Tài liệu Nghiên cứu cấu trúc của ulvan có hoạt tính sinh học từ rong lục ulva lactuca và ulva reticulata

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Quách Thị Minh Thu NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA ULVAN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ RONG LỤC ULVA LACTUCA VÀ ULVA RETICULATA LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Quách Thị Minh Thu NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA ULVAN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ RONG LỤC ULVA LACTUCA VÀ ULVA RETICULATA Chuyên ngành: Hóa lý thuyết và Hóa lý Mã sỗ: 62.44.01.19 LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS Thành Thị Thu Thủy 2. PGS.TS Trần Thị Thanh Vân Hà Nội - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Thành Thị Thu Thủy và PGS.TS Trần Thị Thanh Vân. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Quách Thị Minh Thu ii LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới tập thể cán bộ hướng dẫn khoa học PGS.TS Thành Thị Thu Thủy - Viện Hóa học và PGS.TS Trần Thị Thanh Vân – Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hai PGS là những người Thầy đã chia sẻ kinh nghiệm, hướng dẫn tôi cách tiếp cận với lĩnh vực khoa học chuyên sâu mà tôi đang theo đuổi, cũng như các vấn đề khác trong cuộc sống trong suốt thời gian thực hiện luận án. Đặc biệt, tôi xin cảm ơn Trung tâm Các phương pháp phổ ứng dụng - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện tốt nhất về thời gian cũng như trang thiết bị nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án của mình. Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Yuguchi Yoshiaki– Trường Đại học Điện -Truyền thông Osaka đã giúp thực hiện phép đo SAXS và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành công việc trong thời gian thực tập tại Nhật Bản. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hóa học, các anh chị phụ trách Đào tạo sau Đại học - Viện Hóa học và Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành các học phần của luận án và mọi thủ tục cần thiết. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè và những người thân luôn giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. TÁC GIẢ LUẬN ÁN Quách Thị Minh Thu iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................ ii MỤC LỤC .................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................ vi DANH MỤC HÌNH .................................................................................... viii DANH MỤC BẢNG ...................................................................................... x MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................... 3 1.1. Rong biển và sulfate polysaccharide từ rong biển ............................... 3 1.1.1. Phân loài rong biển ............................................................................ 3 1.1.2. Thành phần dinh dưỡng và ứng dụng của rong biển ........................... 6 1.1.3. Sulfate polysaccharide từ rong biển ................................................... 7 1.1.3.1. Sulfate polysaccharide từ rong nâu ............................................... 7 1.1.3.2. Sulfate polysaccharide từ rong đỏ ................................................. 8 1.1.3.3. Sulfate polysaccharide từ rong lục ................................................ 9 1.1.4. Rong lục chi Ulva và ulvan ............................................................ 12 1.1.4.1. Rong lục chi Ulva ....................................................................... 12 1.1.4.2. Thành phần và cấu trúc hóa học của ulvan.................................. 12 1.1.4.3. Các tính chất hóa lý của ulvan .................................................... 16 1.1.4.4. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của ulvan .................................. 18 1.2. Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc polysaccharide ...................... 22 1.2.1. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel GPC........................................... 22 1.2.2. Phương pháp phổ hồng ngoại IR ...................................................... 22 1.2.3. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR ........................... 23 1.2.4. Phương pháp phổ khối lượng MS..................................................... 27 1.2.5. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ SAXS ......................................... 28 1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước liên quan đến nội dung nghiên cứu của luận án. ................................................................. 30 iv 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ..................................................... 30 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................... 32 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM .................................................................... 38 2.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu ................................................................ 38 2.1.2. Phân tích thành phần hóa học của rong ............................................ 39 2.1.3. Chiết tách và tinh chế ulvan ............................................................. 42 2.1.4. Đánh giá hoạt tính sinh học .............................................................. 44 2.2. Xác định cấu trúc của ulvan ............................................................. 47 2.2.1. Phân tích thành phần hóa học của ulvan ........................................... 47 2.2.2. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) ........................................ 48 2.2.3. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) ................................................... 48 2.2.4. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ........................... 48 2.2.5. Phương pháp phổ khối lượng (MS) .................................................. 49 2.2.6. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) ...................................... 49 2.2.7. Phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM) ......................................... 49 2.3. Sulfate hóa và acetyl hóa mẫu ulvan tự nhiên ................................... 49 2.3.1. Sulfate hóa ....................................................................................... 49 2.3.2. Acetyl hóa ........................................................................................ 50 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 52 3.1. Lựa chọn mẫu nghiên cứu ................................................................ 52 3.1.1. Kết quả xác định thành phần hóa học của ulvan ............................... 52 3.1.2. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của ulvan .................................. 53 3.2. Xác định cấu trúc của ulvan ............................................................. 58 3.2.1. Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata (UR-H) ........................ 58 3.2.2. Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata (UR-N) ....................... 67 3.2.3. Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca (UL-N)........................... 82 3.2.4. Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca (UL-H) ............................ 92 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của sự sulfate hóa và acetyl hóa đến hoạt tính sinh học của ulvan ....................................................................................... 101 v 3.3.1. Ảnh hưởng của sự sulfate hóa ........................................................ 101 3.3.2. Ảnh hưởng của sự acetyl hóa ......................................................... 106 KẾT LUẬN CHUNG ................................................................................. 108 KIẾN NGHỊ ............................................................................................... 110 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ................................... 111 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 113 PHỤ LỤC .................................................................................................. 131 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu C- NMR 13 1 H- NMR AOAC COSY CS% DA DPPH DS ESI -MS Gal GlcA GPC HeLa Hep-G2 HMBC HSQC IC50 IdoA IR MALDI-MS Man MCF-7 MIC Mn Mw NOESY OD Rha SAXS SEM Tiếng Anh Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy Association of Official Analytical Chemist Correlation spectroscopy Cell survival % Degree of Acetyl 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl Degree of Sulfation Electron spray ionization mass spectrometry Galactose Glucuronic acid Gel Permeation Chromatography Henrietta lacks Human hepatocellular carcinoma Heteronuclear mutiple bond connectivity Heteronuclear single-quantum coherence Inhibitory concentration at 50% Iduronic acid Infrared spectroscopy Matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry Mannose Michigan cancer foundation-7 minimum inhibitory concentration Number average molecular mass Weight average molecular mass Nuclear Overhauser effect Spectroscopy Optical density Rhamnose Small Angle X-ray scattering Scanning Electron Microscope Diễn giải Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H Hiệp hội hóa học phân tích Phổ tương tác 2 chiều đồng hạt nhân 1H-1H % tế bào sống sót Mức độ acetyl hóa 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl Mức độ sulfate hóa Phổ khối lượng ion hóa phun mù điện Galactose Glucuronic acid Sắc ký thẩm thấu gel Dòng tế bào ung thư cổ tử cung Dòng tế bào ung thư gan người Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm Iduronic acid Phổ hồng ngoại Phổ khối lượng ion hóa khử hấp thụ nền laze Mannose Dòng tế bào ung thư vú người Nồng độ ức chế tối thiểu Khối lượng phân tử trung bình số Khối lượng phân tử trung bình khối Phổ tương tác không gian đồng hạt nhân 1H1 H Mật độ quang học Rhamnose Tán xạ tia X góc nhỏ Hiển vi điện tử quét vii SP UL-H UL-K UL-N UR-Ac UR-H UR-K UR-N UR-S UroA Xyl Sulfate polysaccharide Uronic acid Xylose Sulfate polysaccharide Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca Ulvan chiết kiềm từ rong lục Ulva lactuca Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca Ulvan acetyl hóa từ UR-N Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata Ulvan chiết kiềm từ rong lục Ulva reticulata Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata Ulvan sulfate hóa từ UR-N Uronic acid Xylose viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh về một số loài rong nâu ............................................................. 4 Hình 1.2. Hình ảnh về một số loài rong đỏ............................................................... 4 Hình 1.3. Hình ảnh về một số loài rong lục .............................................................. 5 Hình 1.4. Biểu đồ biểu thị sự phân bố các loài rong lục có sulfate polysaccharide [38]........................................................................................................................ 11 Hình 1.5. Cấu trúc chuỗi mạch chính trong ulvan [38] .......................................... 14 Hình 1.6. Cơ chế tạo hydrogel của ulvan qua Ca2+: hoặc a) của borate ester hoặc một phần của b) carboxylate hoặc một phần của c) sulfate [1, 51] ......................... 17 Hình 1.7. (a) Phổ 1H-NMR của hỗn hợp liên kết (13)(14)-β-D-glucan; (b) Phổ 13 C-NMR của hỗn hợp liên kết (13)(14)-β-D-glucan ...................................... 24 Hình 1.8. Độ dịch chuyển hóa học của các nhóm trong phân tử polysaccharide ..... 26 Hình 1.9. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate [111] ............................................. 28 Hình 1.10. Sơ đồ nguyên lý của một máy đo SAXS............................................... 29 Hình 1.11. Cấu trúc hóa học của ulvan từ rong lục Ulva pertusa ............................ 35 Hình 2.1. Hình ảnh của mẫu rong nghiên cứu ........................................................ 38 Hình 2.2. Quy trình chiết tách và tinh chế ulvan từ rong lục .................................. 43 Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của phần trăm tế bào sống sót ................. 56 vào nồng độ ulvan UL-N ....................................................................................... 56 Hình 3.2. Phổ IR của UR-H .................................................................................. 59 Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của UR-H........................................................................ 60 Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của UR-H....................................................................... 61 Hình 3.5. Phổ COSY của UR-H ........................................................................... 62 Hình 3.6. Phổ HSQC của UR-H ........................................................................... 62 Hình 3.7. Phổ HMBC của UR-H .......................................................................... 63 Hình 3.8. Phổ ESI-MS của UR-H ......................................................................... 65 Hình 3.9. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 243 ......................... 66 Hình 3.10. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 419 ........................ 67 Hình 3.11. Phổ IR của UR-N ................................................................................ 68 Hình 3.12. Phổ 1H-NMR của UR-N ...................................................................... 69 Hình 3.13. Phổ 13C-NMR của UR-N..................................................................... 70 Hình 3.14. Phổ COSY của UR-N .......................................................................... 71 Hình 3.15. Phổ HSQC của UR-N.......................................................................... 72 ix Hình 3.16. Phổ HMBC của UR-N ......................................................................... 73 Hình 3.17. Phổ ESI-MS của UR-N ....................................................................... 74 Hình 3.18. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 243......................... 75 Hình 3.19. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaUroASO3]- tại m/z 419 ............. 76 Hình 3.20. Sơ đồ phá mảnh của UR-N ................................................................... 77 Hình 3.21. Cấu trúc ulvan UR-N từ rong lục Ulva reticulata.................................. 78 Hình 3.22. Biểu đồ Kratky của dung dịch UR-N 1% trong nước............................ 78 và trong NaCl 0,5 M .............................................................................................. 78 Hình 3.23. Biểu đồ Guinier của dung dịch UR-N 1% trong nước........................... 79 và trong NaCl 0,5 M .............................................................................................. 79 Hình 3.24. a) Đơn vị cấu trúc để xây dựng mô hình cấu trúc phân tử, b) Mô hình cấu trúc phân tử của UR-N xây dựng dựa trên cấu trúc hóa học ............................. 81 Hình 3.25. Biểu đồ Kratky với các đường tán xạ từ thực nghiệm và từ mô hình cấu trúc phân tử. .......................................................................................................... 81 Hình 3.26. Phổ IR của UL-N ................................................................................ 83 Hình 3.27. Phổ 1H-NMR của UL-N ...................................................................... 84 Hình 3.28. Phổ 13C-NMR của UL-N ..................................................................... 85 Hình 3.29. Phổ COSY của UL-N .......................................................................... 86 Hình 3.30. Phổ HSQC của UL-N .......................................................................... 87 Hình 3.31. Phổ HMBC của UL-N ......................................................................... 88 Hình 3.32. Phổ ESI-MS của ulvan UL-N .............................................................. 90 Hình 3.33. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 243 ....................... 91 Hình 3.34. Phổ 1H-NMR của UL-H ...................................................................... 92 Hình 3.35. Phổ 13C-NMR của UL-H ..................................................................... 93 Hình 3.36. Phổ COSY của UL-H .......................................................................... 94 Hình 3.37. Phổ HSQC của UL-H .......................................................................... 95 Hình 3.38. Phổ HMBC của UL-H ......................................................................... 97 Hình 3.39. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 243........................ 99 Hình 3.40. Phổ IR của UR-N (a) và UR-S (b) ..................................................... 102 Hình 3.41. Phổ 13C-NMR của UR-N (a) và UR-S (b) .......................................... 103 Hình 3.42. Phổ HSQC của UR-N (a) và UR-S (b) ............................................... 103 Hình 3.43. Ảnh SEM của UR-N (a) và UR-S (b) ................................................. 104 Hình 3.44. Phổ 1H-NMR a) và 13C-NMR b) của UR-Ac ...................................... 106 Hình 3.45. Ảnh SEM của UR-N (a) và UR-Ac (b) ............................................... 107 x DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Phân loài rong lục trên thế giới có sulfate polysaccharide [38]............... 10 Bảng 1.2. Một số nhóm đặc trưng của phổ IR của polysaccharide từ rong biển...... 23 Bảng 1.3. Độ chuyển dịch hoá học δ (ppm) từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của dạng glucose và galactose [104] ..................................................................................... 25 Bảng 2.1. Thành phần hóa học của rong (% trọng lượng rong khô) ....................... 41 Bảng 2.2. Kết quả hiệu suất chiết tách 6 mẫu ulvan ............................................... 44 Bảng 3.1. Kết quả phân tích thành phần hóa học của 6 ulvan ................................. 52 Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của 6 mẫu ulvan ...... 53 Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của 4 mẫu ulvan ........................... 55 Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của 6 mẫu ulvan .......................... 57 Bảng 3.5. Kết quả xác định khối lượng phân tử của 4 mẫu ulvan .......................... 58 Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ IR của UR-H ..................................................... 59 Bảng 3.7. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UR-H ................................ 64 Bảng 3.8. Kết quả phân tích phổ IR của UR-N ..................................................... 68 Bảng 3.9. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UR-N ................................ 74 Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UL-N............................... 89 Bảng 3.11. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UL-H............................... 98 Bảng 3.12. Kết quả thử hoạt tính chống đông tụ máu của UR-N và UR-S .......... 105 1 MỞ ĐẦU Từ lâu con người đã khai thác rong biển làm nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp như dệt may, mỹ phẩm, dược phẩm và thực phẩm. Hàng năm, theo ước tính sản lượng rong biển của thế giới đạt 15 triệu tấn và dự tính khoảng 22 triệu tấn vào năm 2020. Polysaccharide là các polymer sinh học được tìm thấy trong tự nhiên trên cả thực vật và động vật, cả trên cạn và dưới nước, trong đó rong biển được xem là một nguồn cung cấp polysaccharide rất phong phú và đa dạng. Trên thế giới, các nhà khoa học đã xác định được khoảng 10 000 loài rong biển, chia làm 03 ngành rong chính dựa trên sắc tố của chúng là rong lục (Chlorophyte), rong nâu (Pheophyte) và rong đỏ (Rhodophyte). Rong lục được biết đến như là nguồn nguyên liệu để tách chiết các chất có hoạt tinh sinh học như lipid, protein, peptide, polysaccharide, carotenoid, hợp chất phenolic, alkaloid,… trong đó polysaccharide được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất do khả năng ứng dụng đa dạng của nó [1]. Việt Nam là đất nước có một vùng biển nhiệt đới rộng với bờ biển dài hơn 3000 km, là nguồn cung cấp các loài rong biển phong phú và đa dạng, rong lục với trữ lượng rất lớn lên tới 152 loài, chủ yếu thuộc về các chi Ulva, Caulerpa, Chaetomorpha, Enteromorpha, trong đó chi Ulva gồm 69 loài với hai loài phổ biến nhất là Ulva reticulata và Ulva lactuca. Rong lục chi Ulva phân bố rộng và mọc tự nhiên ven biển, được đánh giá giàu ulvan là một loại sulfate polysaccharide có nhiều hoạt tính sinh học như chống đông máu, chống oxy hóa, hạ mỡ máu, chống ung thư, kháng nấm… Do đó, việc sản xuất và ứng dụng các sản phẩm từ ulvan phục vụ cho mục đích chữa bệnh đang được chú ý. Ulvan là sulfate polysaccharide có trong rong lục chi Ulva và Enteromorpha. Cũng giống như các sulfate polysaccharide từ rong biển khác, ulvan có cấu trúc rất phức tạp, nó được cấu tạo bởi các thành phần chủ yếu là các đường rhamnose, xylose, các acid glucuronic, iduronic và nhóm sulfate. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ulvan phụ thuộc rất lớn vào loài rong, thời điểm thu hái, vị trí địa lý nơi rong sinh trưởng và điều kiện chiết tách. Do cấu trúc của ulvan từ rong lục rất phức tạp làm cho việc nghiên cứu cấu trúc gặp nhiều khó khăn, do đó cản trở sự phát triển của các sản phẩm thuốc chữa bệnh. Mặt khác, đã có nhiều nghiên cứu cho 2 thấy có mối liên hệ chặt chẽ giữa cấu trúc hóa học, cấu trúc không gian với hoạt tính sinh học của polysaccharide, do vậy việc nghiên cứu một cách tổng thể cấu trúc của ulvan là rất cần thiết và đòi hỏi phải có sự kết hợp một cách hợp lý của nhiều phương pháp. Hiện nay, một hướng nghiên cứu đang được quan tâm là điều chế các dẫn xuất của hợp chất thiên nhiên với mục đích nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố cấu trúc đến hoạt tính sinh học, từ đó có thể tạo ra các chất có hoạt tính sinh học cao hơn mẫu tự nhiên. Ở nước ta, polysaccharide chiết tách từ rong đỏ và rong nâu như carrageenan, alginate và fucoidan đã được nghiên cứu và thu được các kết quả tốt ứng dụng vào cuộc sống thì cho đến nay chưa có công bố nào về polysaccharide từ các loài thuộc ngành rong lục nói chung và ulvan từ chi Ulva nói riêng. Với các lý do nêu trên, chúng tôi chọn đề tài "Nghiên cứu cấu trúc của ulvan có hoạt tính sinh học từ rong lục Ulva lactuca và Ulva reticulata”, để nghiên cứu cấu trúc của ulvan-một polysaccharide có trong rong lục và tìm hiểu ảnh hưởng của sự biến tính hóa học đến cấu trúc và hoạt tính sinh học của ulvan nhằm góp phần hoàn thiện hướng nghiên cứu về polysaccharide từ rong biển và mở rộng khả năng ứng dụng của nguồn rong biển Việt Nam. Mục tiêu nghiên cứu của luận án:  Xác định cấu trúc của các ulvan có hoạt tính sinh học chiết tách từ 2 loài rong lục Ulva lactuca và Ulva reticulata.  Tìm hiểu ảnh hưởng của sự biến tính hóa học đến cấu trúc và hoạt tính sinh học của ulvan. Để đạt được mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của luận án gồm: 1. Thu thập 2 loài rong lục phổ biến nhất thuộc chi Ulva ở Việt Nam là Ulva reticulata và Ulva lactuca 2. Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học của ulvan tách chiết từ 2 loài rong trên. 3. Nghiên cứu cấu trúc của các ulvan có hoạt tính tốt. 4. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự biến tính hóa học (sulfate hóa và acetyl hóa) đến cấu trúc và hoạt tính sinh học của ulvan. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Rong biển và sulfate polysaccharide từ rong biển Rong biển hay tảo bẹ hay cỏ biển là loài thực vật sinh sống ở biển, thuộc nhóm tảo biển. Rong biển có thế sống ở cả hai môi trường nước mặn và nước lợ, chúng mọc trên các rạn san hô hoặc trên các vách đá, hoặc có thể mọc dưới tầng nước sâu với điều kiện có ánh sáng mặt trời chiếu tới để quang hợp. 1.1.1. Phân loài rong biển Trên thế giới, các nhà khoa học đã xác định được khoảng 10 000 loài rong biển và chia thành 3 ngành có giá trị kinh tế cao dựa vào màu sắc của chúng, bao gồm: rong đỏ có khoảng 6500 loài; rong nâu với khoảng 1800 loài và rong lục khoảng 1500 loài [2, 3]. So với các nước vùng Đông Nam Á, nước ta thuộc vào nước có nguồn rong biển đa dạng và phong phú [4, 5]. Các khảo sát điều tra cho thấy số lượng các loài rong biển tại các vùng biển như sau: Phú Quốc có 108 loài; Trường Sa 66 loài; Vịnh Hạ Long 99 loài; Cồn Cỏ 48 loài; Bạch Long Vĩ 46 loài. Riêng vùng Nha Trang có 210 loài. Năm 2003, tác giả Đàm Đức Tiến, Trần Đình Toại và CS cho biết riêng vùng ven biển Bắc Bộ đã có 259 loài [6, 7]. Với tổng số gần 800 loài rong tìm thấy ở vùng biển Việt Nam, các nhà khoa học Việt Nam cùng thống nhất xếp chúng vào 3 ngành trong hệ thống phân loại 10 ngành của Gollerbakh năm 1977 [8]: + Ngành rong đỏ (Rhodophyta) + Ngành rong nâu (Phaeophyta) + Ngành rong lục (Chlorophyta) Rong nâu: Là loài rong thường có kích thước lớn, loại lớn thường dài khoảng 20 mét, loài trung bình dài từ 2-4 mét, các loài nhỏ hơn dài từ 30–60 cm [2, 3]. Chúng chứa sắc tố xanthophyll-fucoxanthin cùng với chlorophyll a và c nên cá thể của rong nâu đều thể hiện màu nâu lục đặc trưng. Rong nâu là loài rong phổ biến nhất với trữ lượng lớn, khoảng 1800 loài, thường sinh trưởng ở vùng biển đá, nước biển lạnh thuộc bán cầu Bắc, chúng không chỉ mọc trên đá mà còn trên các chân đập, cầu cảng, san hô, động vật thân mềm và ngay cả trên các loài rong khác. 4 Rong nâu phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp đến là Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, Ấn Độ…. Trước đây, rong nâu được sử dụng để tách iodine và kalium. Trong thời gian gần đây, rong nâu được khai thác rộng rãi để chiết tách alginate và fucoidan. Hình 1.1 là ảnh của một số loài rong nâu. Sargassum microcystum Padina australis Hình 1.1. Hình ảnh về một số loài rong nâu Rong đỏ: Là loài rong có kích thước nhỏ hơn rong nâu, thường dài từ vài centimet đến hàng mét; tuy nhiên rong đỏ không luôn luôn có màu đỏ: thỉnh thoảng chúng có màu tím, thậm chí là nâu đỏ nhưng chúng vẫn được xếp vào ngành rong đỏ do những đặc tính khác như màu sắc của chúng là do các hạt sắc tố phycobilin tạo thành, phycobilin là sắc tố đặc trưng cho rong đỏ. Ngành rong đỏ có khoảng 6500 loài, gồm 400 chi thuộc nhiều họ. Phần lớn các loài rong đỏ sống ở biển, có cấu tạo từ nhiều tế bào, trừ một số ít thuộc dạng một tế bào hay quần thể. Rong đỏ có dạng hình trụ dẹp dài, phiến chia hoặc không chia nhánh, phần lớn chia nhánh kiểu một trục, một số ít theo kiểu hợp trục [2, 3, 9]. Hình 1.2 là ảnh của một số loài rong đỏ. Porphyra Vietnameusis Acanthophora spicifera Hình 1.2. Hình ảnh về một số loài rong đỏ 5 Rong đỏ phân bố nhiều ở Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Chile, Indonesia, Philippine tiếp đến là Thailand, Brazil, Pháp, Trung Quốc, Hawaii, Ấn Độ, Anh, Mỹ … Trên thế giới, rong đỏ được sử dụng với khối lượng lớn để phục vụ cuộc sống con người, một số loài có hàm lượng cao về agar, carageenan, furcellaran được sử dụng để chế biến keo rong biển và làm phụ gia thực phẩm. Các loài rong đỏ được chia thành hai nhóm chính [8]: - Nhóm rong cho agar (Agarophit): Bao gồm các loại như Gelidium, Gracilaria và Acanthopeltis. - Nhóm rong cho carrageenan (Carrageenophit): Bao gồm các loại như Gigartina, Eucheuma, Chondrus, Iridaea và Furcellaria. Rong lục: Là loài rong có kích thước nhỏ giống như rong đỏ, chúng bao gồm cả những loài đơn bào và đa bào. Rong lục chứa chlorophylls cả hai dạng a và b. Trên thế giới, rong lục phân bố chủ yếu tập trung tại Philipine, tiếp theo là Hàn Quốc, Indonesia, Nhật Bản và ít hơn là ở Việt Nam với các loài như Ulva reticulata, Ulva lactuca, Caulerpa racemosa, … Ngoài ra, rong lục còn phân bố rải rác ở các nước: Canada, Chile, Pháp, Israel, Italy, Malaysia, Achentina, Bangladesh… [2, 10]. Hình 1.3 là ảnh của một số loài rong lục. Hình 1.3. Hình ảnh về một số loài rong lục 6 1.1.2. Thành phần dinh dưỡng và ứng dụng của rong biển Từ lâu con người đã khai thác rong biển làm nguyên liệu cho rất nhiều ngành công nghiệp như thực phẩm, dệt may, mỹ phẩm, dược phẩm. Rong còn được dùng để làm phân bón, cung cấp nhiều K, Ca, P cho đất... [11]. Rong biển được coi là loại thực phẩm có giá trị cao, cả góc độ ẩm thực và dinh dưỡng. Tại các nước trong vùng châu Á - Thái Bình Dương, rong biển được tiêu thụ nhiều nhất, chiếm 80% tổng sản lượng toàn cầu, châu Âu chỉ tiêu thụ 1%, rong biển được dùng nhiều để nấu súp, làm sushi, trộn salad … [2, 3]. Thành phần hóa học của rong biển bao gồm lipid, protein, peptide, polysaccharide, carotenoid, các hợp chất phenolic, alkaloid... Trong đó, polysaccharide là thành phần chính của rong biển, được coi là nguồn đường vô tận của rong biển, được cho là rất có giá trị về mặt kinh tế và được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu nhiều nhất cho mục đích y học [3, 10]. Ngoài chức năng là làm vật liệu tạo nên thành tế tào, các polysaccharide giữ nhiều chức năng quan trọng khác đối với tế bào như trao đổi chất và bảo vệ tế bào do chúng có độ bền cơ học cao [12, 13]. Từ rong biển, người ta đã sản xuất ra rất nhiều loại sản phẩm mà tổng giá trị hàng năm được ước tính đạt cỡ 5,5-6,0 tỷ USD. Trong đó các polysaccharide đóng góp phần lớn giá trị của rong. Các sản phẩm mỹ phẩm, như kem bôi da, nước hoa (mỹ phẩm lỏng) mà trong nhãn của nó có chứa các cụm từ “marine extract”, “extract of alga”, “seaweed extract” hoặc tương tự, thường có nghĩa là nó chứa một trong số các hydrocolloid được chiết từ rong biển [14]. Các nghiên cứu về giá trị thành phần dinh dưỡng của rong biển [2, 11] cho thấy rong biển rất giàu dưỡng chất, ngoài thành phần đạm rất cao, rong biển còn chứa rất nhiều khoáng chất, các yếu tố vi lượng trong đó nổi bật là iodine (yếu tố vi lượng tối cần thiết cho tuyến giáp), các vitamin (A, E, C, B12 và B1) và chất xơ [1, 11]. Hàm lượng sinh tố A trong rong biển cao gấp 2 - 3 lần so với cà rốt, gấp 10 lần trong bơ, hàm lượng calcium cao gấp 3 lần so với sữa bò, vitamin B2 cao gấp 4 lần trong trứng, vitamin C, E cao gấp nhiều lần trong rau quả. Thực tiễn cho thấy rong biển còn có tiềm năng sử dụng trong xử lý nước thải. Một số loài rong biển có khả năng hấp thụ các ion kim loại nặng như: Zn và Cd từ nước bị ô nhiễm [3, 10]. Cũng do khả năng hấp thụ cao mà một số vi lượng 7 có trong rong khá cao nên rong còn được dùng làm thức ăn bổ sung để phòng bệnh thiếu một số chất như sắt, iodine….[3]. Polysaccharide từ rong biển có tính chất đặc biệt là dễ tạo gel, có độ nhớt cao rất dễ tạo màng nên chúng được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kinh tế như: công nghệ thực phẩm (chế biến thịt, sữa, làm bánh kẹo), làm thuốc đánh răng, dùng trong mỹ phẩm…ngoài ra chúng còn là nguồn nguyên liệu để làm dược phẩm [2, 10]. Do tính chất dễ tạo màng, có thể dùng polysaccharide tự nhiên để tạo màng polymer sinh học, khi sử dụng polysaccharide để làm vật liệu chế tạo màng sinh học, màng này giữ lại nhiều tính chất tốt của polysaccharide tự nhiên. …Một điều quan trọng là các phế thải của chúng (màng sau khi sử dụng) không gây ô nhiễm môi trường, vì các vật liệu này sau khi thải ra môi trường sẽ dần phân hủy bởi các hệ vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên [1]. Tại Hội nghị Bali về khí hậu trái đất, một nhóm nhà khoa học cho biết rong và rêu biển có thể là một vũ khí hữu hiệu chống lại sự ấm dần của trái đất do chúng có khả năng hút khí carbon dioxide trong khí quyển với một tốc độ tương đương với những cánh rừng nhiệt đới rộng lớn. Polysaccharide từ rong biển còn có tác dụng hấp thụ cholesterol thải ra ngoài cơ thể, khiến hàm lượng cholesterol trong máu duy trì ở mức cân bằng. Nhiều nghiên cứu khoa học trong thời gian gần đây cũng đã xác nhận, rong biển có tác dụng phòng chống virus và phòng chống ung thư [16, 17]. 1.1.3. Sulfate polysaccharide từ rong biển 1.1.3.1. Sulfate polysaccharide từ rong nâu Fucoidan là sulfate polysaccharide có trong rong nâu, fucoidan chiếm hàm lượng khoảng 0,6 - 4% trọng lượng rong khô và cấu trúc của nó thay đổi theo loài nhưng thành phần chính vẫn là đường fucose và nhóm sulfate [18]. Cấu trúc của fucoidan trong rong biển là vô cùng phức tạp và không giống nhau với những thay đổi trong liên kết, sự phân nhánh, vị trí nhóm sulfate và các loại đường đơn khác nhau [19, 20]. Cấu trúc của fucoidan còn phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng. Việc phân tích cấu trúc của các polysaccharide nói chung và fucoidan nói riêng là một trong những thách thức lớn trong hóa học các chất hữu cơ có gốc đường. Các fucoidan có cấu trúc phức tạp bao gồm nhiều vấn đề cần làm sáng tỏ 8 như thành phần các đường đơn, các dạng đồng phân của đường, mức độ phân nhánh và polymer hóa của chúng. Vì vậy, cho tới nay, việc làm sáng tỏ cấu trúc của chúng vẫn còn là vấn đề khó khăn, ngay cả khi sử dụng các kỹ thuật NMR phân giải cao mới nhất [21, 22]. Hiện nay phương pháp sử dụng phổ khối ion hóa phun mù điện (ESI-MS) đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm, ứng dụng trong nghiên cứu cấu trúc fucoidan [23, 24, 25]. Bằng phương pháp sắc ký, phổ IR và NMR đã cho các thông tin về thành phần đường, kiểu liên kết của các đường trong phân tử fucoidan, nhưng các thông tin về trật từ sắp xếp của các đường cũng như vị trí của nhóm sulfate trong phân tử vẫn chưa được xác định, do đó chưa giải thích được các đặc tính sinh học khác nhau của các phân đoạn fucoidan một cách rõ ràng và thuyết phục [18, 19]. Fucoidan có hoạt tính sinh học rất phong phú, nhiều hoạt tính sinh học quí báu như hoạt tính chống khối u, hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống đông tụ máu và hoạt tính chống lại các virus như HIV [26, 27, 28]. Ngoài ra, fucoidan còn được mô tả có nhiều tác dụng sinh học lý thú khác như tác dụng hạ cholesterol, giảm mỡ máu, giảm LDL-cholesterol, triglyceride máu, tăng HDL-cholesterol, ức chế miễn dịch nên có thể sử dụng fucoidan trong các trường hợp ghép phủ tạng … [29, 30]. 1.1.3.2. Sulfate polysaccharide từ rong đỏ Carrageenan là sulfate polysaccharide mạch thẳng, có khả năng tạo gel và làm đặc dung dịch. Carrageenan tồn tại trong một số rong đỏ thuộc họ Rhodophyceae. Hiện nay, carrageenan thường được chiết từ một số loài rong như Gigartina, Chondrus, Iridaea, Eucheuma [31]. Carrageenan được tạo thành từ các đường galactose mạch thẳng với hàm lượng sulfate khác nhau (trong khoảng 15%-40%). Các loại carrageenan khác nhau thì khác nhau về thành phần và cấu dạng, vì thế chúng tạo nên một khoảng biến đổi rộng các tính chất lưu biến cũng như các tính chất đặc biệt khác [32]. Cũng như các polysaccharide tự nhiên khác, carrageenan cũng không có khối lượng phân tử xác định. Carrageenan thương mại loại dùng trong ngành chế biến thực phẩm có khối lượng trung bình nằm trong khoảng 200 000 g/mol. Các tính chất của