Tài liệu Luận văn phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme chitin deacetylase và khả năng ứng dụng​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM --------------------------- NGUYỄN TRẦN THIỆN ĐỨC PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITIN DEACETYLASE VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số ngành: 6042020 TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 9 năm 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM --------------------------- NGUYỄN TRẦN THIỆN ĐỨC PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITIN DEACETYLASE VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số ngành: 6042020 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 9 năm 2017 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Công nghệ TP. HCM ngày … tháng … năm … Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ) TT 1 2 3 4 5 Họ và tên GS.TSKH.Nguyễn Trọng Cẩn PGS.TS.Nguyễn Tiến Thắng TS. Nguyễn Hoàng Dũng TS. Trịnh Thị Lan Anh TS.Nguyễn Ngọc Hồng Chức danh Hội đồng Chủ tịch Phản biện 1 Phản biện 2 Ủy viên Ủy viên, Thư ký Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau khi Luận văn đã được sửa chữa (nếu có). Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHỆ TP. HCM VIỆN ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc TP. HCM, ngày..… tháng….. năm 20..… NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Nguyễn Trần Thiện Đức Giới tính:Nam Ngày, tháng, năm sinh:13/07/1992 Nơi sinh:TP.HCM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV:1541880003 I- Tên đề tài: Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitin deacetylase và đánh giá khả năng ứng dụng trong sản xuất chitosan từ chitin của các chủng vi sinh vật. II- Nhiệm vụ và nội dung: - Thu thập mẫu phân lập - Tăng sinh chọn lọc VSV - Phân lập chủng VSV thuần khiết từ các nguồn mẫu - Sàng lọc khả năng sinh tổng hợp CDA của các chủng phân lập - Khảo sát VSV sàng lọc và định danh - Thử nghiệm chuyển hóa chitin thành chitosan, sử dụng môi trường lên men cơ bản nuối cấy các chủng sàng lọc - Khảo sát ảnh hưởng của nguồn C, N, khoáng đến hiệu suất thu hồi chitosan và chất lượng chitosan tạo thành (độ deacetyl, độ hòa tan) - Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách tăng nồng độ acid acetic hòa tan chitosan. - Tăng hiệu suất thu hồi chitosan bằng cách thay đổi các nguồn cơ chất cảm ứng. - Khảo sát tính chất chitosan tạo thành bằng phương pháp sinh học so sánh với chitosan sản xuất bằng phương pháp hóa học và chitosan thương mại - Đề nghị quy trình sản xuất chitosan từ chitin bằng phương pháp sinh học. III- Ngày giao nhiệm vụ: 15/02/2016 IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 30/08/2016 V- Cán bộ hướng dẫn: (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên): TS. Nguyễn Hoài Hương CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký) i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. TP.HCM, ngày……tháng……năm 2017 Học viên thực hiện Luận văn ii LỜI CÁM ƠN Tôi xin chân thành cám ơn tất cả quý thầy cô trong trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, thầy cô ngành Công nghệ sinh học đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kinh nghiệm kiến thức, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và tạo điều kiện thực hiện để tôi hoàn thành luận văn này. Đặc biệt tôi xin cám ơn Tiến sĩ Nguyễn Hoài Hương đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện và hoàn thành tốt luận văn. Xin được gửi lời cảm ơn đến cô Đỗ Thị Tuyến – Trung tâm phân tích kỹ thuật cao Sài Gòn STC cùng sinh viên Đỗ Thị Phương Trinh đã giúp tôi hoàn thành kết quả chạy điện di các mẫu enzyme. Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn các thầy cô trong hội đồng phản biện đã dành thời gian đọc và nhận xét cho luận văn này để tôi có thể hoàn thiện nó tốt hơn. Tôi xin chúc các thầy cô được nhiều sức khỏe và luôn thành công trong cuộc sống. Học viên thực hiện Luận văn Nguyễn Trần Thiện Đức iii TÓM TẮT PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITIN DEACETYLASE VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CÁC CHỦNG NÀY TRONG SẢN XUẤT CHITOSAN TỪ CHITIN Trong nghiên cứu này, 26 chủng vi khuẩn đã được phân lập từ các mẫu đất thu thập từ các địa điểm khác nhau ở Vũng Tàu, Cần Giờ, trong đó chỉ có 3 chủng (CD1, CD5, CD10) cho thấy khả năng sinh tổng hợp enzyme chitin deacetylase được định danh là Bacillus cereus, B. amyloliquefaciens và B. siamensis. Môi trường sử dụng lên men các chủng trên chuyển hóa chitin huyền phù thành chitosan chứa nguồn C là tinh bột 2%, nguồn N là cao nấm men 1%, nguồn khoáng là MgSO4 0,04% được bổ sung NaCl 0,1%. Hiệu suất thu hồi chitosan khi sử dụng acid acetic 2% hòa tan chitosan lần lượt là 73%, 52%, 49% tương ứng với các chủng CD1, CD5 và CD10. Độ hòa tan, độ nhớt, độ deacetyl hóa và khối lượng phân tử, hoạt tính kháng khuẩn của chitosan sinh học không khác biệt nhiều so với chitosan hóa học và chitosan thương mại. iv ABSTRACT ISOLATION AND SCREENING OF CHITIN DEACETYLASE PRODUCING MICROORGANISMS AND APPLICATION POTENTIAL IN CHITOSAN PRODUCTION FROM CHITIN. In this study, 26 bacterial strains were isolated from soil samples, collected from different locations in Ba Ria Vung Tau Province, among which only three strains namely CD1, CD5 and CD10 showed their chitin deacetylase activity and were identified as Bacillus cereus, B. amyloliquefaciens and B. siamensis, respectively. The culture medium for above – mentioned strains to convert colloidal chitin to chitosan contained 2% soluble starch as the carbon source, 1% yeast extract as the nitrogen source and several minerals such as 0,04% MgSO4 and 0,1% NaCl. Chitosan recovery yields by using 2% acetic acid to dissolve chitosan were 73%, 52%, 49% for CD1, CD5 and CD10 respectively. Chitosan obtained by biological method displayed solubility, viscosity, deacetylation degree, molecular weight and antibacterial activity in the same range as this obtained by chemical method as well as the commercial one. v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i LỜI CÁM ƠN...................................................................................................................... ii TÓM TẮT ............................................................................................................................iii ABSTRACT ....................................................................................................................... iv MỤC LỤC........................................................................................... ....................... v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.......... .............................................................. ix DANH MỤC CÁC BẢNG................... ...................................................................... x DANH MỤC CÁC HÌNH............................. ............................................................. xi MỞ ĐẦU................................. ....................................................................................1 1. Đặt vấn đề............................. ................................... .......................................1 2. Tính cấp thiết của đề tài.................... ...................... .......................................1 3. Mục tiêu nghiên cứu................... ....................................................................2 4. Nhiệm vụ nghiên cứu.................. ...................................................................2 5. Phương pháp nghiên cứu. ...............................................................................3 6. Các kết quả đạt được của đề tài.. ............................ ........................................3 7. Kết cấu của luận văn thạc sĩ....... ....................................................................4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN....... ................................................................................5 1.1. Tổng quan về chitin..... .........................................................................................5 1.1.1. Giới thiệu............. .....................................................................................5 1.1.2. Tính chất vật lý............... ..........................................................................5 1.1.3. Tính chất hóa học........... ..........................................................................6 1.1.4. Tính chất sinh học.......... ..........................................................................6 1.1.5. Nguồn nguyên liệu thu nhận.......... ...................... ....................................7 1.1.6. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới. ... .........7 1.1.6.1. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam ....................... ........7 1.1.6.2. Tình hình sản xuất và nghiên cứu trên thế giới................................. 8 1.1.7. Ứng dụng............ ......................................................................................9 1.2. Tổng quan về chitosan........... ..............................................................................9 vi 1.2.1. Giới thiệu........... .......................................................................................9 1.2.2. Tính chất hóa lý......................... .............................................................10 1.2.3. Tính chất sinh học.................. ................................................................10 1.2.4. Các tính chất của chitosan........ ..............................................................14 1.2.4.1. Mức độ deacetyl hóa...................... ............... ..................................14 1.2.4.2. Trọng lượng phân tử Chitosan........... ......... ....................................14 1.2.4.3. Độ nhớt..................... ......................................................................11 1.2.4.4. Tính tan........................ ...................................................................11 1.2.4.5. Tỷ trọng............... ............................................................................12 1.2.4.6. Khả năng kết hợp với nước và khả năng kết hợp với chất béo ....... 12 1.2.4.7. Khả năng tạo màng............. ................................ ............................12 1.2.4.8. Hoạt tính sinh học của chitosan......... ............. ................................12 1.2.5. Nguồn nguyên liệu thu nhận...... ............................................................14 1.2.6. Công nghệ sản xuất chitosan... ...............................................................14 1.2.6.1. Quy trình sản xuất chitosan từ chitin bằng phương pháp hóa học..15 1.2.6.2. Quy trình sản xuất chitosan bằng phương pháp bán sinh học.........16 1.2.7. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới.... .......18 1.2.7.1. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam.......... . ..................18 1.2.7.2. Tình hình sản xuất và nghiên cứu trên thế giới................. ..............19 1.2.8. Ứng dụng...... ..................................................................... .....................19 1.3. Tổng quan về enzyme chitin deacetylase....... ....................................................20 1.3.1. Giới thiệu enzyme chitin deacetylase.... .................................................20 1.3.2. Cơ chế xúc tác................ ........................................................................20 1.3.3. Phướng pháp xác định hoạt tính............. ................................................22 1.3.4. Điều kiện hoạt động của enzyme...... ................ .....................................22 1.3.5. Ứng dụng............ ....................................................................................23 1.3.6. Lịch sử nghiên cứu enzyme chitin deacetylas... ........... ..........................23 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................ ............ 25 2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài.......................... ...... ...............................25 2.1.1. Thời gian............. ...................................................................................25 vii 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu............. .............................................. ...................25 2.2. Vật liệu nghiên cứu.................. ..........................................................................25 2.2.1. Nguồn mẫu.......... ...................................................................................25 2.2.2. Hóa chất........... .......................................................................................27 2.2.3. Thiết bị – dụng cụ................... ................................................................27 2.2.3.1. Thiết bị............................ ................................. ...............................27 2.2.3.2. Dụng cụ........................... ................................................................28 2.3. Phương pháp luận...............................................................................................28 2.4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................28 2.4.1. Phân lập, sàng lọc vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme chitin deacetylase30 2.4.1.1. Thu thập mẫu................... ...............................................................30 2.4.1.2. Tăng sinh, phân lập chủng thuần khiết................... ........ ................31 2.4.1.3. Sàng lọc...................... .....................................................................31 2.4.1.4. Định danh các chủng sàng lọc....................... .............. ...................32 2.4.2. Khảo sát khả năng chuyển hóa chitin thành chitosan bằng các chủng sàng lọc............. ................................................................................................36 2.5. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................................47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............... .................... .........................48 3.1. Phân lập và sang lọc chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme chitin deacetylase....... ........................................................................ .................................48 3.1.1. Tăng sinh, phân lập chủng thuần khiết........... ......................... ...............48 3.1.2. Sàng lọc........... .................................................. .....................................48 3.1.3. Định danh sơ bộ các chủng sàng lọc............ ......... .................................49 3.1.3.1. Đặc điểm hình thái..................... .................. ...................................49 3.1.3.2. Kết quả định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng vi khuẩn.... ........................................................................................................49 3.1.4. Định danh chủng vi khuẩn chọn lọc bằng phương pháp sinh học phân tử.. ..................................................................................................................... 53 3.2. Khảo sát khả năng chuyển hóa chitin thành chitosan bằng các chủng sàng lọc................ ................... ..........................................................................................53 viii 3.2.1. Thử nghiệm chuyển hóa chitin thành chitosan, sử dụng môi trường lên men chọn cơ bản nuôi cấy các chủng sàng lọc........................ .........................53 3.2.1.1. Định tính sự hiện diện của chitosan.......... ............. .........................54 3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của cơ chất đến hiệu suất thu hồi chitosan.... ...... ..55 3.2.2.1. Nguồn Carbon................... ..............................................................56 3.2.2.2. Nguồn Nitơ........................ ............................. ................................57 3.2.2.3. Thành phần khoáng.................. .................... ...................................58 3.2.3. Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách tăng nồng độ acid acetic hòa tan chitosan....... ......................................................................................................60 3.2.4. Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách thay đổi cơ chất cảm ứng..................61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............. .....................................................................72 Kết luận................. ....................................................................................................72 Kiến nghị.............. .....................................................................................................72 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................74 ix DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CDA : Chitin deacetylase CS :Chitinase DDA : Độ deacetyl LMWC : Low molecular weight chitosan VSV : Vi sinh vật x DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Tổng kết các đặc điểm nuôi cấy của các chủng vi sinh vật khảo sát..... .. .52 Bảng 3.2. Khảo sát ảnh hưởng nguồn Carbon đến hiệu suất thu hồi và chất lượng chitosan tạo thành.............. ........................................................................................56 Bảng 3.3. Ảnh hưởng nguồn Nito đến khả năng sản xuất chitosan của 3 chủng VSV CD1, CD5, CD10........ ..............................................................................................57 Bảng 3.4. Ảnh hưởng nguồn Muối đến khả năng sản xuất chitosan của 3 chủng VSV CD1, CD5, CD10.......... ...................................................................................58 Bảng 3.5. Khảo sát enzyme trong dịch nuôi cấy vi khuẩn tuyển chọn nhằm chuyển hóa chitin thành chitosan....... ....................................................................................59 Bảng 3.6. Ảnh hưởng nồng độ acid acetic đến khả năng sản xuất chitosan của 3 chủng VSV CD1, CD5, CD10......... .........................................................................60 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng đến khả năng sản xuất chitosan của 3 chủng VSV CD1, CD5, CD10.......... ........................................ ................................61 Bảng 3.8. So sánh chitosan điều chế từ phương pháp lên men sinh học, chitosan hóa học, chitosan thương phẩm......... ..............................................................................62 Bảng 3.9. Độ deacetyl hóa chitosan chuyển hóa sinh học sơ với chitosan hóa học và chitosan thương mại.................. ........................................................ ........................63 xi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin......... ..............................................................5 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học N-acety-D-glucosamine liên kết với nhau bằng cầu nối β-(1,4)-glucoside.... .....................................................................................................6 Hình 1.3. Deacetyl hóa chitin thành chitosan........ ................. ..................................10 Hình 1.4. Công thức cấu tạo của chitosan........ .........................................................10 Hình 1.5. Quy trình tổng quát thu nhận chitin và sản xuất chitosan từ vỏ đầu tôm. .14 Hình 1.6. Quy trình sản xuất chitin, chitosan từ nguyên liệu vỏ đầu tôm bằng phương pháp thuần túy hóa học của Robert, đại học Nottingham Trent (1998).......15 Hình 1.7. Quy trình lên men vỏ tôm thu nhận chitin của Bhaskar, viện nghiên cứu công nghệ thực phẩm, Ấn Độ, 2010......... ................................................................17 Hình 1.8. Cơ chế hoạt động của enzyme chitin deacetylase.... ... ..............................21 Hình 2.1. Các mẫu thu thập sử dụng cho phân lập............ .... ...................................26 Hình 2.2. Quy trình các bước định danh sơ bộ chủng vi sinh vật............ ......... ........33 Hình 2.3. Quy trình sản xuất chitosan bằng chủng vi sinh vật thí nghiệm........ .. ....36 Hình 2.4. Nhớt kế Ostwald............. ..........................................................................44 Hình 3.1. Kết quả định tính enzyme chitin deacetylase...................................... ...... 48 Hình 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật chọn lọc............ . ...............49 Hình 3.3. Kết quả thử nghiệm khả năng thủy phân tinh bột............. ............. ...........50 Hình 3.4. Thử nghiệm khả năng sinh enzyme chitinase........ ...... .............................50 Hình 3.5. Kết quả khảo sát sự phân giải protein của chủng vi sinh vật.....................51 Hình 3.6. Chitosan được tạo thành từ các vi sinh vật............ .......... .........................54 Hình 3.7. Định tính chitosan bằng phương pháp Lugol/H2SO4... ..... ........................55 Hình 3.8. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của chitosan trên vi khuẩn .Coli... ...65 Hình 3.9. Ống vi khuẩn E.Coli sau 24h nuôi cấy không bổ sung chitosan....... ........66 Hình 3.10. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn chủng CD1............. ........ ...............66 Hình 3.11. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn chủng CD5.............. .......................67 Hình 3.12. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn chủng CD10............. ... ..................68 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Như chúng ta đã biết về chitin – chitosan, đây là một loại polysaccharide tự nhiên và chiếm tỉ lệ rất lớn, chỉ sau cellulose. Bên cạnh đó chitosan cũng có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau rất hiệu quả và thân thiện với môi trường. Tuy nhiên để có được nguồn nguyên liệu chitin – chitosan thì đòi hỏi phải có một quy trình xử lý hiệu quả, bản chất chung của việc sản xuất chitin – chitosan là khử các thành phần khoáng và hàm lượng protein còn dư thừa trong phế liệu vỏ tôm sẽ cho ra chitin từ đó tiếp tục sử dụng kiềm mạnh ở nhiệt độ cao để cắt các gốc acetyl nhằm chuyển chitin thành chitosan. Hiện nay người ta sử dụng phương pháp hóa học để xử lý, quá trình này sử dụng kiềm mạnh ở nhiệt độ cao trong thời gian dài, mang tới những nhược điểm như tiêu thụ nhiều năng lượng, lãng phí lượng lớn kềm, khó xử lý, ăn mòn thiết bị, ô nhiễm môi trường,… Do đó, việc ứng dụng sinh học mà ở đây là sử dụng vi sinh vật vào quy trình sản xuất nhằm làm tăng chất lượng, hạ giá thành sản phẩm và thân thiện với môi trường là một việc làm quan trọng và thiết yếu. Việc áp dụng vi sinh vật sẽ giúp hoàn toàn loại bỏ những nhược điểm mà phương pháp hoá học hiện nay đang mắc phải và gia tăng chất lượng sản phẩm chitosan tạo thành. 2. Tính cấp thiết của đề tài Chitosan, N-deacetylase dẫn xuất của chitin, hòa tan trong dung dịch acid, và có một phạm vi sử dụng rộng, như một loại thuốc trừ sâu tự nhiên (Thome & Văn Daele, 1986), một tác nhân kháng khuẩn (Liu et al., 2004; Liu et al., 2004), một polymer sinh học cho kim loại (Wan et al., 2004), chất xử lý môi trường như một tác nhân kết bông, hoặc kết tủa chất bẩn. Hiện nay, deacetylation của chitin để tạo thành chitosan thường đạt được bằng nhiệt hóa học để loại bỏ các nhóm acetyl. Quá trình này sử dụng kiềm mạnh ở nhiệt độ cao trong thời gian dài. Tuy nhiên, phương pháp này có năm nhược điểm quan trọng bao gồm: (1) Tiêu thụ một lượng đáng kể năng lượng; (2) Lãng phí một lượng lớn kiềm, dẫn đến sự gia tăng về mức độ ô nhiễm môi trường và làm tăng giá thành sản phẩm; 2 (3) Các sản phẩm có một loạt các khối lượng phân tử và không đồng nhất mức độ deacetylation; (4) Vấn đề thu hồi và xử lý hoá chất; (5) Điều kiện làm việc với hóa chất (NaOH 50%) ở nhiệt độ cao dễ gây ăn mòn thiết bị, làm giảm chất lượng Chitosan do làm giảm hoạt tính của nhóm chức – NH2. Do đó việc ứng dụng sinh học mà ở đây là sử dụng enzyme chitin deacetylase vào quy trình sản xuất nhằm làm tăng chất lượng, hạ giá thành sản phẩm và thân thiện với môi trường là một việc làm quan trọng và thiết yếu. Việc áp dụng enzyme sẽ giúp hoàn toàn loại bỏ những nhược điểm mà phương pháp hoá học hiện nay đang mắc phải và gia tăng chất lượng sản phẩm chitosan tạo thành. 3. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập, sàng lọc vi sinh vật sinh enzyme chitin deacetylase. Khảo sát khả năng chuyển hóa chitin thành chitosan bằng các chủng sàng lọc. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Thu thập mẫu phân lập. - Tăng sinh chọn lọc vi sinh vật. - Phân lập chủng vi sinh vật thuần khiết từ các nguồn mẫu. - Sàng lọc khả năng sinh tổng hợp CDA của các chủng phân lập. - Khảo sát vi sinh vật sàng lọc và định danh. - Thử nghiệm chuyển hóa chitin thành chitosan, sử dụng môi trường lên men cơ bản nuôi cấy các chủng sàng lọc. - Khảo sát ảnh hưởng của nguồn C, N, khoáng đến hiệu suất thu hồi chitosan và chất lượng chitosan tạo thành (độ deacetyl, độ hòa tan). - Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách tăng nồng độ acid acetic hòa tan chitosan. - Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách thay đổi các nguồn cơ chất cảm ứng. - Khảo sát tính chất chitosan tạo thành bằng phương pháp sinh học so sánh với chitosan sản xuất bằng phương pháp hóa học và chitosan thương mại - Đề nghị quy trình sản xuất chitosan từ chitin bằng phương pháp sinh học. 3 5. Phương pháp nghiên cứu  Phương pháp tổng hợp tài liệu - Thu thập, tìm hiểu các tài liệu tham khảo, sách, giáo trình và internet liên quan đến đề tài. - Tổng hợp, lựa chọn các tài liệu liên quan đến mục tiêu của đề tài.  Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh chitin deacetylase  Phương pháp định tính chitin deacetylase  Phương pháp đánh giá khả năng sản xuất chitosan của các chủng vi sinh vật  Phương pháp thu thập và xử lý số liệu - Ghi nhận số liệu trực tiếp từ các thí nghiệm bố trí khảo sát. - Xử lý số liệu bằng phần mềm Statistical Analysis System (SAS) 9.4 và Microsoft Excell 2010. 6. Các kết quả đạt được của đề tài - Tuyển chọn được chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme chitin deacetylase ứng dụng sản xuất chitosan. - Thiết lập được quy trình công nghệ chuyển hóa chitin thành chitosan sử dụng vi sinh vật tuyển chọn. - Chất lượng chitosan thu được bằng phương pháp chuyển hóa sinh học tương đương chitosan hóa học và chitosan thương mại. 7. Kết cấu của luận văn thạc sĩ Phần mở đầu Chương 1: Tổng quan tài liệu. Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên. Chương 3: Kết quả và thảo luận. Phần Kết luận và đề nghị. 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lược về chitin 1.1.1. Giới thiệu Chitin là một chuỗi dài polymer của một N-acetylglucosamine, một dẫn xuất của glucose. Chitin có công thức hóa học (C8H13NO5)n trong đó C chiếm 47,29%, H chiếm 6,45%, N chiếm 6,89% và O chiếm 39,37%. Về cấu trúc, chitin (còn gọi là poly-[1,4-(N-acetyl-β-D-glucosamine)]) là một polysaccharide bao gồm các gốc Nacetyl-D-glucosamine [GlcNAc, còn gọi là (1,4)-2-acetamido-2-deoxy-β-Dglucose] gắn với nhau bằng liên kết β-1,4-O-glycoside. Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin 1.1.2. Tính chất vật lý Ở dạng tự nhiên, chitin là một chất rắn màu trắng vô định hình, dai, có sợi, phụ thuộc vào nguồn gốc và phương pháp thu nhận. Trong dạng tinh khiết, không biến đổi của nó, chitin có tính mềm dẻo, đàn hồi, và khá cứng rắn. Tuy nhiên, ở hầu hết các động vật chân đốt, nó thường bị thay đổi, xảy ra phần lớn như là một thành phần của vật liệu composite, chẳng hạn như trong sclerotin, tạo thành nhiều bộ xương ngoài của côn trùng. Kết hợp với canxi cacbonat, như trong vỏ động vật giáp xác và nhuyễn thể, chitin tạo ra một hỗn hợp mạnh hơn nhiều. Vật liệu composite này cứng hơn nhiều so với chitin nguyên chất, ít giòn hơn canxi cacbonat tinh khiết.