Tài liệu Nghiên cứu bào chế liposome amphotericin b bằng phương pháp bốc hơi pha đảo

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ BÍCH PHƯỢNG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME AMPHOTERICIN B BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỐC HƠI PHA ĐẢO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ BÍCH PHƯỢNG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME AMPHOTERICIN B BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỐC HƠI PHA ĐẢO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Trần Thị Hải Yến 2. DS. Đào Thị Thùy Dung Nơi thực hiện: Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới: TS. Trần Thị Hải Yến DS. Đào Thị Thùy Dung Là những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi cũng xin chân trọng cảm ơn PGS. TS. Phạm Thị Minh Huệ về những chỉ bảo và định hướng của cô cho đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này. Nhân đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong ban giám hiệu, các phòng ban và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người đã giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận. Hà Nội, tháng 5 năm 2013 Sinh viên Ngô Thị Bích Phượng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................. 2 1.1. Amphotericin B .................................................................................. 2 1.1.1. Công thức hóa học .......................................................................... 2 1.1.2. Đặc tính lý hóa ................................................................................ 2 1.1.3. Tác dụng dược lý ............................................................................ 3 1.1.4. Dược động học ................................................................................ 3 1.1.5. Chỉ định........................................................................................... 3 1.1.6. Tác dụng không mong muốn.......................................................... 4 1.1.7. Liều dùng ........................................................................................ 4 1.1.8. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường .......................... 4 1.2. Liposome ............................................................................................ 5 1.2.1. Khái niệm ........................................................................................ 5 1.2.2. Thành phần ..................................................................................... 5 1.2.3. Ưu nhược điểm ............................................................................... 8 1.2.3.1. Ưu điểm ....................................................................................... 8 1.2.3.2. Nhược điểm.................................................................................. 8 1.2.4. 1.3. Độ ổn định ....................................................................................... 9 Bào chế liposome bằng phương pháp bốc hơi pha đảo .................. 10 1.3.1. Tạo liposome thô ........................................................................... 10 1.3.2. Giảm kích thước tiểu phân liposome ........................................... 11 1.3.3. Phương pháp tinh chế liposome ................................................... 13 1.4. Một số nghiên cứu về liposome Amphotericin B ............................ 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 17 2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu .. 17 2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................ 18 2.3. Phương pháp nghiên cứu................................................................. 18 2.3.1. Phương pháp xác định độ tan bão hòa của AMB trong môi trường đệm phosphat pH khác nhau ........................................................ 18 2.3.2. Phương pháp bào chế liposome AMB.......................................... 18 2.3.3. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của liposome AMB ....... 20 2.3.3.1. Phương pháp đánh giá hình thức, hình thái, phân bố KTTP liposome .................................................................................................. 20 2.3.3.2. Phương pháp xác định nhiệt độ chuyển pha của lớp màng lipid..……….. ............................................... Error! Bookmark not defined. 2.3.3.3. Phương pháp đánh giá hiệu suất liposome hóa ......................... 21 2.3.3.3.1. Phương pháp định lượng AMB trong liposome ................... 21 2.3.3.3.2. Phương pháp xác định hiệu suất liposome hóa ................... 23 2.3.3.4. Tính ổn định của liposome AMB ............................................... 23 Điều kiện thí nghiệm ........................................................................ 23 2.4. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................... 24 Thẩm định phương pháp định lượng AMB .................................... 24 3.1. 3.1.1. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí................................ 24 3.1.2. Độ đặc hiệu ................................................................................... 24 3.1.3. Tính tuyến tính ............................................................................. 25 3.1.4. Độ lặp lại ....................................................................................... 26 3.1.5. Giới hạn phát hiện ........................................................................ 26 3.2. Độ tan bão hòa của AMB trong môi trường đệm phosphat pH khác nhau….. ......................................................................................................... 27 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức bào chế đến đặc tính của liposome AMB ............................................................ 28 3.3.1. Bố trí thí nghiệm ........................................................................... 28 3.3.2. Đánh giá một số đặc tính của liposome AMB.............................. 28 3.3.2.1. Hình thức, hình thái, phân bố KTTP của liposome AMB ......... 28 3.3.2.2. Hiệu suất liposome hóa .............................................................. 32 3.3.2.3. Tính ổn định của liposome AMB ............................................... 34 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất trong công thức đến đặc tính của liposome .......................................................................................... 37 3.5. Bàn luận ........................................................................................... 39 3.5.1. Về phương pháp định lượng AMB .............................................. 39 3.5.2. Về phương pháp bào chế .............................................................. 39 3.5.3. Về phương pháp đánh giá hiệu suất liposome hóa ...................... 40 3.5.4. Về xây dựng công thức ................................................................. 41 3.5.5. Về độ ổn định của liposome AMB................................................ 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................................. 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Viết tắt Từ/ cụm từ đầy đủ 1 AMB Amphotericin B 2 Chol Cholesterol 3 DĐVN Dược điển Việt Nam 4 DMPC α-Dimyristoylphosphatidylcholin 5 DMPG l-α-Dimyristoylphosphatidylglycerol 6 DSC Phân tích nhiệt vi sai (Differential scanning calorimetry) 7 DSPC Distearoylphophatidylcholin 8 DSPG Distearoylphosphatidylglycerol 9 EDTA Ethylendiamin tetraacetic acid 10 HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography) 11 HSPC Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogenated soy phosphatidylcholine) 12 IC50 Nồng độ thuốc ức chế 50% đối tượng thử (50 % inhibitory concentrations) 13 KTTP Kích thước tiểu phân 14 N/D Nước/dầu 15 NSX Nhà sản xuất 16 PDI Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index) 17 RBCPR Chỉ số giải phóng kali ra khỏi tế bào hồng cầu (red blood cell potassium release) 18 SPC Phosphatidylcholin đậu nành (Soy phosphatidylcholine) 19 TEM Kinh hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron microscope) 20 TKHH Tinh khiết hóa học 21 USP United state Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ) DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Số hiệu Tên bảng biểu Trang Bảng 1.1 Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường 4 Bảng 2.1 Nguyên liệu 17 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí 24 Bảng 3.2 Mối tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích peak 25 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tính lặp lại của hệ thống sắc kí 27 Bảng 3.4 Thành phần các công thức bào chế liposome AMB 28 Bảng 3.5 KTTP và phân bố KTTP của các mẫu liposome AMB 29 Bảng 3.6 Hiệu suất liposome hóa của các mẫu liposome AMB 32 Bảng 3.7 KTTP, phân bố KTTP và hiệu suất liposome hóa của các 34 mẫu sau 1 tuần bảo quản Bảng 3.8 Thành phần công thức của mẫu liposome A553 và A554 37 Bảng 3.9 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất trong 37 công thức đến các đặc tính của liposome AMB DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Số hiệu Tên hình vẽ, đồ thị Trang Hình 1.1 Cấu trúc của liposome 5 Hình 1.2 Dạng tồn tại của các chất lưỡng tính khi phân tán trong môi 6 trường nước Hình 1.3 Cấu trúc của phospholipid ở dưới và trên nhiệt độ chuyển pha 7 Hình 1.4 Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp bốc hơi pha đảo 11 Hình 1.5 Cơ chế giảm KTTP liposome bằng phương pháp đùn ép 16 (extrusion) Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn của quy trình bào chế liposome 20 AMB Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích 26 peak Hình 3.2 Hỗn dịch liposome AMB sau khi bào chế 29 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn KTTP của các mẫu liposome AMB 30 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn KTTP, phân bố KTTP của các mẫu liposome 30 nhóm A Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn KTTP, phân bố KTTP của các mẫu liposome 30 nhóm B Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn hiệu suất liposome hóa của các mẫu liposome 33 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP của các mẫu liposome sau 1 35 tuần bảo quản Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hiệu suất liposome hóa của các 36 mẫu liposome sau 1 tuần bảo quản Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của các mẫu có tỷ lệ 38 % mol dược chất/tổng lượng lipid khác nhau Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn hiệu suất liposome hóa của các mẫu có tỷ lệ % mol dược chất/tổng lượng lipid khác nhau 38 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học và công nghệ, ngày càng có nhiều dạng thuốc mới ra đời với những tính năng vượt trội hơn so với các dạng thuốc quy ước. Trong đó, liposome được đánh giá là một hệ vận chuyển thuốc có tính tương hợp sinh học cao, có khả năng vận chuyển thuốc hướng đích tách dụng, tăng sinh khả dụng và giảm độc tính của thuốc. Đây được coi là một hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực công nghệ dược phẩm và đang được đầu tư nghiên cứu rất nhiều ở các nước trên thế giới và ở Việt Nam. Amphotericin B là một dược chất thân dầu, có tác dụng kháng nấm, được chỉ định trong trường hợp nhiễm nấm nặng toàn thân do hoạt tính kháng nấm mạnh và phổ tác dụng rộng. Tuy nhiên, thuốc có độc tính cao do tính chọn lọc giữa tế bào nấm và tế bào cơ thể người thấp, vì vậy việc sử dụng còn hạn chế. Đã có rất nhiều hướng nghiên cứu nhằm giảm độc tính của thuốc, trong đó sử dụng liposome làm chất mang đang là một hướng đi đầy triển vọng. Để góp phần ứng dụng liposome làm chất mang làm giảm độc tính của thuốc, đề tài “Nghiên cứu bào chế liposome amphotericin B bằng phương pháp bốc hơi pha đảo” nhằm mục tiêu: + Bào chế được liposome amphotericin B bằng phương pháp bốc hơi pha đảo. + Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức bào chế đến đặc tính của liposome amphotericin B. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Amphotericin B 1.1.1. Công thức hóa học Công thức phân tử: C47H73NO17. Khối lượng phân tử: 924,08. pKa: 5,5; 10 [2]. 1.1.2. Đặc tính lý hóa • Lý tính: - Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng da cam. - Độ tan: không tan trong nước ở pH từ 6 đến 7, tan trong dimethylsulphoxid (30 – 40 mg/ml) và propylene glycol, khó tan trong dimethylformamid (2 – 4 mg/ml), rất khó tan trong methanol [2]. • Hóa tính: Hóa tính chính của AMB là của hệ dây nối đôi luân phiên, nhóm amin và nhóm carboxylic tự do, do đó AMB có tính chất sau: - Tính lưỡng tính. - Tạo muối hơi tan trong nước khi tác dụng với acid hydrochloric hoặc các dung dịch kiềm. - Dung dịch 0,0005 % trong methanol ở vùng sóng từ 300-450 nm có 3 cực đại hấp thụ ở 362, 381 và 405 nm. Tỷ lệ độ hấp thụ ở 362 nm so với 381 nm là 0,570,61, tỷ lệ độ hấp thụ ở 381 nm so với 405 nm là 0,87-0,93 [2]. 3 1.1.3. Tác dụng dược lý - AMB là kháng sinh chống nấm nhờ gắn vào sterol (chủ yếu là ergosterol) ở màng tế bào nấm làm thay đổi tính thấm của màng tế bào và làm giải phóng các thành phần bên trong ra ngoài môi trường. AMB cũng gắn vào sterol bào chất ở người (cholesterol) gây độc tính cho cơ thể. - AMB có tác dụng kìm nấm đối với một số loại nấm như: Absidia spp, Aspergillus spp, Basidiobolus spp, Blastomyces dermatitidis, Candida spp... Nồng độ ức chế tối thiểu đối với các loại nấm này là 0,03 – 1 mcg/ml. - Thuốc không có tác dụng đối với virus, vi khuẩn và ricketsia [3]. 1.1.4. Dược động học - AMB hấp thu rất kém qua đường tiêu hóa, chủ yếu dùng đường tiêm truyền tĩnh mạch để điều trị nhiễm nấm nặng toàn thân, chỉ dùng đường uống để điều trị nhiễm nấm đường tiêu hóa và niêm mạc miệng. - AMB liên kết với protein ở mức cao. Thuốc phân bố rộng rãi trong cơ thể. - AMB bài tiết rất chậm qua thận, 2-5 % liều dùng bài tiết dưới dạng hoạt tính sinh học. AMB có nguy cơ gây độc cao với thận, không loại được thuốc ra khỏi cơ thể bằng thẩm tách máu [3]. 1.1.5. Chỉ định - Thuốc uống (viên, hỗn dịch) dùng tại chỗ để điều trị nhiễm nấm Candida albicans ở miệng và đường tiêu hóa. - Tiêm tĩnh mạch AMB dùng điều trị nhiễm nấm toàn thân nặng do nhiễm Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidioidesimmitis, Cryptococcus, Histoplasma, Mucor, Paracoccidioides và Sporotrichum. - Phòng nhiễm nấm cho bệnh nhân sốt kéo dài và giảm bạch cầu trung tính đã điều trị lâu bằng kháng sinh phổ rộng hoặc sau điều trị ung thư bằng hóa chất. - Dạng liposome hoặc phức hợp lipid: chỉ định cho trường hợp điều trị thất bại bằng AMB thông thường hoặc trường hợp AMB có thể gây độc cho thận hoặc gây suy thận [3]. 4 1.1.6. Tác dụng không mong muốn - Phản ứng chung: sốt, rét run, đau đầu, đau cơ khi mới tiêm truyền. - Độc với thận: giảm sức lọc cầu thận, hoại tử thận. - Tác dụng không mong muốn khác: thiếu máu, độc với gan, tim, giảm K và + Mg2+ huyết… [3]. 1.1.7. Liều dùng Đường tiêm tĩnh mạch: AMB thông thường: bắt đầu với liều 0,25 mg/kg/ngày, tăng dần tới tối đa 1 - mg/kg/ngày, trường hợp nặng, liều có thể cần tới 1,5 mg/kg/ngày hoặc cho cách 1 ngày. AMB dạng liposome: bắt đầu với liều 1 mg/kg/ngày, tăng dần tới 3-4 - mg/kg/ngày. Dạng phức hợp phospholipid: thường dùng với liều 5 mg/kg/ngày. - Đường uống: - Viên 10 mg hoặc hỗn dịch chứa 100 mg/ml. + Nhiễm nấm Candida ở miệng: hỗn dịch dùng 1ml/lần ×4 lần/ngày, giữ thuốc trong miệng ít nhất 1 phút trước khi nuốt, viên tan trong miệng dùng 4 lần/ngày. + Nhiễm nấm Candida ở ruột: 100 – 200 mg/ngày, 4 lần/ngày [3]. 1.1.8. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường Bảng 1.1. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường TT 1 Tên chế Hàm phẩm lượng Fungizone 50 mg Thành phần phức hợp AMB với natri Dạng cấu Dạng bào trúc chế micel bột đông deoxycholat 2 3 Abelcet Amphotec khô 100mg/ DMPC:DMPG:AMB phức hợp hỗn dịch 20ml (tỷ lệ mol 7:3:10) lipid 50 mg, phức hợp AMB với phức hợp bột đông 100 mg cholesteryl sulfate lipid khô 5 (tỷ lệ mol 1:1) 4 Ambisome 50 mg HSPC:DSPG:Chol:AMB liposome (tỷ lệ mol 2:0,8:1:0,4) 1.2. bột đông khô Liposome 1.2.1. Khái niệm Liposome là dạng đặc biệt của vi nang và siêu vi nang, gồm một nhân nước ở giữa được bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng tâm, có kích thước thay đổi từ hàng chục nanomet đến hàng chục micromet [1]. Hình 1.1. Cấu trúc của liposome 1.2.2. Thành phần Phospholipid Là thành phần cơ bản cấu tạo nên tiểu phân liposome, là những phân tử lưỡng tính vừa thân dầu vừa thân nước, cấu tạo từ khung phân tử glycerol gắn với các nhóm phân cực và các acid béo. Nhóm phân cực có thể tích điện dương, âm hoặc không tích điện, các acid béo có thể no hoặc không no. Các phospholipid có khả năng tự đóng vòng để tạo thành liposome khi chúng được trộn lẫn với môi trường nước, đầu phân cực sẽ hướng ra ngoài tương tác với môi trường nước, chuỗi acid béo sẽ quay vào trong, tạo ra lớp lipid kép [4]. Các phospholid này có chỉ số packing parameter (PP) xấp xỉ 1, trong khi các chất diện hoạt khác có chỉ số PP >>1 6 hoặc <<1 chỉ có khả năng tạo thành dạng cấu trúc micel hoặc micel đảo khi phân tán trong môi trường nước [8]: Packing parameter = Trong đó: V: là thể tích chiếm chỗ của nhóm thân dầu. a: là diện tích bề mặt bao quanh nhóm thân nước tại bề mặt phân cách pha giữa nước và không khí. Lc: là chiều dài của nhóm thân dầu. Hình 1.2. Dạng tồn tại của các chất diện hoạt khi phân tán trong môi trường nước Lớp màng lipip kép được tạo thành khi tăng nhiệt độ lên trên nhiệt độ chuyển pha Tc của lipip, là nhiệt độ mà tại đó phân tử lipid chuyển từ trạng thái gel sang trạng thái tinh thể lỏng (liquid crystalline). Tc của lipid phụ thuộc vào chiều dài và mức độ no của chuỗi acid béo cũng như đặc điểm của nhóm phân cực. Lớp lipid kép trở nên linh động và dễ thấm tại và trên Tc làm giải phóng các thành phần bên trong ra ngoài môi trường [5]. Liposome sử dụng trong điều trị cần ổn định trong điều kiện sinh lí, do đó nên sử dụng các phospholipid có Tc > 37 ºC [4]. 7 Cholesterol Cholesterol và các dẫn chất được sử dụng trong bào chế liposome với vai trò làm tăng tính cứng và giảm tính thấm của lớp màng lipip đối với các chất mang [18]. Màng phospholipid kép tồn tại ở 2 trạng thái: trạng thái gel và trạng thái tinh thể lỏng. Ở trạng thái gel, mạch hydrocacbon ở dạng cấu hình trans (hình 1.3), diện tích không gian giữa các phân tử phospholipid nhỏ nhất, độ dày của màng lipid kép cao nhất, chuyển động quay của phân tử hạn chế ở mức tối đa. Ở trạng thái tinh thể lỏng, mạch hydrocacbon ở dạng cấu hình gauche (hình 1.3), diện tích không gian giữa các phân tử lớn hơn, màng lipid kép lỏng lẻo hơn, chuyển động quay nội phân tử và giữa các phân tử diễn ra mạnh hơn. Quá trình chuyển trạng thái của lớp màng lipid khi không có cholesterol diễn ra trong khoảng nhiệt độ hẹp. Sự có mặt của cholesterol làm nới rộng khoảng chuyển pha, giảm enthalpy chuyển pha, giảm diện tích không gian giữa các phân tử, giảm chuyển động quay của các hydrocacbon, làm cho các phân tử phospholipid sắp xếp một cách có trật tự và tạo thành một lớp màng lipid kép cứng chắc hơn [13]. Hình 1.3. Cấu trúc của phospholipid ở dưới và trên nhiệt độ chuyển pha Cholesterol còn giúp làm tăng tính ổn định của liposome trong các dịch sinh học như huyết tương. Liposome không chứa cholesterol sẽ tương tác nhanh với các protein trong huyết tương như albumin, transferin, macrogloburin. Các protein này 8 có xu hướng lôi các phân tử phospholipid ra khỏi cấu trúc màng lipid, làm phá vỡ lớp màng kép. Sự có mặt của cholesterol làm giảm tương tác này [18]. Ngoài phospholipid và cholesterol, các chất diện hoạt, các chất tích điện cho lớp màng lipid… cũng được sử dụng trong bào chế liposome. 1.2.3. Ưu nhược điểm 1.2.3.1. Ưu điểm Liposome có thành phần cấu tạo và tính chất lí hóa tương tự màng sinh học như tính thấm, tính đẳng trương... Do đó đây được coi là hệ vận chuyển thuốc có tính tương hợp sinh học cao [22]. Do đặc điểm cấu trúc mà liposome có thể mang được cả dược chất thân dầu và thân nước. Dược chất thân nước được bao trong nhân nước, còn dược chất thân dầu được gắn kết trên lớp màng lipid kép [22]. Dược chất được bảo vệ khỏi tác động của các yếu tố bất lợi bên ngoài môi trường, do đó hạn chế được tác động bất lợi của đường dùng thuốc đến tác dụng của thuốc, như ảnh hưởng của các enzym phân hủy thuốc [22]. Giảm độc tính của thuốc, ví dụ như: ở dạng bào chế liposome, AMB liên kết bền chặt với lớp màng lipid do tạo thành phức hợp AMB – chol, làm giảm khả năng liên kết với chol trên màng tế bào người dẫn đến giảm độc tính của thuốc. Chỉ khi thuốc phân bố đến các tổ chức viêm nhiễm do ái lực của AMB với ergosterol cao hơn với chol làm giải phóng AMB ra khỏi lớp màng lipid, hình thành phức hợp AMB - ergosterol trên màng tế bào nấm và phát huy tác dụng của thuốc [19]. Liposome cho phép vận chuyển thuốc tới tế bào đích thậm chí là đến các tổ chức bên trong tế bào đích bằng cách gắn thêm các ligand trên màng liposome, do đó làm thay đổi chỉ số điều trị của thuốc [22], [25]. 1.2.3.2. Nhược điểm Mặc dù có rất nhiều ưu điểm nhưng hiện liposome vẫn chưa được sử dụng rộng rãi do có một số nhược điểm sau: Chất lượng nguyên liệu: các phospholipid sử dụng đa số được tách chiết từ nguồn nguyên liệu tự nhiên, do đó rất khó kiểm soát mức độ tinh khiết của nguyên 9 liệu. Phospholipid có thể lẫn các lysophospholipid hoặc các sản phẩm của quá trình oxy hóa phospholipid [21]. Đa số các phương pháp bào chế liposome đều sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan lipid gây tác động bất lợi đến sức khỏe nguời sử dụng cũng như môi trường [25]. Độ ổn định thấp: liposome kém ổn định cả về mặt vật lí và hóa học [21]. Hầu hết các phương pháp bào chế liposome chỉ thích hợp ở quy mô phòng thí nghiệm, rất khó để sản xuất ở quy mô lớn [21]. Hiện vẫn chưa có thông tin đầy đủ về mức độ an toàn của các chế phẩm liposome. Ví dụ như: hội chứng tay chân (“hand and foot” syndrome) không xuất hiện khi sử dụng doxorubicin dạng tự do nhưng lại được tìm thấy khi sử dụng liposome doxorubicin tuần hoàn kéo dài [21]. 1.2.4. Độ ổn định Liposome được coi là dạng bào chế kém ổn định cả về mặt vật lí, hóa học và sinh học. Sự thay đổi đặc tính lí hóa của liposome có thể xảy ra ngay trong quá trình bào chế cũng như trong quá trình bảo quản. Về mặt hóa học: sự kém ổn định về mặt hóa học của liposome là do quá trình oxy hóa chuỗi acid béo không no của phân tử phospholipid và quá trình thủy phân liên kết ester của phospholipid tạo ra các lysophospholid. Có thể dùng các kĩ thuật sắc kí khác nhau để đánh giá mức độ tinh khiết, định tính, định lượng lipid trong liposome [5]. Về mặt vật lí: sự thay đổi đặc tính vật lí của liposome do quá trình thấm thuốc qua màng và do sự có mặt của các thành phần tích điện trên bề mặt gây ra hiện tượng kết tụ tiểu phân trong quá trình bảo quản. Trạng thái vật lí của liposome có thể được đánh giá thông qua các chỉ số: kích thước tiểu phân và thế Zeta [5]. Thế Zeta cho biết mức độ tích điện trên bề mặt tiểu phân liposome. Nếu tiểu phân tích điện lớn thì lực đẩy tĩnh điện mạnh, các tiểu phân cách xa nhau và hạn chế quá trình kết tụ tiểu phân. Sự tích điện càng gần không thì chuyển động Brown càng nhanh làm cho các tiểu phân va chạm và kết tập, hệ keo kém ổn định [6]. 10 Kĩ thuật đông khô được sử dụng để tăng độ ổn định của liposome trong quá trình bảo quản. Một mặt, quá trình này giúp loại nước khỏi hỗn dịch liposome làm giảm quá trình thủy phân phospholipid, mặt khác nó làm chậm quá trình biến đổi vật lí và hóa học của dạng bào chế do sản phẩm tồn tại ở trạng thái rắn bền vững hơn [5]. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng quá trình đông khô không ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị của thuốc [25]. 1.3. Bào chế liposome bằng phương pháp bốc hơi pha đảo 1.3.1. Tạo liposome thô Liposome được tạo ra bằng phương pháp bốc hơi pha đảo nhờ quá trình trung gian tạo micel đảo. Phospholipid, cholesterol và các chất tan trong dầu được hòa tan bằng dung môi hữu cơ thích hợp, sau đó đem cất quay để loại bỏ dung môi. Hòa tan trở lại hỗn hợp các thành phần bằng một dung môi không hỗn hòa với nước. Để tạo micel đảo, thêm pha nước và siêu âm trong khoảng thời gian thích hợp cho đến khi tạo thành hệ phân tán một pha đồng nhất. Các micel đảo có cấu trúc gồm lớp phospholipid đơn lớp bao quang nhân nước. Bốc hơi từ từ dưới áp suất giảm để loại dung môi hữu cơ, khi đó các micel sát nhập vào nhau, hệ chuyển sang trạng thái gel. Tiếp tục quá tình bốc hơi dung môi, khi đạt tới điểm giới hạn, trạng thái gel bị bẻ gẫy, các micel bị phá vỡ và phospholipid tái sắp xếp tạo cấu trúc lipid kép và hình thành liposome. Pha dầu có thể sử dụng các loại dung môi khác nhau như: diethyl ether, isopropyl ether, halothane hoặc trifloro tricloro ethane để hòa tan các phospholipid. Trường hợp phospholipid có độ tan thấp trong các dung môi trên, có thể thêm một tỷ lệ nhỏ chloroform hoặc methanol để tăng độ tan. Nồng độ phospholipid sử dụng thường từ 10 – 100 mmol/ml hỗn dịch sản phẩm. Khi sử dụng nồng độ lipid thấp hoặc hỗn hợp lipid không chứa cholesterol thì quá trình tạo trạng thái gel và bẻ gẫy các micel đảo để hình thành liposome sẽ không xảy ra. 11 Hình 1.4. Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp bốc hơi pha đảo Ưu điểm của phương pháp này là tạo ra các tiểu phân liposome chứa 1 thể tích khoang nước lớn và do đó tăng hiệu suất gắn thuốc đối với các dược chất tan trong nước. Phương pháp này rất phù hợp để bào chế các tiểu phân liposome mang các chất có cấu trúc phân tử cồng kềnh, kích thước lớn như albumin, các phosphatase kiềm, ferritin. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là tạo ra các liposome có kích thước lớn, không đồng nhất và có sự phơi nhiễm với dung môi hữu cơ [23]. 1.3.2. Giảm kích thước tiểu phân liposome Mục đích của quá trình này là tạo ra liposome có kích thước nhỏ và phân bố kích thước hẹp, điều này giúp tăng độ ổn định về mặt vật lí, cải thiện hình thức cho chế phẩm, đồng thời cho phép lọc loại khuẩn liposome và sử dụng liposome bằng đường tiêm tĩnh mạch [23]. Hơn nữa, KTTP là một trong những yếu tố quyết định tỷ lệ liposome bị bắt giữ bởi hệ thống đại thực bào (RES), quá trình opsonin hóa liposome có kích thước nhỏ (< 100 nm) diễn ra chậm hơn các liposome có kích thước lớn (> 100 nm). Các liposome có kích thước nhỏ có thể dễ dàng đi qua các khe kẽ trên màng tế bào vào