Tài liệu Luận văn khảo sát hệ enzyme cellulase thu nhận từ cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò để phân giải rơm qua xử lý​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HỆ ENZYME CELLULASE THU NHẬN TỪ CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN TRONG DẠ CỎ BÒ ĐỂ PHÂN GIẢI RƠM QUA XỬ LÝ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH CN.NGÔ ĐỨC DUY Sinh viên thực hiện: LƯU THÁI HÒA MSSV: 1051110075 Lớp: 10DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp này là kết quả nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Hoàng Quốc Khánh và CN. Ngô Đức Duy, không sao chép của ai. Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu của đồ án. Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm và mọi kỷ luật của khoa và nhà trường đề ra. Sinh viên thực hiện Lưu Thái Hòa LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm đồ án tốt nghiệp ở Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thủ Đức, được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy Cô, các anh chị và các bạn, em đã hoàn thành tốt bài báo cáo này. Em xin cảm ơn chân thành đến: Thầy TS. Hoàng Quốc Khánh, trưởng phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Thầy đã tạo điều kiện cho em được làm đồ án tốt nghiệp tại đây, nhiệt tình hướng dẫn và hỗ trợ để em thực hiện tốt đồ án tốt nghiệp. Thầy Ngô Đức Duy phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Ban giám hiệu Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM và toàn thể các Thầy Cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường là những người đã tận tình dạy dỗ, đã tạo điều kiện để chúng em học tập tốt, đã tận tình giúp đỡ, quan tâm đến việc học tập của chúng em trong suốt 4 năm qua. Các anh chị trong phòng Thí Nghiệm Vi Sinh của Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã cung cấp cho em những số liệu mà em cần, khi em làm về qui trình thực nghiệm. Tất cả các bạn trong lớp 10DSH02 thân yêu đã an ủi động viên tôi hoàn thành tốt bài khóa luận này, cũng như những bạn đã quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ mọi thứ với tôi trong suốt thời sinh viên. Và con xin cám ơn Bố Mẹ, chị hai, em gái, những người thân đã luôn động viên con, giúp con có nghị lực để con có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp. MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................... i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... iv DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................ v DANH MỤC BIỂU ĐỒ ............................................................................................. v DANH MỤC SƠ ĐỒ ................................................................................................ vi DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................ vi LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1.Tính cấp thiết của đề tài .........................................................................................1 2.Tình hình nghiên cứu .............................................................................................1 3.Mục đích nghiên cứu .............................................................................................2 4.Nhiệm vụ nghiên cứu .............................................................................................2 5.Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................3 6.Các kết quả đạt được của đề tài .............................................................................3 7.Kết cấu của đồ án tốt nghiệp..................................................................................3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN..................................................................................... 4 1.1. Giới thiệu về cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò .............................................4 1.1.1. Hệ vi sinh vật trong dạ cỏ bò ......................................................................4 1.1.2.Vi khuẩn phân giải cellulose ở dạ cỏ bò ......................................................8 1.1.3. Điều kiện vật lý trong dạ cỏ bò ...................................................................9 1.2. Giới thiệu về hệ enzym cellulase .....................................................................10 1.2.1. Định nghĩa ................................................................................................10 1.2.2. Phân loại...................................................................................................10 1.2.3. Cấu tạo của cellulase ................................................................................11 1.2.4. Tính chất ....................................................................................................11 1.2.5. Các chất ức chế .........................................................................................12 i 1.2.6. Cellulosome ...............................................................................................12 1.3. Phân giải rơm qua xử lý ...................................................................................13 1.3.1. Thành phần của rơm .................................................................................13 1.3.2. Cấu trúc của rơm trong tự nhiên ..............................................................14 1.3.3. Các phương pháp tiền xử lý rơm rạ ..........................................................15 1.3.4. Con đường phân giải rơm .........................................................................17 1.4. Hiện trạng sử dụng rơm rạ tại Việt Nam và các nước trên thế giới ................18 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 20 2.1. Nguyên vật liệu ................................................................................................20 2.2. Thiết bị, hóa chất..............................................................................................21 2.2.1. Thiết bị .......................................................................................................21 2.2.2. Hóa chất ....................................................................................................21 2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................24 2.3.1. Quy trình tăng sinh chọn lọc. ....................................................................25 2.3.2. Quy trình tăng sinh khảo sát nhiệt độ phát triển của hệ vi sinh vật.........26 2.3.3. Quy trình tăng sinh khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật.................27 2.4. Xác định hàm lượng, hoạt tính của enzyme cellulase .....................................28 2.4.1. Quy trình phát hiện sinh tổng hợp enzyme endoglucanase trên thạch đĩa CMC .....................................................................................................................28 2.4.2. Định lượng hàm lượng protein tổng trong dịch nuôi cấy theo phương pháp Bradford......................................................................................................28 2.4.3. Định lượng hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp Filter Paper .30 2.5. Khảo sát nhiệt độ, pH thích hợp của hệ enzyme cellulase ..............................31 2.5.1. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính cellulase................................................32 ii 2.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính cellulase .......................................32 2.6. Khảo sát quá trình enzyme cellulase thủy phân cellulose từ rơm rạ ..............32 2.6.1. Định lượng đường khử bằng phương pháp DNS ......................................33 2.6.2. Khả năng phân giải rơm rạ .......................................................................34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN........................................................... 35 3.1. Kết quả tăng sinh trên môi trường PCS ...........................................................35 3.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ phát triển của hệ vi sinh vật...................................38 3.3. Kết quả khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật ...........................................39 3.4. Kết quả hàm lượng protein tổngtheo phương pháp Bradford .........................42 3.5. Kết quả đo hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp Filter Paper ..........43 3.5.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt tính cellulase....................43 3.5.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính cellulase ...........44 3.6. Kết quả đo lượng đường khử sau khi phân giải rơm theo phương pháp DNS .................................................................................................................................46 3.7. Kết quả phân giải rơm rạ .................................................................................48 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 49 4.1.Kết luận .............................................................................................................49 4.2.Đề nghị ..............................................................................................................50 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 51 PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CMC carboxymethyl cellulose DNS Acid Dinitro – Salicylic FP phương pháp filter paper mg miligram ml mililiter iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Dung dịch đệm citrate ............................................................................... 22 Bảng 2.2. Dung dịch đệm phosphate ......................................................................... 22 Bảng 2.3. Thông số xây dựng đường chuẩn albumin ............................................... 29 Bảng 2.4. Thông số xây dựng đường chuẩn glucose ................................................ 30 Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra ngày phân giải giấy lọc trong môi trường PCS và vòng phân giải trên đĩa thạch CMC tại 37℃, pH 7,0. ........................................................ 35 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở 37℃, pH 7,0. ............ 38 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở 39℃, pH 7,0. ............ 38 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở 41℃, pH 7,0 ............. 39 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở các pH khác nhau ..... 40 Bảng 3.6. Nồng độ protein tổng của 9 mẫu vi sinh vật dạ cỏ bò .............................. 42 Bảng 3.7. Giá trị OD540nm của 9 mẫu khảo sát hoạt tính cellulase thay đổi pH từ 6,0 – 6,9 ở 39℃ .......................................................................................................... 43 Bảng 3.8. Giá trị OD540nm của 9 mẫu khảo sát hoạt tính cellulase thay đổi nhiệt độ 37℃, 39℃, 41℃ ở pH tối ưu...................................................................................... 44 Bảng 3.9. Kết quả hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp FP ....................... 45 Bảng 3.10. Kết quả hàm lượng glucose trong dịch sau phân giải rơm của 3 mẫu enzyme cellulase. ........................................................................................................ 47 Bảng 3.11. Khả năng phân giải rơm của 3 mẫu enzyme cellulase ........................... 48 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Nồng độ protein tổng của 9 mẫu vi sinh vật dạ cỏ bò .......................... 42 Biểu đồ 3.2. Hoạt tính cellulase tổng số của 9 mẫu enzyme cellulase ..................... 45 Biểu đồ 3.3. Hàm lượng glucose tạo thành trong dịch sau phân giải rơm của 3 mẫu enzyme cellulase. ........................................................................................................ 47 Biểu đồ 3.4. Khả năng phân giải rơm của 3 mẫu enzyme cellulase ......................... 48 v DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Quy trình thu nhận enzyme cellulase. ...................................................... 20 Sơ đồ 2.2. Tóm tắt toàn bộ thí nghiệm. ..................................................................... 24 Sơ đồ 2.3. Quy trình tăng sinh chọn lọc mẫu. ........................................................... 25 Sơ đồ 2.4. Quy trình khảo sát nhiệt độ phát triển của hệ vi sinh vật ........................ 26 Sơ đồ 2.5. Quy trình khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật................................. 27 Sơ đồ 2.6. Quy trình phân giải rơm bằng hệ enzyme cellulase................................. 32 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Hệ tiêu hóa của trâu bò ................................................................................ 4 Hình 1.2.Protazoa cùng với vi khuẩn và bào tử nấm .................................................. 5 Hình 1.3.Ruminococcus flavefaciens........................................................................... 6 Hình 1.4. Thành phần của lignocellulose .................................................................. 13 Hình 1.5. Cấu trúc hiển vi của lignocellulose ........................................................... 14 Hình 1.6. Cấu trúc của lignocellulose ....................................................................... 15 Hình 1.7. Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase theo Erikson .............................. 17 Hình 3.1. Chín mẫu dạ cỏ bò tăng sinh ở 37℃, pH 7,0. ........................................... 36 Hình 3.2.Vòng phân giải trên đĩa thạch CMC của 9 mẫu dạ cò bò ở 37℃, pH 7,0 sau 07 ngày tăng sinh trong môi trường PCS ............................................................ 37 Hình 3.3.Vòng phân giải trên đĩa thạch CMC của 9 mẫu dạ cò bò ở 37℃, pH 7,0 sau 10 ngày tăng sinh trong môi trường PCS. ........................................................... 37 Hình 3.4.Vòng phân giải trên đĩa thạch CMC của 9 mẫu dạ cò bò ở 37℃, pH 7,0 sau 13 ngày tăng sinh trong môi trường PCS. ........................................................... 37 vi Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay nguồn phế thải hữu cơ do các nhà máy công nghiệp chế biến thực phẩm thải ra là rất lớn như: rơm rạ, trấu, bã mía, cám mì, agar…Các phế thải này có thành phần chính là cellulose. Cellulose có thể bị thủy phân trong môi trường kiềm hoặc axit.Tuy nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học rất phức tạp, tốn kém và gây độc hại cho môi trường. Trong khi đó, việc xử lý các chất thải hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh vật sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và môi trường. Số lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu thành công từ việc thu nhận dịch trong dạ cỏ của động vật nhai lại và ứng dụng để tạo chế phẩm cellulase công nghiệp. Ở Việt Nam, hiện nay các nghiên cứu về cộng đồng hệ enzyme cellulase chưa được quan tâm nhiều, đa phần chủ yếu nghiên cứu tính đơn lẻ trong phức hệ enzyme cellulase. Và hướng nghiên cứu cộng đồng hệ enzyme cellulase nhằm đáp ứng một phần trong nghiên cứu phân giải cellulose từ biomasss định hướng cho sự phát triển nguồn nhiên liệu sinh học trong tương lai. Do vậy, đề tài: “ Khảo sát hệ enzyme cellulase thu nhận từ cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò để phân giải rơm qua xử lý” góp phần vào nghiên cứu và ứng dụng sản xuất công nghiệp cho tương lai. 2.Tình hình nghiên cứu 2.1. Thế giới Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu sử dụng hệ vi sinh vật từ dạ cỏ của loài nhai lại có khả năng sinh enzyme celulase để phân giải rơm rạ, xử lý chất thải công nghiệp biomass. Đó là nghiên cứu của Oyeleke.et.al (2008)[21], Faridha Begum.I.er.al (2013) [22]… Nghiên cứu để sản xuất nhiên liệu sạch, thân thiện với môi trường từ biomass và đặc biệt là thay thế được nguồn năng lượng hóa thạch 1 Đồ án tốt nghiệp (dầu mỏ, khí thiên nhiên, than đá...) đang bị cạn kiệt, được các nước trên thế giới rất quan tâm, đặc biệt là những quốc gia có nền kinh tế phát triển mạnh, nghiên cứu của Parameswaraan Binod.et.al (2010)[16]. 2.2. Trong nước Ở Việt Nam, đã có nghiên cứu để xử lý rơm, rạ, trấu thành ethanol - nguồn nhiên liệu sinh học thân thiện môi trường thay thế cho xăng dầu (Nguyễn Hoàng Dũng, trường ĐH Bách Khoa TPHCM, 2012), nghiên cứu sản xuất giấy từ rơm rạ (Nguyễn Phúc Thanh), nghiên cứu “Quy trình lên men acid lactid từ rơm rạ” (Nguyễn Văn Tuyên- Trường Đại Học Đà Nẵng, 2011) [9], “Nghiên cứu việc sử dụng rơm rạ tạo ra các sản phẩm môi trường” như: làm phân hữu cơ, làm giấy, trồng nấm, rau sạch, làm nhiên liệu xây nhà, tạo ra điện, làm thủ công mỹ nghệ, làm chế phẩm sinh học (Nguyễn Thị Ngọc Yến, trường ĐH Công Nghệ TP HCM, 2012)[10], ứng dụng chế phẩm sinh học (nấm Trichoderma) để sản xuất phân rơm rạ hữu cơ và cải thiện độ phì của đất canh tác lúa (Lưu Hồng Mẫn, 2012)… 3.Mục đích nghiên cứu Thu nhận và tối ưu hóa điều kiện phát triển của cộng đồng vi khuẩn từ dạ cỏ bò có khả năng sinh hệ enzyme cellulase phân giải cellulose. Thu nhận và tối ưu hóa điều kiện môi trường ảnh hưởng đến hoạt tính hệ enzyme cellulase. Khảo sát khả năng thủy phân cellulose từ biomass của hệ enzyme cellulase. 4.Nhiệm vụ nghiên cứu Chọn lọc cộng đồng vi khuẩn sinh hệ enzyme cellulase từ dạ cỏ bò. Tối ưu hóa điều kiện phát triển của cộng đồng vi khuẩn dạ cỏ bò. Chọn lọc hệ enzyme cellulase tiềm năng. Tối ưu hóa nhiệt độ, pH và thời gian cho hoạt tính hệ enzyme cellulase cao. Khảo sát khả năng phân giải rơm rạ của hệ enzyme cellulase. 2 Đồ án tốt nghiệp 5.Phương pháp nghiên cứu Tăng sinh, kiểm tra ngày phân giải giấy lọc và kiểm tra khả năng sản sinh endoglucanase phân giải CMC trên đĩa thạch của cộng đồng vi khuẩndạ cỏ bò. Phương pháp đo hàm lượng protein ngoại bào bằng phương pháp Bradford. Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme cellulase tổng số bằng phương pháp Filter Paper. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp Acid Dinitro - Salicylic (DNS). Phương pháp xác định trọng lượng khô của rơm rạ. Sử dụng các phần mền vi tính Microsoft Office Excel 2007, Statgraphics Centurion XV và Microsoft Office Excel 2007 để thống kê và tính toán. 6.Các kết quả đạt được của đề tài Thu nhận và tối ưu hóa nhiệt độ, pH phát triển của 9 cộng đồng vi sinh dạ cỏ bò có khả năng sinh hệ enzyme cellulase. Thu nhận và tối ưu hóa điều kiện môi trường ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme của 9 hệ enzyme cellulase có khả năng phân giải cellulose. Thu nhận được 3 hệ enzyme cellulase có khả năng phân giải rơm qua xử lý. 7.Kết cấu của đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương. Chương 1: Tổng quan. Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Chương 3: Kết quả và biện luận. Chương 4: Kết luận và đề nghị. 3 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò 1.1.1. Hệ vi sinh vật trong dạ cỏ bò Hình 1.1.Hệ tiêu hóa của trâu bò [2]. Dạ cỏ to nhất, chiếm 2/3 dung tích của dạ dày, là túi đặc biệt nhất, tại đây hàng loạt phản ứng sinh hoá học được tiến hành liên tục để phân giải tiêu hoá và hấp thu thức ăn.[2] Trong dạ cỏ có hàng tỷ vi sinh vật sống cộng sinh với nhau. Hệ vi sinh vật này giúp bò tiêu hóa thức ăn, trong khi bò cung cấp cho chúng chỗ ở và chất dinh dưỡng. Nếu không có hệ vi sinh vật này, dạ bò sẽ cần nhiều thời gian tiêu hóa chất xơ, tinh bột và sản xuất axit béo hơn, cung cấp khoảng 60 đến 80% năng lượng. Tóm lại, dạ bò có thể tiêu hóa nhiều loại thức ăn nhờ vào sự đa dạng của hệ vi sinh vật.[14] Hệ vi sinh vật trong dạ cỏ bò bao gồm vi khuẩn, protozoa và nấm. Số lượng vi khuẩn khoảng 109- 1010cfu trong 1ml chất chứa, có trên 60 loài vi khuẩn đã được xác định. Số lượng vi khuẩn của từng loài phụ thuộc rất lớn vào khẩu phần ăn của bò.[2] Ngoài ra còn có Mycoplasma, các loại virus và các thể thực khuẩn. Mycoplasma, virus và thể thực khuẩn không đóng vai trò quan trọng trong tiêu hóa 4 Đồ án tốt nghiệp thức ăn. Quần thể vi sinh vật dạ cỏ có sự biến đổi theo thời gian và phụ thuộc vào tính chất của khẩu phần ăn. Hệ vi sinh vật trong dạ cỏ sống chủ yếu bằng năng lượng sinh ra từ quá trình lên men các chất dinh dưỡng.[8] Hình 1.2.Protazoa cùng với vi khuẩn và bào tử nấm.[33] ❖ Vi khuẩn: được chia thành nhiều nhóm vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose, hemicellulose, tinh bột, đường, protein… Vi khuẩn xuất hiện trong dạ cỏ loài nhai lại trong lứa tuổi còn non, mặc dù chúng được nuôi cách biệt hoặc cùng với mẹ chúng. Thông thường vi khuẩn chiếm số lượng lớn nhất trong vi sinh vật dạ cỏ và là tác nhân chính trong quá trình tiêu hóa xơ. Phân loại vi khuẩn dạ cỏ có thể được tiến hành dựa vào cơ chất mà vi khuẩn sử dụng hay sản phẩm lên men cuối cùng của chúng. Một số nhóm vi khuẩn dạ cỏ chính:  Vi khuẩn phân giải cellulose: Đây là nhóm có số lượng lớn nhất trong dạ cỏ của gia súc sử dụng khẩu phần chính cellulose. Những loài vi khuẩn phân giải cellulose quan trọng là: Bacteroides succinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminoccocus flavefaciens, Ruminococcus albus, Cillobacterium cellulosolven.[8] Ruminococcus flavefaciens là một loại vi khuẩn gram dương sinh ra phức hệ enzyme bám vào thành tế bào thực vật và xúc tác cho các hoạt động khác nhau.[14] 5 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3.Ruminococcus flavefaciens.[33]  Vi khuẩn phân giải hemicellulose: Nhóm vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose thì cũng có khả năng phân giải hemicellulose. Tuy nhiên không phải tất cả các loài sử dụng hemicellulose đều có khả năng thủy phân cellulose. Một số sử dụng hemicelluloses là: Butyrivibrio fibrisolvens, Lachnospira multiparus, Bacteroides ruminicola.[8]  Vi khuẩn phân giải tinh bột: Trong dinh dưỡng carbonhydrate của các loài nhai lại, tinh bột đứng vị trí thứ hai sau cellulose. Phần lớn tinh bột theo thức ăn vào dạ cỏ được phân giải nhờ hoạt động của vi sinh vật. Tinh bột được phân giải bởi nhiều loại vi khuẩn trong dạ cỏ bò trong đó có cả vi sinh vật phân giải cellulose. Các loại vi khuẩn phân giải tinh bột quan trọng như là: Bacteroides amylophilus, Bacteroides Ruminantium, Steptococcus bovis. Prevotella bryantil là vi khuẩn gram âm có thể sử dụng polysaccharide hòa tan, là xylans.[8]  Vi khuẩn phân giải đường: Hầu hết các vi khuẩn sử dụng các loại polysacchride nói trên thì cũng sử dụng đường disacchride và monosaccharide. Các loại vi khuẩn thuộc loài Lachnospira multiparus, Selenomanas ruminantium đều có khả năng sử dụng tốt cacbonhydrat hòa tan.[8]  Vi khuẩn sử dụng acid hữu cơ: Loài vi khuẩn đều có khả năng sử dụng axit lactic mặc dù lượng axit này trong dạ cỏ thường không đáng kể trừ trong 6 Đồ án tốt nghiệp những trường hợp đặc biệt. Những loài sử dụng lactic là Veillonella gasogenes, Veillonella alacalescens, Peptostreptococuss elsdenii.[8]  Vi khuẩn phân giải protein: Sự phân giải protein và acid amin để sản sinh ra như amoniac trong dạ cỏ bò có ý nghĩa quan trọng đặc biệt về cả phương tiện tiết kiệm nitơ cũng như nguy cơ dư thừa amoiniac. Amoniac cần cho các loài vi khuẩn dạ cỏ để tổng hợp nên sinh khối protein của bản thân chúng, đồng thời một số vi khuẩn đòi hỏi hay được kích thích bởi acid amin, peptid, isoacid có nguồn gốc từ valine, leucine và isoleucine. Trong số những loài sinh aminoac thì Peptostreptococus và Clostridium có khả năng lớn nhất.[8]  Vi khuẩn tạo methan: Methanogens là những vi khuẩn sinh methan trong dạ cỏ bò, sử dụng cacbon cho quá trình lên men. Chúng dược chia làm 2 nhóm chính: Methano sphaera stadtmanae và Methano brevibacter ruminatium. Trong đó, Methano bacteriaceae (thuộc Methano sphaera stadtmanae) được tìm thấy nhiều nhất, Methano corpusculaceae và Methano spirillaceae phổ biến thứ hai trong dạ cỏ bò. Nhóm Methano brevibacter ruminatium gồm: Methano microbium, Methano bacterium và Methano sarcina, là những vi khuẩn có khả năng sử dụng khí methan, hình que ngắn, không sinh nội bào tử, nhiệt độ phát triển tối ưu là 40°C và pH 6,1 – 6,9.[14].  Vi khuẩn tổng hợp vitamin: Nhiều loại vi sinh vật trong dạ cỏ bò có khả năng tổng hợp vitamin B và vitamin K.[8]  Vi khuẩn lên men pectin: Nhóm vi khuẩn này phát triển ở pH khoảng 6.0 (ngoại trừ Bacterioides là pH 5,1). Có 32 chủng vi khuẩn lên men pectin đã được phân lập từ dạ cỏ bò, nhưng quy lại có 3 chủng chính: Lachnospira Multiparous, Butyrivbrio fibrisolvens và Bacteroides ruminicola. Chúng đều là vi khuẩn kỵ khí, có đường kính từ 1,0 – 1,2 𝜇m. Chúng thường lên men pectin tạo thành format và khí H2. Các sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men pectin được các vi khuẩn khác sử dụng, như succinate.[14] 7 Đồ án tốt nghiệp ❖ Protozoa: Protozoa hay còn gọi là động vật nguyên sinh, chúng có số lượng ít hơn nhiều so với số lượng vi khuẩn, chúng chỉ có 106 trong 1ml chất chứa, nhưng vì có kích thước lớn hơn nên tổng sinh khối tương tự như vi khuẩn[2].  Protozoa xuất hiện trong dạ cỏ là các loại ciliate thuộc hai họ khác nhau. Họ Isotrichidae, thường gọi là Holotrich, gồm những Protozoa có cơ thể rỗng được phủ bởi các tiêm mao (cilia). Chúng gồm các bộ Isotricha và Dasytricha. Họ kia là Ophryosocolecidae, hay Oligotrich, gồm nhiều loài khác nhau về kích thước, hình thái và diện mạo. Chúng gồm các bộ Entodinium, Diplodinium, Epidinium và Ophryoscolex. Protozoa có tác dụng xé rách màng tế bào thực vật, làm tăng diện tích tiếp xúc, do đó thực vật dễ bị tác động của vi sinh vật.[8]  Polyplastron multivesiculatum là protozoan tiêu biểu có khả năng phân hủy thành tế bào thực vật.[14] ❖ Nấm: Nấm ước tính có khoảng 10% tổng sinh khối trong điều kiện khẩu phần có nhiều xơ. Nấm thuộc loại vi sinh vật yếm khí nghiêm ngặt với chu kỳ sống có hai pha là pha bào tử (zoosore) và pha thực vật (sporangium). Những loài nấm được phân lập từ dạ cỏ gồm: Neocallimastix frontalis, Piramonas communis và Sphaeromonas commuis. Sự có mặt của nấm giúp làm tăng tốc độ tiêu hóa xơ. Oyeleke và ctv (2008) [21] đã tiến hành phân lập và tuyển chọn các vi sinh vật phân giải cellulose trong dạ cỏ của ba động vật nhai lại khác nhau bò, cừu, dê. Kết quả đã phân lập được các loài nấm: Aspergillus, Mucor and Fusarium có khả năng phân giải cellulose. ❖ Những vi sinh vật khác: Dạ cỏ là một nơi sống tối ưu cho vi sinh vật sống kỵ khí. Điều kiện bên trong dạ cỏ thay đổi liên tục (khoảng 30 - 40°C, pH 5.5 – 7.0). Những vi sinh vật bên trong dạ cỏ vừa cạnh tranh với nhau vừa sống cộng sinh với vi khuẩn.[14] 1.1.2.Vi khuẩn phân giải cellulose ở dạ cỏ bò Có hàng trăm loại vi sinh vật khác nhau trong dạ cỏ bò hỗ trợ lẫn nhau trong quá trình tiêu hóa thức ăn của chúng bao gồm nấm, vi khuẩn, động vật nguyên sinh. 8 Đồ án tốt nghiệp Người ta nghiên cứu rằng sau 38 giờ sau khi các bò con được sinh ra thì các vi sinh vật đã phát triển trong dạ cỏ (Mc Allister TA.et.al, 1994) [26]. Bên cạnh đó các nhà khoa học đều đồng ý rằng sự thủy giải cellulose trong dạ cỏ chủ yếu là do các hoạt động của vi khuẩn phân giải cellulose và chiếm đa số với mật độ 1011 cfu/ml. Trong đó các vi khuẩn phân giải cellulose đã được phát hiện chiếm ít nhất là 0,3% tổng số vi khuẩn trong dạ cỏ (Brulc.et.al, 2011) [27]. Vi khuẩn Fibrobacter succnigenes, Ruminococcus albus, Cillobacterium cellulosolvens và Ruminococcus flavefaciens là các loài phân giải cellulose chiếm ưu thế trong vi sinh vật dạ cỏ (Faridha.et.al, 2013) [22]. So sánh với tất cả nghiên cứu hiện nay thì các loại vi khuẩn này có khả năng phân giải cellulose mạnh. Chúng sử dụng cellulose và các sản phẩm thủy phân của chúng như là một nguồn năng lượng cho sự phát triển. Đã có 8 loài được công nhận của giống Ruminococcus, kỵ khí, cầu khuẩn gram dương thích nghi tốt trong môi trường dạ cỏ. Vi khuẩn Ruminococcus flavefaciens đã được Kaars-Sijpesteijn (1951) mô tả như sau: Tế bào hình cầu, gram dương, đường kính 0,8 – 0,9 µm, kỵ khí bắt buộc và tạo ra một sắc tố màu vàng đặc trưng đặc biệt khi phát triển trên cơ chất là cellulose, không có khả năng di động, catalase âm tính. Loài vi khuẩn Cellulomonas flavigena cũng có tế bào hình que, gram dương, thuộc giống Cellulomonas, ngành Actinobacteria, có khả năng sản sinh nhiều loại enzyme cellulase và xylanase trên cơ chất bã mía và nguồn cơ chất cellulose khác [27]. 1.1.3. Điều kiện vật lý trong dạ cỏ bò Dạ cỏ bò có pH khoảng 6.5–7.2. Nhiệt độ của bò khỏe mạnh dao động từ 37,8°C đến 40°C và nhiệt độ của dạ cỏ là khoảng 40°C. Những điều kiện này cho thấy các vi khuẩn trong dạ cỏ là kỵ khí bắt buộc và chúng chỉ phát triển trong điều kiện không khắc nghiệt. [14] Các sản phẩm của mỗi hệ vi sinh vật tạo ra một loại môi trường nhờ đó tất cả chúng cùng tồn tại và góp phần vào tạo nguồn năng lượng cho bò. 9 Đồ án tốt nghiệp Do những ưu điểm nổi bật về tốc độ sinh trưởng, sinh sản và phát triển mà nguồn vi sinh vật được quan tâm nhiều hơn. Mặt khác, do kích thước vi sinh vật nhỏ nên ta có thể cơ giới hóa và tự động hóa trong quá trình nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy vi sinh vật có thể kiểm soát được mà không phụ thuộc vào yếu tố bên ngoài. 1.2. Giới thiệu về hệ enzym cellulase 1.2.1. Định nghĩa Cellulase là tên chung cho các nhóm enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân của cellulose và các dẫn xuất celluoligosaccharide.[11] 1.2.2. Phân loại Theo phân loại của hội sinh học phân tử và sinh hóa quốc tế (IUBMBInternational Union of Biochemistry and Molecular Biology) hệ thống thủy phân cellulose gồm có enzym: endoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.4, exoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.91 và β-glucosidase có ký hiệu EC 3.2.1.21.[6] ❖ Endoglucanase EC 3.2.1.4 Tên thường gọi là cellulase1,4-β –glucanase. Tên hệ thống: 1,2-(1,3:1,4)- β-D-glucan-4- glucanohydrolase. Người ta gọi enzym này bằng những tên khác : endo-1,4- β-D-glucanase; β1,4- glucanase; cellulase A… Enzym này thường thủy phân các liên kết 1,4-β-Dglucosid trong cellulose và các β-D-glucan của ngũ cốc. ❖ Exoglucanase EC.3.2.1.91 Tên thường gọi là cellulase 1,4-β-cellobiosidase. Tên hệ thống: 1,4- β-D-glucan cellobiohydrolase. Các tên khác: exo- cellobiohydrolase; exoglucanase; CBH1… Enzym này có tác dụng thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucosid trong cellulose và cellotetraose từ đầu không khử. 10 Đồ án tốt nghiệp ❖ β-glucosidase EC 3.2.1.21. Tên thường gọi là β-glucosidase. Tên hệ thống: β-D-glucosid glucohydrolase. Các tên khác: cellobiase; β-glucosid glucohydrolase; β-1,6-glucosidase… Enzym này thủy phân các gốc β-D-glucosid, một số trường hợp cũng thủy phân β-D-galactosidase, β-D-fucoside, β-D-xyloside, α-L- arabinoside. 1.2.3. Cấu tạo của cellulase Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị acid amin, các acid amin này được nối với nhau bởi liên kết peptid –(CO – NH)– và gắn những phần phụ khác. Cấu trúc không gian cellulase bao gồm một tâm xúc tác và một đuôi không gian, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác nhưng được gắn thêm đuôi vùng glycosil hóa và cuối đuôi này là vùng gắn kết với cellulose. Vùng gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay đổi chiều dài của vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym.[11] Trọng lượng của enzym cellulase thay đổi từ 30-110 KDal.Cấu trúc không gian khoảng 280 - 600 acid amin nhưng chiều dài cellulase thường khoảng 300-450 acid amin và trung tâm xúc tác có khoảng 250 acid amin. Bằng cách bẽ gãy các liên kết β-1,4-glucan, hệ enzym cellulase đã thủy phân cellulose thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Trong đó exoglucanase là enzyme chính trong quá trình thủy phân cellulose. 1.2.4. Tính chất ❖ Tính đặc hiệu Enzyme exocellulase thủy phân đặc hiệu liên kết -1,4-glucoside ở đầu không khử của chuỗi cellulose hoặc các cellodextrin. Enzyme endocellulase thủy phân liên kết -1,4-glucoside ở vị trí ngẫu nhiên trong chuỗi cellulose, chuỗi cellodextrin và các dẫn xuất cellulose. -glucosidase thủy phân đặc hiệu gốc β-Dglucan của rơm rạ.[6] 11