Tài liệu Nghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật

1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Interleukine là một nhóm các cytokine tiết và các phân tử tín hiệu được tìm thấy đầu tiên trong các tế bào bạch cầu, đóng vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch. Chức năng của hệ thống miễn dịch ở người phụ thuộc chủ yếu vào các interleukine, thiếu hụt interleukin sẽ dẫn đến các bệnh tự miễn và thiếu hụt miễn dịch. Interleukine 7 (hIL-7) là một cytokine có vai trò chính trong sự tăng trưởng của các dòng tế bào B và T. Đây là những dòng tế bào có chức năng quan trọng trong hệ miễn dịch của con người, cũng là đích tấn công của các virus, mầm bệnh khi xâm nhập vào cơ thể con người. Trong y học ngày nay, các protein có hoạt tính sinh học được sử dụng rộng rãi để làm thuốc điều trị như các loại hormone, enzyme tái tổ hợp... Trước đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein này chủ yếu là tách chiết từ các bộ phận của động vật. Tuy nhiên, do nhu cầu ngày càng cao trong khi nguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá thành lại đắt và dễ nhiễm các mầm bệnh nguy hiểm cho con người, nên việc nghiên cứu tổng hợp protein tái tổ hợp được đặt ra một cách cấp thiết. Trong những thập niên gần đây, với những bước tiến lớn trong lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử, việc tổng hợp protein không còn khó khăn như trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học. Thực tế hiện nay phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi không những để tổng hợp một số loại protein làm thuốc như insulin, hormone v.v…. mà còn để tổng hợp rất nhiều hợp chất khác trong khi nguồn nguyên liệu hạn chế hoặc con đường tổng hợp hoá học gặp khó khăn. Hiện nay, biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật đang được quan tâm nghiên cứu vì những ưu điểm vượt trội so với các hệ thống biểu hiện khác như chúng có thể sinh trưởng trên môi trường tương đối đơn giản, protein được tiết ra môi trường nhiều hơn phần tích luỹ trong tế bào nên 2 việc thu hồi và tinh sạch dễ thực hiện, đặc biệt protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật an toàn cho con người hơn so với các protein có nguồn gốc từ các hệ thống nuôi cấy khác do các mầm bệnh và virus thực vật không phải là tác nhân gây bệnh ở người. Nhằm mục đích nâng cao chất lượng điều trị bệnh theo hướng sử dụng liệu pháp sinh học và góp phần hoàn thiện các phương pháp nghiên cứu sản xuất các cytokine nói chung và hIL-7 nói riêng một cách tối ưu. Căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương pháp khả thi, chúng tôi quyết định lựa chọn thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định được hệ thống nuôi cấy thực vật biểu hiện tối ưu protein hIL-7 tái tổ hợp. Thu nhận và tinh sạch được protein hIL-7 tái tổ hợp từ hệ thống nuôi cấy thực vật. 3. Nội dung nghiên cứu Đổi mã di truyền gen hIL-7 phù hợp biểu hiện ở hệ thống thực vật. Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa hIL-7 tái tổ hợp phù hợp với các hệ thống nuôi cấy thực vật. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật: huyền phù, rễ tơ và cây thuốc lá chuyển gen. Phân tích, kiểm tra và đánh giá chất lượng hIL-7 tái tổ hợp thu được qua hệ thống nuôi cấy thực vật. 4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của luận án 4.1. Ý nghĩa lý luận Luận án cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu về biểu hiện, sản xuất protein tái tổ hợp dùng trong y học ở thực vật thông qua biến đổi mã di truyền và các hệ thống nuôi cấy thực vật. 3 Nội dung luận án có thể được sử dụng làm tài liệu giảng dạy, tham khảo cho giảng viên và sinh viên các trường khối khoa học tự nhiên nói chung và sinh học nói riêng. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Luận án cung cấp quy trình biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp ở các hệ thống nuôi cấy dòng tế bào huyền phù BY2, rễ tơ, cây thuốc lá chuyển gen trong quy mô phòng thí nghiệm, phục vụ cho mục đích nuôi cấy thu sinh khối tế bào. Bước đầu đánh giá được hoạt tính sinh học của protein hIL-7 tái tổ hợp thu được sau khi tinh sạch ở các hệ thống nuôi cấy, là tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn. 5. Đóng góp mới của luận án Luận án đã thiết kế thành công 3 cấu trúc vector biểu hiện protein hIL-7 ở tế bào thuốc lá BY2, rễ tơ và cây thuốc lá chuyển gen. Đã biểu hiện thành công protein hIL-7 tái tổ hợp trong: dòng tế bào BY2, rễ tơ và cây thuốc lá chuyển gen. Trong đó, protein biểu hiện cao nhất ở cây thuốc lá chuyển gen 5 ngày tuổi với hàm lượng 36,7 ng/µg protein tan tổng số, có hoạt tính sinh học cao. Đây là công trình nghiên cứu mới ở Việt Nam và trên thế giới về biểu hiện protein hIL-7 trong hệ thống nuôi cấy thực vật. 6. Cấu trúc của luận án: Luận án có 157 trang kể cả tài liệu tham khảo được chia thành các chương, phần: Mở đầu (3 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (25 trang); Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (24 trang); Chương 3: Kết quả nghiên cứu (48 trang); Chương 4: Bàn luận kết quả nghiên cứu (8 trang); Kết luận và đề nghị (1 trang); Các công trình công bố liên quan đến luận án (1 trang); Summary (3 trang); Tài liệu tham khảo (26 trang); Phụ lục (7 trang). Luận án có 10 bảng; 39 hình và tham khảo 175 tài liệu. 4 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án đã tham khảo và tổng kết 175 tài liệu, trong đó có 8 tài liệu tiếng Việt, 164 tài liệu tiếng Anh và 3 địa chỉ trang web về 3 vấn đề cơ bản liên quan: (1). Vai trò của cytokine và interleukine 7 trong hệ miễn dịch ở người; (2). Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các loại cytokine tái tổ hợp trong y học; (3). Nghiên cứu biểu hiện hIL-7 tái tổ hợp trong hệ thống vi khuẩn, dòng tế bào BY2, rễ tơ và cây thuốc lá. Interleukine là một trong các nhóm chính của cytokine, đóng vai trò quan trọng nhất trong hệ miễn dịch của con người. Chúng có chức năng điều hoà miễn dịch, bao gồm cả phát triển tế bào, sự trưởng thành, di chuyển và bám dính. Ngoài ra, chúng còn có khả năng kích hoạt các phản ứng miễn dịch của cơ thể (Chad et al., 2010). Interleukine 7 gồm một chuỗi glycoprotein xoắn 4α, có khối lượng phân tử 17,4 kDa và được ổn định bằng gốc N - glycosyl hóa hoặc O - glycosyl hóa và cầu nối disulfide nội phân tử (Yoseph et al., 2016). Ở người, gen hIL-7 có kích thước 33Kb, gồm có 6 exon và 5 intron nằm trên nhiễm sắc thể số 8, ở vị trí 8q21.13. Hiện nay, việc nghiên cứu và sử dụng các loại cytokine tái tổ hợp đang mở ra một hướng điều trị tích cực mới trong y học. Hàng loạt các cytokine khác nhau đã được nghiên cứu, sản xuất và thử nghiệm trong điều trị lâm sàng như: hIL-2, hIL-7, IFN-, G-CSF, GM-CSF, hIL11 và EPO (Kwon et al., 2003). Các loại cytokine có vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu, do đó các hướng nghiên cứu hiện nay tập trung vào tác dụng điều trị của cytokine như là một tác nhân dược lý hoặc đích tác động đang được quan tâm nghiên cứu. Chính vì lý do đó nên yêu cầu cấp bách đặt ra là phải hoàn thiện các quy trình hệ thống thu nhận cytokine tái tổ hợp nói chung và interleukine 7 nói riêng, phục vụ trong y học. Các hệ thống biểu hiện protein thường được sử dụng như: hệ thống vi khuẩn, hệ thống biểu hiện tế bào huyền phù BY2, hệ thống biểu 5 hiện rễ tơ và hệ thống biểu hiện tạm thời ở thực vật. Trong đó, các hệ thống biểu hiện ở thực vật thể hiện khả năng ưu việt hơn so với các hệ thống khác do: khả năng tạo sinh khối, khả năng thu nhận protein tái tổ hợp, ít tốn công chăm sóc v.v… Đặc biệt là các mầm bệnh, virus thực vật không phải là đối tượng gây bệnh cho con người, nên rất phù hợp để biểu hiện các loại protein tái tổ hợp của người phục vụ trong y học Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU Luận án sử dụng dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum L. Cv Bright Yellow 2), cây thuốc lá N. benthamiana và N. tabacum K326 do phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp. Các chủng vi khuẩn E. coli DH-5α, A. tumefaciens, A. rhizogenes, E.coli Rosetta-gami B của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt nam cung cấp. Tế bào 2E8 do Ngân hàng tế bào Hoa Kỳ ATCC cung cấp. Các vector: pK7WG2D.1, pCB301, pRTRA 35S-TBAG-100xELP, pENTRTM221/cal nhận từ Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Hóa chất, các bộ KIT được sử dụng của các hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Promega… Các loại enzyme sử dụng của hãng Fermentas: BamHI, NcoI, HindIII, T4 ligase…Các thí nghiệm trong nghiên cứu của luận án được thực hiện tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng thí nghiệm trọng điểm về Công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Luận án hoàn thành tại Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phương pháp thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện protein ở thực vật 6 Khai thác trình tự nucleotide và trình tự mRNA. Tiến hành thay các codon hiếm trong gen hIL-7 bằng các codon phổ biến trong thực vật. Thêm trình tự cmyc, histag, các vị trí nhận biết enzyme giới hạn vào trình tự. Sử dụng BioEdit kiểm tra trình tự nucleotide và trình tự acid amin trước và sau khi đổi mã. 2.3.2. Thiết kế vector chuyển gen mang gen hIL-7 tái tổ hợp Trong nội dung luận án, chúng tôi thiết kế các vector chuyển gen: (1). pET32c(+)/IL7; (2). pENTR221/cal/IL7; (3). pK7WG2D.1/cal/IL7; (4). pRTRA 35S-IL7-cmyc-histag-100xELP; (5). pCB301 35S/IL7cmyc-histag-100xELP. 2.3.3. Phương pháp biểu hiện gen ở vi khuẩn, tạo dòng tế bào thuốc lá BY-2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá Phương pháp chuyển gen vào vi khuẩn, dòng tế bào BY2 và rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá được thực hiện gián tiếp thông qua A. tumefaciens và A. rhizogene theo phương pháp của Topping (1998) 2.2.4. Nhóm phương pháp phân tích dòng chuyển gen 2.2.4.1. Phân tích các chỉ tiêu sinh lý của dòng chuyển gen Các chỉ tiêu sinh lý của các dòng tế bào chuyển gen BY2 và rễ tơ chuyển gen được đánh giá thông qua các chỉ số khối lượng tươi và khối lượng khô được nuôi cấy trong môi trường lỏng. Quá trình đánh giá được thực hiện theo phương pháp của Phạm Bích Ngọc năm 2009 (Ngoc et al., 2009). 2.2.4.2. Phân tích dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR, xác định protein tái tổ hợp bằng lai miễn dịch Western blot. Phân tích biểu hiện protein bằng điện di protein theo Laemmli (1970) và Western blot. Định lượng protein hIL-7 tái tổ hợp bằng ELISA theo phương pháp của Sun và cs (2006). Protein được tinh sạch theo phương pháp IMAC và mITC và được đánh giá hoạt tính sinh học bằng dòng tế bào 2E8. 7 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện ở thực vật Sử dụng trình tự gen hIL-7 được công bố trên Ngân hàng Gen có mã số: J04156.1 và bảng tần suất các codon phổ biến ở thực vật (Codon Usage Database) cùng với phần mềm Codon Optimization 2.0 để loại bỏ và thay thế khoảng 10% các codon hiếm trong gen hIL-7 bằng các codon phổ biến trong thực vật mà không làm thay đổi thành phần và trật tự các acid amin. Sử dụng công cụ Graphical Codon Usage Analyzer kiểm tra mức độ phù hợp của các codon trên gen hIL-7 trước và sau cải biến mã di truyền. Ngoài ra, chúng tôi cũng tiến hành loại bỏ trình tự ATTTA trên gen hIL-7 được cho là gây bất ổn trong quá trình phiên mã mRNA (Hood et al, 2002), kết hợp sử dụng phần mềm của Invitrogen để giảm thiểu sự hình thành cấu trúc mRNA thứ cấp. Kết quả chúng tôi đã thay đổi thành công mã di truyền của gen hIL-7 với độ tương đồng nucleotide so với trình tự gen gốc là 63,6 %, độ tương đồng acid amin là 100%. Ngoài ra, các trình tự nhận biết của enzyme giới hạn NcoI, SacI, HindIII, các trình tự nucleotide mã hóa cho protein c-myc và epitope his-tag được thêm vào đầu 5’ và 3’ của gen hIL-7. Trình tự nucleotide sau khi tối ưu có kích thước 536bp, được đặt tổng hợp tại hãng Epoch Life Science (Hoa Kỳ) và được nhân dòng trong vector pBSK/IL7. 3.2. Thiết kế vector chuyển gen hIL-7 tái tổ hợp vào vi khuẩn, dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá 3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen pET32c(+)/IL7 Sử dụng cặp enzyme giới hạn NcoI và HindIII để cắt đồng thời vector tách dòng pBSK/IL7 và vector pET32c(+) để tạo đầu dính sole, sản phẩm cắt được kiểm tra trên gel agarose 0,8% (Hình 3.5.A) Kết quả ở hình 3.5.A cho thấy ở đường chạy 1 thu được băng có kích thước khoảng 5,9 kb tương ứng với kích thước lý thuyết của vector 8 pET32c(+); tại đường chạy 2 xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 2,9 kb và 0,53 kb tương ứng với kích thước của vector pBSK và gen hIL-7. Ghép nối gen interleukin 7 vào vector pET32c(+) sẽ thu được vector tái tổ hợp pET32c(+)/IL7 có kích thước khoảng 6,43 kb và được nhân dòng trong E.coli DH5α. Kiểm tra sự có mặt của vector pET32c(+)/IL7 tái tổ hợp bằng colony PCR với cặp mồi IL7_F và IL7_R và bằng phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn NcoI và HindIII. Kết quả trên hình 3.5.B và 3.5.C; ở đường chạy 1 hình 3.5.B xuất hiện một băng đặc hiệu có kích thước khoảng 0,53 kb, còn ở đường chạy 1 hình 3.5.C xuất hiện hai băng có kích thước khoảng 0,53 kb và 5,9 kb. Các kết quả này chứng tỏ vector chuyển gen pET32c(+)/IL7 đã được thiết kế thành công. Cấu trúc này sẽ được biến nạp vào vi khuẩn E.coli rosetta gami B để biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp. A C B Hình 3.3. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pET32c(+)/IL7 (A). Kết quả điện di sản phẩm cắt mở vòng pET32c(+)(đường chạy 1) và vector pBSK/IL7 (đường chạy 2) bằng cặp enzyme NcoI và HindIII; (B). Kết quả điện di sản phẩm colony PCR pET32c(+)/IL7 bằng cặp mồi IL7_F và IL7_R, (-). Đối chứng âm (pET32c(+)), (+). Đối chứng 9 dương (pBSK/IL7); (C). Kết quả diện di sản phẩm cắt vector pET32c(+)/IL7 bằng enzyme cắt giới hạn NcoI và HindIII; M. Thang DNA chuẩn 1kb. 3.2.2. Thiết kế vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7 Các bước thiết kế vector pENTR221/cal/IL7 tương tự như mục 3.2.1. Sử dụng enzyme cắt giới hạn SacI và HindIII để tạo đầu dính cho gen hIL-7 và vector pENTR221 để thực hiện phản ứng lai ghép, chúng tôi đã thiết kế thành công vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7. 3.2.3. Thiết kế vector chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7 Chúng tôi thực hiện phản ứng LR giữa plasmid tiếp nhận pENTR221/cal/IL7 và vector đích pK7WG2D.1 để tạo vector pK7WG2D.1/cal/IL7 tái tổ hợp bằng kỹ thuật Gateway. Kết quả chúng tôi đã thiết kế thành công vector pK7WG2D.1/cal/IL7. 3.2.4. Thiết kế vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP Các bước thiết kế vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag100xELP tương tự như mục 3.2.1. Sử dụng enzyme BamHI để tạo đầu dính giữa gen hIL-7 và vector pRTRA, chuẩn bị cho phản ứng lai ghép với enzyme xúc tác T4 ligase. Vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag100xELP được dòng hóa trong E.coli DH5α và A.tumefaciens. 3.2.5. Thiết kế vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP Plasmid pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP và pCB301 được xử lý đồng thời bằng enzyme cắt giới hạn HindIII và tiến hành lai ghép dưới sự xúc tác của enzyme T4 ligase. Kết quả chúng tôi đã thiết kế thành công vector chuyển gen pCB301/IL7. 3.3. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp 3.3.1. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong vi khuẩn Tiến hành nuôi cấy tế bào E. coli rosetta-gami B chứa plasmid tái tổ hợp trong hai môi trường LB chọn lọc có bổ sung IPTG với các nồng độ 0,2; 0,4; 0,6 mM ở hai mức nhiệt độ 280C và 370C. 10 Kết quả phân tích protein thể hiện trên hình 3.15, tại các đường chạy protein của các dòng E. coli rosetta-gami B mang plasmid pET32c(+)/IL7 cảm ứng IPTG xuất hiện băng có kích thước khoảng 37 kDa tương ứng với kích thước protein hIL-7 dung hợp với Thiodedoxin (Trx.tag), trình tự mã hóa cmyc-tag và his-tag. Trong khi đó, dòng đối chứng nuôi cấy ở 370C (đường chạy 1) và nuôi cấy ở 280C (đường chạy 5) không biểu hiện protein này. Hình 3.15. Kết quả kiểm tra khả năng biểu hiện hIL-7 từ vi khuẩn E. coli Rosetta gami B nuôi ở 37oC và 28oC 1 - 4: Nuôi cấy 370C; 1: không bổ sung IPTG, 2: 0,6 mM IPTG, 3: 0,4 mM IPTG, 4: 0,2 mM IPTG; 5 - 8: Muôi cấy 280C; 5: không bổ sung IPTG, 6: 0,6 mM IPTG, 7: 0,4 mM IPTG, 8: 0,2 mM IPTG; M: thang protein chuẩn (Fermentas) Chúng tôi xử lý các mẫu protein bằng DTT ở các nồng độ và nhiệt độ khác nhau, sau đó tiến hành lai miễn dịch Western blot để xác định chính xác protein biểu hiện có đúng là protein mong muốn. Độ nhạy của phản ứng lai Western blot được đánh giá bằng đối chứng dương là protein tái tổ hợp scFv có trình tự c-myc với nồng độ xác định là 50 ng/µl. Ngoài ra, chúng tôi có thể định lượng được lượng protein hIL-7 có trong mẫu khi so sánh mầu sắc các vạch mẫu với vạch đối chứng dương. Kết quả thể hiện trên hình 3.16 cho thấy trên các màng lai, ở đường chạy 11 protein số 2, 3, 4, 5, 6, 7 đều xuất hiện một băng màu đậm, rõ nét có kích thước đúng như tính toán lý thuyết, trong khi ở dòng đối chứng không có protein này. Hình 3.16. Kiểm tra biểu hiện protein hIL-7 pha tan bằng Western blot (-). Đối chứng âm: mẫu protein không cảm ứng IPTG; 1. Mẫu protein không xử lý DTT; 2, 3, 4, 5, 6, 7: mẫu protein xử lý DTT ở các điều kiện khác nhau; (+). Đối chứng dương: 150 ng protein scFv; M. Thang chuẩn protein (Fermentas). 3.3.2. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2 Sử dụng các dòng BY2 chuyển gen và một dòng không chuyển gen (đối chứng âm) sau 12 ngày nuôi cấy để tách protein tan tổng số, điện di trên gel 12,6% SDS polyacrylamide và tiến hành phản ứng Western blot để đánh giá chất lượng protein thông qua protein c-myc, phát hiện sự có mặt của protein hIL-7 bằng kháng thể kháng c-Myc. Độ nhạy của phản ứng Western blot được đánh giá bằng đối chứng dương là protein tái tổ hợp scFV có gắn đuôi c-Myc. Kết quả thể hiện trên hình 3.24 cho thấy, các băng protein ở các đường chạy rõ, sắc nét chứng tỏ protein thu được khá sạch, ít bị đứt gãy. Các dòng BY2 chuyển gen hIL-7 số 2, 3, 32 xuất hiện băng khoảng 23 kDa. Trong khi đó, dòng số 13, 39 không xuất hiện băng protein hIL-7 12 mặc dù kết quả kiểm tra bằng PCR cho kết quả dương tính; điều này có thể do hiện tượng gen chuyển không hoạt động (Sun et al., 2006). Hình 3.24. Kiểm tra sự biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong các dòng tế bào huyền phù BY2 bằng Western blot M. Thang protein chuẩn; (+). Đối chứng dương (protein scFv 150 ng); (-). Đối chứng âm (dòng tế bào BY2 hoang dại); 1 - 5: các dòng tế bào BY2 chuyển gen; Phản ứng lai sử dụng kháng thể anti c- myc Từ những kết quả trên cho thấy, chúng tôi đã thiết kế và biểu hiện thành công protein hIL-7 tái tổ hợp trong tế bào huyền phù BY2. Chúng tôi sử dụng kỹ thuật ELISA để đánh giá gián tiếp mức độ biểu hiện của protein hIL-7 trong các dòng BY2 chuyển gen dương tính khi kiểm tra bằng Western blot. Hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp gắn đuôi c-myc được tính toán dựa trên phương trình đường chuẩn của protein scFv gắn đuôi c-myc. Kết quả thể hiện trên hình 3.25. Hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp tích luỹ trong các tế bào huyền phù chuyển gene BY2 dao động từ 2,25 ng/µg đến 3,25 ng/µg protein tan tổng số. Tuy nhiên, mức độ tích luỹ protein hIL-7 tái tổ hợp còn khá thấp so với protein tổng số. Hàm lượng hIL-7 (ng/μg protein tổng số) 13 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 3 3.25 2.25 Dòng 2 Dòng 3 Dòng 32 Dòng BY2 chuyển gen Hình 3.25. Biểu đồ so sánh hàm lượng hIL-7 tái tổ hợp trong các dòng BY2 chuyển gen Hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp tích lũy trong các tế bào huyền phù chuyển gen BY2 dao động từ 2,25 ng/µg đến 3,25 ng/µg protein tan tổng số. 3.3.3. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng rễ tơ chuyển gen Chúng tôi sử dụng A.rhizogenes ATCC15834 để chuyển vector pK7WG2D.1/cal/IL7 vào mảnh lá thuốc lá để cảm ứng tạo rễ tơ chuyển gen. Sau qua trình chọn lọc, kiểm tra trên môi trường chứa kháng sinh và kỹ thuật PCR, đã chọn được những dòng rễ tơ sinh trưởng, phát triển tốt mang gen chuyển để đánh giá biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp. Sử dụng kỹ thuật Western blot để phân tích sự biểu hiện của protein hIL-7 ở 5 dòng rễ tơ chuyển gen. Kết quả thể hiện trên hình 3.30 Kết quả kiểm tra cho thấy, các dòng rễ tơ chuyển gen mã hóa protein hIL-7 đều xuất hiện một băng kích thước khoảng 23 kDa, tương ứng với kích thước protein hIL-7 gắn thêm c-myc và histag theo tính toán lý thuyết. Trong khi ở đường chạy đối chứng âm là dòng rễ tơ không chuyển gen không xuất hiện băng protein. Điều này cho thấy gen mã hóa protein hIL-7 đã được chuyển và biểu hiện thành công trong rễ tơ thuốc lá. 14 Hình 3.30. Kết quả biểu hiện protein hIL-7 các dòng rễ tơ bằng Western blot M. Thang protein chuẩn; 1 - 5: dòng rễ tơ chuyển gen; (+). Đối chứng dương (protein scFv 150 ng), (-). Đối chứng âm: dòng rễ tơ không chuyển gen. Phản ứng lai sử dụng kháng thể kháng c-myc Hàm lượng hIL-7 (ng/μg protein tổng số) 30 25 23.3 22 20 19.93 20 17.84 15 10 5 0 Dòng 1 Dòng 2 Dòng 3 Dòng 4 Dòng 5 Dòng rễ tơ chuyển gen Hình 3.31. Biểu đồ so sánh hàm lượng protein hIL-7 trong 5 dòng rễ tơ chuyển gen Chúng tôi sử dụng phương pháp ELISA để xác định hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp trong các dòng rễ tơ chuyển gen. Kết quả thể hiện ở hình 3.31 cho thấy, hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp thu nhận từ các dòng rễ tơ chuyển gen dao động từ 17,84 ng/µg đến 23,3 ng/µg 15 protein tan tổng số. Trong đó, biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp cao nhất là dòng 1, đạt 23,3 ng/µg protein tan tổng số, thấp nhất là dòng 5, đạt 17,84 ng/µg protein tan tổng số. Đặc biệt, hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp biểu hiện ở dòng 2 và dòng 4 không có sự khác biệt đáng kể. 3.3.4. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá bằng phương pháp Agro-infiltration Chúng tôi sử dụng chủng A.tumefaciens C58C1/pGV2260 mang vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP để biểu hiện tạm thời protein hIL-7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá bằng phương pháp Agroinfiltration. Sau 6 ngày biến nạp, tiến hành thu lá và bảo quản ở -80oC. Để kiểm tra sự biểu hiện của protein hIL-7 tái tổ hợp, chúng tôi tiến hành tách chiết protein tổng số và đo nồng độ theo phương pháp của Bradford (1976), sau đó sử dụng kỹ thuật lai miễn dịch Western blot trên các vị trí biểu hiện tạm thời ở lá non, lá bánh tẻ và lá già. Hình 3.35. Kiểm tra biểu hiện protein hIL-7 trong lá thuốc lá bằng Western blot M. Thang protein chuẩn (4 - 20% tris-glycine SDS-PAGE); 1. Lá non, 2. Lá bánh tẻ, 3. Lá già; (-). Đối chứng âm (lá thuốc lá không chuyển gen) Kết quả thể hiện trên hình 3.35 cho thấy ở các đường chạy 1, 2, 3 xuất hiện một băng có kích thước khoảng 64 kDa tương ứng với kích thước protein hIL-7 tái tổ hợp có gắn thêm protein cmyc, histag và ELP; trong 16 khi ở đường chạy đối chứng âm, cây thuốc lá không chuyển gen không xuất hiện băng này. 3.3.4.4. Phân tích định lượng và tinh sạch protein hIl-7 tái tổ hợp Sau khi biểu hiện thành công protein hIL-7 tái tổ hợp trong thuốc lá, chúng tôi tiến hành tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ion cố định kim loại (niken) để tinh sạch và định lượng protein hIL-7 tái tổ hợp. Đây là phương pháp hiệu quả để tinh sạch protein tái tổ hợp liên kết với his-tag. Phương pháp này dựa trên nguyên lý histidine tạo phức hợp với các kim loại hoá trị II (niken) ở nồng độ pH trung tính. Sự tương tác của protein liên kết his-tag với kim loại phụ thuộc vào nồng độ pH. Protein đích sau khi liên kết với cột tinh sạch, sẽ được hoà tan thu lại bằng cách giảm pH dung dịch hoặc tăng nồng độ của đệm ion hoặc nồng độ của đệm EDTA hoặc imidazole. Sau khi tinh sạch, chúng tôi kiểm tra sự biểu hiện của protein hIL-7 tái tổ hợp bằng điện di SDS-PAGE và phương pháp lai miễn dịch Western blot. Kết quả thể hiện trên hình 3.34 cho thấy, chúng tôi chỉ thu được một băng protein có kích thước khoảng 64 kDa, đúng theo tính toán lý thuyết. 64 Hình 3.36. Kết quả tinh sạch và định lượng protein hIL-7 bằng phương pháp IMAC (A). Điện di SDS-PAGE: 1A. Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP; 2A. Dịch chiết thu nhận sau khi đi qua cột tinh sạch; 3A. Protein hIL-7 sau tinh sạch 17 (B). Kết quả Western blot: 1B. Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP; 2B. Dịch chiết thu nhận sau khi đi qua cột tinh sạch; 3B. Protein hIL-7 sau tinh sạch (C). Định lượng protein hIL-7 bằng western blot và sử dụng phần mềm ImageJ: 1C, 2C, 3C, 4C: đối chứng dương có nồng độ 50, 100, 150, 200 ng/giếng, 5C. Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP trước xử lý, 6C. protein hIL-7 sau tinh sạch (30 µg protein tổng số/giếng). Sau khi tinh sạch theo phương pháp IMAC, nồng độ protein tổng số được định lượng theo phương pháp của Bradford và protein hIL-7 được định lượng bằng phần mềm ImageJ trên màng lai. Kết quả thu được 27,86 ng/µg protein tan tổng số. So sánh với một số nghiên cứu biểu hiện protein tạm thời khác thì sự biểu hiện của protein hIL-7 trong cây thuốc lá N. Benthamiana của chúng tôi là tương đối cao. Kết quả này cho thấy hiệu quả của phương pháp biểu hiện tạm thời và tinh sạch protein hIL-7 từ cây thuốc lá N. benthamiana trong thời gian ngắn, dễ thực hiện. Để có thể thu được protein hIL-7 tái tổ hợp với hàm lượng cao hơn, chúng tôi tiếp tục định lượng và tinh sạch bằng phương pháp mITC dựa trên đặc tính của sự gắn kết giữa ELP với protein đích hIL-7. Chúng tôi sử dụng 100 gam lá thuốc lá đã được biến nạp bằng phương pháp agroinfiltration để tinh sạch thu nhận protein hIL-7 tái tổ hợp theo phương pháp mITC. Kết quả trên hình 3.37 cho thấy, ở đường chạy 3 xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 64 kDa và 130 kDa (trạng thái dimer) của protein có gắn đuôi ELP; còn ở đường chạy 2 là dịch chiết protein ra khỏi màng lọc sau khi đưa dịch protein thô ban đầu qua màng không xuất hiện băng protein nào, điều này chứng tỏ protein IL7 có gắn đuôi ELP đã được giữ lại trên màng lai không bị rửa trôi cùng các protein khác. Ở đường chạy số 1 là dịch chiết sau khi rửa màng bằng nước milipore-Q lạnh ở nồng độ ion thấp chỉ có một băng protein có kích thước khoảng 64 kDa tương ứng với kích thước protein hIL-7 tái tổ hợp theo tính toán. 18 Hình 3.37. Kết quả tinh sạch protein hIL-7 bằng phương pháp mITC M. Thang protein chuẩn; 1. Protein hIL-7 tinh sạch sau khi rửa màng bằng nước lạnh; 2. Dịch chiết ra khỏi màng sau khi đưa dịch thô qua màng; 3. Dịch chiết protein chứa IL7/ELP trước tinh sạch Bảng 3.9. Hiệu suất thu hồi protein hIL-7 bằng phương pháp mITC Dịch chiết Protein Protein Hiệu suất Độ tinh protein tổng số (mg) tái tổ hợp (mg) thu hồi (%) sạch (%) Dịch thô 1634,7 38,3 100 X trước tinh sạch Dịch hIL-7 45,8 36,7 95,82 86,3 đã tinh sạch Từ kết quả xác định nồng độ protein cho thấy hiệu suất thu hồi protein hIL-7 bằng phương pháp mITC đạt 95,82 %, độ tinh sạch đạt 86,3%. Hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp trên protein hòa tan tổng số là 2,34%, kết quả này tương đương với những nghiên cứu trước đó về hàm 19 lượng protein tái tổ hợp trên protein hòa tan tổng số: 2% (Lamphear et al., 2004), (Streatfield et al., 2002); 2,2% (C.H.Ha et al, 2015); 3% (Gil, 2001). Hình 3.38. Kết quả định lượng protein hIL-7 tái tổ hợp bằng Western blot 1. Dịch chiết thô chứa protein IL7/ELP trước khi tinh sạch (30 µg/giếng); 2. Protein hIL-7 tách khỏi màng khi rửa màng bằng nước milipore-Q lạnh; 3, 4, 5, 6. Đối chứng dương với các nồng độ 200, 150, 100, 50 ng/giếng. Phương pháp gắn kết ELP vào protein đích tỏ ra có nhiều ưu điểm như dễ dàng thu nhận và tinh sạch protein tái tổ hợp nhờ tính chất đặc biệt của ELP, đồng thời hàm lượng protein tái tổ hợp thu được thường khá cao. Shoj và cộng sự (2009) đã thu nhận được 200 mg HA/kg lá tươi, Mortimer và cộng sự (2012) cũng thu nhận được 675 mg HA/kg lá tươi khi sản xuất kháng nguyên của virus cúm gia cầm H5N1 bằng phương pháp này. Trong nghiên cứu biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp gắn kết ELP, chúng tôi cũng đã thu nhận được 36,7 ng/µg protein tan tổng số. Kết quả này cho thấy sự biểu hiện tạm thời của protein hIL-7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá N. benthamiana khá cao, là cơ sở để chúng tôi tiến hành sản xuất lượng lớn protein hIL-7 tái tổ hợp phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng trong y học. 20 3.4. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein hIL-7 tái tổ hợp Để đánh giá hoạt tính sinh học của protein hIL-7 chúng tôi sử dụng mẫu protein hIL7 biểu hiện tạm thời ở cây thuốc lá bằng phương pháp agro-infiltration ở các nồng độ hIL-7 là: 0,125 µg/ml; 0,25 µg/ml; 0,5 µg/ml; 1 µg/ml; 1,5 µg/ml; 2 µg/ml; 2,5 µg/ml đối với khả năng hoạt hoá tế bào 2E8. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.10 và hình 3.39. Bảng 3.10. Kết quả hoạt hoá dòng tế bào 2E8 bằng protein interleukin 7 Mức độ hoạt hóa tế bào 2E8 (%) 35,7 45,3 53,3 63,8 73,6 82,5 79,3 0,35 Nồng độ protein hIL-7 0,125 µg/ml 0,25 µg/ml 0,5 µg/ml 1 µg/ml 1,5 µg/ml 2 µg/ml 2,5 µg/ml Giá trị ED50 (g/ml) 100 80 60 40 Protein IL-7 ở thực vật 20 0 0.125 0.25 0.5 1 1.5 2 2.5 Hình 3.39. Khả năng hoạt hóa dòng tế bào 2E8 của protein IL-7