Hoa ở bìa hình môi lép, vàng tươi; hoa giữa hình ống; giữa hoa có vảy cao 1cm, quả bế có 2 răng [18]. Hình 1.1. Cây cúc quỳ (Tithonia diversifolia) 1.1.2. Nguồn ngốc và phân bố Cây có nguồn gốc từ Mehico hiện nay phân bố rộng khắp trong các khu vực cận nhiệt đới và nhiệt đới, chẳng hạn như Trung Mỹ, Đông Nam Á và Châu Phi [1]. Ở Việt Nam, cây cúc quỳ hiện nay đã được tự nhiên hóa, mọc phổ biến ở rất nhiều nơi, đặc biệt là ở vùng Tây Nguyên [15]. 5 1.1.3. Khai thác sử dụng Chính do bản thân cây phát triển một cách nhanh chóng cùng với giá trị dinh dưỡng trong cây khá cao nên trong một thời gian ngắn cúc quỳ đã trở thành một cây đa mục đích không chỉ trong trồng trọt mà còn ở cả trong chăn nuôi và y học. Tại Nhật Bản, vào cuối thời kỳ Minh Trị, loài cây này được nhập khẩu như là cây cảnh mặc dù nó đã từng được trồng tại đây, dù rất ít. Có vị đắng đặc trưng, nó được sử dụng để gây sốt nhằm chống lại ngộ độc, mặc dù không được sử dụng cho các mục đích y học trực tiếp. Người ta cho rằng loài này được Nitobe Inazo đưa vào Nhật Bản, vì thế mà có tên gọi trong tiếng Nhật là cúc Nitobe. Tại Mexico, nó được sử dụng để chữa bong gân, gãy xương, các vết thâm tím và các vết giập. Tại miền nam Trung Quốc nó được sử dụng để chữa trị một số bệnh về da (như bệnh nấm bàn chân), ra mồ hôi trộm ban đêm, cũng như trong vai trò của thuốc lợi tiểu, thuốc nhuận gan, thuốc chữa bệnh vàng da và viêm bàng quang. Cúc quỳ được bán tại thị trường thuốc thảo mộc ở Đài Loan như một loại trà để cải thiện chức năng gan. Tại Việt Nam, cúc quỳ đã được người Pháp đưa vào các đồn điền ở Lâm Đồng. Nó được trồng khi đó để làm phân xanh cho các vườn cà phê, cao su. Thân cúc quỳ chứa nhiều chất P, Ca, Mg nên làm phân hữu cơ khá tốt. Nhờ hạt dễ phát tán, cây dễ trồng nhờ giâm cành nên loài cây này dần dà chiếm lĩnh các nơi hoang dại ở khắp Tây Nguyên. Tên cúc quỳ xuất hiện trên văn chương từ thập niên 1970, trước đó người ta gọi nó là sơn quỳ. Cúc quỳ cũng đã được sử dụng làm biểu tượng chính cho lễ hội hoa Đà Lạt tháng 12 năm 2005. Ở Việt Nam, cúc quỳ thường ra hoa vào mùa đông, vàng rực cả triền đồi và thảo nguyên. Loài cây này có thể coi như là một loài cây báo hiệu cho sự xuất hiện của mùa khô, khi hoa dã quỳ nở có nghĩa là mùa khô đã đến rất gần. Lá của cây này còn sử dụng trong một bài thuốc dân gian để chữa bệnh ghẻ [18]. Cúc quỳ đã được quan tâm nghiên cứu vì hàm lượng chất dinh dưỡng tương đối cao được tìm thấy trong sinh khối của nó và nó có khả năng liên quan đến trích xuất một lượng tương đối cao với đất. 6 1.2. Pectin 1.2.1. Khái niệm Pectin là một hợp chất tự nhiên có nhiều trong màng tế bào của các loài thực vật bậc cao, phân bố chủ yếu ở các bộ phận như quả, củ, thân. Trong màng tế bào, pectin có mặt ở phiến giữa (với hàm lượng cao nhất) và vách tế bào sơ cấp [7]. “Pectin” là một thuật ngữ để chỉ một nhóm các chất sau: - Protopectin: là pectin ở trạng thái tự nhiên (trong vách tế bào thực vật và phiến giữa), mức độ methyl hóa rất cao, không hòa tan. Protopectin có nhiều trong quả xanh. - Acid pectinic: mức độ methyl hóa trung bình, tan, muối là pectinate. - Pectin: mức độ methyl hóa trung bình, tan, bản chất là chất keo, có khả năng tạo gel, tạo nhũ, tạo đặc và ổn định. - Acid pectic: mức độ methyl hóa rất thấp, tan, muối là pectate. Người ta rất hay lẫn lộn giữa pectin và acid pectinic nên thật ra trong thực tế “pectin” là tên gọi chung của cả hai chất này. Pectin được đặc trưng bới các chỉ số sau: - Chỉ số methoxyl (MI): biểu hiện tỷ lệ methyl hóa, là % khối lượng nhóm methoxyl ( -OCH3) trên tổng khối lượng. Sự methyl hóa hoàn toàn ứng với chỉ số methoxyl bằng 16,3%, các pectin tách từ thực vật thường có chỉ số methoxyl từ 10% đến 12%. - Chỉ số ester hóa (DE): thể hiện mức độ ester hóa của pectin, là % về số lượng của các gốc acid galacturonic được ester hóa trên tổng số lượng gốc acid galacturonic có trong phân tử. 1.2.2. Cấu trúc Pectin có cấu trúc phức tạp, dạng mạch thẳng, mỗi phân tử chứa từ vài trăm đến 1000 đơn vị, có phân tử lượng trung bình khoảng 50000 – 150000 đvC [4]. Pectin thương phẩm không có khối lượng phân tử xác định mà phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu, phương pháp trích ly và loại sản phẩm. 7 Phẩn tử đơn vị của pectin là acid D-galacturonic, ngoài ra còn có một số đường trung tính như rhamnose, galactose, arabinose và một số đường khác với hàm lượng ít hơn [5]. Các nhóm carboxyl (-COOH) có thể tồn tại tự do hoặc ở dạng liên kết ester với methanol, acid acetic, acid phenolic hoặc ở dạng muối của Na+, K+, NH4+ ,… Hình 1.2. Cấu trúc phân tử acid D- galacturonic Ở pectin amid hóa, một phần các gốc carboxyl trong phân tử pectin bị amid hóa tạo thành các nhóm amid (-CO=NH2). Ngoài ra pectin cũng có thể chứa các gốc acetyl. Hình 1.3. Các nhóm chức của pectin. Pectin là một polysaccharide, mạch thẳng, cấu tạo từ sự liên kết giữa các mạch của phân tử acid D- galactoronic C6H10O7 , liên kết giữa với nhau bằng liên kết 1,4-glicozide và một trong số gốc acid có chứa nhóm thế metoxyl (-OCH3) [20]. 8 Hình 1.4. Cấu trúc chung của pectin Những năm gần đây, nhiều hoạt tính quý báu như hoạt tính chống ung thư, hạ mỡ máu hay chống tiểu đường của các pectin được phân lập từ dịch chiết nước của nhiều loài thực vật như cây hồng (Diospyros kaki), trà xanh (Camellia sinensis) đã được công bố [9], [11]. 1.2.3. Ứng dụng Pectin là một loại chất xơ hòa tan trong nước, có tác dụng giảm cholesterol trong máu bằng cách giảm lipoprotein mật độ thấp (LDL). Điều này sẽ giúp làm giảm nguy cơ mắc bệnh xơ vữa động mạch và bệnh tim hiệu quả. Pectin được xem như là một chất chống ung thư. Một nghiên cứu được công bố trên tờ Glycobiogy của Mỹ năm ngoái đã chỉ ra, Pectin có thể làm chậm quá trình 9 phát triển của tế bào ung thư tuyến tiền liệt. Các nhà khoa học của trường Đại học Georgia cũng phát hiện ra Pectin có khả năng tiêu diệt đến 40% tế bào ung thư. Các nghiên cứu này cũng chỉ ra tỉ lệ thành công khi sử dụng Pectin trong việc điều trị ung thư phổi và ung thư ruột kết.[19] Pectin có khả năng chống chất độc hại, có thể giúp loại trừ kim loại nặng như thủy ngân ra khỏi cơ thể, giảm nhiệm vụ đào thải độc tố cho gan.Pectin như một phương pháp phòng ngừa cá nhân đối với nguy cơ nhiễm độc chì [22], một trong những chất độc nguy hiểm nhất, nằm trong một nhóm nhiều các chất độc công nghiệp, có thể gây ra nhiễm độc mãn tính do sự sử dụng rộng rãi trong một loạt các ngành công nghiệp. Bột pectin từ táo là nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên, một lực lượng đẩy lùi gốc tự do rất hiệu quả. Không những thế, báo cáo từ một nghiên cứu năm 2007 đã cho thấy tác dụng của các chất chống oxy hóa có trong bột pectin cực kỳ bền và còn hữu hiệu hơn theo thời gian. Chống lão hóa da chỉ mới là một khía cạnh trong công dụng của bột pectin táo. Thành phần này còn có tác dụng thay thế lớp tế bào da đã chết bằng các tế bào mới trẻ, khỏe. Theo các nhà nghiên cứu đến từ đại học Paris Decartes thì bột pectin táo không chỉ tẩy đi lớp da chết mà còn thúc đẩy quá trình tái tạo tế bào mới để thế chỗ. Nguồn cung cấp tế bào mới ổn định sẽ giữ cho làn da của bạn được cung cấp đủ nước, có độ đàn hồi và nhìn thật rạng rỡ [21]. 1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc Hiện nay, nghiên cứu về polysaccharide nói chung và pectin nói riêng đang thu hút sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học trên thế giới. Nhiều công trình về pectin và các dẫn xuất của chúng từ nhiều loài thực vật khác nhau như chè xanh, lá hồng,… đã được công bố. Hướng nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của polysaccharide Sulfat hóa đã và đang được các nhà khoa học trong nước quan tâm nghiên cứu cập nhật theo xu hướng của các nước tiên tiến trên thế giới, bao gồm chiết tách, thử hoạt tính, biến tính để tìm các sản phẩm có hoạt tính cao hơn hay nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc-hoạt tính. 10 Có hai phương thức để thu polysaccharide Sulfat hóa là đi từ con đường chiết tách các polysaccharide có sẵn gốc Sulfat trong phân tử từ tự nhiên (chủ yếu từ rong biển) hoặc tổng hợp, biến tính tạo gốc Sulfat từ polysaccharide thông thường. Các Sulfat polysaccharide trong tự nhiên thường có trong các loại rong biển, nấm và trong một số ít loài thực vật đã thu hút rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học. Các kết quả nghiên cứu cho thấy các Sulfat polysaccharide nhiều hoạt tính sinh học rất đáng chú ý như hoạt tính chống oxi hóa, chống virus, kháng viêm, chống đông máu, chống đông tụ tiểu cầu và chống ung thư…[12]. Trên cơ sở đó, các nghiên cứu tạo dẫn xuất Sulfat polysaccharide qua con đường tổng hợp phát triển khá mạnh mẽ. Do cấu trúc Sulfat hóa của polysaccharide có nhiều điểm tương đồng với heparin, Sulfat polysaccharide có nguồn gốc từ động vật đang được sử dụng phổ biến làm chất chống đông máu hiện nay, nên nhiều nghiên cứu tạo các dẫn xuất Sulfat polysaccharide từ thực vật thường tập trung vào khả năng tăng cường hoạt tính chống đông máu và chống đông tụ tiểu cầu [14]. Bên cạnh đó, nhiều công bố còn cho thấy dẫn xuất Sulfat hóa thường tăng cường hoạt tính chống oxi hóa của các polysaccharide. Năm 2015, Deng và cộng sự công bố nghiên cứu tạo dẫn xuất Sulfat hóa từ polysaccharide phân lập từ Dictyophora indusiata. Dẫn xuất thu được thể hiện hoạt tính chống oxi hóa và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao hơn hoạt tính của polysaccharide ban đầu [8]. Ở Việt Nam, bên cạnh các nghiên cứu về Sulfat polysaccharide chiết xuất từ rong biển [2], [3], cũng có các nghiên cứu theo hướng tổng hợp, tạo dẫn xuất Sulfat hóa từ polysaccharide thông thường. Gần đây, nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Trần Thị Vân Thi, Đại học Huế đã công bố nghiên cứu tạo dẫn xuất Sulfat của polysaccharide phân lập từ lá cây mãng cầu xiêm. Các dẫn xuất thu được thể hiện khả năng tăng cường hoạt tính chống oxi hóa so với polysaccharide ban đầu. Như vậy, tổng quan về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về quá trình tạo dẫn xuất Sulfat hóa của polysaccharide cho thấy quá trình Sulfat hóa hứa hẹn có thể tăng cường hoạt tính sinh học của polysaccharide. 11 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu Nguyên liệu để tổng hợp dẫn xuất Sulfat hóa gồm: - Pectin được phân lập từ cây cúc quỳ. Kết quả phân lập và tinh chế pectin được kế thừa từ các nghiên cứu trước của nhóm nghiên cứu theo quy trình như sau: Các mẫu thực vật sau khi thu hái được thái nhỏ, phơi trong bóng mát, sấy khô ở nhiệt độ 40-450C, sau đó đem nghiền nhỏ. Mẫu sau khi sơ chế, xử lí được ngâm chiết với etanol (1/2 ngày) x3 lần để loại bỏ chất béo, các chất hữu cơ phân tử lượng thấp. Chất rắn sau ngâm chiết được sử dụng cho các bước phân tách tiếp theo Mẫu thực vật sau khi loại bỏ chất béo và các chất hữu cơ phân tử lượng thấp được đun với nước nóng trong 2-3 giờ. Các dung dịch được cô đặc bằng cách cô đuổi dung môi. Pectin được kết tủa từ dung dịch cô đặc bằng etanol tỷ lệ 3:1. Tiếp tục tiến hành ly tâm, lọc, sấy để thu được các pectin thô. Quá trình tinh chế pectin bao gồm việc tách loại protein bằng phương pháp Sevag. Các chất màu được tách loại bằng các chất hấp phụ như than hoạt tính, các nhựa trao đổi ion. Pectin được tiếp tục được tinh chế qua màng thẩm tách... Sau các quá trình ta thu được mẫu pectin, gọi là mẫu TDP. Hình 2.1. Pectin đã đƣợc phân lập và tinh chế - Sulfuric acid - n-butanol