Tài liệu Luận văn nghiên cứu đặc điểm sinh học và trinh tự đoạn gen matk its của một số mẫu cây đậu nho nhe (vigna umbellata)​

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ THANH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN matK/ITS CỦA MỘT SỐ MẪU CÂY ĐẬU NHO NHE (Vigna umbellata) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ THANH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN matK/ITS CỦA MỘT SỐ MẪU CÂY ĐẬU NHO NHE (Vigna umbellata) Ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hữu Quân Thái Nguyên, năm 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố. Thái Nguyên, tháng 6 năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thanh XÁC NHẬN XÁC NHẬN CỦA KHOA CHUYÊN MÔN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN TS. Nguyễn Hữu Quân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Hữu Quân, giảng viên Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của cô Trần Thị Hồng, cô Cao Thị Phương Thảo và các thầy cô kỹ thuật viên phòng thí nghiệm của Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên trong quá trình làm thí nghiệm. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục sinh học, Bộ phận Sau đại học thuộc Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Em xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài bảo tồn và lưu giữ quỹ gen cấp Bộ năm 2018 “Nghiên cứu bảo tồn nguồn gen nhóm cây đậu đỗ địa phương thu thập từ các tỉnh thuộc miền Bắc Việt Nam”, mã số B2018-TNA-09-GEN. Em xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, bạn bè đã động viên, khuyến khích và giúp đỡ em trong tiến trình học tập và hoàn thành luận văn. Thái Nguyên, tháng 6 năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thanh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT................................................................ iv DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. v DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. vi MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1 1. Đặt vấn đề.......................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3 1.1. Sơ lược cây đậu Nho nhe ............................................................................... 3 1.1.1. Hệ thống phân loại ...................................................................................... 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái ...................................................................................... 5 1.1.3. Giá trị dinh dưỡng và công dụng ................................................................ 6 1.1.4. Giá trị sử dụng ............................................................................................. 8 1.2. Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA ............................................................... 9 1.3. Tình hình nghiên cứu nhóm cây họ Đậu ...................................................... 11 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................ 11 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ............................................................ 14 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................. 18 2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị ............................................................................ 18 2.1.1. Vật liệu ...................................................................................................... 18 2.1.2. Hóa chất..................................................................................................... 18 2.1.3. Thiết bị ...................................................................................................... 19 2.1.4. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................. 19 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 19 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu ........................... 19 2.2.1.1.Nghiên cứu hình thái ............................................................................... 19 2.2.1.2. Phương pháp giải phẫu thực vật ............................................................. 20 2.2.2. Phương pháp hóa sinh ............................................................................... 20 2.2.2.1.Xác định hoạt tính α-amilase .................................................................. 20 2.2.2.2 Xác định hoạt tính protease ..................................................................... 22 2.2.2.3. Định lượng protein tan ........................................................................... 23 2.2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng isoflavon ......................................... 24 2.2.2.5. Xác định hàm lượng lipit ....................................................................... 24 2.2.3. Phương pháp sinh học phân tử .................................................................. 25 2.2.4. Phương pháp xử lý và phân tích kết quả ................................................... 27 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................ 28 3.1. Ðặc điểm hình thái ngoài và giải phẫu của các giống đậu Nho nhe ............ 28 3.1.1. Ðặc điểm hình thái ngoài của các giống đậu Nho nhe.............................. 28 3.1.2 Hình thái giải phẫu của các giống đậu Nho nhe ........................................ 36 3.1.2.1. Hình thái giải phẫu của rễ ...................................................................... 36 3.1.2.2 Hình thái giải phẫu của thân.................................................................... 37 3.1.2.3. Hình thái giải phẫu của lá....................................................................... 38 3.2. Hoạt tính α- amylase từ mầm hạt đậu Nho nhe ........................................... 39 3.3. Hoạt tính enzyme protease từ mầm hạt đậu Nho nhe .................................. 41 3.4. Định lượng protein tan ................................................................................. 42 3.5. Hàm lượng isoflavone từ mầm hạt đậu Nho nhe ......................................... 43 3.6. Hàm lượng lipit trong các mẫu đậu Nho nhe ............................................... 44 3.7. Đặc điểm của vùng gen ITS phân lập từ mẫu đậu Nho nhe ........................ 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 50 KẾT LUẬN ......................................................................................................... 50 KIẾN NGHỊ ........................................................................................................ 50 THÀNH TÍCH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ................................................ 51 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 52 TIẾNG VIỆT ....................................................................................................... 52 TIẾNG ANH ....................................................................................................... 53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Bp Base pair cDNA Complementary DNA CIRAD DNA EDTA FAO HDL INRA ITS LDL matK PCR RAPD RNA rRNA SSR Tên tiếng Anh Centre de coopération international en recherche agronomique pour le développement Deoxyribonucleic acid Ethylene diamine tetra acid cetic Food and Agriculture Organization of the United Nations High density lipoprotein cholesterol Institut National de la Recherche Agronomique Internal transcribed space Low density lipoprotein cholesterol matK maturase Polymerase chain reaction Random Amplification of Polymorphic DNA Ribonucleic acid RNA ribosome Simple Sequence Repeats Nghĩa tiếng Việt Cặp bazơ nitơ DNA sợi đôi được tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme phiên mã ngược Trung tâm hợp tác quốc tế en recherche agronomique pour le développement Deoxyribonucleic Axit (DNA) Etylen diamin tetraxetic axit Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp của Liên Hợp Quốc lipoprotein tỷ trọng cao Viện Quốc gia de la Recherche Agronomique Vùng gen ITS lipoprotein tỷ trọng thấp Gen matK Phản ứng chuỗi polymerase Đa hình DNA nhân bản ngẫu nhiên Ribonucleic axit riboxom RNA Đa hình các đoạn lặp lại đơn giản Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Danh sách các mẫu đậu Nho nhe sử dụng trong nghiên cứu ............. 18 Bảng 2.2. Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm.............................................. 18 Bảng 2.3. Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ...................................................... 19 Bảng 2.4. Chương trình gradient nồng độ của pha động .................................... 25 Bảng 2.5. Thông tin về cặp mồi ITS sử dụng trong nghiên cứu ......................... 26 Bảng 2.6. Thông tin về cặp mồi ITS sử dụng trong nghiên cứu ......................... 26 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái hạt của các giống đậu Nho nhe ........................... 34 Bảng 3.2. Định tính α-amylase của các giống đậu Nho nhe .............................. 39 Bảng 3.3. Hoạt tính α-amylase của các giống đậu Nho nhe............................... 40 Bảng 3.4. Hoạt tính protease của các giống đậu Nho nhe .................................. 41 Bảng 3.5. Hàm lượng protein tan của các giống đậu Nho nhe ........................... 42 Bảng 3.6. Hàm lượng isoflavone trong hạt nảy mầm 3 ngày tuổi của 4 mẫu đậu Nho nhe ............................................................................................................... 43 Bảng 3.7. Hàm lượng lipit của các giống đậu Nho nhe...................................... 45 Bảng 3.8. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly dựa trên trình tự vùng gen ITS từ mẫu đậu Nho nhe NN18-LC và NN20-TC với các loài trên GenBank .............. 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Đường chuẩn nồng độ glucose theo phương pháp Miller .................. 21 Hình 2.2. Đường chuẩn nồng độ tyrosine .......................................................... 23 Hình 3.1. Hình thái rễ của các giống đậu Nho nhe ............................................ 29 Hình 3.2. Hình thái thân của các giống đậu Nho nhe......................................... 30 Hình 3.3. Hình thái lá của các giống đậu Nho nhe............................................. 31 Hình 3.4. Hình thái hoa các giống đậu Nho nhe ............................................... 33 Hình 3.5. Hình thái ngoài quả các giống đậu Nho nhe ..................................... 33 Hình 3.6. Hình thái ngoài hạt các giống đậu Nho nhe ...................................... 35 Hình 3.7. Hình thái giải phẫu rễ các giống cây đậu Nho nhe............................. 36 Hình 3.8. Hình thái giải phẫu thân các giống đậu Nho nhe ............................... 37 Hình 3.9. Hình thái giải phẫu lá của các giống đậu Nho nhe ............................. 39 Hình 3.10. Định tính α- amylase trên đĩa thạch của các giống đậu Nho nhe ..... 40 Hình 3.11. Sắc ký đồ phân tích daidzein và genistein từ mầm hạt đậu Nho nhe sau 3 ngày tuổi..................................................................................................... 44 Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ khuôn DNA tổng số................. 46 Hình 3.13. Trình tự vùng gen ITS của đậu Nho nhe NN18-LC và NN20-TC ... 47 Hình 3.14. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự vùng gen ITS của mẫu đậu Nho nhe NN18-LC và NN20-TC với một số trình tự vùng ITS trên GenBank bằng BLAST trong NCBI ................................................................................... 47 Hình 3.15. Trình tự nucleotit của vùng gen ITS từ mẫu đậu Nho nhe NN18-LC và NN20-TC với loài mang mã số KX087818.1 trên GenBank ......................... 48 Hình 3.16. Sơ đồ cây phân loại dựa trên trình tự nucleotit vùng gen ITS từ mẫu đậu Nho nhe NN18-LC và NN20-TC với một số loài trên GenBank ................ 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ở Việt Nam đậu đỗ được trồng ở các tỉnh thành trên cả nước. Các giống đậu đỗ rất phong phú và đa dạng gồm các giống nhập nội, giống lai tạo, giống đột biến và tập đoàn các giống đậu đỗ địa phương. Do vậy, nguồn gen nhóm cây đậu đỗ địa phương cần phải được bảo tồn trong một môi trường thuận lợi, ổn định, ít có những biến đổi khắc nghiệt mang tính hủy diệt nguồn gen. Do nhiều nguyên nhân như sự tăng dân số, nhu cầu lương thực và các nhu cầu khác của con người ngày càng tăng dẫn đến khai thác đất rừng, đất nông nghiệp và các nguồn tài nguyên một cách quá mức. Ngoài ra do các yếu tố tự nhiên như thiên tai, dịch bệnh và sự phát triển nhanh của các giống mới có năng suất cao dẫn đến nguồn tài nguyên di truyền ở nhiều vùng sinh thái đã suy giảm nghiêm trọng. Sự suy giảm nhanh và mạnh của các giống đậu đỗ địa phương ở các khu vực miền núi khi mùa mưa đến. Trước tình trạng các giống đậu đỗ địa phương, đặc biệt là giống đậu Nho nhe địa phương đang dần bị thoái hóa và mất dần các đặc tính quý của giống, việc thu thập nguồn gen, xác định đặc điểm sinh học và mã vạch DNA là rất cần thiết. Đậu Nho nhe (Vigna umbellata) là cây có giá trị dinh dưỡng cao cung cấp thực phẩm cho con người, làm thức ăn cho gia súc, cung cấp nguyên liệu chế biến. Đậu Nho nhe có khả năng cải tạo và làm tốt đất, giảm thiểu việc đầu tư phân đạm vô cơ so với nhiều loại cây trồng khác, góp phần bảo vệ môi trường bền vững. Kỹ thuật canh tác đậu Nho nhe đơn giản, dễ tăng vụ, trồng xen, trồng gối với nhiều loại cây trồng khác. Đậu Nho nhe phân bố rải rác ở một số địa phương thuộc khu vực miền núi phía Bắc. Vì vậy, công tác thu thập đậu Nho nhe để có được một tập đoàn giống phục vụ công tác lưu giữ và bảo tồn nguồn gen là mục tiêu cần hướng tới. Bên cạnh việc sử dụng các phương pháp so sánh hình thái, nghiên cứu sẽ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn tiến hành đánh giá sự đa dạng ở mức độ DNA và mối quan hệ di truyền giữa các giống nghiên cứu để làm cơ sở bước đầu phát hiện khả năng trùng lặp mẫu giống trong tập đoàn đậu đỗ; đồng thời phục vụ công tác bảo tồn, khai thác các nguồn gen đậu đỗ địa phương, tiến tới ứng dụng chọn tạo các giống đậu đỗ mới phù hợp với nhu cầu thực tiễn. Xuất phát từ các cơ sở trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và trình tự đoạn gen matK/ITS của một số mẫu cây đậu Nho nhe (Vigna umbellata)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Phân tích được đặc điểm sinh học và trình tự đoạn gen ITS của mẫu cây đậu Nho nhe (Vigna umbellata) thuộc khu vực miền núi phía Bắc. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Phân tích đặc điểm sinh học của 08 mẫu cây đậu Nho nhe (Vigna umbellata) thuộc khu vực miền núi phía Bắc. 3.2. Phân lập gen và xác định trình tự nucleotide của đoạn gen ITS từ 02 mẫu cây đậu Nho nhe thu được. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lược cây đậu Nho nhe 1.1.1. Hệ thống phân loại Họ Đậu còn gọi là họ Cánh bướm (danh pháp khoa học: Fabaceae) thuộc bộ Đậu. Họ Đậu là họ thực vật có hoa lớn thứ ba sau họ Phong lan và họ Cúc gồm khoảng 730 chi và 19.400 loài. Các loài trong họ Đậu rất đa dạng và tập trung chủ yếu ở các phân họ như phân họ Trinh nữ (Mimosoideae) và phân họ Đậu (Faboideae), chiếm khoảng 9,4% trong tổng số loài thực vật hai lá mầm. Các loài trong họ Đậu chiếm khoảng 16% các loài cây trong vùng rừng mưa nhiệt đới Nam Mỹ. Ngoài ra, họ Đậu cũng có mặt nhiều ở các rừng mưa và rừng khô nhiệt đới thuộc châu Mỹ và châu Phi [11]. Việc chia họ Đậu thành 3 phân họ hay tách các phân họ của nó thành các họ riêng biệt vẫn còn nhiều tranh cãi. Có rất nhiều thông tin về dữ liệu phân tử và hình thái học chứng minh họ Đậu là một họ đơn ngành [23]. Quan điểm này được xem không chỉ ở cấp độ tổng hợp khi so sánh các nhóm khác nhau trong họ này và các quan hệ họ hàng của chúng mà còn dựa trên các kết quả phân tích về phát sinh loài gần đây dựa trên DNA [36]. Tên gọi chủ yếu của các loài trong họ Đậu là đỗ hay đậu và họ này chứa một số loài quan trọng bậc nhất (các loài đậu, đỗ, lạc, đậu tương và đậu lăng) giúp cung cấp thực phẩm cho con người [12]. Các loài khác trong họ Đậu cũng là các nguồn cung cấp thức ăn quan trọng cho gia súc và gia cầm hoặc làm phân xanh (như loài đậu lupin, cỏ ba lá, muồng hay đậu tương) cung cấp cho đất. Một số loài thuộc các chi Laburnum, Gleditsia, Acacia, Mimosa và Delonix được sử dụng làm cây cảnh. Một số loài khác có các tính chất y học hoặc diệt trừ sâu bọ hay sản sinh ra các chất quan trọng như gôm Ả-rập, tanin, thuốc nhuộm hoặc nhựa. Một số loài như sắn dây có nguồn gốc ở khu vực Đông Á, được trồng đầu tiên tại miền Đông Nam Hoa Kỳ nhằm cải tạo đất và làm thức Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ăn cho gia súc, nhưng đã nhanh chóng trở thành một loài cỏ dại xâm hại nguy hiểm có xu hướng phát triển trên mọi thứ đất và chèn ép nhiều loài bản địa. Tất cả các loài trong họ Đậu đều có hoa 5 cánh, trong đó bầu nhụy lớn khi phát triển được sẽ tạo ra quả thuộc loại quả đậu, hai vỏ của nó có thể tách đôi, bên trong chứa nhiều hạt ở các khoang riêng rẽ. Các loài trong họ này theo truyền thống được phân loại trong ba phân họ, đôi khi được nâng lên thành các họ riêng trong bộ Đậu (Fabales), trên cơ sở hình thái học của hoa (đặc biệt là hình dạng cánh hoa) được chia thành 3 phân họ chính. Phân họ Vang (Caesalpinioideae) hay họ Vang (Caesalpiniaceae): Có khoảng 170 chi và 2.000 loài. Hoa của chúng mọc đối xứng hai bên, nhưng thay đổi tùy theo từng chi cụ thể, chẳng hạn trong chi Cercis thì hoa gần giống với hoa của các loài trong phân họ Faboideae, trong khi chi Bauhinia thì nó lại là đối xứng với 5 cánh hoa bằng nhau. Phân họ Trinh nữ (Mimosoideae) hay họ Trinh nữ (Mimosaceae): Có các cánh hoa nhỏ và thường có dạng hình cầu hay cụm hoa dạng bông và các nhị hoa là bộ phận sặc sỡ nhất của hoa. Phân họ Đậu (Faboideae hay Papilionoideae) hay họ Papilionaceae: Có một cánh hoa lớn và có nếp gấp trên đó, hai cánh hoa nhỏ hơn mọc bên cạnh còn hai cánh hoa dưới chúng nối liền với nhau ở đáy, tạo thành một cấu trúc tương tự như cái thuyền con. Đậu Nho nhe có tên khoa học là Vigna umbellata, là loài thực vật có hoa thuộc họ Đậu. Đậu Nho nhe được Ohwi và Ohashi nghiên cứu đầu tiên [31]. Đậu Nho nhe thuộc loại cây một năm, thích hợp với khí hậu ấm, có hoa màu vàng và hạt nhỏ ăn được. Đậu Nho nhe thường được gọi là đậu gạo, đậu nâu, đậu Cao Bằng, đậu đà, thua dài. Đến nay, đậu Nho nhe ít được biết đến, ít được nghiên cứu, ít được khai thác ở trong nước cũng như trên thế giới. Nó được coi là một loại cây lương thực, làm thức ăn cho gia súc nhỏ và thường được trồng làm cây trồng xen với ngô (Zea mays) hoặc đậu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn đũa (V. unguiculata). Giống như các loài thuộc chi Vigna ở châu Á, đậu Nho nhe được trồng vào mùa ấm áp khá ngắn trong năm và trồng chủ yếu dưới dạng hạt khô. Trước đây, nó được trồng rộng rãi dưới dạng cây trồng trên vùng đất thấp sau khi thu hoạch lúa mùa, nhưng nó đã bị thay thế bởi các giống đậu có thời gian ngắn hơn. Ở Việt Nam, đậu Nho nhe được trồng phổ biến ở các tỉnh thuộc miền núi phía bắc như Sơn La, Cao Bằng, Lạng Sơn, Hà Giang, Lào Cai. Đậu Nho nhe thích hợp trên các loại đất trồng khác nhau. Ngày nay, đậu Nho nhe phát triển nhanh chóng và có khả năng sản xuất một lượng lớn thức ăn gia súc bổ dưỡng và hạt của nó có chất lượng cao. Sự phát triển của cây đậu Nho nhe cho thấy tính đa hình thích nghi với các môi trường đa dạng. Sự phân bố của đậu Nho nhe từ khí hậu nhiệt đới ẩm đến cận nhiệt đới. Những giống đậu Nho nhe này được cho là có nguồn gốc từ mẫu Vigna umbellata var gracilis hoang dã, có khả năng sinh sản chéo và được phân phối từ miền Nam Trung Quốc đến phía Bắc Việt Nam, Lào, Thái Lan, Myanmar và Ấn Độ. 1.1.2. Đặc điểm hình thái Đậu Nho nhe thuộc nhóm thực vật có hoa với tên khoa học là Vigna umbellata, thuộc chi đậu Vigna, họ Fabaceae, bộ Fabales. Đậu Nho nhe có thân mảnh, chiều cao từ 1m trở lên, khi còn non trên thân cây có những sợi lông mảnh và khi trưởng thành thì không có lông. Thân cây có nhánh và một số vùng thân cây có thể leo. Lá có hình trái tim, lá chét hình trứng hoặc hình chóp, có lông nhung thưa thớt trên các gân của cả hai bề mặt lá, gốc rộng hình nêm, toàn bộ hoặc hơi thùy, ba gân lá từ gốc, có chóp nhọn. Hoa mọc trên các nách dài 5-10 cm. Mỗi nách lá có nhiều hơn 2 hoa. Hoa có hình dạng nhú và màu vàng sáng, cuống hoa ngắn. Quả nang dài, không có lông, dài từ 7,5-12,5 cm chứa 6-10 hạt thuôn, mỗi hạt dài 6-8 mm với một lõm. Hạt đậu Nho nhe có màu sắc rất đa dạng, từ vàng lục đến đen qua vàng nâu hoặc lốm đốm, hình thuôn. Đậu Nho nhe thường được trồng và thu hoạch từ tháng 5 đến tháng 9. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Công thức hoa chung: *, ↑ K5C5A10-8-7G1 1.1.3. Giá trị dinh dưỡng và công dụng Đậu Nho nhe đóng một vai trò quan trọng trong việc cải thiện sức khỏe của con người, động vật và đất trồng. Các giống đậu Nho nhe là nguồn cung cấp protein, axit amin thiết yếu, axit béo thiết yếu và khoáng chất [26]. Hạt đậu Nho nhe khô là một nguồn dinh dưỡng bổ sung cho những người có chế độ ăn kiêng. Đậu đỗ nói chung và đậu Nho nhe nói riêng có nhiều giá trị dinh dưỡng đã được công bố. (1) Đậu đỗ giàu cabonhydrat giúp cung cấp năng lượng, ổn định cơ bắp và não bộ; (2) Đậu đỗ giàu dưỡng chất và nhiều hơn bất kỳ loại thực phẩm nào. Đó là các vi chất như: Canxi, kali, vitamin B6, magie, folate và axit alpha-linolenic. Những vitamin này sẽ giúp cải thiện sức khỏe một cách toàn diện. Các hạt đậu đỗ cũng rất giàu protein mà rất hiếm gặp ở thực vật. Trong khi các loại thực vật rất giàu vitamin nhưng lại thiếu protein thì đậu đỗ lại rất giàu nguồn dinh dưỡng này. Nó làm nên sự sống và duy trì các chức năng sống trong cơ thể người. (3) Đậu đỗ làm giảm nguy cơ mắc ung thư: Việc ăn các loại đậu đỗ thường xuyên sẽ giúp cơ thể giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch, tiểu đường, béo phì và thậm chí là cả ung thư một cách tự nhiên. Một nghiên cứu tại Đại học Bang Michigan chỉ ra rằng những người ăn đậu đỗ thường xuyên sẽ giảm tới 22% nguy cơ mắc các bệnh tim mạch, ngoài ra các giá trị dinh dưỡng trong đậu đỗ sẽ giúp cơ thể “quản lý” các nguồn năng lượng hiệu quả hơn, đồng thời hỗ trợ giảm cân. Giúp cơ thể có thể duy trì sự hoạt bát, năng động cả ngày nhờ bổ sung nguồn dinh dưỡng từ đậu đỗ. (4) Đậu đỗ giúp duy trì tuổi trẻ: Một trong những yếu tố làm đậu đỗ trở nên cần thiết cho sức khỏe con người đó là rất giàu chất chống ôxy hóa. Các chất chống ôxy hóa cũng là những vi chất giúp bảo vệ cơ thể chống lại những ảnh hưởng không mong đợi như sự lão hóa và ung thư. Như vậy, đậu đỗ có khả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn năng hỗ trợ, bảo vệ cơ thể khi đang mắc bệnh ung thư, cũng như giúp kéo dài tuổi xuân và tinh thần lạc quan, tươi trẻ. (5) Giúp ổn định lượng đường trong máu: Chất xơ có ở các thực phẩm như đậu nành, đậu Hà Lan, đậu đen, đậu Nho nhe là chất xơ tan trong nước giúp làm giảm cholesterol, điều hòa huyết áp, giảm co thắt tim, chống oxy hóa. Chất xơ làm giảm cholesterol bằng cách làm giảm chất béo LDL và tăng HDL. Nếu chế độ ăn nhiều bơ, cholesterol tăng cao, nhưng khi thêm chất xơ vào khẩu phần ăn thì lượng cholesterol giảm xuống 20%. Lượng cholesterol tăng cao trong máu là nguyên nhân gây một số bệnh tim mạch. Thực phẩm có chất xơ có nhiều khả năng bình thường hóa lượng đường trong máu, giảm đường sau bữa ăn, tăng công hiệu của Insulin. Đặc biệt, chất xơ tan trong nước rất tốt vì nó ngăn cản không cho đường hấp thụ vào ruột và làm giảm đường trong máu tới 30%. Người mắc bệnh tiểu đường cũng hay có biến chứng xơ vữa động mạch vì triglyceride lên cao. Chất xơ có thể làm giảm triglyceride và mỡ xấu LDL và làm tăng mỡ lành HDL. Giá trị dinh dưỡng của các thực phẩm nguồn gốc thực vật nói chung cũng như giá trị của các thực phẩm thuộc họ Đậu nói riêng đều tốt cho sức khỏe, phòng tránh các bệnh tăng huyết áp, tiểu đường, thừa cân béo phì,... Tuy nhiên để duy trì chế độ ăn hợp lý, tốt cho sức khỏe, phù hợp với từng lứa tuổi, khẩu phần ăn hàng ngày cần phải cân đối giữa đạm động vật và thực vật. Hàm lượng protein thô của đậu Nho nhe thấp hơn một lượng đáng kể so với hầu hết các loại đậu đỗ khác. Gopinathan và cộng sự (1987) khi nghiên cứu hàm lượng protein của từ các loài hoang dã (ví dụ Vigna minima ) nhận thấy hàm lượng protein có xu hướng cao hơn so với các loài đã được thuần hóa. Do đó, nhóm nghiên cứu có thể lai tạo để cải thiện hàm lượng protein của đậu Nho nhe [19]. Thành phần một số axit amin có trong đậu Nho nhe tốt cho sức khỏe của con người đã được một số tác giả công bố như nghiên cứu của Chandel và cộng sự (1978) [13], Mohan và Janardhan (1994) [26], De Carvalho và Vieira (1996) [14]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Năm 2010, Peter Andersen đã nghiên cứu về “Giá trị dinh dưỡng của đậu Nho nhe Vigna umbellata thông qua phương pháp phân tích thành phần hóa học của các chất dinh dưỡng trong hạt”. Nghiên cứu đã chỉ ra đậu Nho nhe có nhiều đặc điểm tốt so với nhiều loại đậu đỗ khác. Hàm lượng protein có trong hạt không cao nhưng với tỉ lệ tiêu hóa cao và thành phần axit amin rất có lợi cho con người. Hàm lượng vitamin B cao, đặc biệt là các thiamine, riboflavin, niacin, axit pantotenic và axit folic, nhưng nó không phải là nguồn vitamin quan trọng nhất. Ngoài ra, đậu Nho nhe có một nguồn khoáng chất dồi dào như canxi, phốt phát, kali, sắt và kẽm. So với chế độ ăn cần thiết hàng ngày, việc tiêu thụ một lượng đậu Nho nhe thực tế có thể cung cấp rất đáng kể lượng protein, các axit amin thiết yếu, vitamin B và khoáng chất. Hàm lượng chất béo rất thấp và thành phần axit béo không no. Không có độc tố hoặc dị ứng, các hợp chất liên quan đến đậu Nho nhe và hàm lượng chất ức chế enzyme thấp so với hầu hết các loại hạt khác. Hàm lượng của các chất chống độc khác như phytate cũng vừa phải so với các loại hạt đậu đỗ khác và mức độ giảm với các phương pháp nấu ăn phổ biến [27]. 1.1.4. Giá trị sử dụng Đậu Nho nhe có rất nhiều tác dụng tốt và được sử dụng phổ biến trong đời sống của con người. Trong đời sống, con người sử dụng các loại đậu đỗ cũng như đậu Nho nhe để làm thức ăn và rau hàng ngày. Mùa hè ăn nhiều đậu Nho nhe (hay đậu gạo) có thể làm dịu tình trạng khô khát khó chịu, có hiệu quả xoa dịu đối với chứng phù nề do mùa hè nóng ẩm gây ra, đặc biệt là phù nề chi dưới. Ngoài ra, đậu Nho nhe còn được nấu xôi rất ngon dẻo là món ăn phổ biến ở các tỉnh vùng núi phía Bắc nước ta. Quả đậu chín sau khi được thu hoạch sẽ được phơi khô và chế biến thành những món ăn mang nét đặc trưng riêng. Một đặc trưng nổi bật khác của các loài cây thuộc họ Đậu và đậu Nho nhe là chúng có quan hệ mật thiết với nhiều loài vi khuẩn tại các nốt sần trên rễ của chúng. Các loại vi khuẩn này được biết đến như là vi khuẩn nốt rễ (Rhizobium), Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn có khả năng lấy khí nitơ (N2) trong không khí và chuyển hóa nó thành các dạng nitơ mà cây có thể hấp thụ được (NO3- hay NH4+). Hoạt động này được gọi là cố định đạm. Cây đậu cung cấp nơi ở và dinh dưỡng, còn vi khuẩn nốt rễ có vai trò là nhà cung cấp nitrat có ích, tạo ra một quan hệ cộng sinh. Mối quan hệ này không chỉ giúp tạo đạm cho cây đậu sử dụng mà còn cho cả các cây khác xung quanh, do đó có tác dụng cải tạo đất. Năm 2016, Heuzé và cộng sự đã nghiên cứu về đậu Nho nhe Vigna umbellata trong Feedipedia - một chương trình của INRA, CIRAD, AFZ VÀ FAO cho thấy đậu Nho nhe được coi là một loại thức ăn cao cấp cho gia súc để tăng sản lượng sữa trong chăn nuôi [21]. Smil (1997) nhận thấy, hầu hết các cây họ Đậu có chứa một hoặc một số chất ức chế enzyme và các yếu tố chống độc trong khi thì hàm lượng của các chất này dường như có rất ít trong cây đậu Nho nhe [34]. 1.2. Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA Khái niệm mã vạch DNA được Hebert đưa ra lần đầu tiên vào năm 2003, giúp nhận diện các mẫu sinh vật (Hebert, 2003) [20]. Mã vạch DNA sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong genome của sinh vật như là một chuỗi ký tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau, nó tương tự như máy quét trong siêu thị đọc hai mã vạch của hai sản phẩm mà nhìn bên ngoài chúng rất giống nhau nhưng thực sự là khác nhau. Mã vạch DNA là một phương pháp định danh mà nó sử dụng một đoạn DNA chuẩn ngắn nằm trong genome của sinh vật đang nghiên cứu nhằm xác định sinh vật đó thuộc về loài nào. Hiện nay, các mẫu sinh vật vẫn thường được nhận diện bằng các đặc tính hình thái bên ngoài hoặc các đặc tính sinh lý sinh hóa bên trong nhờ vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp mẫu vật chưa phát triển đầy đủ các đặc tính hình thái, hoặc chúng bị hư hỏng các bộ phận ngoài, hoặc mẫu vật chết đã khiến quá trình nhận diện mẫu vật trở nên khó khăn thậm chí là không thể. Trong những trường hợp này mã vạch DNA đã Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn giúp giải quyết bài toán trên vì trình tự DNA dễ dàng thu nhận từ một mẫu mô rất nhỏ. Mã vạch DNA ngoài ý nghĩa giúp định danh mẫu vật, nó còn giúp quá trình phân tích tiến hóa sinh học của loài vật đó trong tự nhiên. Mã vạch DNA dùng để phân biệt các cây thực vật trong một chi hoặc cùng một loài có hình dạng giống nhau. Nhiều nghiên cứu đã phát hiện ra vùng gen ITS và gen matK khác nhau giữa các loài thực vật nhưng lại gần như trùng khớp với các cây thuộc cùng loài. Như vậy, vùng gen ITS và gen matK có thể cung cấp cho các nhà khoa học một cách dễ dàng để phân biệt những loài cây khác nhau, thậm chí là những loài nhìn gần giống nhau bằng mắt thường. Định hướng mục tiêu lâu dài của các nhà khoa học là xây dựng dữ liệu di truyền DNA matK và vùng ITS của càng nhiều loài thực vật. Các mẫu nghiên cứu có thể được so sánh với dữ liệu này và nhận diện chính xác, nhanh chóng loài thực vật mà mình nghiên cứu. Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) là locus được giải mã phổ biến nhất. Vùng ITS có hiệu quả cao trong nghiên cứu phân loại nhiều đối tượng thực vật và nấm (ngoại trừ dương xỉ) và đây là một locus được sử dụng đọc trình tự với DNA ngắn (Stoeckle et al, 2003) [35]. Ở mức độ loài, vùng ITS có mức độ đa dạng cao (khoảng 13,6% giữa các loài gần gũi) và đã được chứng minh trong hầu hết các nghiên cứu. Thuận lợi của vùng ITS là có thể nhân bản theo hai đoạn nhỏ hơn (ITS1 và ITS2) nằm hai bên với locus 5,8S, điều này rất có ý nghĩa khi nhân bản các mẫu bị hư hại. Vùng ITS cũng đã được chứng minh có mức độ biến đổi thấp bên trong loài (Baldwin et al, 1995) [10]. Vùng gen matK (gen mã hóa cho maturaseK) được phát hiện đầu tiên trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) khi giải trình tự vùng gen trnK mã hóa cho tRNALys (UUU) của lục lạp. Nó gồm 1 đoạn ORF chứa 509 nucleotit nằm trong intron của gen trnK và chưa rõ chức năng. Các nghiên cứu sử dụng trình tự gen matK để xây dựng cây phát sinh loài cho thấy gen matK có tính đa dạng hơn những gen khác có trong lục lạp và do vậy gen matK trở thành gen chỉ thị quan trọng để giúp phân loại thực vật [33]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn