Tài liệu Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (nigrofomes melanoporus (mont.) murrill) và nấm vân chi (trametes cubensis (mont.) sacc.) ở vùng bắc trung bộ

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN THỊ NGẦN NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ QUẢ THỂ NẤM ĐA NIÊN LỖ ĐEN (NIGROFOMES MELANOPORUS (MONT.) MURRILL) VÀ NẤM VÂN CHI (TRAMETES CUBENSIS (MONT.) SACC.) Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC Vinh - 2015 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN THỊ NGẦN NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ QUẢ THỂ NẤM ĐA NIÊN LỖ ĐEN (NIGROFOMES MELANOPORUS (MONT.) MURRILL) VÀ NẤM VÂN CHI (TRAMETES CUBENSIS (MONT.) SACC.) Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ Chuyên ngành : HOÁ HỮU CƠ Mã số: 62.44.2701 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS TRÀN ĐÌNH THẮNG GS. TS TIAN-SHUNG WU Vinh – 2015 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Vinh, ngày 20 tháng 10 năm 2015 Ký tên Nguyễn Thị Ngần ii LỜI CẢM ƠN Luận án được thực hiện tại các phòng thí nghiệm chuyên đề Hoá hữu cơ - khoa Hoá, Trung tâm Phân tích và Chuyển giao công nghệ Thực phẩm và Môi trường, Trường Đại học Vinh, khoa Hóa-Đại học Quốc gia Cheng Kung - Đài Nam, Đài Loan, Viện Hoá học-Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS. TS. Trần Đình Thắng - Trường Đại học Vinh và GS. TS. Tian-Shung Wu - Đại học Quốc gia ChengKung, Đài Nam, Đài Loan là người những thầy đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất, giúp tôi từng bước trong quá trình thực hiện luận án. PGS. TS Ping-Chung Kuo - Đại học Quốc gia Formosa, Đài Loan đã giúp đỡ trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Hoàng Văn Lựu đã tạo điều kiện thuận lợi, động viên tôi trong quá trình làm luận án. Tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn PGS. TS PingChung Kuo - Đại học Quốc gia Formosa, Đài Loan đã giúp đỡ trong quá trình thực hiện luận án. PGS. TS. Ngô Anh - Khoa Sinh, Trường Đại học Khoa học Huế đã giúp định danh các mẫu nấm. Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, khoa Hoá học, cán bộ phòng Đào tạo Sau đại học, các phòng ban chức năng của Trường Đại học Vinh, các thầy cô, các bạn đồng nghiệp, học viên cao học, sinh viên, gia đình và người thân đã động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này. Vinh, ngày 20 tháng 10 năm 2015 Nguyễn Thị Ngần iii MỤC LỤC Trang Mở đầu 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Đối tượng nghiên cứu 2 3. Nhiệm vụ nghiên cứu 2 4. Phương pháp nghiên cứu 3 5. Những đóng góp mới của luận án 3 6. Cấu trúc của luận án 4 Chương 1: Tổng quan 5 1.1. Những hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm lớn 5 1.1.1. Giới thiệu về nấm lớn 5 1.1.2. Những hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm lớn 6 1.1.2.1. Kháng khuẩn và kháng nấm 6 1.1.2.2. Khả năng kháng virut 13 1.1.2.3. Gây độc tế bào, chống ung thư và tăng cường hệ thống miễn dịch 16 1.1.2.4. Những hoạt tính khác 22 1.2. Nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) 25 1.2.1. Đặc điểm và sự phân bố 25 1.2.2. Thành phần hoá học và hoạt tính của các chất đã được phân lập 26 1.3. Nấm vân chi (Trametes cubensis) 26 1.3.1. Đặc điểm và sự phân bố 26 1.3.2. Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học 27 Chương 2: Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm 30 2.1. Phương pháp nghiên cứu 30 2.1.1. Phương pháp lấy mẫu 30 2.1.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các chất phân lập 30 iv được 2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất 30 2.1.4. Phuơng pháp thử hoạt tính sinh học 31 2.2. Hóa chất và thiết bị 31 2.2.1. Hoá chất 31 2.2.2. Thiết bị 31 2.2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) 31 2.2.2.2. Sắc ký cột (CC) 31 2.2.2.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 32 2.2.2.4. Phổ tử ngoại (UV) 32 2.2.2.5. Phổ hồng ngoại (FT-IR) 32 2.2.2.6. Phổ khối lượng (MS) 32 2.2.2.7. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 32 2.2.2.8. Phổ X-ray 32 2.2.2.9. Điểm nóng chảy 33 2.2.2.10. Độ quay cực riêng 33 2.3. Nghiên cứu các hợp chất từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes 33 melanoporus) 2.3.1. Mẫu nấm 33 2.3.2. Phân lập các hợp chất 33 2.3.3. Thử hoạt tính gây độc tế bào của 2 hợp chất NDM1, NDM2 36 2.3.4. Hằng số vật lý các hợp chất 37 2.3.4.1. Hợp chất NDM-1 (chất mới) 37 2.3.4.2. Hợp chất NDM-2 (chất mới) 38 2.3.4.3. Hợp chất NDM-3 39 2.3.4.4. Hợp chất NDM-4 39 2.3.4.5.Hợp chất NDM-5 40 2.3.4.6.Hợp chất NDM-6 40 v 2.3.4.7. Hợp chất NDM-7 41 2.3.4.8. Hợp chất NDM-8 42 2.3.4.9. Hợp chất NDM-9 42 2.3.4.10. Hợp chất NDM-10 43 2.3.4.11. Hợp chất NDM-11 43 2.4. Nghiên cứu các hợp chất từ quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) 44 2.4.1. Mẫu nấm 44 2.4.2. Phân lập các chất 44 2.4.3. Thử hoạt tính các hợp chất phân lập từ quả thể nâm vân chi 47 2.4.3.1. Thử hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất DQE-1 47 2.4.3.2. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật của hợp chất DQE-1 48 2.4.4. Hằng số vật lý của các hợp chất 49 2.4.4.1. Hợp chất DQE-1 (chất mới) 49 2.4.4.2. Hợp chất DQE-2(chất mới) 50 2.4.4.3. Hợp chất DQE-3 51 2.4.4.4. Hợp chất DQE-4 51 2.4.4.5. Hợp chất DQE-5 52 2.4.4.6. Hợp chất DQE-6 53 2.4.4.7. Hợp chất DQE-7 53 2.4.4.8. Hợp chất DQE-8 54 Chương 3: Kết qủa và thảo luận 55 3.1. Nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) 55 3.1.1. Mẫu nấm 55 3.1.2. Phân lập các hợp chất 55 3.1.3 Xác định cấu trúc các hợp chất 56 3.1.3.1. Hợp chất NDM-1 (chất mới) 56 3.1.3.2. Hợp chất NDM-2 (chất mới) 64 3.1.3.3. Hợp chất NDM-3 70 vi 3.1.3.4. Hợp chất NDM-4 71 3.1.3.5. Hợp chất NDM-5 72 3.1.3.6. Hợp chất NDM-6 74 3.1.3.7. Hợp chất NDM-7 76 3.1.3.8. Hợp chất NDM-8 78 3.1.3.9. Hợp chất NDM-9 80 3.1.3.10. Hợp chất NDM-10 83 3.1.3.11. Hợp chất NDM-11 83 3.1.4. Hoạt tính sinh học của các hợp chất nigrofomin A và nigrofomin B 85 3.2. Quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) 86 3.2.1. Mẫu nấm 86 3.2.2. Phân lập các hợp chất 86 3.2.3 Xác định cấu trúc các hợp chất 87 3.2.3.1. Hợp chất DQE-1 (chất mới) 89 3.2.3.2. Hợp chất DQE-2 (chất mới) 95 3.2.3.3. Hợp chất DQE-3 101 3.2.3.4. Hợp chất DQE-4 103 3.2.3.5. Hợp chất DQE-5 103 3.2.3.6. Hợp chất DQE-6 103 3.2.3.7. Hợp chất DQE-7 108 3.2.3.8. Hợp chất DQE-8 10 3.2.4. Hoạt tính sinh học của hợp chất tramecubin A (DQE-1) 111 Kết luận 116 Danh mục công trình công bố 118 Tài liệu tham khảo 119 Phụ lục 133 vii DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 3.1. Các hợp chất phân lập từ quả thể nấm đa niên lỗ đen 55 Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của hợp chất NDM-1 63 Bảng 3.3: Số liệu phổ NMR của hợp chất NDM-2 69 Bảng 3.4: Số liệu phổ 1H-NMR của chất NDM-3 70 Bảng 3.5: Số liệu phổ 1H-NMR của chất NDM-4 72 Bảng 3.6: Số liệu phổ NMR của chất NDM-5 73 Bảng 3.7: Số liệu phổ NMR của chất NDM-6 75 Bảng 3.8: Số liệu phổ NMR của hợp chất NDM-7 77 Bảng 3.9: Số liệu phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất NDM-8 79 Bảng 3.10: Số liệu phổ NMR của hợp chất NDM-9 81 Bảng 3.11: Số liệu phổ NMR của hợp chất NDM-11 84 Bảng 3.12: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất nigrofomin A và 85 nigrofomin B Bảng 3.13: Các hợp chất phân lập từ quả thể nấm vân chi 87 Bảng 3.14: Số liệu phổ NMR của hợp chất DQE-1 93 Bảng 3.15: Bảng dữ liệu phổ NMR của chất DQE-2 99 Bảng 3.16: Bảng dữ liệu phổ NMR của chất DQE-3 102 Bảng 3.17: Bảng dữ liệu phổ NMR của chất DQE-6 104 Bảng 3.18: Số liệu phổ NMR của hợp chất DQE-7 106 Bảng 3.19: Số liệu phổ NMR của hợp chất DQE-8 109 Bảng 3.20: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào 3 dòng ung thư của hợp chất 111 tramecubin A Bảng 3.21: Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật của hợp chất tramecubin A 112 viii DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1.1. Ảnh nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) 26 Hình 1.2. Ảnh nấm vân chi (Trametes cubensis) 27 Hình 3.1: Phổ ESI-MS của hợp chất NDM-1 56 Hình 3.2: Phổ HR-ESI-MS của hợp chất NDM-1 57 Hình 3.3: Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất NDM-1 57 Hình 3.4: Phổ 1H-NMR của hợp chất NDM-1 58 Hình 3.5: Phổ HSQC của hợp chất NDM-1 59 Hình 3.6: Sự tương tác xa HMBC (H→C) trong hợp chất NDM-1 60 Hình 3.7: Phổ HMBC của hợp chất NDM-1 60 Hình 3.8: Phổ NOESY của hợp chất NDM-1 61 Hình 3.9: Sự tương tác xa (H↔H) trong phổ NOESY của chất NDM-1 61 Hình 3.10: Cấu trúc X-ray của hợp chất NDM-1 62 Hình 3.11: Phổ ESI-MS của hợp chất NDM-2 64 Hình 3.12: Phổ HR-ESI-MS của hợp chất NDM-2 65 Hình 3.13: Phổ 13C-NMR và DEPT của chất NDM-2 66 Hình 3.14: Phổ 1H-NMR của chất NDM-2 66 Hình 3.15: Phổ HMBC của NDM-2 67 Hình 3.16: Phổ NOESY của NDM-2 68 Hình 3.17: Sự tương tác xa (H↔H) trong phổ NOESY của NDM-2 69 Hình 3.18: Tương tác xa HMBC (H  C) trong hợp chất NDM-5 73 Hình 3.19: Tương tác xa HMBC (H  C) trong hợp chất madolin A 77 Hình 3.20. Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất DQE-1 87 Hình 3.21. Phổ khối lượng HR-ESI-MS của hơp chất DQE-1 88 Hình 3.22: Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất DQE-1 89 ix Hình 3.23: Phổ 1H-NMR của hợp chất DQE-1 89 Hình 3.24: Phổ 1H-NMR của hợp chất DQE-1 90 Hình 3.25: Phổ HMBC của chất DQE-1 91 Hình 3.26: Phổ COSY của chất DQE-1 92 Hình 3.27: Phổ NOESY của chất DQE-1 92 Hình 3.28: Sự tương tác H→C trong phổ HMBC, H→H trong phổ COSY 93 của chất DQE-1 Hình 3.29: Phổ khối lượng ESI-MS của DQE-2 95 Hình 3.30: Phổ khối lượng HR-ESI-MS của DQE-2 95 Hình 3.31: Phổ 13C-NMR và DEPT của chất DQE-2 96 Hình 3.32: Phổ 13C-NMR và DEPT của chất DQE-2 97 Hình 3.33: Phố 1H-NMR của hợp chất DQE-2 97 Hình 3.34: Phổ HMBC của DQE-2 98 Hình 3.35: Phổ NOESY của DQE-2 99 Hình 3.36: Sự tương tác xa HMBC( H→C)của DQE-2 99 Hình 3.37: Sự tương tác H→C trong phổ HMBC của hợp chất DQE-6 104 Hình 3.38: Tương tác xa HMBC (H  C) của hợp chất DQE-7 106 Hình 3.39: Tương tác xa HMBC (H  C) của hợp chất DQE-8 109 x DANH SÁCH SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 2.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất (NDM) -1, -2, -3, -4, -8 và -9 35 Sơ đồ 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất (NDM) -7, -8, -9, -10, -11 36 Sơ đồ 2.3. Sơ đồ chiết quả thể nấm Trametes cubensis 45 Sơ đồ 2.4: Sơ đồ phân lập các hợp chất (DQE) -2, -6, -7, -8 46 Sơ đồ 2.5. Sơ đồ phân lập các hợp chất (DQE) -3, -4, -5 47 xi DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT CC: Column Chromatography (Sắc kí cột) FC: Flash Chromatography (Sắc ký cột nhanh) TLC: Thin Layer Chromatography (Sắc kí lớp mỏng) HPLC: High Performance Liquid Chromatography(Sắc ký lỏng cao áp) IR: Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại) MS: Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng) EI-MS: Electron Impact-Mass Spectroscopy (Phổ khối va chạm electron) ESI-MS: Electron Spray Impact-Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng phun mù electron) HR-ESI-MS: High Relution-Electron Spray Impact Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng phân giải cao phun mù electron) 1 H-NMR: Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) 13 C-NMR: Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13- cacbon) DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer. HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation NOESY: Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy s: singlet br s: singlet tù t: triplet d: dublet dd: dublet của duplet dt: doublet của triplet m: multiplet xii TMS: Tetramethylsilan DMSO: DiMethylSulfoxide Đ.n.c.: Điểm nóng chảy. EC50: Giá trị 50% các tế bào hoặc gốc tự do bị chết hoặc được tạo ra bởi DPPH được trung hòa. 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, thời tiết thuận lợi nên là một trong những quốc gia có sự đa dạng sinh học cao so với các quốc gia khác trên thế giới với khoảng 12000 loài thực vật bậc cao và 3000 loài động vật có xương sống đã được mô tả. Số loài nấm trên lãnh thổ Việt Nam ước lượng gấp 6 lần số loài thực vật bậc cao, khoảng 80.000 loài trong đó có 2500 loài nấm đã được định danh, nấm lớn chiếm 1400 loài thuộc 120 chi. Nấm đảm (Basidiomycota) chiếm ưu thế với hơn 90% tổng số loài, nấm nang (Ascomycota) chiếm 8%; nấm nhầy (Myxomycota) chiếm 1,5%; nấm nội cộng sinh (Glomeromycota) chiếm khoảng 0,5% đã được ghi nhận. Nấm dược liệu ở Việt Nam có khoảng hơn 700 loài trong đó có rất nhiều các loài dược liệu quý như Linh chi (Ganoderma), nấm Vân chi (Trametes), đông trùng hạ thảo (Cordycep)…[6, 31, 32]. Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật đã cho thấy nấm lớn là nguồn tài nguyên vô tận ẩn chứa các hợp chất có tác dụng dược liệu (polysaccarit, polysaccaritprotein..) dùng để điều trị bệnh [47]. Ở Việt Nam có ít nhất 651 loài thuộc 182 chi có chứa các hợp chất polysaccarit có tác dụng dược liệu [81], chúng hầu hết là các glucan với nhiều kiểu liên kết glucosit khác nhau, những hợp chất này có khả năng chống ung thư, diệt virut HIV hay hỗ trợ cho hệ miễn dịch của cơ thể con người [14, 16]. Ngoài những hợp chất có khối lượng lớn, những hợp chất chuyển hoá thứ cấp có khối lượng nhỏ như triterpenoit, flavonoit,…được phân lập từ nấm lớn, nhiều hợp chất đã được ghi nhận có khả năng kháng ung thư, kháng khối u, kháng virut hay kháng khuẩn, kháng nấm [126]. Nấm dược liệu ở Việt Nam phong phú, nhiều loài là thuốc quý trong y học cổ truyền, là nguồn tài nguyên vô cùng quý giá cho khoa học và thực tiễn nhưng chưa được các nhà khoa học nghiên cứu nhiều, chỉ chủ yếu nghiên cứu về sự đa dạng sinh học [2, 3, 4, 6, 8, 9]. Hợp chất thiên nhiên đang tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong chương trình tìm kiếm thuốc mới của ngành công nghiệp dược và những ngành nghiên cứu khác. Một lý 2 do quan trọng trong việc sử dụng các sản phẩm thiên nhiên như nguồn các hợp chất có vai trò là những chất lý tưởng vì chúng có cấu trúc rất đa dạng phong phú và hoạt tính rất thú vị. Hơn nũa, các hợp chất có hoạt tính sinh học được tìm thấy từ thiên nhiên có thể dùng trực tiếp trong y học, nhiều hợp chất khác được dùng như chất dẫn đường hoặc phân tử hiên đại (mẫu) trong lĩnh vực tổng hợp và bán tổng hợp thuốc. Ngày nay, các hợp chất thiên nhiên và dẫn xuất của chúng chiếm 50% lượng thuốc điều trị lâm sàng. Trong đó các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ thực vật bậc cao chiếm 25%. Theo các nghiên cứu gần đây của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) khoảng 80% dân số thế giới lựa chọn các bài thuốc y học cổ truyền nhằm chăm sóc sức khoẻ. Chúng tôi nhận thấy việc nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học của các loài nấm dược liệu rất cần thiết, giúp cho chúng ta hiểu hơn về giá trị dược học cũng như kinh tế và tầm quan trọng của nguồn nấm dược liệu ở nước ta. Chính vì vậy mà chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus (Mont.) Murrill) và nấm vân chi (Trametes cubensis (Mont.) Sacc.) ở vùng Bắc Trung Bộ” nhằm nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên bằng cách sử dụng các kỹ thuật hiện đại nhằm phân tích, phân lập và xác định cấu trúc hiện đại. Đồng thời, thử nghiệm hoạt tính sinh học gây độc tế bào ung thư và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các hợp chất này. 2. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của luận án là quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus (Mont.) Murrill) và quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis (Mont.) Sacc.) được thu hái ở vùng Bắc Trung Bộ Việt Nam. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Chiết hỗn hợp các chất từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) và quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis); - Sử dụng các phương pháp sắc ký để phân lập các hợp chất từ dịch chiết của hai loại nấm trên; - Xác định cấu trúc của những hợp chất phân lập được; - Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được. 3 4. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp lấy mẫu: mẫu sau khi lấy về được rửa sạch, sấy khô ở 400C. Việc xử lý tiếp các mẫu bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm. - Phương pháp phân tích, tách các hỗn hợp và phân lập các chất: sử dụng các phương pháp sắc ký cột thường (CC), sắc ký lớp mỏng phân tích và điều chế, sắc ký cột nhanh (FC) với các pha tĩnh khác nhau như silica gel, sephadex LH-20, RP18, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích và điều chế trên các pha đảo, pha silica gel. - Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất: cấu trúc hoá học các hợp chất được phân lập được xác định bằng các phương pháp vật lý hiện đại như phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS), phổ khối lượng phun mù electron (ESI-MS), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) với các kỹ thuật khác nhau như 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC và HMBC. - Cấu hình tương đối của các hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ NMR với các kỹ thuật NOE, NOESY và phương pháp nhiễu xạ tia X (X-Ray). - Thăm dò các hoạt tính sinh học gây độc tế bào ung thư và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm. 5. Những đóng góp mới của luận án Đây là công trình nghiên cứu về thành phần hoá học và cả về hoạt tính sinh học của một số chất phân lập được từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) và quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) lần đầu tiên ở Việt Nam. * Từ dịch chiết quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) đã phân lập và xác định cấu trúc 11 hợp chất: - 04 hợp chất secquiterpenoit: nigrofomin A, nigrofomin B, madolin A và dehydrovomifoliol. Nigrofomin A và nigrofomin B là các hợp chất mới; - 02 hợp chất steroit: ergosterol và ergosterol peroxit; - 03 hợp chất phenolic: trans-p-hydroxycoumaric, metyl ferulat và (2-hydroxy- phenyl) axetat; 4 - 01 hợp chất lacton: γ-(4-metyphenyl)-γ-metyl-γ-butyrolacton; - 01 hợp chất axit benzoic; Các hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ loài nấm này. * Xác định được các thông số cấu trúc tinh thể của hợp chất nigrofomin A. Các số liệu về tinh thể học của hợp chất này hiện được lưu trữ tại Trung tâm dữ liệu Cambridge. * Hai hợp chất nigrofomin A và nigrofomin B đều có khả năng gây độc các dòng tế bào bệnh bạch cầu cấp tính (Jurkat), ung thư biểu bì vòm họng ở người (NPCTW01), ung thư phổi (NCI-H661). * Từ dịch chiết quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) phân lập được 8 hợp chất: - 04 hợp chất triterpenoit: tramecubin A, tramecubin B, axit eburicoic, 3β- hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic. Tramecubin A và tramecubin B là các hợp chất mới; - 02 hợp chất steroit: ergosterol, ergosterol peroxit; - 02 hợp chất coumarin: oospolacton và oospoglycol; Các hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ loài nấm này. * Hợp chất mới tramecubin A và tramecubin B tiến hành thử hoạt tính khả năng gây độc tế bào ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (Lu), ung thư biểu mô liên kết (RD); hoạt tính kháng khuẩn với các chủng vi khuẩn Gr (-) (ATCC 25922), vi khuẩn Gr (+) (ATCC 25923); hoạt tính kháng nấm với chủng nấm sợi (439, M42), nấm men (ATCC 7754, SH 20) với các kết quả âm tính. Kết quả thử sơ bộ hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập gợi mở khả năng ứng dụng là nguồn nguyên liệu cho thực phẩm chức năng. 6. Cấu trúc của luận án Luận án bao gồm 119 trang với 19 bảng số liệu, 36 hình và 5 sơ đồ với 124 tài liệu tham khảo. Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan (28 trang), phương pháp và thực nghiệm (24 trang), kết quả và thảo luận (61 trang), kết luận (2 trang), danh mục công trình công bố (1 trang), tài liệu tham khảo (13 trang). Ngoài ra còn có phần phụ lục gồm 110 phổ của một số hợp chất chọn lọc. 5 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Những hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm lớn 1.1.1. Giới thiệu về nấm lớn Trong hàng ngàn năm qua, nấm được con người biết đến, sử dụng như một nhóm sinh vật quan trọng và phong phú trong lĩnh vực dược học, thực phẩm. Hiện nay, giới nấm chủ yếu gồm bốn ngành rộng, Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, và Basidiomycota, các chi thuộc giới nấm được tìm thấy đóng vai trò là một trong những nguồn đa dạng sinh học rộng bao gồm cả trên mặt đất và dưới nước, góp phần đặc biệt quan trọng trong sự hình thành hệ sinh thái học của hành tinh chúng ta. Số loài nấm trên lãnh thổ Việt Nam ước lượng gấp 6 lần số loài thực vật bậc cao, khoảng 80.000 loài trong đó có 2500 loài nấm đã được định danh, nấm lớn chiếm 1400 loài thuộc 120 chi. Nấm đảm (Basidiomycota) chiếm ưu thế với hơn 90% tổng số loài, nấm nang (Ascomycota) chiếm 8%; nấm nhầy (Myxomycota) chiếm 1,5%; nấm nội cộng sinh (Glomeromycota) chiếm khoảng 0,5% đã được ghi nhận [7, 45, 31, 32]. Theo thống kê của Trịnh Tam Kiệt, số loài nấm lớn Việt Nam là khoảng 22.000 loài trong đó khoảng 1.000 loài là nấm mục gỗ, 700 loài có giá trị làm thuốc. Từ xa xưa, người phương Đông đã biết dùng nhiều loài nấm để làm thuốc bổ, tăng cường thể lực, phòng chống bệnh tật như các loài nấm sau: Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis), phục linh, vân chi, linh chi, nấm hương… Những loài nấm này được sử dụng rộng rãi, với nhiều bài thuốc dân gian khác nhau nhằm điều trị nhiều loại bệnh. Trong những phương thuốc này, hai loài nấm C.sinesis, Ganoderma lucidum được xếp vào loại thuốc quan trọng [7, 31, 35, 90]. Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây cho thấy rằng lớp nấm nang, nấm sinh sản vô tính và nấm đảm là những loài nấm có khả năng sản sinh ra các sản phẩm chuyển hóa bậc hai có hoạt tính sinh học, quen thuộc nhất là từ các loài nấm thuộc các chi Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Trichoderma, Phoma, Alternaria, Acremonium, và Stachybotrys, Ganoderma, Lactarius và Aureobasidium [111]. 6 Số lượng các nghiên cứu được đầu tư công nghệ phân lập, phân loại nấm ngày càng nhiều, ngày càng hiện đại. Do đó, từ những năm 1990 đến nay, nhiều mẫu nấm lớn trên thế giới đã được tìm thấy, đặc biệt là nấm ký sinh côn trùng và nấm biển được chú ý như nguồn nguyên liệu mới, đa dạng có hiệu quả tốt nhằm cung cấp cho ngành dược liệu. Nấm lớn dược liệu có số lượng rất lớn, có sự đa dạng sinh học phong phú [15, 72]. 1.1.2. Những hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm lớn Trong lịch sử nghiên cứu về thành phần hoá học của nấm lớn, hợp chất chuyển hoá bậc hai được phân lập đầu tiên là từ nấm lớn là axit mycophenolic từ P.glaucoma được công bố bởi Gosio. Đến năm 1929, nhà bác học Alexander Fleming công bố hợp chất penicillin được phân lập từ nấm mốc Penicillium notatum, có khả năng kháng khuẩn hiệu quả được sử dụng rộng rãi trong chiến tranh thế giới lần thứ II. Đây là sự phát hiện vĩ đại, cho thấy con đường mới, quan trọng mở ra con đường mới cho việc tìm ra các loại thuốc trong y học hiện đại. Năm 1940, các chất chuyển hoá bậc hai từ nấm lớn mới thật sự được sự chú ý đặc biệt [125]. Từ đó đến nay, các nhà khoa học phân lập được khoảng hơn 8.600 hợp chất chuyển hoá bậc hai có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ các loài nấm lớn [111]. 1.1.2.1. Kháng khuẩn và kháng nấm Qua nghiên cứu của các nhà khoa học trong thời gian gần đây thì có hơn 75% các loài nấm lớn trên thế giới thể hiện khả năng kháng khuẩn [92]. Những hoạt tính này không chỉ liên quan đến các hợp chất chuyển hoá có khối lượng nhỏ mà còn liên quan đến những hợp chất có khối lượng lớn như polysaccarit… Nấm lớn, đặc biệt là họ Polyporaceae, Ganodermaceae có lịch sử lâu dài trong việc sử dụng làm thuốc, chẳng hạn như Fomes fomentarius sử dụng làm thuốc cầm máu, băng bó vết thương ở thế kỷ 18, 19 [8, 81]. Cho đến nay, nhiều nghiên cứu công bố cho thấy khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của các hợp chất phân lập từ các loài nấm lớn, chẳng hạn từ Ganoderma lucidum, Ganoderma resinoceum, Ganoderma pfeifferi thể hiện khả năng kháng khuẩn dòng Baccillus subtilis. Hợp chất ganomycin A (1) và ganomycin B (2) phân lập từ nấm Ganoderma pfeifferi có khả năng kháng nhiều dòng vi khuẩn như dòng Gram (+): B. subtilis, S. aureus, Micrococcus flavus [71].