Tài liệu Nghiên cứu đa hình hệ gen các dòng tôm sú (penaeus monodon) việt nam nhằm phục vụ công tác chọn giống tôm.

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nguyễn Thị Minh Thanh (Times New Roman, 15, Bold, Viết chữ thường) NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH HỆ GEN CÁC DÒNG TÔM SÚ (Penaeus monodon) VIỆT NAM NHẰM PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG TÔM (Times N ew Roma, Bold, Viết chữ in) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 9 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Đinh Duy Kháng Viện Công nghệ sinh học 2. PGS.TS. Nguyễn Hữu Ninh Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản III Hà Nội, 2019 LỜI CẢM ƠN Với tất cả tấm lòng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS Đinh Duy Kháng - Phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và PGS.TS Nguyễn Hữu Ninh - Viện trưởng Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III là những người Thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên và hết lòng giúp đỡ tôi ngay từ những ngày đầu thực hiện luận án cho đến lúc hoàn thành. Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Đồng Văn Quyền - Phó Viện trưởng, Trưởng Phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện các nghiên cứu tại Phòng vi sinh vật học phân tử và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Tập thể cán bộ nghiên cứu của Phòng Vi sinh vật học phân tử đã giúp tôi học hỏi thêm những kiến thức và kỹ thuật về sinh học phân tử và tin sinh học trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Văn Hảo và tập thể nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II đã giúp đỡ tôi cũng như nhóm thực hiện đề tài trong việc thu mẫu và thực hiện một phần nội dung nghiên cứu quan trọng của luận án về di truyền số lượng. Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Đăng Tôn và tập thể nghiên cứu tại Viện nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện kỹ thuật GBS. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu tại Viện trong suốt những năm qua. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Thị Hải Hà đã giúp đỡ tôi hoàn thành các thủ tục cần thiết trong thời gian học tập và bảo vệ luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Biên tập Tạp chí Công nghệ sinh học đã hỗ trợ tôi và nhóm nghiên cứu đăng tải các công bố liên quan đến luận án. i Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Công nghệ Đông Á nơi tôi đang công tác đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian tôi làm nghiên cứu sinh để tôi có thể vừa công tác vừa học tập và hoàn thành luận án của mình. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn và mong muốn nhận được những ý kiến đóng góp quý báu đến từ các chuyên gia, các nhà nghiên cứu và các đồng nghiệp để giúp tôi chỉnh sửa hoàn thiện nội dung luận án. Cuối cùng, tôi xin được nói lời biết ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình và những người bạn, những đồng nghiệp thân thiết đã luôn bên cạnh, giúp đỡ, động viên, hỗ trợ về mọi mặt và khích lệ để tôi có thể vượt qua mọi khó khăn trong thời gian dài học tập và nghiên cứu để có thể hoàn thành được luận án. Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Minh Thanh ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong Luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý của các đồng tác giả, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả Nguyễn Thị Minh Thanh iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ...............................................................................................................i LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... iii MỤC LỤC ...................................................................................................................iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................... vii DANH MỤC CÁC BẢNG .........................................................................................ix DANH MỤC CÁC HÌNH ..........................................................................................xi MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 5 1.1. Tôm sú Penaeus monodon ................................................................................ 5 1.1.1. Đặc điểm sinh học, phân loại và phân bố địa lý ................................................. 5 1.1.2. Khái quát tình hình nuôi tôm sú trên thế giới và ở Việt Nam ............................. 8 1.2. Các kỹ thuật phân tích chỉ thị phân tử thông dụng ..................................... 14 1.3. Ứng dụng kỹ thuật phân tích chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa hình hệ gen tôm sú ................................................................................................. 23 1.4. Phương pháp GBS và ứng dụng trong chọn giống ...................................... 30 1.5. Phương pháp PCR đặc hiệu alen cạnh tranh (KASP) và ứng dụng .......... 37 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 39 2.1. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 39 2.1.1. Mẫu tôm sú ....................................................................................................... 39 2.1.2. Hóa chất .......................................................................................................... 40 2.1.3. Thiết bị ............................................................................................................. 43 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 44 2.2.1. Thu mẫu tôm sú tự nhiên phục vụ nghiên cứu đa hình hệ gen ....................... 44 2.2.2. Thu mẫu tôm sú tự nhiên làm tôm giống bố mẹ, sàng lọc mầm bệnh và chăm sóc tôm bố mẹ ......................................................................................... 45 2.2.3. Thiết lập các gia đình tôm sú tạo thế hệ Go và G1 ........................................... 46 2.2.4. Tách chiết, tinh sạch và xác định nồng độ DNA tổng số từ mô cơ tôm sú ...... 48 iv 2.2.5. Điện di kiểm tra DNA trên gel agarose........................................................... 49 2.2.6. Kỹ thuật AFLP đánh giá đa hình hệ gen ......................................................... 50 2.2.7. Phân tích kết quả AFLP trên máy xác định trình tự tự động sử dụng điện di mao quản và phần mềm phân tích đoạn ..................................................... 54 2.2.8. Kỹ thuật GBS phân tích hệ gen tôm sú ........................................................... 55 2.2.9. Chú giải các đoạn trình tự và xác định gen liên quan ..................................... 58 2.2.10. Xác định trình tự amino acid của contig và đánh giá mức độ tương đồng với gen mã hóa protein quan tâm ................................................................... 59 2.2.11. Phương pháp KASP ........................................................................................ 60 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................... 61 3.1. Đa hình AFLP ở các quần đàn tôm sú Việt Nam ........................................ 61 3.1.1. Kiểm tra hoạt tính cắt DNA của cặp enzyme EcoRI và MseI ......................... 61 3.1.2. Tách DNA tổng số từ tôm sú để thực hiện kỹ thuật AFLP .............................. 62 3.1.3. Kết quả thực hiện phản ứng tiền chọn lọc........................................................ 62 3.1.4. Đa hình AFLP trong các quần đàn và giữa các quần đàn tôm sú .................... 64 3.1.5. Cây phát sinh chủng loại giữa các quần đàn tôm sú Việt Nam ....................... 78 3.2. Sản xuất tôm sú thế hệ Go, G1 ....................................................................... 79 3.2.1. Sàng lọc nguồn tôm bố mẹ đầu vào ................................................................. 79 3.2.2. Thiết lập các gia đình tôm sú thế hệ Go, G1 ...................................................... 81 3.3. Sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNP) liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tôm sú ...................................................................................... 85 3.3.1. Giải trình tự, kết nối các đoạn trình tự và thiết lập hệ gen tham chiếu tạm thời................................................................................................................... 85 3.3.2. Sàng lọc SNP.................................................................................................... 88 3.3.3. Chú giải gen chức năng từ dữ liệu giải trình tự tôm sú .................................... 88 3.3.4. Xác định chỉ thị SNP và tương quan giữa các contig chứa SNP với gen MHC ................................................................................................................. 91 3.3.5. Xác định vùng tương đồng giữa contig chứa SNP so với gen mã hóa protein MHC, xác định codon chứa SNP và vị trí tương ứng của chỉ thị v SNP trên gen MHC .......................................................................................... 94 3.4. Sàng lọc chỉ thị SNP G>A ở tôm sú tăng trưởng nhanh bằng phương pháp KASP ..................................................................................................... 97 Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ .......................................................................... 99 4.1. Chọn địa điểm thu mẫu để nghiên cứu đa hình di truyền ................................ 99 4.2. Tách DNA tổng số từ tôm sú tạo vật liệu nghiên cứu ...................................100 4.3. Kết quả phản ứng tiền chọn lọc AFLP ........................................................... 102 4.4. Đa hình AFLP trong các quần đàn tôm sú ..................................................... 104 4.5. Lựa chọn kỹ thuật chỉ thị AFLP để đánh giá đa hình hệ gen tôm sú ............. 107 4.6. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa các quần đàn tôm sú ............................... 108 4.7. Tạo vật liệu tôm sú thế hệ Go, G1 ................................................................... 110 4.8. Ứng dụng kỹ thuật GBS để sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNP) liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tôm sú ...................................................... 112 4.9. Sàng lọc chỉ thị SNP G>A ở tôm sú tăng trưởng nhanh bằng phương pháp KASP và tiềm năng ứng dụng trong chọn giống ........................................... 121 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................125 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .................................126 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH ........................................................ 127 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................134 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt AFLP bp Tiếng Anh Amplified Fragment Length Đa hình độ dài các đoạn Polymorphism khuếch đại Base pair Cặp base Chỉ thị phân tử CTPT DNA Deoxyribonucleic Acid EDTA Ethylene-Diamine-TetraAcetic Acid Đồng tác giả et al. GBS Gb Tiếng Việt Genotyping By Sequencing Xác định kiểu gen bằng phương pháp giải trình tự GigaByte Phản ứng chuỗi trùng hợp KASP Kompetitive Allele Specific PCR LMM Light meromyosin MAS Marker-assisted selection MHC Myosin Heavy Chain Myosin chuỗi nặng mtDNA Mitochondrial DNA DNA ty thể NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự thế hệ thứ mới PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PCI Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol CI Chloroform : Isoamyl alcohol đặc hiệu alen cạnh tranh Meromyosin chuỗi nhẹ Chọn giống dựa trên chỉ thị phân tử QTL Quantitative Trait Loci Locus tính trạng định lượng QC Quality control Kiểm soát chất lượng Restriction Fragment Length Đa hình độ dài đoạn cắt hạn Polymorphism chế RFLP RAPD Random Amplify Polymorphism DNA DNA đa hình được nhân bản ngẫu nhiên vii RNase Ribonuclease SNP Single Nucleotide Polymorphism TE Tris-EDTA IHHNV Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus Đa hình nucleotide đơn Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan tạo biểu mô Virus gây Hội chứng LSNV Laem Singh Virus YHV Yellow Head Virus Virus gây bệnh đầu vàng White Spot Syndrome Virus Virus gây bệnh đốm trắng WSSV VIE Visible Implant Elastomer ĐBSCL chậm lớn Chất màu phát xạ huỳnh quang Đồng bằng sông Cửu Long BTB Bắc Trung Bộ NTB Nam Trung Bộ Nam Bộ NB Nuôi trồng thủy sản NTTS Dòng tôm sú Ấn Độ Dương Dòng A Dòng tôm sú Dòng T Thái Bình Dương Dòng N Dòng tôm sú Nội địa Dòng G Dòng tôm sú Gia hóa Go Tôm sú thế hệ Go G1 Tôm sú thế hệ G1 F Fast Tôm sú lớn nhanh L Low Tôm sú lớn chậm NCBI National Center for Biotechnology Information Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (Hoa Kỳ) viii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Số lượng cá thể thu thập được của bốn dòng tôm sú sử dụng làm vật liệu gốc (tôm bố mẹ) ...................................................... 40 Bảng 2.2. Các nhóm tôm sú sử dụng cho nghiên cứu sàng lọc SNP ........... 40 Bảng 2.3. Thành phần các mồi sử dụng trong kỹ thuật AFLP .................... 42 Bảng 2.4. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ……………………….... 44 Bảng 2.5. Sơ đồ lai tổ hợp toàn phần bốn dòng tôm khác nhau .................. 48 Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của phản ứng khuếch đại tiền chọn lọc .............. 52 Bảng 2.7. Chu trình nhiệt của phản ứng khuếch đại chọn lọc ..................... 53 Bảng 2.8. Danh sách 22 loại protein liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở họ giáp xác ............................................................................... 59 Bảng 2.9. Chu trình nhiệt của phản ứng KASP ........................................... 60 Bảng 3.1. Nồng độ DNA trung bình của các mẫu tôm sú sử dụng trong kỹ thuật AFLP ........................................................................................... 62 Bảng 3.2. Số lượng và vị trí alen của các mẫu tôm sú vùng biển BTB ...... 65 Bảng 3.3. Số lượng và vị trí alen của các mẫu tôm sú vùng biển NTB ...... 69 Bảng 3.4. Số lượng và vị trí alen của các mẫu tôm sú vùng biển NB ......... 72 Bảng 3.5. Kết quả xác định số lượng alen trên các quần đàn tôm sú .......... 76 Bảng 3.6. Kết quả sàng lọc tôm sú bố mẹ đầu vào ...................................... 80 Bảng 3.7. Số lượng gia đình tôm sú thế hệ Go thả nuôi thành công từ 16 phép lai ........................................................................................ 81 Bảng 3.8. Tỷ lệ góp vật liệu di truyền theo dòng ở thế hệ Go ..................... 83 Bảng 3.9. Số lượng các nhóm gia đình tôm sú thế hệ G1........................... Bảng 3.10. Tóm tắt kết quả xử lý dữ liệu giải trình tự GBS ......................... 87 Bảng 3.11. Kết quả chú giải các gen liên quan tính trạng tăng trưởng ở tôm 84 sú ................................................................................................. 90 Bảng 3.12. Kết quả xác định SNP trên contig83953 và contig260347 ......... 91 ix Bảng 3.13. Trình tự amino acid tương ứng của contig83953 và contig260347 ............................................................................... 92 Bảng 3.14. Các tỷ lệ tương đồng cao nhất giữa contig83953 với protein MHC ............................................................................................ 93 Bảng 3.15. Các tỷ lệ tương đồng cao nhất giữa contig260347 với protein MHC ............................................................................................ 93 x DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Tôm sú Penaeus monodon .......................................................... 5 Hình 1.2 Vòng đời của tôm sú ................................................................... 8 Hình 1.3 Cơ sở phân tử của kỹ thuật RAPD .............................................. 15 Hình 1.4 Các bước thực hiện kỹ thuật RFLP.............................................. 16 Hình 1.5 Minh họa đa hình microsatellite .................................................. 17 Hình 1.6 Minh họa SNP trong một đoạn DNA sợi kép ở ba cá thể giả định .............................................................................................. 19 Hình 1.7 Các bước chính trong kỹ thuật AFLP ......................................... 21 Hình 1.8 Các bước cơ bản của kỹ thuật GBS ............................................ 36 Hình 2.1 Mẫu tôm sú ................................................................................. 45 Hình 2.2 Trình tự các adaptor sử dụng trong xây dựng thư viện GBS ..... 55 Hình 2.3 Các bước xây dựng thư viện GBS .............................................. 57 Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm của phản ứng cắt DNA bằng cặp enzyme EcoRI và MseI trên gel agarose 1,5% để kiểm tra hoạt tính của enzyme………………………………………………... 61 Hình 3.2 Điện di sản phẩm của phản ứng tiền chọn lọc ............................ 63 Hình 3.3 Cây phát sinh chủng loại các quần đàn tôm sú thu từ 3 vùng biển Việt Nam ............................................................................. 79 Hình 3.4 Kết quả điện di tự động bằng máy 2100 Bioanalyzer đánh giá thư viện DNA.............................................................................. 85 Hình 3.5 Phân bố độ dài các contig sau tinh sạch ..................................... 87 Hình 3.6 Số lượng SNP ở nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh và nhóm tôm 88 sú tăng trưởng chậm.................................................................... Hình 3.7 Kết quả chú giải gen chức năng ................................................. 89 Hình 3.8 Vùng tương đồng nucleotide giữa mạch bổ sung của contig83953 của tôm sú P. monodon so với trình tự gen MHCa xi ở tôm he Nhật Bản P. japonicas ................................................. 95 Hình 3.9 Vùng tương đồng trình tự amino acid giữa contig83953 của tôm sú P. monodon với protein MHCa ở tôm he Nhật Bản P. japonicas ..................................................................................... 95 Hình 3.10 Vùng tương đồng nucleotide giữa contig260347 so với trình tự gen MHC1 ở tôm sú P. monodon ................................................ 96 Hình 3.11 Vùng tương đồng trình tự amino acid giữa contig260347 với protein MHC1 ở tôm sú P. monodon ........................................... 96 Hình 3.12 Kết quả phân tích tín hiệu huỳnh quang trong kỹ thuật KASP đánh giá tương quan giữa SNP G>A thuộc gen MHC1 với tính trạng tăng trưởng nhanh ở tôm sú ........................................ 98 xii 1 MỞ ĐẦU  Đặt vấn đề Tôm sú Penaeus monodon Fabricius (1798) là một trong những loài tôm có kích thước lớn và được coi là loài thủy sản nuôi kinh tế quan trọng ở nhiều nước trên thế giới. Ở Việt Nam, tôm sú đã và sẽ tiếp tục là một trong những đối tượng nuôi chủ lực cho xuất khẩu thủy sản đem về ngoại tệ cho đất nước. Diện tích và sản lượng tôm nước lợ của nước ta ngày càng tăng. Nhu cầu tôm giống hằng năm là 130 tỷ con (trong đó có 30 tỷ con giống tôm sú). Năm 2016, diện tích nuôi tôm là 649.645 ha với sản lượng 657.282 tấn, giá trị xuất khẩu đạt trên 3,15 tỷ USD. Đến năm 2025, mục tiêu xuất khẩu tôm của Việt Nam đạt 10 tỷ USD; sản lượng 1,1 triệu tấn trên quy mô 750.000 ha; nhu cầu tôm bố mẹ khoảng 500.000 - 600.000 con, trong đó nhu cầu tôm sú bố mẹ là 100.000 con/năm (https://laodong.vn). Chiến lược phát triển ngành nuôi tôm sú ở Việt Nam cũng như ở các quốc gia nuôi tôm trên thế giới là có được ngành sản xuất tôm sú bền vững, hạn chế tối thiểu các tác động tiêu cực đến môi trường, sinh thái. Nền tảng cho chiến lược này là chú trọng phát triển nguồn tôm bản địa với các chương trình nhân giống khoa học để nâng cao tỷ lệ sống và sự tăng trưởng. Để đạt được mục tiêu này, nghiên cứu cấu trúc và chức năng của toàn bộ hệ gen tôm sú là vấn đề khoa học cơ bản có định hướng ứng dụng hết sức quan trọng. Những nghiên cứu chi tiết về genome, transcriptome, proteome và bản đồ gen tôm sú sẽ cung cấp những thông tin sinh học quan trọng giúp cho việc xác định các tính trạng cần thiết như tính kháng bệnh, tính chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường, tính trạng quyết định năng suất và chất lượng của tôm. Các chỉ thị phân tử (CTPT) cũng như các thông tin khác có được từ việc nghiên cứu về hệ gen và lập bản đồ gen tôm sú có vai trò rất quan trọng đối với công tác chọn giống và phát triển ngành công nghiệp nuôi tôm thương phẩm. Trong lĩnh vực nghiên cứu hệ gen tôm sú để phục vụ cho các mục tiêu nói trên, nghiên cứu đa dạng di truyền là một trong những hướng nghiên cứu được quan tâm và có ý nghĩa ứng dụng thiết thực đối với thành công của chiến lược quản lý lâu dài và bền vững nguồn lợi thủy sản. 2 Ngày nay, các CTPT đang ngày càng trở thành công cụ hữu hiệu được ứng dụng rộng rãi để đánh giá đa dạng di truyền, xây dựng bản đồ di truyền, ứng dụng trong nghiên cứu cải tạo, chọn giống tôm chất lượng tốt, sạch bệnh. Trong số đó, chỉ thị đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại chọn lọc (AFLP) được xem là một trong những kỹ thuật hiện đại và hiệu quả cho phép đưa ra nhanh chóng và chính xác một ước lượng độ đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể với nhau. Nhiều kỹ thuật CTPT khác cũng được xây dựng để phát triển các chỉ thị DNA sử dụng rộng rãi cho nhiều mục đích nghiên cứu. Tùy thuộc vào mục đích cụ thể để lựa chọn loại CTPT phù hợp. Đối với mục tiêu chọn giống, đa hình nucleotide đơn (SNP) được xem là một trong những loại CTPT hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay để chọn được các tính trạng quan trọng liên quan đến năng suất và chất lượng giống. Với những thế mạnh vượt trội, các CTPT ngày nay được sử dụng như những công cụ chọn lọc đắc lực đối với các tính trạng quan tâm trong các chương trình chọn giống ở nhiều loài vật nuôi, cây trồng và các loài thủy sản. Việc ứng dụng các CTPT giúp cho các nhà chọn giống nhận diện chính xác các gen quan tâm nhằm rút ngắn thời gian chọn giống. Hiệu quả cải tiến giống sẽ gia tăng gấp nhiều lần so với các phương pháp chọn giống cổ điển nhờ thực hiện việc chọn lọc không cần trực tiếp trên tính trạng mong muốn mà thông qua CTPT liên kết với tính trạng đó. Hiện nay, các nghiên cứu về di truyền phân tử trên đối tượng tôm sú vẫn còn ít và chưa tương xứng với vai trò của một đối tượng nuôi kinh tế quan trọng. Thông tin về các locus tính trạng định lượng (QTLs) liên quan đến tính trạng tăng trưởng hầu như rất hiếm. Vì vậy, việc nghiên cứu xác định mối tương quan giữa các SNP loại biến dị phổ biến nhất trong hệ gen - với tính trạng tăng trưởng ở tôm sú để tạo cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu về chọn giống dựa trên CTPT là hướng nghiên cứu hết sức quan trọng và thiết thực đối với ngành công nghiệp nuôi tôm sú. Trong khuôn khổ của Đề tài “Lập bản đồ bộ gen tôm sú (Penaeus monodon)” thuộc Nhiệm vụ đánh giá di truyền nguồn gen cấp Nhà nước, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu đa hình hệ gen các dòng tôm sú (Penaeus monodon) Việt Nam nhằm phục vụ công tác chọn giống tôm”. 3  Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá đa hình hệ gen các quần đàn tôm sú thu từ các vùng biển Việt Nam; Sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNP) có tiềm năng liên kết với tính trạng tăng trưởng bằng cách áp dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (phương pháp GBS) trên hai nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm.  Nội dung nghiên cứu (1) Đánh giá đa hình hệ gen ba quần đàn tôm sú thu từ các vùng biển khác nhau của Việt Nam bằng kỹ thuật AFLP; (2) Lai hỗn hợp 4 dòng tôm sú bố mẹ khác nhau về nguồn gốc địa lý để tạo vật liệu nghiên cứu thế hệ Go và G1; (3) Áp dụng kỹ thuật xác định kiểu gen bằng phương pháp giải trình tự (GBS) để phân tích hệ gen tôm sú thuộc hai nhóm tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm thế hệ Go và G1 nhằm sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNP) liên quan đến tính trạng tăng trưởng; (4) Sàng lọc chỉ thị SNP G>A ở tôm sú tăng trưởng nhanh bằng kỹ thuật PCR đặc hiệu alen cạnh tranh (KASP) để đánh giá tiềm năng ứng dụng của SNP này đối với việc đánh giá nhanh chóng và chính xác các cá thể tôm nhằm hỗ trợ trong công tác chọn giống tôm sú.  Những đóng góp mới của luận án về mặt khoa học và thực tiễn (1) Luận án là nghiên cứu đầu tiên đưa ra đánh giá về đa dạng di truyền của ba quần đàn tôm sú tự nhiên từ các vùng biển Việt Nam bằng kỹ thuật AFLP. (2) Sàng lọc được bộ chỉ thị SNP ở nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh làm cơ sở cho việc tìm kiếm chỉ thị SNP liên kết với tính trạng tăng trưởng nhanh ở tôm sú. Hai chỉ thị SNP được xác định trong nghiên cứu của luận án là phát hiện đầu tiên về chỉ thị SNP nằm trong exon của gen MHC ở họ giáp xác. Những kết quả này cung cấp dẫn liệu khoa học hữu ích cho việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống tôm sú. 4 Tóm tắt sơ đồ nghiên cứu NỘI DUNG NGHIÊN CỨU BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM Đánh giá đa hình hệ gen các quần đàn tôm sú bằng kỹ thuật AFLP. 1. Thu mẫu tôm sú từ 3 quần đàn BTB, NTB, NB 1. DNA tổng số từ các mẫu tôm sú 2. Kỹ thuật AFLP đánh giá đa hình hệ gen. 2. Đa hình AFLP trong các quần đàn và giữa các quần đàn tôm sú. Tạo vật liệu nghiên cứu: tôm sú thế hệ Go và G1 Sàng lọc SNPs liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tôm sú bằng kỹ thuật GBS. Kỹ thuật dựa trên SNP kiểm G1 tăng nhanh. KASP chỉ thị tra tôm trưởng 1. Thu mẫu 4 dòng tôm sú: A, T, G, N 2. Thiết lập các gia đình tạo thế hệ Go, G1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3. Cây phát sinh chủng loại. 1. Tôm sú bố mẹ sạch bệnh. 2. Tôm sú thế hệ Go, G1 . 1. Tách chiết DNA tôm sú Go, G1. 2. Giải trình tự bằng GBS 3. Sàng lọc SNPs 4. Chú giải gen chức năng 5. Xác định tương quan giữa các contig chứa SNP so với gen MHC 6. Xác định: vùng tương đồng giữa contig chứa SNP so với gen mã hóa protein MHC, codon chứa SNP, vị trí tương ứng của chỉ thị SNP trên gen MHC 1. Thiết kế mồi đặc hiệu dựa trên trình tự chứa SNP G>A của gen MHC. 2. Kiểm tra trên 40 cá thể tôm sú tăng trưởng nhanh thuộc thế hệ G1. 1. Bộ dữ liệu SNP của 2 nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm. 2. Hai chỉ thị SNP nằm trong vùng exon của gen MHC:  SNP Contig83953:g.20T>C trên gen MHCa biến đổi codon AAAAAG, không làm thay đổi acid amin Lysine;  SNP Contig260347:g.19G>A trên gen MHC1 biến đổi codon GGA (mã hóa acid amin Glycine)  GAA (mã hóa acid amin Glutamic). 28 mẫu đồng hợp tử A:A; 2 mẫu đồng hợp tử G:G; 10 mẫu dị hợp tử G:A. 5 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TÔM SÚ Penaeus monodon 1.1.1. Đặc điểm sinh học, phân loại và phân bố địa lý Tôm sú có tên khoa học là Penaeus monodon do Fabricius mô tả và đặt tên năm 1798. Tôm sú là một trong số các loài tôm nuôi quan trọng và được phân loại như sau (Brusca et al., 1990): Giới: Animalia Ngành: Arthropoda Ngành phụ: Crustatacea Lớp: Malacostraca Bộ: Decapoda Bộ phụ: Natantia Siêu họ: Penaeoidea Họ: Penaeidae Giống: Penaeus Loài: monodon Hình 1.1. Tôm sú Penaeus monodon (Nguồn: Nguyễn Hữu Ninh, 2012) Cơ thể tôm sú có màu xanh đậm, có những vân sắc tố trắng đen ở các đốt bụng. Phần còn lại của thân biến đổi từ màu nâu sang màu xanh hoặc đỏ (Hình 1.1). 6 Trong các loài tôm nuôi, tôm sú là loài có kích thước lớn (có thể dài đến 270 mm, nặng 260g hoặc lớn hơn) và là loài tôm thương mại quan trọng (Motoh, 1985). Tôm có các bộ phận: chủy (cứng, có răng cưa, phía trên chủy có 7-8 răng, dưới chủy có 3 răng); mũi khứu giác và râu (cơ quan nhận biết và giữ thăng bằng cho tôm); 3 cặp chân hàm (lấy thức ăn và bơi lội); 5 cặp chân ngực (lấy thức ăn và bò); cặp chân bụng (rf); đuôi (nhảy xa, điều chỉnh bơi lên cao, xuống thấp); bộ phận sinh dục (Motoh, 1985). Tôm sú là loài giáp xác có vỏ kitin bao bọc bên ngoài cơ thể nên sự phát triển của chúng mang tính gián đoạn và đặc trưng bởi sự gia tăng về kích thước và khối lượng. Sau mỗi lần lột xác, cơ thể tôm sú tăng nhanh về kích thước. Quá trình này phụ thuộc vào môi trường nước, điều kiện dinh dưỡng và giai đoạn phát triển của cá thể. Tôm sú thuộc loại dị hình phái tính, con cái có kích thước lớn hơn con đực ở cùng độ tuổi. Khi tôm trưởng thành phân biệt rõ đực cái thông qua cơ quan sinh dục phụ bên ngoài. Cơ quan sinh dục chính của con đực nằm ở phía trong phần đầu ngực, bên ngoài có cơ quan giao phối phụ nằm ở nhánh ngoài đôi chân ngực thứ 2, lỗ sinh dục đực mở ra hốc háng đôi chân ngực thứ 5. Tinh trùng thuộc dạng chứa trong túi. Con cái có buồng trứng nằm dọc theo mặt lưng phía trên, hai ống dẫn trứng mở ra ở khớp háng đôi chân ngực thứ 3. Bộ phận chứa túi tinh gồm 2 tấm phồng lên ở đôi chân ngực thứ 4 và thứ 5 dưới bụng tôm. Tuổi thành thục sinh dục của tôm đực và tôm cái trong tự nhiên là từ tháng thứ tám trở đi (Nguyễn Văn Thường và Trương Quốc Phú, 2009). Vùng phân bố: Tôm sú thuộc loài rộng muối nên chúng có mặt rộng từ Ấn Ðộ Dương sang hướng Nhật Bản, Ðài Loan, phía Ðông Tahiti, phía Tây Châu Phi và phía Nam Châu Úc. Ở nước ta, tôm sú xuất hiện dọc theo bờ biển Ðông và vùng đảo Phú Quốc. Nhìn chung, loài này phân bố từ kinh độ 30oE đến 155oE và từ vĩ độ 35oN đến 35oS xung quanh các vùng xích đạo như: Philipines, Malaysia, Indonesia và Việt Nam. Tôm bột (Postlarve), tôm giống (Juvenile) và tôm gần trưởng thành có tập tính sống gần bờ biển và rừng ngập mặn ven bờ. Khi tôm trưởng thành di chuyển xa bờ (Motoh, 1985). 7 Vòng đời của tôm sú: Tôm sú từ 8 - 10 tháng tuổi đã có thể tham gia sinh sản. Chúng đẻ quanh năm nhưng chủ yếu tập trung ở 2 thời kỳ chính là tháng 3 - 4 và tháng 7 - 10 hàng năm. Tôm cái đẻ trứng nhiều hay ít là phụ thuộc vào chất lượng của buồng trứng và trọng lượng của cơ thể (Phạm Văn Tình, 2004). Vòng đời của tôm sú được chia ra làm các giai đoạn: phôi, ấu trùng, hậu ấu trùng, tôm giống, tôm tiền trưởng thành và trưởng thành (Hình 1.2). - Giai đoạn phôi: giai đoạn này bắt đầu từ khi trứng thụ tinh và phân cắt thành 2, 4, 8, 16, 32, 64 tế bào, phôi dâu, phôi nang, phôi vị đến khi nở. Thời gian hoàn tất giai đoạn này khoảng 12 đến 15 giờ tùy thuộc điều kiện nhiệt độ nước. - Nauplius: chia làm 6 giai đoạn phụ (N1- N6) kéo dài 2 đến 3 ngày, dinh dưỡng bằng noãn hoàng. - Zoae: chia làm 3 giai đoạn phụ (Z1-Z3) kéo dài 4 - 5 ngày, dinh dưỡng chủ yếu bằng tảo khuê. - Mysis: chia làm 3 giai đoạn phụ (M1-M3) kéo dài 3 - 4 ngày, tôm ăn chủ yếu là phiêu sinh động vật như ấu trùng Artemia, Branchionus plicatilis... Hầu hết giai đoạn ấu trùng mất khoảng 9 - 10 ngày, sau đó biến thái sang giai đoạn hậu ấu trùng (Postlarvae). Giai đoạn này tôm bám thành bể, sống đáy, có hình dạng giống như tôm trưởng thành. Ngoài động vật phù du tôm ăn cả mùn bã hữu cơ, sinh vật đáy, 5 - 6 tuần sau trở thành tôm giống. Tôm giống 6 - 8 tháng sau đạt tiêu chuẩn tôm trưởng thành và có thể tham gia sinh sản (Nguyễn Thanh Phương et al., 1999). Tôm đẻ trứng vào ban đêm từ 22 giờ đến 3 giờ sáng ngày hôm sau. Trong tự nhiên tôm thường đẻ một lần trong mỗi chu kỳ lột xác, trong điều kiện nuôi vỗ tôm có thể đẻ nhiều lần (có thể đến 6 lần) (Thạch Thanh et al., 2005). Trong nghề nuôi tôm, mùa vụ nuôi và thời gian thu hoạch tôm sú thương phẩm trong năm tùy thuộc vào điều kiện khí hậu thời tiết của từng vùng (Bộ Thủy sản, 2000). Trong chu kỳ sống, tôm sú có khả năng thích ứng với độ mặn từ 2‰ - 40‰ tùy thuộc vào giai đoạn phát triển. Giai đoạn ấu trùng và thời kỳ đầu của tôm giống, chúng thích nghi độ mặn từ 28 - 32‰. Lớn lên, tôm sú thích ứng với độ mặn giảm dần từ 10 - 15‰, đến cỡ tôm 50 - 70 gam, chúng có thể sống và sinh trưởng nhanh