Tài liệu Nghiên cứu công nghệ nuôi cấy và thu nhận tetrodotoxin từ một số chủng vi khuẩn phân lập từ cá nóc độc việt nam.

6 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bùi Thị Thu Hiền NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY VÀ THU NHẬN TETRODOTOXIN TỪ MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ NÓC ĐỘC VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bùi Thị Thu Hiền NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY VÀ THU NHẬN TETRODOTOXIN TỪ MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ NÓC ĐỘC VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 62 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. Khuất Hữu Thanh 2. GS. TS. Phạm Quốc Long Hà Nội – 2013 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố. Hà Nội, ngày 03 tháng 03 năm 2013 Nghiên cứu sinh Bùi Thị Thu Hiền i LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu, học tập và hoàn thành Luận án này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của hai người thầy đáng kính là PGS.TS. Khuất Hữu Thanh Đại học Bách Khoa Hà Nội, GS.TS. Phạm Quốc Long - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới hai thầy. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - ĐHBKHN đã giảng dạy, chỉ bảo và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trau dồi kiến thức chuyên môn và cuộc sống. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Shigeru SATO - Đại học Kitasato, Nhật Bản đã truyền đạt cho tôi kiến thức và quy trình công nghệ tách chiết, tinh sạch độc tố Tetrodotoxin; TS. Đào Thị Lương, TS. Trịnh Thành Trung -Viện Vi sinh và Công nghệ Sinh học, ĐHQGHN; KS. Hoàng Thị Oanh, ThS. Nguyễn Hữu Hoàng, ThS. Bùi Trọng Tâm, ThS. Phạm Thị Điềm -Viện Nghiên cứu Hải sản đã cùng tôi thực hiện một số nội dung của Luận án này. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Hải sản, Lãnh đạo Phòng, các anh chị em trong Phòng Nghiên cứu Công nghệ Sau thu hoạch, Công nghệ Sinh học Biển đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi về thời gian và vật chất để tôi hoàn thành Luận án này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng kính yêu và biết ơn tới gia đình, bố mẹ, chồng, con và các anh chị em, bạn bè đã thực sự động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội. Hà Nội, ngày 03 tháng 03 năm 2013 Nghiên cứu sinh Bùi Thị Thu Hiền ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Nội dung viết tắt 1 ADN Acid Deoxyribo Nucleic 2 Anhy-TTX Anhydro Tetrodotoxin (dẫn xuất anhydro của TTX) 3 ARN Acid Ribo Nucleic 4 CBS Chất bổ sung 5 C-NMR Carbon Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng 6 7 8 9 dATP dCTP dGTP dNTP hưởng từ hạt nhân cacbon 13) Deoxyadenosine triphosphate Deoxycytidine triphosphate Deoxyguanosine triphosphate Deoxyribonucleotide triphosphate 10 dTTP Deoxythymidine triphosphate 11 Epi-TTX Epi-Tetrodotoxin (dẫn xuất epi của TTX) 12 FLD Fluorescence Detector- Detecto huỳnh quang 13 FISH Flourescent in situ hybridization (Kỹ thuật lai phân tử đánh 14 1H-1H COSY dấu huỳnh quang) 1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy (Phổ học tương quan giữa 2 vị trí H) Hetero nuclear Multiple Bond Connectivity (Tương tác giữa 15 HMBC 16 H-NMR 17 HPLC High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng cao áp) 18 IgM Immunoglobulin M 19 KKT Kháng kháng thể 20 KN Kháng nguyên 21 KT Kháng thể 22 LB Luria Broth 23 LC-MS Liquid chromatography–mass spectrometry (Sắc ký khối phổ) 24 LC-MS/MS hidro với cacbon bên cạnh) Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) Liquid chromatography–mass spectrometry/mass spectrometry (Sắc ký khối phổ/khối phổ) iii 25 MB Marine Broth 26 MSD Mass Spectrum Detector (Detecto phổ khối lượng) 27 MU Mouse unit (Đơn vị chuột) 28 NOESY Nuclear Overhauser and Exchange Spectroscopy (Phổ trao đổi hiệu ứng Overhauser hạt nhân) 29 µCP Micro contact printing 30 µFN Micro fluidics networks 31 µM Micro Mol 32 OD Optical Density (Mật độ quang) 33 ORI Ocean Research Institute medium 34 PCR Polymerase Chain Reaction 35 TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose 36 TTX Tetrodotoxin 37 TTXs Tetrodotoxin và các dẫn xuất + 38 TTX-s Na 39 TTX-r Na+ Kênh điện thế Na+ nhạy cảm TTX Kênh điện thế Na+ kháng TTX iv MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ...............................................................iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ................................................................................. ix MỞ ĐẦU................................................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .................................................................................................. 2 1.1. TETRODOTOXIN........................................................................................................... 2 1.1.1. Công thức phân tử, cấu tạo hóa học của TTX .......................................................... 2 1.1.2. Đặc tính của TTX...................................................................................................... 4 1.1.3. Cơ chế gây độc của TTX........................................................................................... 5 1.1.4. Ứng dụng của TTX.................................................................................................... 7 1.2. NGUỒN THU NHẬN TTX.............................................................................................. 9 1.2.1. TTX từ động vật biển ................................................................................................... 9 1.2.2. TTX từ vi sinh vật biển............................................................................................... 15 1.3. CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH TTX TỪ CÁ NÓC ............................... 20 1.3.1. Tổng hợp TTX theo phương pháp hóa học ............................................................. 20 1.3.2. Tách chiết và tinh sạch TTX từ cá nóc ................................................................... 21 1.4. THU NHẬN VÀ TINH SẠCH TTX TỪ VI SINH VẬT................................................... 24 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 26 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ............................................... 26 2.1.1. Đối tượng................................................................................................................ 26 2.1.2. Thiết bị nghiên cứu ................................................................................................. 26 2.1.3. Hóa chất và môi trường nghiên cứu ....................................................................... 27 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................................. 28 2.2.1. Phương pháp xác định độc tố của 3 loài cá nóc độc bằng HPLC ......................... 28 2.2.2. Phương pháp phân tích, xác định tính chất của TTX từ cá nóc Việt Nam làm tiền đề kiểm chứng tính chất TTX từ vi sinh vật ...................................................................... 28 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh TTX .... 29 2.2.4. Phương pháp phân loại các chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh TTX................ 30 2.2.5. Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi cấy vi khuẩn sản sinh TTX ........................... 33 2.2.6. Tối ưu hóa điều kiện nuôi vi khuẩn sinh TTX theo đường dốc của Box-Wilson .... 34 2.2.7. Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ tách chiết và tinh sạch TTX từ dịch nuôi vi khuẩn............................................................................................................................. 36 2.2.8. Phương pháp phân tích xác định độc tính của TTX từ vi sinh vật ......................... 39 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................................... 41 3.1. PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT ĐỘC TỐ TTX CỦA CÁ NÓC ĐỘC VIỆT NAM.................................................................................................................. 41 3.1.1. Lựa chọn mẫu vật để phân lập vi sinh vật từ cá nóc độc ....................................... 41 v 3.1.2. Nghiên cứu xác định tính chất TTX từ mẫu cá nóc độc Việt Nam.......................... 43 3.2. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SẢN SINH TTX TỪ CÁ NÓC ĐỘC VIỆT NAM......................................................................................................... 48 3.2.1. Phân lập và lựa chọn các chủng vi sinh vật từ 3 loài cá nóc độc .......................... 48 3.2.2. Lựa chọn các chủng vi khuẩn sinh TTX từ các loại mô khác nhau của cá nóc độc49 3.2.3. Nghiên cứu khả năng sinh TTX của các chủng vi sinh vật thu được...................... 51 3.2.3. Phân loại các chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh TTX ................................... 52 3.3. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI CẤY VI KHUẨN SẢN SINH TTX ... 59 3.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ...................................................................... 59 3.3.2. Ảnh hưởng của pH nuôi cấy ................................................................................... 61 3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy ........................................................................... 63 3.3.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy.......................................................................... 64 3.3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ bổ sung mô trứng cá nóc độc vào môi trường nuôi cấy ........ 64 3.3.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống ............................................................................... 65 3.3.7. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy thích hợp .................................................................. 66 3.4. TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHỦNG M37 SẢN SINH TTX....................... 67 3.4.1. Chọn miền khảo sát ................................................................................................ 67 3.4.2. Thiết lập mô hình .................................................................................................... 69 3.4.3. Tối ưu hóa khả năng sinh độc tố TTX của chủng M37 theo phương pháp lên dốc của Box-Wilson................................................................................................................. 72 3.4.4. Kiểm định mô hình tối ưu khả năng sinh TTX của chủng M37 bằng thực nghiệm 73 3.5. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH TTX TỪ DỊCH NUÔI VI KHUẨN M37.................................................................... 76 3.5.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ tách chiết TTX ngoại bào từ dịch nuôi vi khuẩn M37 ........................................................................................................................ 76 3.5.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ tinh sạch TTX từ dịch độc tố thô chứa TTX tách chiết từ dịch nuôi vi khuẩn................................................................................ 77 3.6. KIỂM TRA CHẾ PHẨM TTX TỪ VI SINH VẬT .......................................................... 89 3.6.1. Kiểm tra chế phẩm TTX từ vi sinh vật .................................................................... 89 3.6.2. Thử nghiệm độc tính cấp của TTX thu nhận từ dịch nuôi chủng vi khuẩn M37..... 90 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................................ 92 1. KẾT LUẬN....................................................................................................................... 92 2. KIẾN NGHỊ ..................................................................................................................... 92 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .............................................................. 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................... 94 PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 102 vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Vi khuẩn sinh TTX phân lập từ một số loài sinh vật biển ................................... 16 Bảng 3.1. Hàm lượng độc tố TTX trong các mô của cá thể cái ở 3 loài cá nóc độc Việt Nam...................................................................................................................................... 41 Bảng 3.2. Hàm lượng độc tố TTX trong các mô của cá thể đực ở 3 loài cá nóc độc Việt Nam...................................................................................................................................... 42 Bảng 3.3. Số liệu phổ 1H và 13C NMR cùng các tương tác xa H-C của TTX ...................... 47 Bảng 3.4. Số lượng các chủng vi sinh vật phân lập trên 4 loại môi trường từ 3 loài cá nóc ............................................................................................................................................. 48 Bảng 3.5. Số lượng vi sinh vật phân lập từ 4 mô của 3 loài cá nóc độc ............................. 49 Bảng 3.6. Số lượng các chủng vi sinh vật sinh TTX phân lập từ 4 mô của 3 loài cá nóc độc ............................................................................................................................................. 50 Bảng 3.7. Kết quả phân tích định lượng hàm lượng TTX có trong dịch nuôi cấy của 24 chủng ................................................................................................................................... 51 Bảng 3.8. Kết quả phân loại một số chủng vi khuẩn sản sinh TTX hàm lượng cao............ 52 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến sinh tổng hợp TTX. 60 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh TTX..................... 61 Bảng 3.11. Hàm lượng TTX của dịch nuôi cấy trong điều kiện chỉnh pH ban đầu và chỉnh pH trong quá trình nuôi....................................................................................................... 62 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của đệm điều chỉnh pH môi trường đến khả năng sinh TTX.......... 63 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh TTX ............................... 63 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh TTX .............................. 64 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nồng độ mô trứng cá nóc độc bổ sung vào môi trường nuôi cấy ............................................................................................................................................. 65 Bảng 3.16. Sinh trưởng của chủng vi khuẩn M37 trong quá trình lên men ở các tỷ lệ cấp giống khác nhau. ................................................................................................................. 66 Bảng 3.17. Sinh trưởng và sinh tổng hợp TTX của chủng M37 trong quá trình lên men ở các tốc độ khuấy khác nhau................................................................................................. 67 Bảng 3.18. Mức và khoảng biến thiên của các yếu tố thực nghiệm (TN)............................ 68 Bảng 3.19. Bảng ma trận thực nghiệm với biến X............................................................... 69 Bảng 3.20. Ma trận thực nghiệm ở tâm phương án. ........................................................... 70 Bảng 3.21. Ước lượng tính ý nghĩa các hệ số theo tiêu chuẩn Student............................... 71 Bảng 3.22. Bảng tối ưu hóa theo đường dốc của Box - Wilson .......................................... 73 Bảng 3.23. Thử nghiệm lên men sinh tổng TTX .................................................................. 74 Bảng 3.24. Kết quả phân tích TTX trên HPLC của các mẫu tách chiết ngoại bào với các tỷ lệ % axit axetic khác nhau so với thể tích dịch nổi ......................................................... 76 Bảng 3.25. Ảnh hưởng của các thành phần dịch giải hấp đến việc thu hồi độc tố TTX ..... 78 Bảng 3.26. Kết quả phân tích định tính và định lượng các phân đoạn giải hấp theo tỷ lệ than hoạt tính/mẫu độc tố thô.............................................................................................. 79 Bảng 3.27. Kết quả định tính TTX từ phần dịch rửa than hoạt tính của các thí nghiệm .... 80 vii Bảng 3.28. Kết quả định tính và định lượng TTX với các thí nghiệm thay đổi tốc độ dòng chảy qua cột sắc ký.............................................................................................................. 82 Bảng 3.29. Kết quả phân tích hàm lượng TTX của dịch giải hấp từ than hoạt tính ........... 83 Bảng 3.30. Kết quả phân tích TTX có trong dịch giải hấp với các mẫu ở pH khác nhau... 83 Bảng 3.31. Định lượng TTXs có trong dịch giải hấp ở nồng độ axit axetic khác nhau ...... 84 Bảng 3.32. Kết quả định lượng các phân đoạn dịch giải hấp khi tiến hành tinh sạch trên cột sắc ký theo tỷ lệ gel Bio-gel P2/mẫu khác nhau..................................................... 85 Bảng 3.33. Kết quả phân tích hàm lượng TTX sau khi tinh sạch bằng sắc ký Bio-gel P2.. 85 Bảng 3.34. Hàm lượng TTX trong các phân đoạn chứa độc từ cột Bio-Rex 70 (H+) ......... 86 Bảng 3.35. Tỷ lệ chuột chết ở các lô chuột......................................................................... 90 viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Công thức cấu tạo của TTX................................................................................... 2 Hình 1.2. Cấu trúc dạng Hemilactal của họ TTX.................................................................. 3 Hình 1.3. Cấu trúc dạng lacton của họ TTX ......................................................................... 3 Hình 1.4. Hai dạng tautome của Tetrodotoxin...................................................................... 3 Hình 1.5. Cấu trúc dạng 4,9-anhydro của họ TTX................................................................ 4 Hình 1.6. Sự khác biệt về cấu trúc của nhóm độc tố TTX ..................................................... 5 Hình 1.7. Màng với các kênh ion và ion natri đã bị hydrat hóa và TTX............................... 6 Hình 1.8. Một số loài cá nóc biển chứa độc tố Tetrodotoxin .............................................. 10 Hình 1.9. Một số động vật biển khác chứa Tetrodotoxin .................................................... 11 Hình 1.10. Một số động vật trên cạn chứa Tetrodotoxin .................................................... 11 Hình 1.11. Cá nóc vằn Takifugu oblongus [6] .................................................................... 13 Hình 1.12. Cá nóc xanh chấm cam Torquigener pallimaculatus [6].................................. 14 Hình 1.13. Cá nóc đầu thỏ mắt to Lagocephalus lunaris [6].............................................. 15 Hình 2.1. Buồng trứng của cá nóc Torquigener pallimaculatus trong mùa sinh sản ........ 26 Hình 2.2. Phân tích TTX trên hệ thống HPLC .................................................................... 28 Hình 3.1. Sắc kí đồ của TTX từ cá nóc ................................................................................ 44 Hình 3.2. Sắc kí đồ của TTX chuẩn ..................................................................................... 44 Hình 3.3. Phổ khối lượng của TTX...................................................................................... 45 Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của TTX ........................................................................................ 45 Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của TTX ......................................................................................... 46 Hình 3.6. Phổ COSY của TTX ............................................................................................ 46 Hình 3.7. Phổ HMBC của TTX............................................................................................ 46 Hình 3.8. Cấu trúc TTX ở dạng Hemilactal ........................................................................ 48 Hình 3.9. Tỷ lệ % các chủng vi sinh vật phân lập được từ 3 loài cá nóc độc đã lựa chọn . 49 Hình 3.10. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M3& M28 ............................................. 53 Hình 3.11. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M6......................................................... 54 Hình 3.12. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M8......................................................... 54 Hình 3.13. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M10....................................................... 55 Hình 3.14. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M19....................................................... 56 Hình 3.15. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M30....................................................... 57 Hình 3.16. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M37....................................................... 57 Hình 3.17. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M43....................................................... 58 Hình 3.18. Phổ khối của TTX tách từ cá nóc độc................................................................ 89 Hình 3.19. Phổ khối của TTX tách chiết từ vi sinh vật........................................................ 89 Hình 3.20. Phương trình tương quan tỷ lệ chuột chết với liều uống TTX ........................... 91 ix MỞ ĐẦU Tetrodotoxin (TTX) là một độc tố sinh học cực mạnh được chiết xuất chủ yếu từ cá nóc độc, động vật biển và một số chủng vi sinh vật. Trong những năm gần đây, TTX đã được nghiên cứu sử dụng làm thuốc gây tê, gây mê,... ở nhiều nước như Canada, Mỹ, Trung Quốc.... Ở nước ta, Dư Đình Động và cộng sự nghiên cứu thành công việc sử dụng TTX kết hợp với bài thuốc dân tộc cổ truyền để làm thuốc cai nghiện, đã được tiến hành thử nghiệm trên các bệnh nhân cho kết quả khả quan [9]. Những năm trước đây, để đáp ứng được nhu cầu của thị trường, một số nghiên cứu đã sinh tổng hợp TTX theo phương pháp hoá học. Tuy nhiên, giá thành của sản phẩm TTX tổng hợp hóa học cao, độ tinh sạch thấp, không kinh tế bằng phương pháp tách chiết TTX trực tiếp từ cá nóc độc. Vì vậy, TTX được tách chiết chủ yếu từ cá nóc độc hoặc động vật biển. Do hàm lượng TTX từ cá nóc độc rất thấp (100kg trứng cá nóc độc mới tách chiết được 1g TTX) nên giá thành của TTX rất cao. Hơn nữa, trữ lượng của các loài cá nóc độc ngày càng giảm, trong khi nhu cầu tiêu thụ TTX lại ngày càng tăng [93]. Gần đây, các nghiên cứu thu nhận TTX từ vi sinh vật đã mở ra một triển vọng mới trong công nghệ sinh học. Hướng nghiên cứu cho phép chủ động sản xuất TTX trong phòng thí nghiệm hoặc ở quy mô công nghiệp, độ tinh sạch cao, giảm được giá thành,... Xuất phát từ ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu công nghệ nuôi cấy và thu nhận Tetrodotoxin từ một số chủng vi khuẩn phân lập từ cá nóc độc Việt Nam”. * Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng được quy trình công nghệ từ phân lập, nuôi cấy, tách chiết và xác định tính chất, độc tính TTX của vi khuẩn. * Nội dung nghiên cứu: - Phân lập và lựa chọn chủng vi sinh vật sản sinh TTX từ cá nóc độc Việt Nam. - Xây dựng quy trình công nghệ nuôi cấy vi khuẩn sinh TTX. - Xây dựng quy trình công nghệ tách chiết và tinh sạch TTX từ dịch nuôi cấy vi khuẩn. - Xác định tính chất và độc tính của TTX từ dịch nuôi cấy vi khuẩn. * Những đóng góp mới của Luận án: Lần đầu tiên ở Việt Nam, nghiên cứu có hệ thống về TTX từ vi khuẩn (từ phân lập, nuôi cấy, tách chiết, tinh sạch và xác định tính chất của TTX từ vi khuẩn). 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. TETRODOTOXIN Tetrodotoxin (TTX) là một chất độc sinh học, có hoạt tính sinh học cao, có bản chất phi protein, khó bị phá hủy bởi nhiệt; là một hợp chất hữu cơ dị vòng, có cấu trúc lưỡng cực, có liên kết nội phân tử với hemilactal và được phân loại như là một hợp chất aminohydroquinazoline [23]. 1.1.1. Công thức phân tử, cấu tạo hóa học của TTX Tên tiếng Anh: Tetrodotoxin. Công thức phân tử : C11H17N3O8. Khối lượng phân tử: 319,28 g.mol−1 Hình 1.1. Công thức cấu tạo của TTX Các dẫn xuất tạo ra từ TTX: anhydrotetrodotoxin, 4-epitetrodotoxin, 6epitetrodotoxin, nor-tetrodotoxin, quinazolin, axit tetrodoic, .... TTX được tách chiết đầu tiên từ loài cá nóc Nhật Bản, sau đó được tìm thấy ở nhiều loài cá nóc và một số loài sinh vật khác. Cấu trúc của TTX được xác định lần đầu tiên năm 1964 bởi Goto, Tsuda và Woodward [24, 74, 78]. Một số các nhà khoa học đã tiến hành tổng hợp TTX bằng con đường hóa học, nhưng sản phẩm thu được có chất lượng chưa ổn định, độ tinh sạch không cao. Cùng với sự phát triển của khoa học, các thiết bị phân tích hiện đại ra đời, các dẫn xuất của TTX đã lần lượt được xác định cấu trúc và mối tương quan giữa cấu trúc và độc tính của chúng [84]. Năm 1988, Yasumoto và cộng sự nghiên cứu cấu trúc của TTX tách chiết được từ sa giông, cho thấy trên phổ NMR sự tồn tại ở 2 dạng tautome là hemilactal và lacton của TTX. Giữa 2 dạng tautome này có sự chuyển hóa lẫn nhau (hình 1.4). Tỷ lệ giữa 2 tautome tùy thuộc vào cấu trúc của từng dẫn xuất TTX [90]. 2 Hình 1.2. Cấu trúc dạng Hemilactal của họ TTX Hình 1.3. Cấu trúc dạng lacton của họ TTX Hình 1.4. Hai dạng tautome của Tetrodotoxin 3 Hình 1.5. Cấu trúc dạng 4,9-anhydro của họ TTX Theo Yamashita M.Y, phương pháp phân tích TTX có hiệu quả hiện nay là sử dụng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) có nối ghép detector huỳnh quang (FLD) hoặc detector phổ khối lượng. Công cụ đắc lực nhất trong xác định cấu trúc TTX là phổ cộng hưởng từ hạt nhân… [82]. 1.1.2. Đặc tính của TTX 1.1.2.1. Tính chất hóa lý của TTX a) Dạng tồn tại: TTX tồn tại ở dạng tinh thể hoặc dạng bột màu trắng, có khối lượng phân tử M=319,28 Da. Ở trạng thái tự do TTX tồn tại dạng hydrat C11H17O8N3.1/2 H2O (M = 328,28) [2, 82]. b) Nhiệt độ nóng chảy: Tetrodotoxin có bản chất phi protein, không bị nhiệt phá huỷ, nấu chín hay phơi khô, sấy, độc chất vẫn tồn tại. Đun sôi (100oC) sau 6 giờ độc tính TTX bị giảm một nửa; Muốn phá hủy hoàn toàn độc tính TTX cần phải đun sôi ở 200oC trong 10 phút [1]. TTX không bị nóng chảy ở nhiệt độ 2000C, khi tăng nhiệt độ TTX chuyển sang màu sẫm (khoảng 2200C trở lên) nhưng vẫn không bị nóng chảy [35; 82]. c) Độ hòa tan: TTX không tan trong dung môi hữu cơ, tan trong axit loãng, tan nhẹ trong nước. TTX không bền trong môi trường kiềm và môi trường axit mạnh. Trong môi trường axit, TTX chuyển thành hợp chất axit hydroclotetrodoic C11H17O8N3HCl; trong môi trường 4 kiềm, TTX chuyển thành hợp chất không no là axit anhydrotetrodoic C11H19O9N3. TTX thể hiện tính bazơ yếu pKa = 8,76 [82]. d) Hấp thụ ánh sáng: TTX không hấp thụ ánh sáng hồng ngoại với λ=1690-2000 cm-1, không hấp thụ cực đại ở bước sóng trên 220 nm trong vùng tử ngoại [82]. 1.1.2.2. Một số đồng phân phổ biến của TTX TTX có rất nhiều đồng phân khác nhau, như: 4 epi-TTX, 6 epi-TTX, anhydro-TTX, deoxy-TTX, axit tetrodotoic,.... Hoạt tính sinh học của các đồng phân của TTX có sự khác nhau. Trong hỗn hợp TTX tách chiết được thường gồm TTX và hai đồng phân epi-TTX và anhydro-TTX [74]. a) Epi-Tetrodotoxin (Epi-TTX): Epi-TTX là một dạng dẫn xuất của TTX thuộc nhóm độc tố TTX, được tìm thấy qua phân tích HPLC, có khối lượng phân tử là 319,28g/mol. Công thức phân tử là C11H17N3O8 giống với TTX, điểm khác biệt là liên kết của nhóm OH- tại vị trí C4 có hướng quay khác với cấu trúc của TTX. Epi-TTX không có độc tính như TTX [74, 101]. b) AnhydroTetrodotoxin (Anhy-TTX): Anhy-TTX cũng là một dẫn xuất của TTX, theo các đỉnh trong biểu đồ phân tích HPLC thì Anhy-TTX xuất hiện sau TTX và dẫn xuất 4 – Epi-TTX. Khối lượng phân tử là 301,253 g/mol và công thức phân tử là C11H15N3O7. Khác với cấu trúc TTX tại vị trí C4 và C9 cùng liên kết với một nhóm OH-, anhy-TTX lại có cấu trúc tại 2 vị trí đó gắn với nguyên tử O. Anhy-TTX có độc tính kém hơn TTX [74, 102]. HO - - - O H O O OH OH OH + N 4 HN H OH O 10 9 H O O 11 7 8OH8aOH NH2 1 + NH2 N HO HO 6 5 4a 4 H 2 N3 H OH HO 4-epiTTX TTX O 9 H O O OHO OH N 4 HN H + NH2 Anhy-TTX Hình 1.6. Sự khác biệt về cấu trúc của nhóm độc tố TTX 1.1.3. Cơ chế gây độc của TTX Sự vận chuyển những ion natri vào tế bào thần kinh là yếu tố cần thiết cho tính dẫn truyền xung trong sợi thần kinh, xung bị kích thích và được dẫn truyền dọc theo sợi trục. Thông thường tế bào sợi trục thần kinh có nồng độ ion K+ cao, nồng độ Na+ thấp và có điện thế âm. Sự kích thích có hiệu quả dẫn đến luồng ion Na+ từ ngoài màng tế bào đi vào 5 trong làm phát sinh điện thế hoạt động dương ở màng tế bào. Sự khử cực lan truyền dọc theo dây thần kinh, dòng ion Na+ qua màng tế bào chiếm kênh ion Na+ (một kênh chọn lọc những ion natri hơn là những ion kali theo thứ tự cường độ), giúp dẫn truyền tín hiệu qua rron thần kinh [37]. Kênh Na+ được cấu tạo từ một chuỗi peptid đơn với bốn tiểu đơn vị lặp, mỗi đơn vị bao gồm 6 xoắn xuyên màng (hình 1.7). Các lỗ xuyên màng được tạo thành khi 4 tiểu đơn vị cuộn gấp trong một bó, với tâm là lỗ xuyên màng [37]. Hình 1.7. Màng với các kênh ion và ion natri đã bị hydrat hóa và TTX TTX gắn với vị trí lỗ mở của kênh ion bên ngoài tế bào, một vài phân tử TTX gắn với vị trí lỗ màng mở của kênh ion, tạm thời làm mất khả năng vận chuyển của kênh ion [47]. Có hai loại kênh điện thế natri khác nhau trong tế bào của các mô con người: kênh điện thế Na+ nhạy cảm TTX (kênh TTX-s Na+) và kênh điện thế natri kháng TTX (kênh TTX-r Na+). TTX gắn với kênh TTX-s Na+ với một liên kết có ái lực 5-15 nanomolar, trong khi kênh TTX-r Na+ liên kết TTX với ái lực thấp micromolar. Tế bào chứa những kênh TTX-r Na+ có chủ yếu là ở trong mô tim, trong khi những tế bào thần kinh chứa những kênh TTX-s Na+ chiếm ưu thế lúc nghỉ ngơi của con người. Các kênh TTX-s bị bất hoạt nhiều hơn kênh TTX-r ở điện thế nghỉ. Trong khi kênh vận chuyển ion natri của tế bào mô cơ có xu hướng đối kháng với TTX thì tế bào thần kinh lại rất nhạy cảm với TTX [65, 70]. Với một số lượng đủ lớn, TTX bám giữ lấy phức hợp kênh Na+, chiếm giữ những vị trí nhận ở kênh Na+, ngăn không cho ion natri có cơ hội vào kênh cho đến khi nó khuếch tán chậm rồi ngừng hẳn, làm rối loạn hoạt động khử cực của màng tế bào thần kinh (thay đổi đột ngột điện thế màng), và tác động dọc theo dây thần kinh làm phong bế dẫn truyền các xung động thần kinh. TTX phong bế chọn lọc lên các kênh vận chuyển ion natri do vậy ngăn chặn dẫn truyền tín hiệu trên các sợi thần kinh vận động và cảm giác dẫn đến liệt. Thực tế TTX ngăn cản sự vận chuyển những ion natri vào bên trong màng tế bào thần kinh và mô cơ ở nồng độ thấp 10-7-10-9 M [68, 73]. Khi nghiên cứu tế bào của chuột, cho thấy dưới tác dụng của TTX, màng tế bào bị khử cực và kênh vận chuyển ion natri bị đóng, làm cho quá trình truyền thông tin cũng như quá trình trao đổi chất của tế bào bị dừng lại. TTX có tác dụng trực tiếp vào sợi trục của tế 6 bào thần kinh cơ, rồi đến khớp nối của tế bào thần kinh và tác dụng vào trung tâm sợi cơ. Sự tiếp nhận cholinergic trên các hạch độc lập, tuyến thượng thận không bị tác động bởi TTX, chúng có phản ứng bình thường với acetylcholin khi có mặt TTX. Điều này cho thấy trước tiên TTX tác dụng vào tế bào thần kinh vận động tiếp đó mới tác động đến tế bào thần kinh cảm giác. Khi sử dụng TTX ở nồng độ cao sẽ làm mất khả năng phản xạ của thần kinh đối với những kích thích mạnh. Các kênh dẫn truyền của tế bào thần kinh chỉ bị ngăn cản ở nồng độ TTX cao hơn 1µM. Ở các tế bào tim, tác dụng kìm hãm của TTX có hiệu quả khi tác dụng ở nồng độ thấp hơn tùy thuộc vào con đường đưa TTX vào tế bào. Đối với tế bào thần kinh của vỏ não trong môi trường nuôi cấy, kênh vận chuyển ion natri bị ngừng hoạt động ở ngay nồng độ thấp hơn 0,1 µM [2]. Nếu tetrodotoxin là một độc tố mạnh, tại sao lại không gây độc cho vật chủ? Các nghiên cứu cho thấy, kênh vận chuyển Na+ trong vật chủ có cấu tạo khác với những động vật khác, ở vật chủ kênh Na+ không nhạy cảm với độc tố TTX. Điều đó được chứng minh ở một trong các loài cá nóc: gen mã hóa protein của kênh ion natri bị đột biến làm thay đổi trình tự axit amin làm cho kênh này không nhạy cảm với tetrodotoxin. Đột biến điểm này có lợi cho cá nóc, cho phép cá nóc kết hợp chặt chẽ với vi sinh vật cộng sinh, sử dụng độc tố do vi sinh vật sinh ra vào mục đích phòng vệ [77, 81]. 1.1.4. Ứng dụng của TTX Trong những năm gần đây, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu tìm hiểu, khai thác và sử dụng các chất có hoạt tính sinh học cao từ sinh vật biển như: prolactin, oxytoxin, progesteron, estrion, các axit amin, aldosteron,... và đặc biệt là các chất độc sinh học (biotoxin) phục vụ nền kinh tế quốc dân. TTX là một trong số các chất độc sinh học có hoạt tính sinh học cao (là chất độc thần kinh rất mạnh), không chỉ được sử dụng trong khoa học để nghiên cứu sự vận chuyển ion Na+ qua màng tế bào, mà còn được sử dụng để điều chế thuốc gây tê, gây mê và thuốc kích thích sự hoạt động của hệ tuần hoàn, điều trị một số bệnh hiểm nghèo như các bệnh về tim mạch, ung thư, HIV-AIDS, làm thuốc cai nghiện... 1.1.4.1. Một số ứng dụng của TTX Thứ nhất, Tetrodotoxin (TTX) có tác dụng kích thích hoạt động của hệ tuần hoàn, làm thay đổi nhịp tim, thay đổi trương lực của thành mạch, dẫn đến sự thay đổi huyết áp. Sử dụng TTX với liều lượng 1,3.10-3 mg/kg có hiệu quả phòng ngừa các trạng thái xơ cứng động mạch. TTX còn được sử dụng để bào chế các loại thuốc đặc trị chữa bệnh huyết áp, rối loạn nhịp tim [19]. Thứ hai, TTX làm giảm tính thấm của màng tế bào đối với việc vận chuyển ion Na+ mà không ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển ion K+, trong khi đó các thuốc gây tê khác lại có tác dụng đối với cả 2 kênh vận chuyển này. Điều này rất có ý nghĩa trong việc nghiên cứu sinh lý màng tế bào [28]. 7 Thứ ba, TTX được dùng để điều chế thuốc gây tê, gây mê trong phẫu thuật. Ngoài những tác dụng gây tê giống thuốc: novocain, procain, cocain, TTX có nhiều ưu điểm hơn ở khả năng gây tê tại chỗ và tác dụng mạnh hơn nhiều so với thuốc gây tê khác. Ví dụ: để kìm hãm hoạt động của hệ thần kinh bằng cocain phải cần đến nồng độ 500mg, trong khi đó TTX chỉ cần 0,03mg (hiệu quả tác dụng của TTX mạnh gấp 60.000 lần cocain) [33]. Thứ tư, TTX còn được dùng như thuốc giảm đau, khi sử dụng TTX với liều lượng rất nhỏ có khả năng cắt cơn đau của những bệnh nhân ung thư gan ở giai đoạn cuối. Công ty International Wex Technologies (Canada) đã sử dụng TTX để chế ra Tectin (thuốc giảm đau), Tocudin (thuốc gây tê), và Tetrodin (thuốc cai nghiện ma túy) - một vài loại thuốc giúp bệnh nhân ung thư vượt qua được những cơn đau hoặc giúp con nghiện heroin cắt cơn. Các thử nghiệm ban đầu khi sử dụng thuốc cho kết quả khả quan. Theo các chuyên gia, các thuốc này có thể ngăn chặn tế bào thần kinh chuyển tín hiệu đau đến não, chúng khác với các thuốc giảm đau khác ở chỗ nó không gây ra tác dụng phụ như morphin, không xung đột với các loại thuốc khác và cũng không gây nghiện [71]. Ở Việt Nam đã nghiên cứu thành công biệt dược Thiên Thanh Hoàn sử dụng cho cai nghiện ma tuý. Mỗi viên nhộng Thiên Thanh Hoàn có chứa tối đa 0,1 miligam TTX và một số vị thuốc Đông y khác [9]. Thứ năm, nghiên cứu của Lesort cho thấy TTX có khả năng liên kết với protein của HIV, đặc biệt là gp-120, gp-120 là thụ thể hay móc bám của HIV gắn được vào thụ thể tế bào người, đặc biệt là những tế bào Lympho T có thụ thể CD4, từ đó hệ gen của HIV không được chuyển vào trong tế bào... dẫn đến hệ gen của HIV không thể gắn được vào hệ gen của người và không làm tan tế bào người. Vì vậy, người bị nhiễm HIV không thể phát triển thành AIDS được. Đây chính là tín hiệu đáng mừng cho quá trình đi tìm thuốc điều trị căn bệnh thế kỷ HIV-AIDS [34]. 1.1.4.2. Một số tác dụng có hại của TTX TTX không chỉ có tác dụng có lợi, cũng như nhiều biệt dược khác, nếu sử dụng không đúng cách, đúng liều lượng hoặc đúng mục đích TTX sẽ trở thành độc dược, có tác hại khôn lường đến sức khoẻ con người, có thể gây tử vong. Đối với hệ thần kinh của người và động vật, TTX có khả năng ngăn chặn điện thế hoạt động của sợi trục thần kinh dẫn đến sự thay đổi điện tích Na+ trên bề mặt của tế bào thần kinh, làm cho điện thế hoạt động của cơ bị ức chế và hệ thống thần kinh bị suy yếu. Tùy vào liều lượng độc tố TTX nhiều hay ít mà gây ra hậu quả khác nhau, nhẹ thì gây cảm giác choáng váng, nôn mửa, co giật giữ dội, sau đó bất tỉnh vài ngày, nặng thì rối loạn hô hấp và gây tử vong... [50, 59]. Khi tác dụng vào tế bào thần kinh, TTX giống như xung điện gây kích thích mạnh, làm hưng phấn quá mức dẫn đến ion Na+ được kích thích tạo ra với một lượng dư thừa trong tế bào. Ion Na+ không được vận chuyển ra ngoài tế bào và tập trung nhiều ở phần đầu mút dây thần kinh, dẫn đến ảnh hưởng tới phản ứng truyền dẫn xung của tế bào thần kinh 8 cảm giác, đồng thời làm cho màng tế bào bị khử cực, làm đóng kênh vận chuyển ion, gây ức chế hệ thống thần kinh [58]. Nhìn chung, tác dụng có lợi của TTX đối với con người khá rõ và nổi bật. TTX đã và đang được sử dụng rộng rãi trong y dược, nhu cầu sử dụng TTX không chỉ ở Việt Nam mà trên thế giới cũng ngày càng tăng. Hiện nay, lượng TTX được tách chiết, tinh chế từ động vật biển, đặc biệt là cá nóc còn ít. Do vậy, hướng nghiên cứu thu nhận TTX từ vi sinh vật có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. 1.1.4.3. Triển vọng ứng dụng TTX ở Việt Nam TTX là thành phần quan trọng trong các liệu pháp cai nghiện, chữa ung thư, HIV hoặc sử dụng làm thuốc giảm đau. Những nhóm liệu pháp này tạo ra nhu cầu sử dụng TTX rất lớn ở Việt Nam, đòi hỏi một nguồn cung cấp TTX dồi dào. Theo thống kê 6 tháng đầu năm 2012 của Bộ Lao động – Thương binh và Xã hội Việt Nam, có 171.400 người nghiện ma tuý đã được quản lý hồ sơ trong cả nước, con số thực tế khoảng hai lần số liệu thống kê, nghĩa là có khoảng gần 350.000 người nghiện ma túy trong cả nước [1]. Giả sử để cai nghiện cho số người nghiện này; mỗi người sử dụng 02 viên thuốc biệt dược Thiên Thanh Hoàn trong một ngày và quá trình điều trị kéo dài trong 10 ngày thì nhà sản xuất phải sử dụng ít nhất 650 gam TTX để phối trộn cùng một số vị thuốc Đông y. Để sản xuất một lượng TTX như vậy, cần có ít nhất 65 tấn trứng cá nóc độc, hay khoảng 6.500 tấn cá nóc độc (trứng chiếm khoảng 5-10% trọng lượng cá nóc) [6, 9]. Đây là vấn đề khó có thể thực hiện thành công ở nước ta. Trữ lượng cá nóc trên toàn vùng biển Việt Nam (theo ước tính năm 2005 là khoảng 37.387 tấn). Trong đó họ cá nóc Tetraodontidae chiếm khoảng 84,7% tổng trữ lượng. Đây là nguồn nguyên liệu tiềm tàng để tách chiết TTX. Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu này đang bị chia sẻ bởi việc thu mua của các thương gia Trung Quốc và Hàn Quốc, trong khi Chính phủ Việt Nam vẫn chưa gỡ bỏ lệnh cấm khai thác, buôn bán, vận chuyển và chế biến cá nóc. Bởi vậy, việc thu mua, xử lý và chiết xuất TTX từ một lượng lớn cá nóc 6.500 tấn là hầu như không thể thực hiện, xét về mặt kinh tế và xã hội. Rõ ràng, bên cạnh nguồn nguyên liệu triển vọng là cá nóc, cần tìm kiếm những nguồn nguyên liệu khác để sản xuất TTX. Hướng nghiên cứu sản xuất TTX từ vi sinh vật là hướng nghiên cứu đang được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu [6]. 1.2. NGUỒN THU NHẬN TTX 1.2.1. TTX từ động vật biển Trên thực tế, TTX có ở nhiều động vật khác nhau như: bạch tuộc đốm xanh, ếch, cua Xanthid, ốc biển, cá bống vân mây, cá nóc, nhuyễn thể,.... TTX được phát hiện đầu tiên vào năm 1950 từ trứng của loài cá nóc ở Nhật Bản và được gọi là spheroidine [91]. Sau đó độc tố spheroidine được đổi tên là TTX và được các nhà độc tố học dùng làm tên chung cho đến ngày nay. 9