Tài liệu Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (m, gp5, gp5ectom) của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ agrobacterium

i VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH HẰNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN (M, GP5, GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY THUỐC LÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM LỌC NHỜ AGROBACTERIUM Chuyên ngành: Hoá sinh học Mã số: 94 20 116 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Trung Nam Viện Công nghệ sinh học 2. PGS. TS. Chu Hoàng Hà Viện Công nghệ sinh học HÀ NỘI – 2018 i ii LỜI CẢM ƠN Luận án được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam và Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương. Với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài thuộc nhiệm vụ nghiên cứu thường xuyên của Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học. Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của tập thể cán bộ hướng dẫn, các thầy cô giáo, các nhà khoa học, các anh chị em đồng nghiệp và quý cơ quan, phòng ban. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, Bộ phận đào tạo sau đại học, các phòng chức năng của Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai thầy, PGS.TS. Chu Hoàng Hà và TS. Nguyễn Trung Nam đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS. Lê Trần Bình, PGS.TS. Phạm Bích Ngọc, PGS.TS. Đinh Duy Kháng, PGS.TS. Tô Long Thành, TS. Nguyễn Tường Vân, ThS. Hồ Thị Thương và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen đã luôn giúp đỡ, chia sẻ những kiến thức quý báu và tạo những điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Lâm nghiệp, Ban Lãnh đạo, cùng toàn thể cán bộ của Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để cho tôi yên tâm học tập và thực hiện luận án. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Minh Hằng ii i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Chu Hoàng Hà, TS. Nguyễn Trung Nam và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần kết quả còn lại của luận án chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả Nguyễn Thị Minh Hằng i ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................................6 1.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn...................................................6 1.1.1. Sơ lược tình hình dịch bệnh.............................................................................6 1.1.2. Bệnh tích của PRRS.........................................................................................8 1.1.3. Virus PRRS.....................................................................................................9 1.2. Vaccine phòng PRRS......................................................................................20 1.2.1. Vaccine sống - nhược độc.............................................................................21 1.2.2. Vaccine vô hoạt.............................................................................................23 1.2.3. Các dạng vaccine thử nghiệm dựa vào kháng nguyên GP5 và M chống PRRSV.........................................................................................................24 1.3. Biểu hiện tạm thời kháng nguyên của PRRSV bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium..................................................................................30 1.3.1. Lợi thế của phương pháp biểu hiện gen tạm thời nhờ Agrobacterium...........30 1.3.2. Quá trình thẩm lọc nhờ A. tumefaciens..........................................................33 1.3.3. Một số giải pháp tăng cường biểu hiện gen tạm thời ở thực vật....................35 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................43 2.1. Vật liệu............................................................................................................. 43 2.1.1. Chủng vi khuẩn.............................................................................................43 2.1.2. Các vector và vật liệu thực vật, động vật.......................................................43 2.1.3. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu.........................................................44 2.1.4. Hoá chất........................................................................................................45 2.1.5. Thiết bị..........................................................................................................45 2.2. Phương pháp nghiên cứu...............................................................................46 ii iii 2.2.1. Nhân dòng gen mã hoá protein GP5, M và GP5ectoM của virus PRRS........46 2.2.2. Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen m, gp5opt và gp5ecto-m phục vụ chuyển gen..............................................................................................47 2.2.3. Biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp trong lá thuốc lá N. benthamiana............................................................................................49 2.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện biểu hiện gen tạm thời đến mức độ biểu hiện protein M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP trong lá cây thuốc lá...................................................................................................................50 2.2.5. Tách chiết và xác định nồng độ protein tổng số............................................52 2.2.6. Điện di SDS-PAGE và lai Western blot........................................................52 2.2.7. Tinh sạch protein M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP..............................53 2.2.8. Phương pháp đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên GP5ELP, GP5ectoM-ELP, M-ELP trên động vật thí nghiệm.............................54 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU............................................................................. 61 3.1. Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen m, gp5, gp5ecto-m và tạo chủng A. tumefaciens mang vector tương ứng............................................61 3.1.1. Vector chuyển gen mang gen mã hoá kháng nguyên M dung hợp ELP (MELP).............................................................................................................61 3.1.2. Vector chuyển gen mang gen mã hoá kháng nguyên GP5 dung hợp ELP (GP5-ELP)....................................................................................................65 3.1.3. Vector chuyển gen mang gen mã hoá kháng nguyên GP5ectoM dung hợp ELP (GP5ectoM-ELP).................................................................................69 3.2. Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M -ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP trong cây thuốc lá N. benthamiana ........................................................................................................................ 74 3.2.1. Anh hưởng của vector hỗ trợ.........................................................................75 3.2.2. Anh hưởng của nồng độ AS..........................................................................76 3.2.3. Anh hưởng của mật độ vi khuẩn A. tumefaciens............................................78 3.2.4. Anh hưởng của tuổi của lá.............................................................................79 3.2.5. Anh hưởng của tuổi cây.................................................................................80 iii iv 3.2.6. So sánh mức độ biểu hiện các gen mã hoá kháng nguyên M-ELP, GP5ELP, GP5ectoM-ELP trong điều kiện đã được tối ưu bằng lai miễn dịch .....................................................................................................................81 3.3. Tinh sạch kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP................82 3.3.1. Tối ưu nồng độ PEG 8000 cho quá trình tinh sạch thu nhận kháng nguyên .....................................................................................................................83 3.3.2. Tinh sạch kháng nguyên bằng phương pháp mITC.......................................86 3.4. Tính sinh miễn dịch dịch thể của các kháng nguyên tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm.......................................................................................91 3.4.1. Đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột..................................................91 3.4.2. Đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu trên lợn......................................................98 Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.................................................108 4.1. Biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium..........108 4.1.1. Lựa chọn kháng nguyên trong thiết kế vector biểu hiện..............................108 4.1.2. Mức độ biểu hiện tạm thời các kháng nguyên tái tổ hợp.............................109 4.1.3. Cấu trúc vector biểu hiện và mức độ biểu hiện gen tạm thời ở thực vật......110 4.2. Khả năng kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột...........116 4.3. Tính sinh miễn dịch dịch thể trên lợn........................................................120 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................................................... 130 NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN................132 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH...............................................................133 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................. 140 PHỤ LỤC..............................................................................................................................I iv v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AS aa 2b CMV Acetosyringone Amino acid (axit amin) Cucumber mosaic virus (CMV) 2b protein (Protein 2b của virus bp BSA CaMV Cs DNA ER ELISA ELP et al Fc GFP GP5 GP5ecto HC-Pro HP-PRRSV khảm dưa chuột) Base pair (Cặp base) Bovine serum albumin Cauliflower mosaic virus (Virus khảm súp lơ) Cộng sự Deoxyribonucleic acid Endoplasmic reticulum (Lưới nội chất) Enzyme linked immunosorbent assay Elastin-like polypeptide And co-workers (và các cộng sự) Fragment crystallizable Green fluorescent protein (Protein huỳnh quang xanh) Glycoprotein 5 Ectodomain of glycoprotein (Vùng ngoại bào của protein GP5) Helper component protease (Protein hỗ trợ) Highly pathogenic Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp thể độc lực HRP IPMA cao) Horseradish peroxidase Immunoperoxidase monolayer assay (Xét nghiệm miễn dịch đơn lớp IgG kb kDa LB cộng hợp enzyme peroxidase) Immunoglobulin G Kilobase Kilodalton Luria-Bertani (Môi trường nuôi khuẩn Luria-Bertani) v vi LV M MES mg MLV mITC Lelystad virus Matrix/ Membrance protein 2-(N- Morpholino)ethanesulfonic acid Milligram Modified-live virus (Virus sống đã làm biến đổi = virus nhược độc) Membrane-based Inverse transition cycling (Chu trình chuyển pha nptII nghịch đảo qua màng) Gene mã hoá Neomycin phosphotransferase (Gen kháng Nos nsp OD kanamycin) Nopaline synthase terminator Non-structural protein Optical density (Mật độ quang) ORF Open reading frame (Khung đọc mở) PBS Phosphate-buffered saline PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Fc Stabilizing domain - "Fragment of crystallizable chain of IgG" PRRSV (Vùng hằng định của kháng thể IgG) Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus (Virus gây RNA hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn) Ribonucleic acid ScFv Single chain variable fragment SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis TSP Total soluble protein (Protein tổng hợp) 35S Ter 35S Terminator (Trình tự kết thúc phiên mã) VLP Virus-like particle WT Wild type (Cây không chuyển gen) DANH MỤC BANG Bảng 1.1 Tình hình dịch PRRS giai đoạn 2015 – 2016 ………………... 8 Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu gen gp5opt, gp5ecto- 44 vi vii m và m ……………………………………………………….. Bảng 2.2 Thành phần phản ứng ghép nối gen m, gp5opt với vector pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xELP ……………………….. Bảng 2.3 47 Thành phần phản ứng ghép nối đoạn gp5ecto với gen m và với vector pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xEL ……………… 47 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng ghép nối các cassette gen với vector pCB301 ………………………………………………………. 48 Bảng 3.1 So sánh mức độ biểu hiện tạm thời gen mã hoá các kháng nguyên tái tổ hợp (M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP) trong lá thuốc lá N. benthamiana …………………………………... 82 Bảng 3.2 Hiệu suất thu hồi và mức độ tinh sạch của các protein MELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP …………………………….. 91 DANH MỤC CÁC HÌNH vii Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Hình 1.6 Đặc điểm hình thái của virus PRRS …………………………. Anh hiển vi điện tử của các hạt Arterivirus …………………. Mô hình cấu trúc hạt virus PRRS và các khung đọc mở trên viii hệ gen PRRS ………………………………………………… Đặc điểm của GP5 …………………………………................ Cấu trúc Arterivirus …………………………………………. Sơ đồ mô tả sự biểu hiện gen tạm thời sử dụng các vector Hình 1.7 Hình 1.8 Hình 2.1 pEAQ bằng phương pháp thẩm lọc A. tumefaciens …………. 34 Thẩm lọc nhờ A. tumefaciens vào lá N. benthamiana ……….. 34 Sơ đồ của chu kỳ chuyển pha nghịch đảo qua màng ………... 41 Chuyển gen tạm thời vào lá cây thuốc lá nhờ A. tumefaciens Hình 2.2 Hình 2.3 Hình 3.1 bằng phương pháp hút chân không ………………………….. 50 Sơ đồ thí nghiệm gây miễn dịch trên chuột …………………. 55 Sơ đồ thí nghiệm gây miễn dịch trên lợn ……………………. 56 Thiết kế vector tách dòng pRTRA 35S-m-Histag-Cmyc- Hình 3.2 100xELP ……………………………………………………... 61 Sơ đồ cấu trúc cassette gen m mã hoá protein M dung hợp Hình 3.3 ELP............................................................................................ 62 Kết quả thiết kế vector chuyển gen pCB301 35S-m-Histag- Hình 3.4 Cmyc-100xELP ……………………………………………… 63 Phân tích sản phẩm Colony-PCR kiểm tra A. tumefaciens 65 Hình 3.5 mang vector pCB301 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP ……….. Thiết kế vector tách dòng pRTRA 35S-gp5opt-Histag-Cmyc- 66 Hình 3.6 100xELP ……………………………... Sơ đồ cấu trúc cassette gen gp5opt mã hoá protein GP5 dung hợp ELP ……………………………………………………... Kết quả thiết kế vector chuyển gen pCB301 35S-gp5opt- 67 Hình 3.7 Hình 3.8 Histag-Cmyc-100xELP ……………………………………… 68 Sản phẩm Colony-PCR kiểm tra A.tumefaciens mang vector Hình 3.9 pCB301 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP ……………….. 69 Thiết kế vector nhân dòng pRTRA 35S-gp5ecto-m-Histag- Cmyc-100xELP ………………..………… Hình 3.10 Sơ đồ cấu trúc cassette gen gp5ecto-m mã hoá protein 9 9 12 13 14 70 GP5ectoM dung hợp ELP trong vector pRTRA ……………… 72 Hình 3.11 Kết quả phân tích kiểm tra vector chuyển gen mang gen gp5ecto-m mã hóa kháng nguyên GP5ecto-M dung hợp ELP…..………………..………………..………………..……. Hình 3.12 Sản phẩm Colony-PCR kiểm tra A.tumefaciens mang vector 72 chuyển gen pCB301 35S-gp5ecto-m-Histag-CmycHình 3.13 100xELP…..………………..………………..……………….. 73 Anh hưởng của vector hỗ trợ pBI-35S-2bCMV và pIBT-35SHC-Pro PVY đến mức độ biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp thông qua kết quả lai Western sử dụng kháng thể kháng C- myc .. ………………..………………..………………..…….. 76 viii Hình 3.14 Anh hưởng của nồng độ AS đến sự biểu hiện của các protein tái tổ hợp được xác định bằng Western blot sử dụng kháng thể ix ix 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine reproductive and respiratory syndrome – PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trên lợn do virus gây ra. Ở Việt Nam, bệnh còn được gọi là “Bệnh lợn tai xanh” (theo ngôn ngữ đại chúng) do lợn mắc bệnh thường bị xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm, sau tím xanh. PRRS gây thiệt hại kinh tế rất lớn ở những nước có bệnh. PRRS được phát hiện ở Mỹ vào năm 1987. Hàng năm nước Mỹ phải chịu những thiệt hại do bệnh này ước tính khoảng 664 triệu USD cho việc tiêu huy lợn chết, lợn ốm, chi phí chống dịch và xử lý môi trường. Ở Việt Nam, dịch PRRS do virus thể độc lực cao xuất hiện lần đầu tiên vào năm 2007. Từ đó đến nay, dịch đã xuất hiện ở hầu hết các địa phương trong cả nước. Theo thống kê của Cục Thú y, từ cuối tháng 4/2016 đến tháng 11/2016, đã xuất hiện 14 ổ dịch PRRS tại 8 huyện của 4 tỉnh là Quảng Trị, Hậu Giang, Nghệ An và Hà Tĩnh, làm 3.433 con lợn mắc bệnh, trong đó có 1.242 con lợn bị tiêu huy. PRRS đã ảnh hưởng nặng nề tới ngành chăn nuôi lợn trong nước. Bệnh vẫn xuất hiện ở một số địa phương và có tính chất 2-3 năm một lần. Điều này cũng cho thấy nguy cơ xuất hiện trở lại của dịch bệnh này trong thời gian tới. Hiện nay, các vaccine phòng PRRS chủ yếu là vaccine vô hoạt và nhược độc. Các vaccine vô hoạt thường an toàn nhưng khả năng bảo hộ thấp. Các vaccine nhược độc bảo hộ tốt hơn nhưng còn nhiều lo ngại về tính an toàn của các loaị vaccine này. Vaccine nhược độc có thể giảm dần mức bảo hộ do giảm mức tương đồng với chủng mới (nếu có) và bản thân virus vaccine sau nhiều lần truyền nhiễm cũng có thể đột biến trở thành cường độc. Mặc dù vậy, phòng chống PRRS tại Việt Nam đã đạt hiệu quả cao. Hiện nay, dịch chỉ xuất hiện lẻ tẻ, trong những năm gần đây hầu như không có dịch, một phần là nhờ biện pháp chủ động tiêm phòng cho lợn. Virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn ở nước ta hiện nay được xác định là thể độc lực cao và chưa có thuốc đặc trị. Việc phòng chống dịch chủ yếu vẫn là tiêm phòng vaccine kết hợp các biện pháp thú y (Tiêu độc khử 2 trùng, vệ sinh truồng trại, cách ly và tiêu huy lợn bệnh ...). Để phòng chống virus thể độc lực cao đang lưu hành tại Việt Nam cần phải có thêm vaccine phù hợp. Nhu cầu về các loại vaccine PRRS thế hệ mới trong đó có vaccine tiểu đơn vị, an toàn và hiệu quả là vấn đề cấp thiết. Protein GP5 và M là những protein cấu trúc chính của virus PRRS (PRRSV) được lựa chọn là những ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểu đơn vị chống PRRSV. Các kháng thể kháng GP5 và M ở lợn là các kháng thể có khả năng trung hoà PRRSV. Sự kết hợp đoạn peptit miền ngoài của kháng nguyên GP5 (Ectodomain, GP5ecto) được cho là chứa các epitope trung hoà của GP5 với protein M với mong muốn sẽ tạo được protein tái tổ hợp heterodimer GP5ectoM có khả năng kích thích tạo đáp ứng miễn dịch mạnh và trở thành một trong những ứng viên tiềm năng làm nguyên liệu để phát triển sản xuất vaccine chống PRRSV. Kháng nguyên của virus PRRS có thể được sản xuất trong hệ thống thực vật nhằm phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS thông qua phương pháp biểu hiện gen tạm thời. Hệ thống biểu hiện gen tạm thời ở thực vật bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium nhằm sản xuất kháng nguyên có nhiều ưu điểm như: Mức độ biểu hiện kháng nguyên cao, có thể sản xuất protein với số lượng lớn, phương pháp thực hiện đơn giản, thời gian nhanh, không bị ảnh hưởng bởi vị trí gắn gen đích trong tế bào thực vật và có thể tiến hành biểu hiện trong các mô đã biệt hóa hoàn toàn như lá, cung cấp kháng nguyên cho mục đích sản xuất vaccine chống chủng virus mới xuất hiện một cách nhanh chóng khi dịch bệnh xảy ra. Căn cứ vào các luận cứ khoa học và tình hình thực tiễn nêu trên, luận án được thực hiện với đề tài “Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium” với mục đích tạo cơ sở khoa học và thực nghiệm để biểu hiện các gen mã hoá kháng nguyên của chủng virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn đang lưu hành ở 3 Việt Nam bằng phương pháp biểu hiện gen tạm thời trong thực vật phục vụ cho định hướng phát triển sản xuất vaccine thế hệ mới. 2. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp M/GP5/GP5ectoM của chủng virus PRRS (PRRSV) đang gây bệnh lợn tai xanh ở Việt Nam bằng công nghệ biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá phục vụ cho định hướng phát triển vaccine thế hệ mới. Mục tiêu cụ thể  Thiết kế được 3 cấu trúc vector chuyển gen mang gen m, gp5optimize (gp5opt) và gp5ecto-m của chủng virus thể độc lực cao gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn dưới sự điều khiển biểu hiện bởi promoter CaMV 35S.  Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá 3 loại kháng nguyên M, GP5 và GP5ectoM của chủng PRRSV thể độc lực cao trong lá cây thuốc lá và tinh sạch được kháng nguyên M, GP5 và GP5ectoM tái tổ hợp từ mô lá thuốc lá.  Đánh giá được tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp M, GP5 và GP5ectoM trên động vật thí nghiệm. 3. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang các gen m, gp5opt và gp5ecto-m mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP và tạo chủng Agrobacterium tumefaciens mang vector tương ứng. Nội dung 2: Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen m, gp5opt và gp5ecto-m ở lá cây thuốc lá Nicotiana benthamiana. Biểu hiện tạm thời và tinh sạch các kháng nguyên tái tổ hợp. Nội dung 3: Đánh giá tính sinh miễn dịch dịch thể của kháng nguyên MELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm. 4. Đong gop mơi của luận án Luận án đã tiến hành thực hiện nghiên cứu một cách tổng thể, từ việc thiết kế vector chuyển gen mang các gen mã hóa kháng nguyên của virus PRRS gây bệnh 4 lợn tai xanh, tối ưu các điều kiện biểu hiện gen tạm thời trong thực vật, biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm. Luận án là công trình nghiên cứu thành công đầu tiên tại Việt Nam về việc thiết kế vector chuyển gen và biểu hiện tạm thời các gen m/ gp5opt/ gp5ecto-m mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP của chủng virus PRRS gây bệnh lợn tai xanh đang lưu hành tại Việt Nam trong lá cây thuốc lá N. benthamiana bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium. Kết quả của luận án cũng đã chứng minh được các kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP có khả năng kích thích sinh kháng thể đặc hiệu kháng virus PRRS trên động vật thí nghiệm. Trong đó, kháng nguyên GP5ecto (vùng ngoại bào của GP5) dung hợp với kháng nguyên M (GP5ectoM-ELP) kích thích đáp ứng kháng thể đặc hiệu tốt hơn kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP riêng lẻ. Kháng nguyên GP5ectoM-ELP và GP5-ELP là hai ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểu đơn vị chống PRRSV thể độc lực cao đang gây bệnh ở Việt Nam. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp cơ sở khoa học quan trọng trong việc thiết kế các cấu trúc vector chuyển gen mang gen m/gp5opt/gp5ecto-m mã hóa cho các kháng nguyên tái tổ hợp M, GP5 và GP5ectoM của PRRSV dung hợp Elastin - like polypeptide (ELP); biểu hiện tạm thời kháng nguyên tái tổ hợp trên cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium; tách chiết, tinh sạch và đánh giá khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể của các kháng nguyên tái tổ hợp này trên động vật thí nghiệm. Kết quả đề tài luận án là bằng chứng khoa học về tiềm năng của việc sản xuất, phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS trong thực vật. Ý nghĩa thực tiễn Các cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen m/ gp5opt/ gp5ecto-m mã hóa các kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP của chủng virus PRRS đang lưu hành ở Việt Nam và các chủng A. tumefaciens mang các vector này có thể được sử dụng để nghiên cứu biểu hiện, sản xuất và phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS. 5 Quy trình biểu hiện gen tạm thời trên lá cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ A. tumefaciens với các điều kiện tối ưu của đề tài luận án có thể ứng dụng để sản xuất các kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP hoặc các protein tái tổ hợp khác. Kháng nguyên tái tổ hợp GP5-ELP và GP5ectoM-ELP được tạo ra trong đề tài luận án là hai ứng viên tiềm năng cho sản xuất vaccine tiểu đơn vị phòng bệnh lợn tai xanh ở Việt Nam. 6 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 1.1.1. Sơ lược tình hình dịch bệnh Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) còn được gọi là Bệnh lợn tai xanh (theo ngôn ngữ đại chúng), lần đầu tiên được phát hiện ở Mỹ vào năm 1987, với các biểu hiện bệnh ở cơ quan sinh sản và hô hấp. Lợn nái mắc hội chứng này bị sảy thai ở thai kỳ cuối, thai lưu, đẻ non, lợn con sinh ra yếu hoặc bị chết, ty lệ đẻ thấp, chậm động dục trở lại. Lợn con đang bú sữa hoặc lợn con đã cai sữa có biểu hiện rối loạn hô hấp nghiêm trọng. Sau đó, dịch PRRS đã lây lan nhanh sang nhiều quốc gia khác bao gồm: Canada (1988); Đức (1990); Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh (1991) và ở Pháp (1992) (Rossow, 1998). Đến năm 1991, nguyên nhân gây bệnh “bí hiểm” được xác định là do một loại virus RNA gây ra. Ngay sau đó, virus này cũng đã được phân lập ở Mỹ (Collins et al., 1992), Canada (Dea et al., 1992a,1992b) và nhiều nước trên thế giới. Năm 1992, hội nghị quốc tế về bệnh này được tổ chức tại St. Paul, Minnesota đã thống nhất tên gọi là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn PRRS và được tổ chức Thú y thế giới (OIE) công nhận. Từ đó, virus gây bệnh cũng được gọi là PRRSV. Tại Trung Quốc, PRRS xuất hiện từ những năm 1995, gây chết hàng loạt lợn bệnh. Năm 2006, PRRS lại bùng phát trong vòng ba tháng, làm trên 2 triệu lợn mắc bệnh, 400 nghìn con chết, ước tính ty lệ chết khoảng 20%. Bệnh có tốc độ lây lan nhanh, chỉ sau 3 - 5 ngày bệnh có thể lây ra toàn đàn, với biểu hiện sốt cao 40 420C, vì vậy năm 2006 bệnh này còn có tên là “bệnh sốt cao”. Năm 2007, dịch lại tiếp tục bùng phát, xảy ra ở 26/33 tỉnh với 257.000 con mắc, làm chết hơn 68.000 con, tiêu huy 175.000 con. Các chủng PRRSV thể độc lực thấp và thể độc lực cao thuộc dòng Bắc Mỹ đều đã được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm của lợn mắc bệnh. Từ đó đến nay, bệnh vẫn diễn biến phức tạp. Ở Philippines, PRRS xuất hiện từ năm 2006, trong năm 2007 có 18 ổ dịch, 13.542 con mắc, làm chết 1.743 con. Sau đó PRRS lan ra cả nước, gây ốm và chết lợn nái và lợn con theo mẹ (Cục Thú y, 2008). 7 Tại Thái Lan, PRRS xuất hiện vào năm 1989 bao gồm hai chủng thuộc dòng châu Âu và Bắc Mỹ. Các báo cáo cho thấy, từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các Châu lục trên thế giới đều có PRRSV lưu hành (ngoại trừ châu Úc và Newzeland) đã gây ra những thiệt hại lớn về kinh tế cho người chăn nuôi ở nhiều quốc gia trên khắp thế giới (Han et al., 2006). Ở Mỹ, hàng năm PRRS gây tổn thất ước tính thiệt hại lên đến 664 triệu USD/năm (Holtkamp et al., 2012). Tại Việt Nam, bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1996 trên đàn lợn giống 51 con nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam. Từ cuối 1996 đến đầu năm 2007, không có các thông báo về bệnh lâm sàng hoặc thiệt hại trực tiếp do PRRSV gây ra mà chỉ có thống kê về trường hợp dương tính với PRRSV của một số mẫu khi kiểm tra 478 mẫu huyết thanh của lợn tại Cần Thơ (Tô Long Thành, 2007). Cuối tháng 2/2007, bệnh xảy ra trên các đàn lợn tại Hải Dương được xác định do nhiễm PRRSV thể độc lực cao, là virus PRRS type II tương đồng 99% với các chủng của Trung Quốc (Feng et al., 2008). Cũng trong năm 2007, các trường hợp lợn mắc PRRS với ty lệ mắc và ty lệ chết cao lần đầu tiên được ghi nhận xảy ra tại Việt Nam (Cục Thú y, 2007). Dịch có xu hướng trầm trọng hơn do thường phát hiện vi khuẩn kế phát (Tiêu Quang An et al., 2011). Trong giai đoạn 2007-2012, dịch PRRS liên tục xảy ra trên diện rộng tại nhiều địa phương, đặc biệt trong các năm 2008, 2010 và 2012, đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho người chăn nuôi lợn, ảnh hưởng tiêu cực đến an sinh xã hội và gây ô nhiễm môi trường do phải tiêu hủy hàng trăm ngàn con lợn mắc bệnh và chết. Tháng 3/2008, bệnh tiếp tục bùng phát ở Thanh Hoá và Hà Tĩnh, đến tháng 7/2008 bệnh lây lan trên 17 tỉnh/thành phố, trong đó có các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi lợn trong nước (Đậu Ngọc Hào et al., 2008). Dịch có tính chất chu kỳ 2-3 năm một lần (Cục Thú y, 2011). Theo thống kê của Cục Thú y năm 2016 (Bảng 1.1), từ cuối tháng 4/2016 đến tháng 11/2016, đã xuất hiện 14 ổ dịch PRRS tại 8 huyện của 4 tỉnh là Quảng Trị, Hậu Giang, Nghệ An và Hà Tĩnh làm 3.433 con lợn mắc bệnh, trong đó có 1.242 con lợn tiêu huy. So với năm 2015, diện dịch có giảm nhẹ, nhưng số lợn mắc bệnh phải tiêu hủy là tăng cao hơn. Bệnh vẫn còn diễn biến phức tạp do sự biến chủng 8 nhanh chóng của virus PRRS và sự tồn tại của virus này trong các đàn lợn lành bệnh. Điều này cũng cho thấy nguy cơ bùng phát trở lại của dịch bệnh trong thời gian tới (Cục Thú y, 2016). Bảng 1.1: Tình hình dịch PRRS giai đoạn 2015 – 2016 Nội dung so sánh Số xã có dịch Số huyện có dịch Số tỉnh có dịch Số gia súc mắc bệnh, chết, tiêu hủy Năm 2015 Năm 2016 19 11 06 1.288 14 08 04 3.433 (Nguồn: Cục Thú y, 2016) 1.1.2. Bệnh tích của PRRS Trong cơ thể lợn bệnh, virus phá hủy đại thực bào làm giảm về số lượng và chức năng, dẫn đến suy giảm miễn dịch. Lợn bị mắc PRRS thường đi kèm nhiễm trùng các loại mầm bệnh kế phát khác như Dịch tả, tụ huyết trùng .v.v. Đối với PRRS, bệnh tích đặc trưng nhất là ở phổi. Phổi có hiện tượng viêm hoại tử, đặc trưng bởi những đám chắc, đặc. Trên các thuỳ phổi bị bệnh có màu xám đỏ, có mủ, chắc đặc. Mặt cắt ngang của các thuỳ phổi bệnh lồi ra, khô. Lợn bị viêm phế quản, phổi hóa mủ. Bệnh tích vi thể thấy phổi có hiện tượng dịch thẩm xuất và hiện tượng thâm nhiễm bạch cầu, trong phế nang chứa đầy dịch viêm, đại thực bào. Một số trường hợp hình thành tế bào khổng lồ nhiều nhân. Một bệnh tích khá đặc trưng ở phổi là hiện tượng phế nang bị nhăn và thấy có hiện tượng đại thực bào bị phân huy. Ở các bộ phận khác cũng có các dấu hiệu như xuất huyết trên da, thâm tím do chảy máu trong mô, lách nhồi máu, hóa gỗ và nhiều bọt khí. Thận có nhiều đốm máu, tim có nhiều dịch ở màng bao, gan hoại tử, chảy dịch màu trắng ngà. Các mạch máu não mềm và mỏng, hạch não rỉ máu. Hạch bạch huyết có những đốm xuất huyết. Ngoài bệnh tích ở phổi, một số bệnh tích khác thường gặp tùy theo tình trạng bội nhiễm như viêm màng bao tim, viêm màng phổi, viêm phúc mạc, viêm màng não khi ghép với Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis (Mateu và Diaz, 2007). 1.1.3. Virus PRRS 9 1.1.3.1. Đăc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại PRRSV Virus PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus, virus gây Hội trứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn – PRRSV) thuô ̣c chi Arterivirus, họ Arteriviridae, thuộc bộ Nidovirales, là virus RNA sợi đơn, dương có vỏ bao bọc (Lunney et al., 2016). PRRSV có hình dạng thay đổi từ hình oval đến hình cầu (Hình 1.1). PRRSV có vỏ bọc ngoài với đường kính của hạt virus từ 50 – 65 nm (trung bình là 55 nm). Phần lõi nucleocapsid có đường kính khoảng 40 nm, có cấu trúc đối xứng 20 mặt, được bao bọc bên ngoài bởi một lớp vỏ bọc. Hình 1.1. Đặc điểm hình thái của virus PRRS (Nguồn: https://www.prrs.com/en/prrs/virus/ và http://www.vemedim.com) Mặt ngoài virus nhẵn với vài điểm lồi lõm do các vùng ngoại bào (ectodomain) của các glycoprotein vỏ tạo thành, cách biệt với vỏ bọc khoảng 2 - 3 nm. Bên trong hạt virus là một vòng trống với đường kính trung bình khoảng 39 nm (Hình 1.2). Lớp lipit kép và phần lõi nucleocapsid cách nhau khoảng 3 nm. Lớp lõi nuclecapsid sắp xếp dạng xoắn, không đối xứng (Eric et al., 2013). Hình 1.2. Ảnh hiển vi điện tử của các hạt Arterivirus (Nguồn: A: Snijder et al., 1998; B, C: Spilman et al., 2009) (A): Hình ảnh hiển vi điện tử của các hạt PRRSV; (B): Các hạt PRRSV tinh khiết; (C): Hạt PRRSV điển hình với kích thước xác định.