Tài liệu Luận văn nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro cây bình vôi (stephania spp)

1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN 34 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ---------------------------------- Thongkham LAPHASY NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY IN VITRO CÂY BÌNH VÔI (Stephania spp) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN, NĂM 2019 1 2 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ---------------------------------- Thongkham LAPHASY NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY IN VITRO CÂY BÌNH VÔI (Stephania spp) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS. Phạm Thị Thanh Nhàn THÁI NGUYÊN, NĂM 2019 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn: “Nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vỉtro cây Bình vôi (Stephania spp)” là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Mọi kết quả thu được là trung thực, không sao chép từ kết quả nghiên cứu khác. Tất cả những tham khảo và kế thừa đều được trích dẫn đầy đủ. Thái Nguyên, tháng 05 năm 2019 Tác giả luận văn Thongkham LAPHASY Xác nhận của BCN Khoa Sinh học Xác nhận của cán bộ hướng dẫn TS. Phạm Thị Thanh Nhàn i ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ tận tình của nhiều cá nhân, cơ quan đơn vị. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Thị Thanh Nhàn, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự hỗ trợ của Đề tài cấp Bộ mã số B2019-TNA-09. Tôi xin được cảm ơn các thầy giáo, cô giáo thuộc khoa Sinh học, bộ phận Sau đại học của Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học. Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới cô Trần Thị Hồng, Hứa Quỳnh Liên là cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi tiến hành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người thân trong gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã tạo điều kiện, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập. Thái Nguyên, tháng 05 năm 2019 Tác giả luận văn Thongkham LAPHASY ii iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................... ii MỤC LỤC..................................................................................................... iii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT............................................................................ vi DANH MỤC CÁC HÌNH............................................................................. vii DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................ viii MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3 1.1. Cây Bình vôi ........................................................................................ 3 1.2. Giá trị dược liệu của cây Bình vôi …………………..…………….... 7 1.2.1. Các hợp chất alkaloid ở cây Bình vôi………….................................. 7 1.2.2. Hợp chất rotundin và tình hình nghiên cứu về dược chất ở cây Bình vôi………………………………………………………………………….. 9 1.3. Một số phương pháp nhân cây giống cây Bình vôi …………..…… 13 1.3.1. Nhân giống cây Bình vôi trong tự nhiên ……………………….….. 13 1.3.2. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô- tế bào thực vật trong nghiên cứu bảo tồn nguồn gen cây Bình vôi ………………………………………………... 14 1.3.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào thực vật ……………… 14 1.3.2.2. Vai trò của các chất kích thích sinh trưởng đối với tái sinh cây in vitro ……………………………………….……………………….………. 15 1.3.2.3. Các phương pháp nhân giống in vitro ……………………………. 16 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................... 20 2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu............................... 20 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu.............................................................................. 20 2.1.2. Hóa chất và thiết bị ….…………………............................................. 20 iii iv 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 20 2.2. Các phương pháp nghiên cứu ……..................................................... 20 2.2.1.Pha môi trường và hấp khử trùng môi trường nuôi cấy………………. 20 2.2.2. Phương pháp khử trùng mẫu cấy …………………………………….. 21 2.2.3. Phương pháp nuôi cấy in vitro cây Bình vôi ……………………………. 21 2.2.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi … 21 2.2.3.2.. Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi.. 22 2.2.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cây Bình vôi …….. 22 2.2.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Bình vôi …….. 23 2.2.3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất phụ da đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Bình vôi …………………………………………….. 24 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu …..……………………………………… 24 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................... 25 3.1. Nghiên cứu công thức khử trùng mẫu ……………………………… 25 3.2. Nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro cây Bình vôi hoa đầu ….. 27 3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm cytokinin đến sự tạo chồi cây Bình vôi hoa đầu ……...…………………………………………………………. 27 3.2.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi hoa đầu ……………………………………………………………………………. 27 3.2.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi hoa đầu ……………………………………………………………………….. 29 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm auxin đến khả năng tạo rễ ở cây Bình vôi hoa đầu ………………………………………………………………………... 31 3.2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cây Bình vôi hoa đầu …………………………………………………………………………… 31 3.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Bình vôi hoa đầu …………………………………………………………………………… iv 32 v 3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Bình vôi hoa đầu ………………………...................... 33 3.3. Nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro cây Bình vôi tím ……….. 35 3.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm cytokinin đến sự tạo chồi cây Bình vôi tím ……...……………………………………………………………… 35 3.3.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi tím 35 3.3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi tím……………………………………………………………………………. 37 3.3.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và kinetin với nồng độ tối ưu đến sự sinh trưởng chồi cây Bình vôi tím …………………………………………. 40 3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm auxin đến khả năng tạo rễ ở cây Bình vôi tím ………………………………………………………………………........ 41 3.3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cây Bình vôi tím. 41 3.3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Bình vôi tím... 42 3.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Bình vôi tím ………………………........................... 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 47 v vi NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ADN Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic BAP 6 - Benzyl Amino Purin CT Công thức ĐC Đối chứng IBA Indoly Butyric Acid Kinetin 6 - Fururolamino purine Axit 3 – Indolebutyric Khử trùng KT MS Murashige and Skoog NAA α - Naphthalen Acetic Acid Môi trường MS Thí nghiệm TN vi vii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Mặt trước và sau lá cây Bình vôi tím ………………………….. 6 Hình 1.2. Cây Bình vôi hoa đầu ………………………………………….. 6 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của L-tetrahydropalmatin …………………… 12 Hình 3.1. Chuẩn bị mẫu ……………………………………………………. 26 Hình 3.2. Mẫu cây tái sinh trong môi trường MS bổ sung nước dừa …........ 26 Hình 3.3. Chồi cây Bình vôi hoa đầu trên môi trường NC2 …………………… 29 Hình 3.4. Chồi cây Bình vôi hoa đầu ở môi trường Ki1 ……………………… 30 Hình 3.5. Ảnh hưởng của BAP đến sự tạo chồi cây Bình vôi tím sau 7 tuần ….. 37 Hình 3.6. Ảnh hưởng của kinetin đến sự tạo chồi cây Bình vôi tím sau 7 tuần ... 39 Hình 3.7. Ảnh hưởng của của tổ hợp BAP 2,0 mg/l và kinetin 1,5 mg/l đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi tím sau 7 tuần nuôi cấy …………………………… 40 Hình 3.8. Ảnh hưởng của NAA đến sự ra rễ cây Bình vôi tím sau 7 tuần ……. 42 Hình 3.9. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ cây Bình vôi tím sau 7 tuần. 43 vii viii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của một số alkaloid ở cây Bình vôi ………….. 9 Bảng 1.2. Kết quả khử trùng cây Bình vôi từ đoạn thân non sau 4 tuần nuôi cấy …………………………………………………………………... 25 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi hoa đầu …. 28 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi hoa đầu .. 30 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cây Bình vôi hoa đầu …… 32 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của cây Bình vôi hoa đầu … 33 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Bình vôi hoa đầu ……………………………………………. 34 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi tím ………... 36 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi tím …….. 38 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cây Bình vôi tím …………. 41 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của cây Bình vôi tím …….. 43 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự sinh trưởng của cây Bình vôi.. 44 viii 1 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng, trong đó nguồn dược liệu có vị trí quan trọng về thành phần, chủng loại và giá trị sử dụng đối với đời sống con người. Theo kết quả điều tra của Viện Dược Liệu, tính đến 2005 đã ghi nhận được 3948 loài thực vật và nấm, 52 loài tảo biển, 408 loài động vật và 75 chất khoáng có công dụng làm thuốc ở Việt Nam. Trong số đó, gần 90 % là cây thuốc mọc tự nhiên, tập trung chủ yếu trong các quần xã rừng, chỉ có gần 10% là cây thuốc trồng. Tuy nhiên, việc khai thác các cây dược liệu chưa được tiến hành theo kế hoạch, nhiều bài thuốc hay, cây thuốc quý đã bị thất truyền, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phong phú loài và nguồn gen trong hệ sinh thái. Giấc ngủ là tiêu chuẩn vàng để đánh giá sức khỏe. Mất ngủ gây ra những tác hại không thể lường trước, khi biến chứng có thể gây tử vong. Đây là một chứng bệnh của xã hội hiện đại với nhiều áp lực lớn. Một trong các cây có tác dụng điều hòa giấc ngủ là cây Bình vôi tím. Cây Bình vôi tím có tên khoa học là Stephania rotunada Lour, họ Tiết dê (Menispermaceae), là một trong những cây thuốc quý mà thiên nhiên ban tặng cho con người. Cây Bình vôi tím là một loài dây leo, phần gốc phát triển thành củ to, bám vào núi đá, có củ nặng tới hơn 40kg, vỏ thân củ màu đen, xù xì giống như hòn đá, củ còn gọi là “củ một”, “củ mối trôn”, “ngải tượng”. Nguồn dược liệu này chứa alkaloid, được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền và hiện đại ở trong nước và trên thế giới. Sử dụng cây Bình vôi chữa được các bệnh như mất ngủ, điều hòa hô hấp, hệ tim mạch, sốt nóng, chữa ung thư, lợi tiểu, hen xuyễn, … Do có tác dụng chữa bệnh tốt, ít gây độc hại, các sản phẩm từ củ Bình vôi đã được đưa vào chế biến trong công nghiệp dược phẩm. Do vậy, nguồn nguyên liệu tự nhiên đã bị khai thác ngày một nhiều và ngày càng cạn kiệt, và đã được ghi trong Sách đỏ Việt Nam với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” (Bậc V) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật 1 2 rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 2) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ để hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại. Do vậy, việc chọn lọc giống cây hết sức quan trọng và là nhiệm vụ cấp thiết trong công tác bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen. Trong tự nhiên với tình trạng chặt phá rừng như hiện nay, cây Bình vôi sinh trưởng thường rất chậm. Để vừa đáp ứng được nhu cầu sử dụng dược liệu, vừa bảo tồn và phát triển loài cây thuốc quý ở Việt Nam, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một kỹ thuật có triển vọng ứng dụng lớn, tạo ra những giống cây trồng sạch bệnh chất lượng tốt, đồng đều và hệ số nhân lớn trong thời gian ngắn. Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro cây Bình vôi (Stephania spp)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định được công thức môi trường nuôi cấy in vitro phù hợp của cây Bình vôi hoa đầu và Bình vôi tím. 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu công thức khử trùng mẫu nuôi cấy - Nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro cây Bình vôi hoa đầu: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm cytokinin (BAP, kinetin) đến khả năng phát sinh chồi, ảnh hưởng của auxin (NAA, IBA) đến sự tạo rễ, ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng sinh trưởng, phát triển của cây in vitro. - Nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro cây Bình vôi tím: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm cytokinin (BAP, kinetin) đến khả năng phát sinh chồi, ảnh hưởng của auxin (NAA, IBA) đến sự tạo rễ, ảnh hưởng của chất than hoạt tính đến khả năng sinh trưởng, phát triển của cây in vitro. 2 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cây Bình vôi Theo Form, chi Bình vôi đã biết có khoảng trên dưới 49 loài, phân bố ở những vùng có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Vùng phân bố kéo dài từ Nepal, Ấn Độ, Thái Lan, miền nam Trung Quốc, phía nam Nhật Bản, Việt Nam, Lào, … đến phía đông Australia. Số lượng loài đa dạng nhất tập trung tại các tỉnh phía bắc của Việt Nam, Lào, Thái Lan, nam Trung Quốc. Tại Trung Quốc có khoảng 20 loài, tại Thái Lan có khoảng 11 loài [6]. Các loài Bình vôi có sự khác nhau về hình thái, hàm lượng và thành phần của alkaloid. Những loài Bình vôi hiện có ở nước ta rất đa dạng và phong phú. Chúng sinh trưởng trong nhiều loại hình thảm thực vật, trên núi đá vôi, trên đất lẫn đá, và trên cát ven biển ở một số địa phương. Năm 1986, Nguyễn Chiều và Ngô Trại ghi nhận có 11 loài ở Việt Nam [6]. Cây Bình vôi được phân loại khoa học trong hệ thống giới Thực vật cụ thể như sau: Giới (regnum) Plantae (không phân hạng) Angiospermae (không phân hạng) Eudicots Bộ (ordo) Ranunculales Họ (familia) Menispermaceae Chi (genus) Stephania Loài (species) Rotunada [38]. Chi Bình vôi, hay chi Thiên kim đằng (Stephania spp), là một chi thực vật có hoa trong họ Biển bức cát (Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê), có nguồn gốc ở miền đông và nam châu Á cũng như Australia. Tên gọi dân dã nhất trong tiếng Việt là Bình vôi. Tuy nhiên, nhiều loài có các tên gọi địa phương có thể trùng nhau. 3 4 Các loài Bình vôi là cây dây leo, thân thảo, sống lâu năm, phần gốc thường hóa gỗ. Chồi và thân non thường nhẵn, có màu xanh đậm, xanh nhạt hay xanh bóng. Vỏ ngoài thân có những rãnh nứt dọc theo thân hay gờ, những mụn cóc xù xì. Thân già có màu xám tro, nâu sẫm, nâu nhạt hay nâu đất sáng. Rễ củ rất đa dạng, củ thường có dạng hình cầu, hình trụ hay hình bất định. Kích thước và trọng lượng củ cũng rất khác nhau, có loài chỉ khoảng 1 3 kg, có loài củ rất nặng tới 80 kg. Ruột củ màu vàng nhạt, vàng chanh, trắng ngà hoặc nâu đỏ [7]. Lá mọc so le, cuống lá dài khoảng 5 - 10 cm, đính vào phiến lá khoảng 1/3 - 1/6 chiều dài lá. Phiến lá mỏng, thường nhẵn, có hình khiên nhọn, hình tròn hoặc hình tam giác tròn, mép lá nguyên hay hơi chia thùy. Gân lá dạng chân vịt gồm từ 8 - 11 gân xuất phát từ đỉnh của cuống lá. Chóp lá nhọn hoặc gần tròn, gốc lá tròn hoặc có hình tim. Phiến lá màu xanh đậm, xanh vàng nhạt hoặc xanh sáng, mặt dưới có màu xanh nhạt hay hơi bạc [7], [38]. Cây Bình vôi có hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa có dạng tán kép, tán đơn, sim tán kép, dạng hình đầu và tán ngù [7], có cuống, đơn độc hay xếp theo kiểu chùm ở các nhánh tán cấp 1, các nhánh cuối cùng đôi khi không đều hoặc đôi khi các xim tụ họp thành đầu hình đĩa [9]. Hoa đực thường có cấu tạo đối xứng tỏa tròn, đài 6 - 8 rời, xếp thành 2 vòng; 3 - 4 cánh hoa, dạng vỏ sò, màu vàng, đôi khi trắng xanh; nhị 2 - 6, thường 4, chỉ nhị dính nhau tạo thành ống hình trụ, đầu nhụy xoè thành đĩa tròn. Hoa cái thường chỉ gồm 1 lá đài và 2 cánh hoa (rất ít khi có 3 - 4 lá đài và 3 - 4 cánh hoa), bầu hình trứng có 4 đến 6 hoặc 7 núm nhụy hình dùi [7], [26]. Quả hạch, dạng hình gần tròn, hình trứng, trứng bầu, 2 bên dẹt. Bầu 2 noãn, nhưng chỉ có 1 phát triển thành hạt, còn 1 thoái hóa. Ở quả chín, vỏ ngoài thường có màu vàng đậm hoặc đỏ tươi, nhẵn bóng. Hạt hình móng ngựa, hình trứng dẹp hoặc hơi tròn, 2 mặt bên lõm, ở giữa có lỗ thủng hoặc không, dọc theo gờ lưng bụng thường có 4 hàng vằn hoặc gai [7]. Nhìn chung, chi Bình vôi 4 5 rất đa dạng về hình thái, sự đa dạng, phong phú này phụ thuộc vào điều kiện đất đai, khí hậu nơi sinh sống và đặc tính của từng loài. Các loài thuộc chi Bình vôi thường sinh trưởng trong các rừng nguyên sinh hay rừng thứ sinh. Sống thích hợp ở nhiệt độ trung bình năm 21 - 23oC, lượng mưa 2000 - 2500mm, ưa đất nhiều mùn, thoát nước, độ pH = 6,5 - 7. Một số loài có thể phân bố ở độ cao 2000 - 2800 m so với mực nước biển. Hầu hết các loài Bình vôi đều ưa sáng, ưa đất có độ ẩm vừa phải [18]. Các loài Bình vôi hiện ở Việt Nam thường có 2 thời vụ chồi chính trong năm. Vụ chồi đông xuân, bao gồm các chồi xuất hiện (trên thân và trên đầu củ) ngay từ tháng 11 - 12. Những chồi này ở trạng thái "chồi ngủ" cho đến mùa xuân (tháng 1 - 2) thì bắt đầu thời kỳ sinh trưởng mạnh. Chỉ trong vòng 1 - 2 tháng, chồi đã dài tới hơn 1m. Chồi đông xuân là lứa chồi quan trọng nhất của cây Bình vôi, vì từ chồi này cây sẽ ra lá, hoa, quả và mọc ra lứa chồi xuân hè (chồi cấp II). Số lá của chồi cấp II nhiều hơn gấp bội so với chồi đông xuân (tính trên cùng một đơn vị chiều dài của chồi). Sự tái sinh chồi mạnh mẽ của cây Bình vôi còn thể hiện ở khả năng mọc mầm trên các mảnh bổ ra từ củ đem vùi xuống đất. Những mảnh ở đầu củ (khoảng 1/3 củ trở lên) mọc mầm tốt hơn những mảnh khác. Người ta có thể lợi dụng khả năng này để nhân giống cây Bình vôi. Trong tự nhiên, hoa Bình vôi được thụ phấn chéo chủ yếu nhờ côn trùng [9], [18]. Hạt Bình vôi hình móng ngựa, rất nhỏ, khối lượng trung bình 1000 hạt khoảng 10 – 29 g. Hạt thường phát tán nhờ nước. Các cá thể Bình vôi trồng từ hạt thường sinh trưởng, phát triển nhanh hơn [9], [18]. Cây Bình vôi tím được người dân tộc Tày ở tỉnh Bắc Kạn thường gọi là “Cà tòm đeng” (có nghĩa là Bình vôi đỏ), tên khoa học Stephania rotunada Lour. Cây Bình vôi tím có giá trị về mặt kinh tế (350000đ/kg củ tươi). Cây Bình vôi tím được coi là cây trồng “xóa đói giảm nghèo” của người dân tộc vùng cao nếu được sự quan tâm và phát triển của các cấp lãnh đạo. Bình 5 6 vôi tím là một loại cây dạng leo dễ trồng, phù hợp với điều kiện nước ta. Cây không đòi hỏi tốn công chăm sóc, kỹ thuật canh tác cao. Cây Bình vôi sẽ là cây có tiềm năng lớn trong y học. Tuy nhiên, loại cây quý này đang dần cạn kiệt và có nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên trước việc khai thác tàn phá rừng của người dân [1], [6]. Hình 1.1. Mặt trước và sau lá cây Bình vôi tím Hình 1.2. Cây Bình vôi hoa đầu [nguồn website www.24h.com.vn] Cây Bình vôi hoa đầu có tên khoa học là Stephania cephalantha Hayata, phân bố ở vùng nhiệt đới. Các thành viên của họ chủ yếu là các loài thảo mộc hoặc cây bụi nhưng cây hiếm. Các loài thực vật của chi này là thân leo mảnh với lá mỏng. Trên thế giới cây có ở Trung Quốc (Quảng Tây, Quảng Đông), Đài Loan. Đây là loài có khu phân bố chia cắt, sống ở vùng núi đá vôi, nơi cư trú bị xâm hại do nạn chặt phá rừng; điểm phân bố ở Quảng Ninh đang bị tàn phá (khai thác đá). Cây bị đào rễ để làm thuốc, có nguy cơ tuyệt chủng cao [16]. Bình vôi hoa đầu là một nguồn gen quý hiếm. Rễ dùng làm thuốc an thần, gây 6 7 ngủ; còn được dùng làm thuốc thanh nhiệt, giải độc, tiêu phù, giảm đau, ho nhiều đờm, hen suyễn, khó thở, hạ huyết áp, chống co quắp. Phối hợp với các vị thuốc khác để trị ho lao, sốt rét, kiết lỵ, ngừa lở ngoài da, mụn nhọt. Ngày dùng 3-6 g dạng bột hoặc rượu thuốc. Tuy nhiên, để tránh ngộ độc, chỉ nên sử dụng với liều nhỏ. Người lớn ngày uống từ 3-6 g. Y học hiện đại dùng toàn cây, cao hoặc alkaloid bào chế thành thuốc thích hợp để làm thuốc an thần [17], [36], [37]. 1.2. Giá trị dược liệu của cây Bình vôi 1.2.1. Các hợp chất alkaloid ở cây Bình vôi Alkaloid là một hợp chất hữu cơ có chứa nitơ đa số có nhân vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi trong động vật, thường có dược lực tính mạnh và độc, cho kết tủa và phản ứng màu với một số thuốc thử gọi là thuốc thử của alkaloid [32]. Alkaloid thường chứa trong các bộ phận của cây như hoa, lá, rễ, hạt, vỏ. Đôi khi trong cùng một cây thì bộ phận này giàu alkaloid bộ phận khác lại không có. Lượng alkaloid và tỷ lệ thành phần các alkaloid trong cây có thể thay đổi tùy theo mùa thu hái, tuổi của cây, điều kiện khí hậu thổ nhưỡng. Trong một cây thường chứa các alkaloid có cấu trúc hóa học gần giống nhau. Đặc biệt trong một số cây có chứa vài chục alkaloid như cây thuốc phiện, cây canhkina. Các alkaloid trong cây tồn tại dưới dạng muối với các hợp chất hữu cơ như acid succinic, acid oxalic, acid malic, acid meconic [32]. Alkaloid thường là các chất có trọng lượng phân tử cao, thường ở thể rắn ở nhiệt độ thường. Các alkaloid ở thể rắn thường là các alkaloid không bay hơi, các alkaloid bay hơi thường ở thể lỏng. Các alkaloid ở thể rắn thường là các chất kết dễ kết tinh và có độ chảy xác định. Một số alkaloid không đo được độ chảy do nó bị phá hủy ở nhiệt độ thấp hơn độ chảy. Các alkaloid ở dạng lỏng ở nhiệt độ thường thường không có oxy trong phân tử (nicotin, spartein). Các alkaloid ở dạng lỏng dưới dạng tự do nhưng khi tạo muối với acid thì nó có thể 7 8 chuyển sang thể rắn (spartein ở thể lỏng nhưng spartein sulfat ở thể rắn). Tuy nhiên có một và trường hợp ngoại lệ một số alkaloid có oxy trong phân tử nhưng vẫn ở thể lỏng như arecolin, pilocarpin [3], [8]. Alkaloid nói chung là những chất có hoạt tính sinh học, có nhiều chất rất độc. Tác dụng của alkaloid thường khác nhau ở những loại cây khác nhau. Trên thế giới hiện nay dùng nhiều thuốc tổng hợp nhưng vẫn không bỏ được các alkaloid lấy từ cây cỏ, vì có chất chưa tổng hợp được, và cũng có nhiều thuốc sản xuất tổng hợp không rẻ hơn chiết xuất hoặc tác dụng của chất tổng hợp chưa bằng tác dụng của các chất lấy từ cây. Do đó người ta vẫn dùng phương pháp chiết xuất từ cây ví dụ như ajmalin, morphin, reserpin, quinin, eserin hoặc vừa sử dụng thuốc có nguồn gốc thiên nhiên vừa tổng hợp vừa bán tổng hợp ví dụ như: ajimalisin, theobromin, cafein, ephedrine, atropine, vincamin [3], [8], [13]. Trước đây người ta cho rằng nhân cơ bản của các alkaloid là do các chất đường hay thuộc hợp chất của đường kết hợp với ammoniac để có nitơ mà sinh ra. Ngày nay bằng phương pháp dùng các nguyên tử đánh dấu (đồng vị phóng xạ) người ta chứng minh được alkaloid tạo ra từ các acid amin. Qua định tính và định lượng alkaloid trong các bộ phận khác nhau của cây và theo dõi sự thay đổi của chúng trong quá trình phát triển của cây người ta thấy nơi tạo ra alkaloid không phải luôn luôn là nơi tích tụ alkaloid. Nhiều alkaloid được tạo ra ở rễ lại vận chuyển lên phần trên mặt đất của cây, sau khi thực hiện những biến đổi thứ cấp chúng được tích lũy ở lá, quả hoặc hạt. Năm 1941, Trần Xuân Thuyết cùng Đỗ Tất Lợi và P.Bonnet đã phát hiện ra hỗn hợp alkaloid của củ bình vôi, đặt tên là rotundin, đưa Việt Nam trở thành nước đầu tiên trên thế giới chiết được rotundin. Trong củ bình vôi có chứa nhiều alkaloid. Các alkaloid này thuộc nhóm alkaloid dẫn xuất của nhân isoquinolin. Trong đó, quan trọng nhất là rotudin (0,2- 3,55%). Hàm lượng alkaloid toàn thân cũng như rotudin thay đổi tùy loài và vùng thu hái [25]. 8 9 1.2.2. Hợp chất rotundin và tình hình nghiên cứu về dược chất ở cây Bình vôi Mất ngủ, giấc ngủ không sâu là bệnh của thế giới hiện đại khi con người luôn phải đối mặt với các stress. Nhiều người phải tìm đến các loại thuốc gây ngủ hoặc các thuốc hướng tâm thần gây ngủ. Giải pháp này tuy có hiệu quả tốt nhưng dễ gây lệ thuộc thuốc, thậm chí gây nghiện và ảo giác. Một trong những thuốc được quan tâm có nguồn gốc dược liệu, an toàn và ít gây tác dụng phụ là rotundin. Các nhà khoa học đã tách chiết được thuốc rotudin sulphat từ củ bình vôi làm thuốc tiêm và được lưu hành trên toàn quốc. Sản phẩm đã được Cục Sở hữu trí tuệ cấp bằng độc quyền sáng chế và giải thưởng sáng tạo khoa học. Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của một số alkaloid ở cây Bình vôi Hoạt tính Chống sốt rét Tên chất Dehydroroemerine,tetrahydropalmatine, Nmethylliriodendronine, cepharanthine, dicentrinone, aloe - emodine, corydine, liriodenine, 2 - O, N dimethylliriodendronine, Kháng sinh Glabradine (dịch chiết từ củ loài S. glabra (Roxb.) Mies, dịch chiết từ rễ loài S. japonica), cepharanone D, N formyl - asimilobine, N - formylannonain Diệt giun sán Dịch chiết từ rễ loài S. glabra (Roxb.) Miers Chống virus Dịch chiết từ củ loài S. cepharantha Hayata Chống ung thư Dl - tetrandrine, fangchinoline, d - tetrandrine, d - isochondrodendrine, dịch chiết từ củ loài S. venosa (Blume) Spreng, aporphine, cepharanthine, cepharanoline, isotetrandrine An thần. (−) Stepholidine, L - tetrahydropalmatin Kích đẻ cho phụ sản Tetrandrine Đảo chiều đa kháng Insotrilobine và trilobine Chống viêm và giảm Tetrandrine, fangchinoline, L - tetrahydropalmatin, đau cepharinthin Miễn dịch Tetrandrine 2+ Chặn kênh Ca Tetrandrine Chống oxy hóa Fangchinoline cepharanthine 9 10 Cây Bình vôi chứa nhiều hoạt chất có giá trị về dược liệu. Trong củ Bình vôi chứa một lượng chất alkaloid L - tetrahydropalmatin (rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin. Những hợp chất này được sử dụng phổ biến để điều chế các loại thuốc, đặc biệt là thuốc an thần [8]. Theo y học cổ truyền, củ Bình vôi được dùng dưới dạng thuốc sắc hay ngâm rượu để chữa các bệnh mất ngủ, ho hen, kiết lỵ, sốt, đau bụng. Các hoạt chất chiết từ các loài Bình vôi đã được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước nghiên cứu. Các hợp chất alkaloid có trong các loài Bình vôi rất đa dạng cả về hàm lượng và thành phần cấu tạo. Một trong những hoạt chất được nghiên cứu nhiều nhất là rotundin (Bảng 1.1) [9], [18], [37]. Tác dụng dược lý của rotundin đã được nghiên cứu ở Việt Nam, Liên Xô cũ và Trung Quốc rotundin có tác dụng dược lý: (1) Rotundin rất ít độc [3]; (2) Tác dụng thần kinh rõ rệt trên nhu động vị tràng, có thể dùng chữa những trường hợp tăng nhu động và ống tiêu hoá bị giật; (3) Tác dụng điều hoà đối với tim và bổ tim nhẹ; (4) Tác dụng điều hoà hô hấp, có thể dùng chữa hen hay chữa nấc; (5) Rotundin có tác dụng an thần, gây ngủ và chống co quắp, hạ huyết áp [4], [26]. Chu Hongyuan và cộng sự, Mantsch John và Li Shi - Jian nghiên cứu cơ chế giảm đau của L - tetrahydropalmatin cho thấy thuốc có tác dụng ức chế receptor dopamin D2, ứng dụng này đã được sử dụng trong bài thuốc cai nghiện [28], [33]. Đối với những alkaloid của củ bình vôi chỉ có alkaloid A (tức là roemerin) do Ngô Vân Thu tách chiết được Dương Hữu Lợi thí nghiệm dược lý và đã đi tới những kết luận: Dung dịch có tác dụng gây tê niêm mạc và phong bế. Tính theo công thức G. Valette, dung dịch 0,5% có tác dụng gây tê niêm mạc tương đương với dung dịch 1,8% clohydrat cocain. Theo thí nghiệm của Mak và Nelson, dung dịch có tác dụng gây tê phong bế mạnh hơn dung dịch clohydrat cocain 1% và dung dịch novocain 3%. Dung dịch alkaloid A có tác 10