Tài liệu Luận văn bước đầu nghiên cứu thành phần hóa thực vật và một số hoạt tính sinh học từ lá cây trứng cá muntingia calabura l.​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM ----------------------------- PHẠM HỮU TUẤN BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ LÁ CÂY TRỨNG CÁ MUNTINGIA CALABURA L. LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số ngành: 60420201 TP. HỒ CHÍ MINH, tháng…năm 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM ----------------------------- PHẠM HỮU TUẤN BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ LÁ CÂY TRỨNG CÁ MUNTINGIA CALABURA L. LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số ngành: 60420201 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN NGỌC HỒNG TP. HỒ CHÍ MINH, tháng…năm 2017 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học : Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hồng (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Công nghệ TP. HCM ngày 11 tháng 11 năm 2017 Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ) TT Họ và tên Chức danh Hội đồng 1 PGS TS. Nguyễn Tiến Thắng Chủ tịch 2 TS. Nguyễn Hoàng Dũng Phản biện 1 3 PGS TS. Thái Văn Nam Phản biện 2 4 TS. Võ Đình Lệ Tâm Ủy viên 5 TS. Nguyễn Thị Hai Ủy viên, Thư ký Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau khi Luận văn đã được sửa chữa (nếu có). Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHỆ TP. HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM VIỆN ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC Độc lập – Tự do – Hạnh phúc TP. HCM, ngày..… tháng….. năm 20..… NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: ...............Phạm Hữu Tuấn...............................Giới tính: Nam ................. Ngày, tháng, năm sinh: ............18/04/1993................................Nơi sinh: TP.HCM.......... Chuyên ngành: .....................Công nghệ sinh học......................MSHV: 1541880011 ...... I- Tên đề tài: BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ LÁ CÂY TRỨNG CÁ MUNTINGIA CALABURA L. II- Nhiệm vụ và nội dung: Nhiệm vụ: Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật và một số hoạt tính sinh học của lá cây trứng cá. Nội dung: Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu, định tính thành phần hóa học bằng phương pháp hóa, khảo sát năng chống oxi hóa, khả năng kháng khuẩn, khả năng điều hòa đường huyết, khả năng giải độc gan, khả năng điều trị tiêu chảy, định tính một số thành phần hóa học nhờ sắc ký cao áp ghép khối phổ. III- Ngày giao nhiệm vụ: (Ngày bắt đầu thực hiện LV ghi trong QĐ giao đề tài) 15/02/2017 IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 30/08/2017 V- Cán bộ hướng dẫn: (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên) Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hồng CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên và chữ ký) KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên và chữ ký) i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Học viên thực hiện Luận văn ii LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua. Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Ngọc Hồng người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các bạn đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của mình. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc sống. iii TÓM TẮT Cây trứng cá (Muntingia calabura) được trồng nhiều ở miền Nam Việt Nam và thường dùng để làm bóng mát nhưng hoạt tính sinh học ít được nghiên cứu. Trong nghiên cứu này dịch chiết ethanol 70% (EMC70), ethanol 90% (EMC90) và dịch chiết nước (AMC) từ lá cây trứng cá được sử dụng để đánh giá sơ bộ thành phần hóa học và khảo sát một số hoạt tính sinh học bao gồm: Khả năng chống oxi hóa, khả năng kháng khuẩn, khả năng điều hòa đường huyết, khả năng trị tiêu chảy, khả năng giải độc gan đồng thời định tính một số thành phần hóa học cơ bản bằng phương pháp LC-MS/MS. Kết quả định tính cho thấy có nhiều hợp chất như phenolic, flavonoid, tannin và steroid trong các dịch chiết EMC70 và EMC90, trong khi AME chứa saponin và amino acid tự do. Kết quả định tính cũng cho thấy hàm lượng pholyphenol, flavonoid và tannin tổng số trong dịch chiết EMC70 là cao nhất. Khả năng kháng khuẩn của EMC70 và EMC90 là tương đương nhau đối với các chủng E.coli-ETEC, Shigella flexneri, Listeria monocytogenes, Listeria innocua và Staphylococcus aureus. Dịch chiết EMC90 có khả năng hạ đường huyết tốt nhất trong tổng số 2 loại dịch chiết còn lại tại nồng độ 200 mg/kg. Khả năng ức chế tiêu chảy của dịch chiết EMC70 tại nồng độ 750 mg/kg lên tới 78,87 % và tương đương với đối chứng loperamide 3 mg/ml. Khả năng giải độc gan của 3 loại dịch chiết được xác định dựa trên chỉ số men gan ALT và AST. Dịch chiết EMC70 tại nồng độ 50 mg/kg với kết quả giá trị ALT giảm đáng kể so với lúc trước khi được chữa trị. Phân tích HPLCMS của dịch chiết EMC70 cho kết quả hướng tới sự hiện diện của chrysoeriol có khả năng bảo vệ gan nhiễm độc cũng như tác động tích cực trong điều trị bệnh tiểu đường. Một số chất khác thuộc nhóm flavonoid cũng được tìm thấy trong dịch chiết này. Kết quả tổng hợp cho thấy cây Muntingia calabura có hoạt tính chống oxi hóa, tiềm năng kháng khuẩn đối với một số chủng vi sinh gây bệnh đường ruột, khả năng trị tiêu chảy, điều hòa đường huyết và bảo vệ gan của dịch chiết ethanol. iv ABTRACT Muntingia calabura L. was grown in southern Vietnam. Until now there are not many scientific articles published on the bioactivity of Muntingia calabura leaves. In this study, ethanol 70% extract (EMC70), ethanol 90% extract (EMC90) and aqueous extract (AMC) from Muntingia calabura leaves are used to test phytochemical and evaluation of bioactivities such as antioxidant, antimicrobial activity, hypoglycemia, anti-diarrhea and hepatoprotective activity. Determination of compounds by high performance liquid chromatography ‒ mass spectrometry (HPLC/MS). The result of phytochemical screening showed that phenolics, flavonoids, tannins and steroids in EMC70 and EMC90. AMC with saponins and free amino acids. Result of EMC70 in total polyphenol content, total flavonoid content and total tannin content were highest. Antimicrobial activity of EMC70 and ECM90 were the same in E.coli-ETEC, Shigella flexneri, Listeria monocytogenes, Listeria innocua and Staphylococcus aureus. Anti-diarrhea activity of EMC70 was reached 78.87% and it was equivalent to the group was treated by loperamide 3 mg/ml. Hepatoprotective activity of EMC70, EMC90 and AMC was determined based on ALT and AST. EMC70 resulted in a significant reduction in ALT at 50 mg/kg compared with prior to treatment. Qualitative HPLC/MS analysis of EMC70 was showed the results toward the presence of chrysoeriol that is capable of protecting the liver from toxicity as well as positive effects in treatment of diabetes. Other flavonoid compounds were found in this extract. The results in this study were showed that Muntingia calabura had antioxidant activity, potential antimicrobial activity, antidiarrhea activity, hypoglycemia and hepatoprotective activity of ethanol extracts. v MỤC LỤC TRANG LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ii TÓM TẮT ................................................................................................................ iii ABTRACT ................................................................................................................ iv MỤC LỤC .................................................................................................................. v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... ix DÁNH SÁCH CÁC BẢNG ....................................................................................... x DANH SÁCH CÁC HÌNH.................................................................................... xiii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 4 1.1. Tổng quan về cây Muntingia calabura ............................................................. 4 1.1.1. Nguồn gốc ......................................................................................................... 4 1.1.2. Phân loại ........................................................................................................... 4 1.1.3. Đặc điểm chung của cây Muntingia calabura ................................................ 4 1.1.4. Công dụng ........................................................................................................ 6 1.1.5. Một số hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây Muntingia calabura ......... 6 1.1.6. Cây trứng cá và các bài thuốc dân gian .......................................................... 8 1.1.7. Các nghiên cứu trong và ngoài nước .............................................................. 9 1.2.Tổng quan về chất chống oxi hóa .................................................................... 11 1.2.1. Khái niệm chất chống oxi hóa ....................................................................... 11 1.2.2. Cơ chế chống oxi hóa của các hợp chất tự nhiên ........................................ 11 1.2.3. Một số chất tự nhiên từ thực vật có khả năng chống oxi hóa ..................... 11 1.3. Vi sinh vật chỉ thị.............................................................................................. 12 1.3.1. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Escherichia....................................................... 12 1.3.2. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Listeria .............................................................. 13 1.3.3. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Shigella ............................................................. 15 1.3.4. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Staphylococcus ................................................. 17 1.4. Hợp chất kháng khuẩn từ thực vật ................................................................ 19 1.4.1. Khái niệm hợp chất kháng khuẩn từ thực vật .............................................. 19 vi 1.4.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật ...................................... 19 1.5. Giới thiệu về bệnh tiểu đường ......................................................................... 22 1.5.1. Khái niệm........................................................................................................ 22 1.5.2. Phân loại ......................................................................................................... 23 1.5.3. Thuốc trị tiểu đường glibenclamide .............................................................. 24 1.6. Giới thiệu về bệnh tiêu chảy ............................................................................ 25 1.6.1. Khái niệm........................................................................................................ 26 1.6.2.Nguyên nhân gây bệnh ................................................................................... 26 1.6.3. Cơ chế gây bệnh tiêu chảy ............................................................................. 28 1.6.4. Cơ chế gây tiêu chảy bằng tác nhân castor oil ............................................. 29 1.6.5. Thuốc trị tiêu chảy loperamide ...................................................................... 29 1.7. Giới thiệu các bệnh về gan và acetaminophen .............................................. 30 1.7.1. Các bệnh về gan ............................................................................................. 30 1.7.2. Các loại enzyme của gan ................................................................................ 30 1.7.3. Cơ chế gây độc gan của acetaminophen ....................................................... 31 1.7.4. Thuốc giải độc gan Silymarin........................................................................ 33 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 34 2.1.Thời gian và địa điểm ....................................................................................... 34 2.1.1. Thời gian......................................................................................................... 34 2.1.2. Địa điểm .......................................................................................................... 34 2.2. Đối tượng nghiên cứu....................................................................................... 34 2.2.1. Nguyên liệu thực vật ...................................................................................... 34 2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị ........................................................................................... 34 2.2.3. Đối tượng động vật ......................................................................................... 34 2.2.4. Hóa chất, dụng cự và thiết bị ......................................................................... 34 2.3. Phương pháp nghiên cứu................................................................................. 35 2.3.1. Thu hái và xử lý mẫu ..................................................................................... 35 2.3.2. Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn dược liệu .............................................. 35 2.3.3. Phương pháp xác định thành phần hóa học ................................................ 38 2.3.4. Hàm lượng flavonoid tổng số ........................................................................ 39 2.3.5. Hàm lượng phenolic tổng số ......................................................................... 39 vii 2.3.6. Hàm lượng tannin tổng số ............................................................................. 39 2.3.7. Phương pháp FRAP....................................................................................... 39 2.3.8. Khả năng chống oxy hóa quét gốc tự do DPPH ........................................... 40 2.3.9. Phương pháp xác định năng lực khử ........................................................... 40 2.3.10. Hoạt tính kháng khuẩn ................................................................................ 40 2.3.11. Xác định độc tính cấp diễn .......................................................................... 40 2.3.12. Mô hình chuột tiểu đường cấp tính............................................................. 41 2.3.13. Mô hình chuột bi ̣nhiễm độc acetaminophen ............................................. 41 2.3.14. Mô hình chuột tiêu chảy castor oil ................................................................. 41 2.3.15. Phương pháp sắc ký cao áp ghép khối phổ (HPLC-MS) ........................... 41 2.3.16. Xử lý số liệu .................................................................................................. 41 2.4. Bố trí thí nghiệm............................................................................................... 41 2.4.1. Thí nghiệm 1: Thu nhận cao chiết EMC70, EMC90 và AMC từ cây Muntingia calabura.................................................................................................. 43 2.4.2. Thí nghiệm 2: Định tính một số thành phần hóa học có trong cây ............ 43 2.4.3. Thí nghiệm 3: Hàm lượng flavonoid tổng số................................................ 46 2.4.4. Thí nghiệm 4: Hàm lượng phenolic tổng số ................................................. 46 2.4.5. Thí nghiệm 5: Hàm lượng tannin tổng số .................................................... 47 2.4.6. Thí nghiệm 6: Khả năng chống oxi hóa bằng phương pháp FRAP ........... 47 2.4.7. Thí nghiệm 7: Khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH ................... 48 2.4.8. Thí nghiệm 8: Xác định năng lực khử .......................................................... 49 2.4.9. Thí nghiệm 9: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EMC70, EMC90 và AMC từ cây Muntingia calabura .......................................................... 51 2.4.10. Thí nghiệm 10: Xác định độc tính cấp diễn ................................................ 52 2.4.11. Thí nghiệm 11: Mô hình chuột tiểu đường cấp tính .................................. 53 2.4.12. Thí nghiệm 12: Mô hình chuột bi ̣nhiễm độc acetaminophen ................... 54 2.4.13. Thí nghiệm 13: Mô hình chuột tiêu chảy castor oil ................................... 55 2.4.14. Thí nghiệm 14: Định tính bằng phương pháp sắc ký sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ HPLC................................................................................................ 56 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN ................................................................ 57 3.1. Bước đầu góp phần xây dựng tiêu chuẩn dược liệu ...................................... 57 3.1.1. Khảo sát vi phẩu và soi bột dược liệu ............................................................ 57 viii 3.1.2. Độ tinh khiết của dược liệu ........................................................................... 61 3.1.3. Hàm lượng cắn thu được từ dịch chiết lá cây trứng cá ............................... 62 3.2. Thành phần hóa học có trong cây Muntingia calabura ................................ 62 3.3. Định lượng flavonoid phenolic và tannin ....................................................... 65 3.4. Khả năng chống oxy hóa.................................................................................. 65 3.4.1. Khả năng chống oxi hóa theo phương pháp FRAP ..................................... 65 3.4.2. Khả năng chống oxi hóa theo phương pháp xác định năng lực khử.......... 67 3.4.3. Khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH ........................................... 68 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn .................................................................................... 72 3.5.1. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Muntingia calabura ............ 72 3.5.2. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của dịch chiết EMC70, EMC90 và AMC . 76 3.6. Độc tính cấp diễn .............................................................................................. 79 3.7. Khả năng điều hòa đường huyết trên mô hình chuột tiểu đường cấp tính 80 3.8. Khả năng trị tiêu chảy trên mô hình castor oil ............................................. 82 3.9. Khả năng giải độc gan trên mô hình acetaminophen ................................... 85 3.10. Phân tích sắc kí HPLC-MS ........................................................................... 89 KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 93 4.1. Kết luận ............................................................................................................. 93 4.2. Đề nghị............................................................................................................... 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 95 ix DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMC: Aqueous extract of Muntingia calabura (Dịch chiết nước từ lá cây Muntingia calabura) EMC70: 70% ethanol extract of Muntingia calabura (Dịch chiết ethanol 70% từ lá cây Muntingia calabura) EMC90: 90% ethanol extract of Muntingia calabura (Dịch chiết ethanol 70% từ lá cây Muntingia calabura) FRAP: Ferric reducing antioxidant power (Khả năng chống oxi hóa thông qua việc khử sắt). HPLC/MS: High performance liquid chromatography / mass spectrometry (Sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ) PSMs: Plant secondary metabolites: (Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ thực vật) x DANH MỤC CÁC BẢNG TRANG Bảng 1.1. Một số hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật............................ 20 Bảng 2.1. Các chỉ tiêu theo dõi ................................................................................. 52 Bảng 3.1. Độ ẩm của lá cây và bột dược liệu ........................................................... 61 Bảng 3.2. Định tính thành phần hóa học có trong Muntingia calabura L. .............. 63 Bảng 3.3. Hàm lượng polyphenol, flavonoid và tannin tổng số ............................... 65 Bảng 3.4. Kết quả tính toán giá trị FRAP ................................................................. 66 Bảng 3.5. Tương quan pearson giữa hàm lượng polyphenol và flavonoid với khả năng chống oxi hóa theo phương pháp FRAP ................................................................... 66 Bảng 3.6. Tương quan pearson giữa hàm lượng polyphenol và flavonoid với khả năng chống oxi hóa theo theo năng lực khử ...................................................................... 68 Bảng 3.7. Kết quả IC50 chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH ................................... 70 Bảng 3.8. Tương quan pearson giữa hàm lượng polyphenol và flavonoid với khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH ......................................................................... 70 Bảng 3.9. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EMC70, EMC90 và AMC (100 mg/ml) đối với các chủng vi sinh vật khác ............................................................... 74 Bảng 3.10. Hoạt tính kháng khuẩn từ cây Muntingia calabura L. tại nồng độ 100 mg/ml ........................................................................................................................ 75 Bảng 3.11. Nồng độ ức chế tối thiểu EMC70 ở các nồng độ 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12.5 mg/ml ................................................................................................................ 77 Bảng 3.12. Nồng độ ức chế tối thiểu EMC90 ở các nồng độ 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12.5 mg/ml ................................................................................................................ 77 Bảng 3.13. Nồng độ ức chế tối thiểu AMC ở các nồng độ 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12.5 mg/ml ........................................................................................................................ 78 Bảng 3.14. Kết quả phân tích một số hợp chất từ dịch chiết cây Muntingia calabura bằng phương pháp sắc ký HPLC-MC ...................................................................... 89 xi DANH MỤC CÁC HÌNH TRANG Hình 1.1. Ảnh chụp cây Muntingia calabura L ......................................................... 5 Hình 1.2. Mô phỏng hình thái cây Muntingia calabura L ......................................... 5 Hình 1.3. Mô phỏng cấu tạo bầu nhụy, nhị và cánh hoa ............................................ 6 Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa ............................................... 11 Hình 1.5. Hình thái E.coli trên kính hiển vi điện tử ................................................. 12 Hình 1.6. Khuẩn lạc E.coli trên môi trường EMB ................................................... 13 Hình 1.7. Hình thái Listeria monocytogenes trên kính hiển vi điện tử .................... 14 Hình 1.8. Khuẩn lạc Listeria monocytogenes trên môi trường thạch thường .......... 14 Hình 1.9. Hình thái Shigella trên kính hiển vi điện tử ............................................. 15 Hình 1.10. Khuẩn lạc Shigella trên môi trường Macconkey .................................... 16 Hình 1.11. Hình thái Staphylococcus trên kính hiển vi điện tử................................ 17 Hình 1.12. Khuẩn lạc Staphylococcus aureus trên môi trường Baird Parker bổ sung egg yolk ..................................................................................................................... 18 Hình 1.13. Các điểm tác động của PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm ................................................................................................................................... 20 Hình 1.14. Cơ sở đánh giá các loại phân .................................................................. 26 Hình 1.15. Sơ đồ chuyển hóa acetaminophen trong cơ thể ...................................... 32 Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát ......................................................................................... 42 Hình 2.2. Sơ đồ thu nhận cắn chiết từ cây Muntingia calabura .............................. 43 Hình 2.3. Quy trình định tính dịch chiết EMC70 EMC90 và AMC từ cây Muntingia calabura .................................................................................................................... 44 Hình 2.4. Quy trình thực hiện khả năng chống oxi hóa theo phương pháp FRAP .. 47 Hình 2.5. Quy trình thực hiện khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH ........ 48 Hình 2.6. Quy trình thực hiện khả năng chống oxi hóa theo năng lực khử ............. 50 Hình 2.7. Quy trình thực hiện khả năng kháng khuẩn ............................................. 51 Hình 2.8. Mô hình chuột tiểu đường cấp tính .......................................................... 53 Hình 2.9. Mô hình giải độc gan acetaminophen....................................................... 54 Hình 2.10. Mô hình tiêu chảy castor oil ................................................................... 55 Hình 3.1. Lông tiết.................................................................................................... 57 Hình 3.2. Mặt cắt biểu bì lá ...................................................................................... 57 xii Hình 3.3 A. Mặt cắt ngang thân B. Mặt cắt dọc thân ............................................... 58 Hình 3.4. Mặt cắt dọc hoa cây Muntingia calabura. ................................................ 58 Hình 3.5 A. Cấu tạo nhị hoa. B. Chỉ nhị C. Bao phấn ............................................. 59 Hình 3.6. Hình thái hạt phấn .................................................................................... 59 Hình 3.7. Bề mặt cánh hoa ....................................................................................... 60 Hình 3.8. Cấu tạo noãn ............................................................................................. 60 Hình 3.9. Bột dược liệu ............................................................................................ 61 Hình 3.10. Hàm lượng của 3 loại cắn thu được từ lá cây Muntingia calabura........ 62 Hình 3.11. A Định tính saponin B. Định tính flavonoid (thử nghiệm shinoda), C. Định tính alkaloid trên AMC, D. Định tính amino acid trên AMC, E. Định tính phenolic, F. Định tính steroid. .................................................................................. 64 Hình 3.12 Đường chuẩn Fe2+-TPTZ ......................................................................... 66 Hình 3.13. Khả năng khử của 3 dịch chiết EMC70, EMC90, AMC và đối chứng acid ascorbic...................................................................................................................... 67 Hình 3.14. Đường chuẩn acid ascorbic nồng độ từ 20 đến 70 µg/ml ...................... 68 Hình 3.15. Hoạt tính quét gốc tự do ở các nồng độ từ cây Muntingia calabura ..... 69 Hình 3.16. Hoạt tính chống oxi hóa của acid ascorbic ............................................. 69 Hình 3.17. Khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do của EMC70 ở các nồng độ khác nhau ........................................................................................................................... 70 Hình 3.18. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EMC70, EMC90 và AMC (100 mg/ml) đối với chủng E.coli-ETEC. ......................................................................... 73 Hình 3.19. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EMC70, EMC90 và AMC (100 mg/ml) đối với chủng Shigella flexneri và Shigella boydii. ..................................... 73 Hình 3.20. A. Hoạt tính kháng khuẩn của EMC90 (100 mg/ml) đối với chủng Shigella flexneri, B. AMC (100 mg/ml) đối với chủng Listeria monocytogenes, C. EMC70 (100 mg/ml) đối với chủng E.coli-ETEC, D. EMC70 (100 mg/ml) đối với chủng Staphylococcus aureus .............................................................................................. 76 Hình 3.21. Chỉ số đường huyết của các nhóm chuột uống cao chiết, nhóm tăng đường, đối chứng và glibenclamide 10 mg/kg ...................................................................... 80 Hình 3.22. Tỷ lệ ức chế tiêu chảy............................................................................. 82 Hình 3.23. Thời gian tiêu chảy ................................................................................. 83 Hình 3.24. Chỉ số men gan ALT của các nhóm chuột uống dịch chiết EMC70, EMC90, AMC, sylimarin, nhóm tăng men gan và nhóm chuột đối chứng .............. 86 xiii Hình 3.25. Chỉ số men gan AST của các nhóm chuột uống dịch chiết EMC70, EMC90, AMC, sylimarin, nhóm tăng men gan và nhóm chuột đối chứng .............. 87 Hình 3.26. Sắc ký đồ HPLC-MS dịch chiết EMC70 từ lá cây Muntingia calabura 90 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây thuốc dân gian từ lâu đã được nhiều người quan tâm đến. Từ những năm đầu thế kỷ XX con người ta đã biết sử dụng thực vật như một nguồn thuốc chữa bệnh bằng kinh nghiệm dân gian. Theo đà phát triển của lịch sử, kho tàng kinh nghiệm dân gian phòng chống bệnh tật ngày càng phong phú và đa dạng. Đây là nguồn tài nguyên thực vật có giá trị cao trong việc phòng chữa nhiều loại bệnh thay cho một số loại thuốc Tây y. Trong chẩn đoán và điều trị bệnh, một số loại thuốc Tây y luôn đi kèm với nhiều tác dụng phụ không mong muốn như nôn mửa, rối loạn tiêu hóa, chóng mặt, nhức đầu, có nguy cơ tái bệnh,… Bên cạnh một hiện trạng thực tế là việc kháng thuốc kháng sinh ngày càng trở nên phổ biến ở các nước phát triển thì việc tìm đến các loại thảo dược thiên nhiên để chữa bệnh thay cho các loại thuốc tây là điều tất yếu và dần đang trở thành một xu thế. Trong những năm trở lại đây, từ xu hướng sử dụng các loại cây thuốc dân gian để chữa bệnh, các nước phát triển đầu tư vào nghiên cứu nhiều loại cây thuốc dân gian nhằm tách chiết cũng như trích ly các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học để tìm ra hướng ứng dụng và điều chế nhiều loại thuốc mới. Cây mật sâm (trứng cá) trên một số nghiên cứu trên thế giới có tác dụng chống oxi hóa, kháng khuẩn cùng với kháng viêm. Tại Việt Nam, cây trứng cá chủ yếu được trồng khắp nơi để làm bóng mát với số lượng đáng kể, nhưng hoạt tính sinh học ít được nghiên cứu đến. Thậm chí, ở nhiều nơi còn bắt đầu chặt phá loài cây này. Tannin, một thành phần hóa học được biết đến với khả năng ức chế quá trình tiêu chảy được tìm thấy nhiều trong cây trứng cá nhưng cho tới hiện nay vẫn chưa có bất cứ nghiên cứu nào liên quan tới khả năng này. Nhằm tận dụng nguồn nguyên liệu tiềm năng trong chữa trị một số bệnh cũng như khẳng định tầm quan trọng cây trứng cá trong từ điển trị liệu Đông y. Chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa thực vật và một số hoạt tính sinh học từ lá cây trứng cá Muntingia calabura L.” nhằm tìm hiểu sâu hơn về tác dụng sinh học, cũng như hướng 2 ứng dụng thực tiễn cùng với khả năng chữa bệnh của cây trứng cá theo một góc nhìn khoa học. 2. Mục đích Đánh giá một số thành phần hóa học có trong cá dịch chiết từ cây Muntingia calabura. Khảo sát một số hoạt tính sinh học tiềm năng trong dịch chiết từ cây Muntingia calabura. 3. Nội dung nghiên cứu Đánh giá sơ bộ hoạt tính hóa học. Khảo sát khả năng chống oxy hóa của cây Muntingia calabura. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn các dịch chiết từ lá cây Muntingia calabura. Đánh giá khả năng hạ đường huyết của cây Muntingia calabura trên mô hình động vật. Đánh giá khả năng trị tiêu chảy của cây Muntingia calabura trên mô hình động vật Đánh giá khả năng bảo vệ gan chống lại chất độc từ cây Muntingia calabura. Định tính một số thành phần hóa học cơ bản bằng phương pháp HPLC/MS. 4. Ý nghĩa khoa học Lá cây Muntingia calabura có hoạt tính chống oxi hóa, kháng một số vi khuẩn gây hại ở đường ruột, có tiềm năng bảo vệ gan và ổn định đường huyết. Bên cạnh đó, hoạt tính lá cây Muntingia calabura có tiềm năng phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh tiêu chảy mà các nghiên cứu trong và ngoài nước chưa thấy nghiên cứu về tác dụng sinh học này. 5. Ý nghĩa thực tiễn 3 Nguyên liệu lá cây Muntingia calabura trong nghiên cứu có tác dụng điều hòa đường huyết, giải độc gan cũng như chống lại một số chủng gây bệnh đường ruột hỗ trợ điều trị tiêu chảy nên có thể ứng dụng làm thực phẩm chức năng. Một sản phẩm hướng ứng dụng của lá cây này là làm trà thảo mộc ngăn ngừa béo phì và các biến chứng về tim mạch, ngăn ngừa các bệnh về gan và tốt cho hệ tiêu hóa. Sản phẩm này mang lại hiệu quả về mặt kinh tế vì có nguồn nguyên liệu phong phú, giá rẻ. Nghiên cứu cũng chứng minh được hoạt tính dược lý của bộ phận lá nên cũng góp phần tạo nên thu nhập cho người dân trồng loại cây này. 6. Phạm vi nghiên cứu Khảo sát chỉ giới hạn trên đối tượng là bộ phận lá Các khảo sát chỉ thực hiện trên 3 loại dung môi ethanol 70%, ethanol 90% và nước. Giới hạn khảo sát hoạt tính kháng khuẩn chỉ trên 9 chủng vi sinh vật chỉ thị Khảo sát khả năng giải độc gan chỉ dựa trên 2 loại enzyme alanine transaminase và aspartate transaminase