Tài liệu Luận văn phân tích trình tự orf2 của pcv2 từ heo nuôi ở một số tỉnh phía nam và nghiên cứu vắc xin phòng bệnh liên quan pcv2 trên heo sau cai sữa

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH LÊ THỊ THU PHƯƠNG PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ORF2 CỦA PCV2 TỪ HEO NUÔI Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA NAM VÀ NGHIÊN CỨU VẮC-XIN PHÒNG BỆNH LIÊN QUAN PCV2 TRÊN HEO SAU CAI SỮA Chuyên ngành: Bệnh lý học và Chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9.64.01.02 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải TS. Nguyễn Thị Thu Hồng TP. Hồ Chí Minh – tháng 11 năm 2019 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan những công bố trong luận án này là trung thực, một phần dữ liệu là công trình nghiên cứu của tôi chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác, một phần dữ liệu trong luận án thuộc đề tài độc lập trong chương trình nhiệm vụ nghiên cứu đặc thù, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đặt hàng theo công văn số 2151/BNN-KHCN ngày 21/4/2011 và theo hợp đồng số 23 HĐ/TCKHCN giữa Văn phòng Bộ NN-PTNN và Trung Tâm Nghiên Cứu Thú Y – Công ty TNHHMTV Thuốc Thú Y Trung Ương – NAVETCO ngày 07/6/2011 do TS. Nguyễn Thị Thu Hồng làm chủ nhiệm. Những số liệu trong luận án được phép công bố với sự đồng ý của chủ nhiệm đề tài và cơ quan chủ trì. Tác giả Lê Thị Thu Phương iii LỜI CẢM ƠN Xin thành kính biết ơn công lao sinh thành dưỡng dục đến Ba Má. Xin thành kính ghi ơn PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải và TS. Nguyễn Thị Thu Hồng đã hết lòng hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình công tác, học tập, thực hiện và hoàn thành luận án này. Xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Nguyễn Tất Toàn, PGS.TS. Lâm Thị Thu Hương, PGS. TS. Nguyễn Văn Khanh, TS. Hồ Thị Kim Hoa, PGS.TS. Lê Thanh Hiền, PGS.TS. Trần Thị Dân, PGS.TS. Nguyễn Ngọc Tuân đã động viên và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Lãnh Đạo Công ty Cổ phần Thuốc Thú Y Trung Ương NAVETCO, BLĐ Trung Tâm Nghiên Cứu Thú Y đã đồng ý và tạo điều kiện về thời gian, cơ sở vật chất để tôi được học tập, nghiên cứu thực hiện và hoàn thành luận án này. Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm và quý Thầy Cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y, Phòng đạo tạo sau đại học đã giảng dạy, truyền đạt kinh nghiệm, kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cũng như những hỗ trợ khác để tôi hoàn thành khóa học. Xin chân thành cảm ơn Ông Chris. J. Morrissy và Ông Darren Schafer thuộc phòng thí nghiệm Australian Animal Health Laboratory – CSIRO, đã cung cấp một số sinh phẩm trong nghiên cứu này. Xin chân thành cảm ơn Anh Đặng Hùng, Chị Lam Hương và các bạn đồng nghiệp Ngọc Ánh, Nhị Hà, Vô Ngôn, Hồng Phúc, Tấn Liêm, Hào Quang, Thu Lâm, Minh Hải ở Trung Tâm Nghiên Cứu, bạn Kim Phúc và anh Hải, Chị Thu Hà, Chị Diệu Thúy, Em Thanh Phong đã đồng hành và động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài. Xin gởi lời cảm ơn và lời yêu thương chân thành đến đại gia đình đã ủng hộ, động viên tôi trong công tác, học tập và hoàn thành luận án. iv TÓM TẮT Đề tài “Phân tích trình tự ORF2 của PCV2 từ heo nuôi ở một số tỉnh phía Nam và nghiên cứu vắc-xin phòng bệnh liên quan PCV2 trên heo sau cai sữa” được thực hiện nhằm xác định genotype và đánh giá sự tương đồng di truyền của PCV2 lưu hành tại một số tỉnh phía Nam Việt Nam và nghiên cứu thử nghiệm vắcxin phòng hội chứng còi, giảm lượng vi-rút huyết trong mô và bệnh tích liên quan PCV2 trên heo dựa trên chủng phân lập trong nghiên cứu. Kết quả đạt được như sau: Phân tích cây phát sinh chủng loại dựa trên toàn bộ ORF2 của 48 mẫu PCV2 thu thập từ năm 2007 đến 2016 từ 44 trại heo ở 13 tỉnh thành Việt Nam (gồm 12 tỉnh phía Nam và 1 tỉnh Bắc Trung Bộ) cho thấy, có sự lưu hành đồng thời PCV2b, PCV2d và PCV2-Re (2h) (trước đây được xếp vào nhóm PCV2 tái tổ hợp, theo cách phân loại mới được xếp vào genotype PCV2h), trong đó phổ biến nhất là PCV2b (24/48). Sự xuất hiện và ngày càng trở nên phổ biến của genotype PCV2d, đặc biệt là PCV2d2 (15/16 mẫu thuộc PCV2d) từ năm 2012 trở đi. Mức độ tương đồng về nucleotide ở mỗi genotype tương ứng 98,7% - 100% đối với PCV2b, 98,5 - 100% đối với PCV2d2 và PCV2-Re (2h) là 98,7 - 100%. Khoảng cách di truyền (p - distance) giữa các genotype khá cao, từ 0,0595  0,0096 đến 0,0663  0,0102, cao hơn rất nhiều so với ngưỡng p = 0,035. Đã phân lập được 18 chủng PCV2 thuộc các genotype PCV2b (9 chủng), PCV2d (6 chủng) và PCV2-Re (2h) (3 chủng) từ 21 mẫu bệnh phẩm dương tính PCV2 - thu nhận từ heo có biểu hiện triệu chứng và bệnh tích bệnh do circovirus. Hiệu giá vi-rút đạt được trên môi trường tế bào PK15A dao động từ 1,67 đến 5,50log10 TCID50/ml ở lần tiếp đời thứ 3. Ba chủng thuộc 3 genotype khác nhau có hiệu giá cao ổn định qua các lần tiếp đời (≥ 5,0log10 TCID50/ml): NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b), NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) và NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)) được sử dụng để lựa chọn làm giống gốc nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng bệnh do circovirus trên heo. Đánh giá sự tương đồng kháng nguyên giữa các chủng PCV2 thuộc các genotype khác nhau bằng phản ứng trung hòa chéo. Kết quả cho thấy giữa chủng NAVET- v DongNai2/2009 và NAVET-vietnam3/2004 tương đồng hoàn toàn về kháng nguyên với hệ số R là 104,20%. Hệ số R giữa chủng NAVET-DongNai2/2009 và chủng NAVETLongAn2/2012; giữa NAVET-LongAn2/2012 và NAVET-vietnam3/2004 tương ứng là 91,60% và 91,30%, tất cả đều > 70%. Qua đây cho thấy, cả 3 chủng này tuy khác nhau về genotype nhưng tương đồng với nhau về kháng nguyên. Từ các kết quả nghiên cứu về đặc tính di truyền, nuôi cấy trên tế bào, tương đồng kháng nguyên cho thấy, chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) đáp ứng đầy đủ các tiêu chí để được chọn làm giống gốc trong nghiên cứu sản xuất vắc-xin. Sử dụng binary ethylenimine (BEI) để bất hoạt vi-rút chế tạo kháng nguyên PCV2, với nồng độ BEI 3 mM, ở nhiệt độ 370C, sau 24 giờ có thể vô hoạt hoàn toàn các vi-rút thuộc các chủng NAVET-vietnam3/2004, NAVET-DongNai2/2009 và NAVET-LongAn2/2012, với tốc độ bất hoạt tương ứng với các chủng lần lượt là 0,71; 0,86 và 1,33log10 TCID50/giờ. Đánh giá hiệu lực của vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu thử nghiệm từ chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b). Thí nghiệm 3: lúc 4 tuần tuổi, heo ở lô thí nghiệm (n = 6) được tiêm vắc-xin thử nghiệm (2 ml/ liều, chứa lượng kháng nguyên 106,0TCID50) và sử dụng dịch chiết tế bào PK15A trên lô đối chứng (n = 4). Sau tiêm vắc-xin 28 ngày, tất cả heo được công cường độc bằng cách nhỏ mũi 2 ml và tiêm bắp 2 ml với vi-rút chủng NAVET-DongNai2/2009 ở tiếp đời thứ 6 với hiệu giá 5,33log10TCID50/ml. Ở lô thí nghiệm, heo có sự chuyển đổi kháng thể ở 14 - 21 ngày sau tiêm vắc-xin. Heo sau tiêm vắc-xin và công cường độc đều khỏe mạnh, tăng trọng bình thường, có thời gian vi-rút huyết ngắn, bài thải vi-rút qua phân và dịch tiết mũi với tỉ lệ thấp hơn so với heo đối chứng. Tỉ lệ heo mắc PMWS trên lô vắc-xin là 0/6 và ở lô đối chứng là 1/4. Kết quả cho thấy vắc-xin vô hoạt nhũ dầu này có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch cũng như bảo hộ heo về mặt lâm sàng chống lại PCV2b, giảm tỉ lệ heo có vi-rút huyết và giảm hiệu giá vi-rút trong mô lúc 28 ngày sau công cường độc. vi SUMMARY The study “Genetic analysis of PCV2-ORF2 from pigs in Southern Vietnam and study on vaccine against porcine circovirus diseases in post-weaning pigs” was carried out from June 2012 to June 2018, in Veterinary Research Center – NAVETCO National Veterinary Joint Stock Company, Nong Lam University Ho Chi Minh City. The aims were to determine the prevalence of PCV2 genotypes, genetic homology of PCV2 isolates circulating in Southern of Vietnam and research on vaccine against porcine circovirus in post-weaning pigs based on PCV2 isolates in this study. Full-length ORF2 of 48 PCV2 isolates from 44 pig farms in 13 provinces in Vietnam (including 12 Southern and 1 North Central Coast provinces) between 2007 and 2016 was analysed nucleotide sequence. The results showed that genotype PCV2b, PCV2d and PCV2-Re (2h) (formerly classified as recombinant cluster) coexisted, of which the most prevalent genotype was PCV2b (24/48). PCV2d genotype was emergent and predominant, especially PCV2d-2 (15/16) from 2012 onwards. Nucleotide homology for each genotype was 98.7% - 100% for PCV2b, 98.5 - 100% for PCV2d-2 and 98.7 - 100% for PCV2-Re (2h). p - distance among genotypes were quite high and range from 0.0595  0.0096 to 0.0663  0.0102. Eighteen PCV2 strains were isolated from the PCV2 PCR positive samples, belonged to genotype PCV2b (9 strains), PCV2d (6 strains) and PCV2-Re (2h) (3 strains). The viral titer of PCV2 isolates at the third passages in PK15A cells was in the ranges from 1.67 to 5.50log10 TCID50/ml. Three PCV2 field strains, which the viral titers were stably high (≥ 5.0log10 TCID50/ml) through passages, belonged to different genotypes, namely NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b), NAVET- LongAn2/2012 (PCV2d) and NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)), were selected as master seed for studying of PCV2 vaccines. Applying cross neutralization test and R value (cross-reactivity value) to determine antigenic diversity of PCV2 strains. The R value obtained by cross neutralization test between NAVET-DongNai2/2009 and NAVET-vietnam3/2004 was 104.20%; NAVET-DongNai2/2009 and NAVET-LongAn2/2012; NAVET- vii LongAn2/2012 and NAVET-vietnam3/2004 were 91.60% and 91.30%, respectively. These results indicated that no antigenic differences were found among these strains (R > 70%). Using binary ethylenimine (BEI) to inactivate virus for producing PCV2 antigen, BEI at 3 mM, 370C after 24 hours was able to inactivate completely NAVETvietnam3/2004, NAVET-DongNai2/2009 and NAVET-LongAn2/2012 strains with inactivation rates 0.71; 0.86 and 1.33log10 TCID50 per hour, respectively. Efficacy of experimental inactivated oil emulsion PCV2 vaccine based on NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) strain: Experiment 3: at 4 weeks of age, vaccine group (n = 6) were vaccinated with the experimental PCV2 vaccine (2 ml/dose, contains 106.0TCID50) by intramuscular route, and control group (n = 4) were injected with 2 ml of PK15A cell extract. After 4 weeks post-vaccination, the vaccinated together with unvaccinated controls were challenged intranasally and intramuscularly with 4x105,33TCID50 of NAVET-DongNai2/2009 strain, and observed for 28 days post challenge. The seroconversion started at 14 - 21 dpv in vaccinated pigs. The vaccinated pigs had no increase in body temperature, without any clinical signs during the experiment. The obtained results indicated that this vaccine induced immunological responses in vaccinated pigs that appeared to provide clinically protective against PCV2b infection. Viremia, shedding and viral load in tissues were reduced in vaccinated pigs compared to controls. viii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa ...............................................................................................................i Lời cam đoan ...............................................................................................................ii Lời cảm ơn ................................................................................................................ iii Tóm tắt/Summary.......................................................................................................iv Mục lục.................................................................................................................... viii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt .................................................................... xii Danh mục các bảng ...................................................................................................xv Danh mục các hình, biểu đồ và sơ đồ .................................................................... xvii Mở đầu ........................................................................................................................4 Chương 1. Tổng quan..................................................................................................4 1.1. Giới thiệu về PCV2............................................................................................................ 4 1.1.1. Phân loại PCV2 ............................................................................................................... 4 1.1.2. Đặc điểm hình thái và sức đề kháng của PCV2........................................................... 5 1.1.3. Đặc điểm nuôi cấy của PCV2........................................................................................ 6 1.2. Các bệnh do circovirus trên heo ....................................................................................... 8 1.2.1. Tên gọi ............................................................................................................................. 8 1.2.2. Đặc điểm dịch tễ ............................................................................................................. 9 1.2.3. Cơ chế sinh bệnh ........................................................................................................... 11 1.2.4. Đáp ứng miễn dịch chống PCV2 ................................................................................ 13 1.2.5. Triệu chứng và bệnh tích.............................................................................................. 17 1.2.6. Các biện pháp phòng và kiểm soát PMWS ................................................................ 18 1.3. Các nghiên cứu về di truyền của PCV2 ......................................................................... 18 1.3.1. Các nghiên cứu về biến đổi di truyền của PCV2 trên thế giới ................................. 18 1.3.2. Các nghiên cứu về biến đổi di truyền của PCV2 ở Việt Nam.................................. 21 1.4. Các nghiên cứu về vắc-xin PCV2 .................................................................................. 22 1.4.1. Các loại vắc-xin PCV2 ................................................................................................. 22 1.4.1.1. Vắc-xin cổ điển .......................................................................................................... 22 1.4.1.2. Vắc-xin thế hệ mới .................................................................................................... 23 1.4.2. Các nghiên cứu vắc-xin PCV2 ở Việt Nam ............................................................... 26 ix 1.4.3. Hiệu quả của việc tiêm phòng vắc-xin PCV2 ............................................................ 27 1.4.3.1. Lâm sàng .................................................................................................................... 27 1.4.4.2. Cận lâm sàng .............................................................................................................. 28 1.4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tiêm phòng vắc-xin PCV2 .............................. 30 1.4.5.1. Kháng thể thụ động ................................................................................................... 30 1.4.5.2. Quy trình tiêm phòng ................................................................................................ 31 1.4.5.3. Các tác nhân đồng nhiễm .......................................................................................... 33 1.4.5.4. Sự biến đổi di truyền của PCV2 ............................................................................... 34 1.4.6. Thất bại sau tiêm phòng vắc-xin PCV2 ...................................................................... 34 1.5. Cơ sở khoa học nghiên cứu sản xuất vắc-xin PCV2 .................................................... 35 1.5.1. Cơ sở chọn thể loại vắc-xin để nghiên cứu ................................................................ 35 1.5.2. Cơ sở chọn chủng vi-rút vắc-xin ................................................................................. 36 1.5.3. Cơ sở lựa chọn chất vô hoạt PCV2 ............................................................................. 36 1.5.4. Cơ sở lựa chọn chất bổ trợ ........................................................................................... 38 1.5.5. Tiêu chuẩn đánh giá vắc-xin ........................................................................................ 39 1.5.5.1. An toàn........................................................................................................................ 39 1.5.5.2. Hiệu lực....................................................................................................................... 39 Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ....................................................43 2.1. Phạm vi và đối tượng nghiên cứu ......................................................................43 2.1.1. Địa điểm......................................................................................................................... 43 2.1.2. Thời gian ........................................................................................................................ 43 2.1.3. Đối tượng ....................................................................................................................... 43 2.2. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................43 2.3. Vật liệu, hóa chất................................................................................................43 2.3.1. Vật liệu thí nghiệm ....................................................................................................... 43 2.3.2. Hóa chất và các sinh phẩm........................................................................................... 44 2.3.3. Dụng cụ và trang thiết bị .............................................................................................. 45 2.4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................45 2.4.1. Phân tích di truyền của PCV2 tại một số tỉnh thành Việt Nam ................................ 45 2.4.2. Khảo sát đặc tính sinh học của các chủng PCV2 phân lập ....................................... 47 2.4.2.1. Phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15A...................................................... 47 2.4.2.2. Xác định liều lượng vi-rút gây nhiễm ...................................................................... 48 x 2.4.2.3. Xác định thời gian thu hoạch tối ưu đối với các chủng phân lập .......................... 49 2.4.2.4. So sánh sự tương đồng kháng nguyên giữa các chủng PCV2 phân lập thuộc các genotype khác nhau ................................................................................................................. 50 2.4.2.5. Thí nghiệm 1. Đánh giá khả năng gây bệnh và tính sinh miễn dịch của chủng NAVET-DongNai2/2009 ...................................................................................................... 52 2.4.3. Nghiên cứu chế tạo vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu ................................................. 55 2.4.3.1. Quy trình vô hoạt PCV2 ........................................................................................... 55 2.4.3.2. Chế tạo vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu .................................................................. 56 2.4.3.3. Tính an toàn và hiệu lực của vắc-xin vô hoạt nhũ dầu thử nghiệm ...................... 56 2.5. Các kỹ thuật dùng trong nghiên cứu ..................................................................59 2.5.1. Phương pháp ly trích ADN .......................................................................................... 59 2.5.2. Kỹ thuật PCR phát hiện PCV2 .................................................................................... 59 2.5.3. Các phương pháp huyết thanh học .............................................................................. 60 2.5.3.1. Phương pháp miễn dịch peroxidase trên tế bào một lớp định lượng kháng thể .. 60 2.5.3.2. Phương pháp ELISA phát hiện IgG......................................................................... 60 2.5.3.3. Phương pháp trung hòa ............................................................................................. 60 2.5.4. Phương pháp phân lập PCV2 trên tế bào PK15A ..................................................... 61 2.5.5. Phương pháp chuẩn độ PCV2 ..................................................................................... 62 2.6. Xử lý thống kê .................................................................................................................. 62 Chương 3. Kết quả và thảo luận ................................................................................63 3.1. Phân tích di truyền của các mẫu PCV2 tại một số tỉnh thànhViệt Nam ..............63 3.1.1. Phân tích cây phát sinh chủng loại dựa trên ORF2 của PCV2 ................................. 63 3.1.2. Phân tích đa dạng di truyền của PCV2 dựa vào ORF2 ............................................. 67 3.1.3. Đặc điểm ORF2 của các chủng PCV2 ở Việt Nam .................................................. 68 3.1.4. Phân tích sự tái tổ hợp .................................................................................................. 72 3.2. Kết quả phân lập PCV2 và đặc tính nuôi cấy của một số phân lập PCV2 .............78 3.2.1. Kết quả phân lập PCV2 từ các mẫu thực địa ............................................................. 78 3.2.2. Xác định liều lượng gây nhiễm của chủng NAVET-DongNai2/2009 trên tế bào PK15A ...................................................................................................................................... 82 3.2.3. Khả năng gây bệnh tích tế bào..................................................................................... 83 3.2.4. Khả năng nhân lên của PCV2 trên môi trường tế bào PK15A ................................ 85 3.2.5. Tính ổn định .................................................................................................................. 86 xi 3.3. Sự tương đồng kháng nguyên giữa các phân lập PCV2 thuộc các genotype khác nhau ...........................................................................................................................87 3.4. Thí nghiệm 1: Khả năng gây bệnh và tính sinh miễn dịch của chủng NAVETDongNai2/2009 ..........................................................................................................89 3.5. Kết quả vô hoạt PCV2 .........................................................................................97 3.5.1. Vô hoạt PCV2 với các nồng độ chất vô hoạt khác nhau .......................................... 97 3.5.2. Kết quả vô hoạt ba chủng PCV2 phân lập với nồng độ BEI 3 mM ...................... 100 3.6. Đánh giá an toàn và hiệu lực của vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu thử nghiệm chủng NAVET-DongNai2/2009 .............................................................................103 3.6.1. Thí nghiệm 2 ............................................................................................................... 103 3.6.2. Thí nghiệm 3 ............................................................................................................... 107 Chương 4. Kết luận và đề nghị ...............................................................................124 Danh mục các công trình đã công bố của tác giả ....................................................126 Tài liệu tham khảo ...................................................................................................127 Phụ lục .....................................................................................................................155 xii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt aa Amino acid A-xít a-min AAHL Australian Animal Health Laboratory Phòng thí nghiệm sức khỏe động vật quốc gia Úc ADN Deoxyribonucleic acid ARN Ribonucleic acid bp Base pair Cap Capsid CD/CD Cesarean-derived colostrumdeprived Mổ lấy thai và không bú sữa đầu DC Dendritic cell Tế bào tua dpc Day post-challenge Ngày sau gây nhiễm ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Phản ứng miễn dịch hấp phụ nối kết enzyme FAID Fluorescent antibody infectious dose Liều gây nhiễm được xác định bằng kháng thể huỳnh quang FCM Fetal cardinomonocyte Tế bào đơn nhân tim thai IFN Interferon Cản nhiễm tố IL Interleukin IPMA Immunoperoxidase monolayer assay Phương pháp miễn dịch peroxidase trên tế bào một lớp IPX Immunoperoxidase Phương pháp nhuộm miễn dịch peroxidase kb Kilobase kDa kilodalton xiii MOI Multiplicity of infection Tỷ số gây nhiễm NIPC Natural interferon producing cell Tế bào tiết interferon tự nhiên NK Natural killer cell Tế bào giết tự nhiên nt Nucleotide ORF Open reading frame Khung đọc mở Ori Origin of replication Gốc sao chép PAM Porcine alveolar macrophages Đại thực bào phế nang của heo PBMC Peripheral blood mononuclear cell Tế bào đơn nhân máu ngoại vi PCR Polymerase chain reaction Phản ứng polymerase PCV2 Porcine circovirus type 2 PCVD Porcine circovirus diseases PDNS Porcine dermatitis and nephropathy Hội chứng viêm da và bệnh lý syndrome thận ở heo PK15A Pig kidney 15A PMWS Postweaning multisystemic wasting Hội chứng còi trên heo sau cai syndrome sữa PNP Proliferative and necrotising pneumonia PPV Porcine parvovirus PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome Rep Replicase SE Standard error Sai số chuẩn SD Standard deviation Độ lệch chuẩn S phase Synthesis phase Pha tổng hợp tạo chuỗi do Các bệnh do circovirus trên heo Tế bào thận heo dòng 15A Viêm phổi hoại tử và tăng sinh Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo xiv TCID Tissue culture infectious dose Liều gây nhiễm tế bào TLR Toll-like receptor Thụ thể giống Toll TNF Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử khối u VNT Virus neutralization test Xét nghiệm trung hòa vi-rút xv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Tóm tắt triệu chứng và bệnh tích bệnh PCVD ......................................... 17 Bảng 1.2. Tổng kết các nghiên cứu về vắc-xin PCV2 ............................................. 25 Bảng 1.3. Các loại vắc-xin PCV2 thương mại ở Việt Nam ..................................... 27 Bảng 2.1. Các mẫu dương tính ADN-PCV2 thu nhận từ năm 2007 đến 2016 ........ 46 Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm phản ứng trung hòa chéo giữa 3 chủng PCV2 phân lập ... 50 Bảng 3.1. Khoảng cách di truyền trong cùng genotype và giữa các genotype lưu hành ở các tỉnh thành Việt Nam từ năm 2007 đến 2016 ................................... 68 Bảng 3.2. Các a-xít a-min của protein Cap khác nhau giữa các genotype PCV2 ..... 69 Bảng 3.3. Mức độ tương đồng về trình tự nucleotide và a-xít a-min giữa các chủng PCV2 ........................................................................................................ 71 Bảng 3.4. Phần trăm tương đồng giữa các mẫu PCV2-Re (2h) với chủng bố mẹ giả định dựa trên ORF2 .................................................................................................. 72 Bảng 3.5. Kết quả phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15A .......................... 79 Bảng 3.6. Hiệu giá của các chủng NAVET-DongNai2/2009, NAVET-LongAn2/2012 và NAVET-vietnam3/2004 qua các lần tiếp đời trên tế bào PK15A ....... 86 Bảng 3.7. Hiệu giá kháng thể trung hòa của phản ứng trung hòa chéo giữa huyết thanh heo với các genotype PCV2 phân lập ...................................................... 88 Bảng 3.8. Hệ số tương đồng kháng nguyên R giữa ba chủng PCV2 khảo sát.......... 88 Bảng 3.9. Khối lượng và điểm thể trạng heo thí nghiệm 1 ....................................... 89 Bảng 3.10. Tăng trọng bình quân hàng ngày trên heo ở thí nghiệm 1 ...................... 90 Bảng 3.11. Phát hiện ADN-PCV2 trong huyết thanh và mô của heo ở thí nghiệm 1 ... 91 Bảng 3.12. Số lượng bạch cầu của heo ở thí nghiệm 1 ............................................. 92 Bảng 3.13. Diễn biến kháng thể chống PCV2 trên heo ở thí nghiệm 1 ................. 93 Bảng 3.14. Hiệu giá vi-rút chủng NAVET-DongNai2/2009 theo thời gian vô hoạt ở các nồng độ BEI ...................................................................................... 97 Bảng 3.15. Hiệu giá vi-rút của ba chủng PCV2 phân lập giảm theo thời gian vô hoạt ở nồng độ BEI 3 mM .............................................................................. 101 xvi Bảng 3.16. Khối lượng ban đầu và tăng trọng bình quân hàng ngày trên heo ở thí nghiệm 2 ................................................................................................. 103 Bảng 3.17. Diễn biến kháng thể chống PCV2 trên heo ở thí nghiệm 2 .................. 105 Bảng 3.18. Khối lượng và điểm thể trạng heo thí nghiệm 3 ................................... 108 Bảng 3.19. Tăng trọng bình quân hàng ngày của heo ở thí nghiệm 3 .................... 108 Bảng 3.20. Diễn biến kháng thể chống PCV2 trên heo ở thí nghiệm 3 .................. 110 Bảng 3.21. Số lượng bạch cầu ở heo sau công cường độc ở thí nghiệm 3 ............. 115 Bảng 3.22. Phát hiện ADN-PCV2 trong huyết thanh, mẫu ngoáy mũi và mẫu ngoáy trực tràng trên heo sau công cường độc ở thí nghiệm 3 ......................... 116 Bảng 3.23. Hiệu giá vi-rút ở mô heo thí nghiệm 3, mổ khảo sát lúc 28 dpc .......... 119 xvii DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ Hình 1.1. Hình ảnh PCV2 dưới kính hiển vi điện tử ................................................. 6 Hình 1.2. Cấu trúc bộ gen PCV2 ............................................................................... 7 Hình 2.1. Tóm tắt nội dung nghiên cứu ................................................................... 44 Hình 2.2. Mô tả thiết kế thí nghiệm 1 ....................................................................... 52 Hình 2.3. Mô tả thiết kế thí nghiệm 2 ...................................................................... 57 Hình 2.4. Mô tả thiết kế thí nghiệm 3 ...................................................................... 58 Hình 3.1. Cây phát sinh chủng loại của các chủng PCV2 dựa trên trình tự nucleotide ORF2 ..................................................................................................................... 65 Hình 3.2. Phân tích các mẫu PCV2-Re (2h) bằng phần mềm RDP4 v.4.39 dựa trên ORF2 ........................................................................................................ 74 Hình 3.3. So sánh nucleotide giữa các mẫu PCV2-Re (2h) và chủng bố mẹ .......... 77 Hình 3.4. Điện di sản phẩm PCR 760 bp để phát hiện ADN-PCV2......................... 80 Hình 3.5. Phản ứng IPMA phát hiện PCV2 phân lập trên môi trường tế bào PK15A ....... 80 Hình 3.6. Heo 16 tuần tuổi có biểu hiện viêm da...................................................... 81 Hình 3.7. Thai khô ở các giai đoạn khác nhau ......................................................... 81 Hình 3.8. Hình dạng tế bào tế bào PK15A nhiễm PCV2 ......................................... 84 Hình 3.9a. Nang bạch huyết bình thường ở heo đối chứng ..................................... 96 Hình 3.9b. Suy giảm tế bào lym-phô và xuất hiện tế bào đa nhân khổng lồ ở nang bạch huyết ................................................................................................ 96 Hình 3.10a. Phổi heo đối chứng ............................................................................... 96 Hình 3.10b. Viêm phổi kẽ ........................................................................................ 96 Hình 3.11. Điện di sản phẩm PCR phát hiện ADN-PCV2 trong dịch tế bào ........ 100 Hình 3.12. Nhuộm IPX xác định sự hiện diện của PCV2 trong tế bào PK15A ..... 100 Hình 3.13. Điện di sản phẩm PCR phát hiện ADN-PCV2 trong dịch tế bào ......... 102 Hình 3.14. Các bệnh tích đại thể trên heo sau công cường độc 28 ngày ............... 120 Hình 3.15. Các bệnh tích vi thể trên heo sau công cường độc 28 ngày ................. 121 xviii Biểu đồ 3.1. Phân bố theo thời gian của các mẫu PCV2 thu thập ở miền Nam Việt Nam từ năm 2007 đến 2016 .................................................................... 67 Biểu đồ 3.2. Phân bố theo địa lý của các mẫu PCV2 thu thập ở miền Nam Việt Nam từ năm 2007 đến 2016 ............................................................................. 67 Biểu đồ 3.3. Phân tích tương đồng của các mẫu PCV2-Re (2h) và 2 chủng bố mẹ giả định......................................................................................................................... 73 Biểu đồ 3.4. Hiệu giá vi-rút theo hệ số MOI và thời gian thu hoạch của chủng NAVET-DongNai2/2009 ........................................................................ 83 Biểu đồ 3.5. Đường cong sinh trưởng của các chủng NAVET-DongNai2/2009, NAVETLongAn2/2012 và NAVET-vietnam3/2004 trên tế bào PK15A .................. 86 Biểu đồ 3.6. Diễn biến đáp ứng kháng thể trên heo ở thí nghiệm 1 ......................... 94 Biểu đồ 3.7. Khuynh hướng giảm hiệu giá vi-rút theo thời gian vô hoạt ở các nồng độ BEI ............................................................................................. 98 Biểu đồ 3.8. Khuynh hướng giảm hiệu giá vi-rút của các chủng PCV2 theo thời gian vô hoạt ở nồng độ BEI 3 mM ................................................................ 102 Biểu đồ 3.9. Diễn biến đáp ứng kháng thể trên heo ở thí nghiệm 2 ....................... 106 Biểu đồ 3.10. Diễn biến đáp ứng kháng thể chống PCV2 trên heo thí nghiệm 3 ... 112 Biểu đồ 3.11. Tỉ lệ phát hiện ADN-PCV2 trong huyết thanh, mẫu ngoáy mũi và mẫu ngoáy trực tràng, hiệu giá kháng thể trung hòa chống PCV2 ở heo sau công cường độc .............................................................................................. 117 1 MỞ ĐẦU Porcine circovirus type 2 (PCV2) liên quan đến một số bệnh trên heo, gọi chung là các bệnh do circovirus trên heo (procine circovirus diseases – PCVD) (Segalés, 2012). Trong đó, đáng lưu ý nhất là hội chứng còi trên heo sau cai sữa (postweaning multisystemic wasting syndrome - PMWS) làm gia tăng tỉ lệ heo chết và loại thải, tăng tiêu tốn thức ăn và giảm tăng trọng, vì thế gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi heo. Ngoài ra, PCV2 còn gây ảnh hưởng bất lợi lên đáp ứng miễn dịch sau tiêm vắc-xin phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (porcine reproductive respiratory syndrome) (Opriessnig và ctv, 2006a). Trước khi có vắc-xin PCV2 thì việc phòng PCVD chủ yếu dựa vào các biện pháp quản lý, an toàn sinh học và kiểm soát yếu tố đồng nhiễm. Đến nay, có khá nhiều nghiên cứu về vắc-xin PCV2, bao gồm cả loại vắc-xin dạng cổ điển và loại dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại; nhiều loại đã được thương mại hóa. Các nghiên cứu thí nghiệm và thực địa đã chứng minh hiệu quả của việc phòng PMWS bằng vắc-xin như cải thiện tăng trọng bình quân hàng ngày, giảm tỷ lệ chết, tỷ lệ loại thải, giảm lượng vi-rút bài thải cũng như giảm bệnh tích vi thể ở các mô bạch huyết (Kristensen và ctv, 2011; Fraile và ctv, 2012a; Seo và ctv, 2014b). Hiện nay, vắc-xin PCV2 được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam. Tuy nhiên, các loại vắc-xin PCV2 thương mại lưu hành tại Việt Nam hiện hành đều là ngoại nhập, và đa số dựa trên genotype PCV2a. Trong khi đó, PCV2 lưu hành ở Việt Nam thuộc genotype PCV2b, PCV2d và nhóm tái tổ hợp (Nguyễn Ngọc Hải và ctv, 2013; Huỳnh Thị Mỹ Lệ và ctv, 2012, 2013; Phạm Hồng Quân và ctv, 2017). Ngoài ra, một số kết quả nghiên cứu cho thấy, genotype của PCV2 có thể ảnh hưởng đến hiệu quả phòng PMWS bằng vắc-xin (Takahagi và ctv, 2010; Opriessnig và ctv, 2013a). Do đó, việc nghiên cứu chế tạo vắc-xin từ chủng PCV2 thuộc genotype lưu hành phổ biến ở Việt Nam là cần thiết, nhằm giúp chủ 2 động nguồn cung vắc-xin, góp phần kiểm soát hiệu quả bệnh PMWS, cũng như giảm giá thành chăn nuôi. Để góp phần giải quyết các vấn đề thực tiễn trên, đề tài: “PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ORF2 CỦA PCV2 TỪ HEO NUÔI Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA NAM VÀ NGHIÊN CỨU VẮC-XIN PHÒNG BỆNH LIÊN QUAN PCV2 TRÊN HEO SAU CAI SỮA” được tiến hành. Mục tiêu nghiên cứu  Xác định genotype và đánh giá sự tương đồng di truyền của PCV2 lưu hành tại một số tỉnh thành ở Việt Nam.  Nghiên cứu chế tạo vắc-xin phòng bệnh liên quan PCV2 trên heo sau cai sữa dựa trên chủng phân lập của đề tài.