Tài liệu Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú (penaeus monodon)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN HOÀNG THỊ THU YẾN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC MỘT SỐ GEN THUỘC HỆ MIỄN DỊCH TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 70 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. NÔNG VĂN HẢI 2. TS. PHẠM ANH TUẤN THÁI NGUYÊN - 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS. Nông Văn Hải và TS. Phạm Anh Tuấn đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và hết lòng giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin cảm ơn các cấp Lãnh đạo Đại học Thái Nguyên, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, Khoa Sinh - KTNN và Khoa Sau đại học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Phòng trọng điểm Công nghệ gen, tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng ADN ứng dụng thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đặc biệt là TS. Kim Thị Phƣơng Oanh đã tạo điều kiện về vật chất, phương tiện và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn các cấp Lãnh đạo Trường Đại học khoa học, Khoa Khoa học Sự sống, Phòng ĐT - KH và QHQT đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi về mọi mặt trong suốt quá trình nghiên cứu thực hiện đề tài luận án. Tôi xin cảm ơn tập thể nghiên cứu thực hiện đề tài cấp nhà nước: “Nghiên cứu giải trình tự một phần bộ gen và xây dựng cơ sở dữ liệu genome tôm sú (P. monodon)” thuộc Chương trình Công nghệ sinh học thủy sản 2008-2010, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã tạo điều kiện về kinh phí để tôi thực hiện luận án. Tôi cũng xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, các bạn đồng nghiệp, những người luôn động viên, khuyến khích và giúp đỡ về mọi mặt để tôi có thể hoàn thành công việc nghiên cứu của mình. Thái Nguyên, tháng 8 năm 2012 Tác giả luận án Hoàng Thị Thu Yến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan tất cả các kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu sai tôi xin chị u trách nhiệm hoàn toàn. Thái Nguyên, tháng 8 năm 2012 Tác giả luận án Hoàng Thị Thu Yến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... ii MỤC LỤC ................................................................................................................. iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................... vi DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... viii DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................ ix MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................. 2 3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 1.1. Tôm sú và các bệnh thường gặp ở tôm sú ......................................................... 3 1.1.1. Giới thiệu về tôm sú .................................................................................... 3 1.1.2. Tình hình nuôi và dị ch bệnh tôm sú ở Việt Nam ........................................ 5 1.1.3. Các bệnh thường gặp ở tôm sú ................................................................... 7 1.1.4. Phương pháp phòng và trị bệnh ở tôm sú ................................................. 12 1.2. Hệ miễn dịch tôm sú ........................................................................................ 14 1.2.1. Đáp ứng miễn dịch tế bào ......................................................................... 15 1.2.2. Đáp ứng miễn dịch dịch thể ...................................................................... 21 1.3. Nghiên cứu gen và tiềm năng ứng dụng trong phòng trị bệnh cho tôm su ......... ́ 23 1.3.1. Tình hình nghiên cứu genome tôm sú trên thế giới .................................. 23 1.3.2. Nghiên cứu gen liên quan đến khả năng miễn dị ch ở tôm sú ................... 24 1.3.3. Tiềm năng ứng dụng của gen liên quan đến miễn dị ch trong phò ng trị bệnh ở tôm sú ...................................................................................... 28 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ....................................................... 32 2.1. Vật liệu ............................................................................................................ 32 2.1.1. Thu thập mẫu ............................................................................................ 32 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv 2.1.2. Hóa chất .................................................................................................... 32 2.1.3. Thiết bị ...................................................................................................... 34 2.1.4. Các vi sinh vật được sử dụng trong nghiên cứu ....................................... 34 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 35 2.2.1. Tách chiết RNA tổng số............................................................................ 36 2.2.2. Tinh sạch mRNA ...................................................................................... 37 2.2.3. Tổng hợp cDNA........................................................................................ 38 2.2.4. Thiết kế mồi phân lập một số gen (cDNA) lựa chọn ................................ 41 2.2.5. Khuếch đại gen bằng phản ứng PCR ........................................................ 48 2.2.6. Tinh sạch sản phẩm PCR .......................................................................... 49 2.2.7. Tạo dòng phân tử sản phẩm PCR ............................................................. 49 2.2.8. Xác định trình tự gen (cDNA) ................................................................. 50 2.2.9. Biểu hiện gen ALFPm3 ............................................................................. 50 2.2.10. Phân tích dữ liệu trình tự và xử lý số liệu ............................................... 55 2.3. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận án ................................................... 55 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 56 3.1. Gen Rab7 - protein liên quan đến cơ chế xâm nhiễm của virus ...................... 56 3.1.1. Tạo dòng gen Rab7 từ mẫu tôm sú Việt Nam .......................................... 56 3.1.2. Xác định và phân tích trình tự gen Rab7 .................................................. 58 3.2. Gen syntenin - protein liên quan đến con đường dẫn truyền tí n hiệu ............. 61 3.2.1. Phân lập đoạn 5‟-syntenin từ mẫu tôm sú Việt Nam ................................ 62 3.2.2. Tạo dòng gen syntenin hoàn chỉnh từ mẫu tôm sú Việt Nam ................... 64 3.2.3. Xác định và phân tích trình tự gen syntenin ............................................. 65 3.3. Gen hemocyanin - protein có hoạt tính phenoloxidase ................................... 68 3.3.1. Phân lập đoạn 5‟-hemocyanin từ mẫu tôm sú Việt Nam .......................... 69 3.3.2. Tạo dòng gen hemocyanin hoàn chỉnh từ mẫu tôm sú Việt Nam ............. 72 3.3.3. Phân tích trình tự gen hemoccyanin .......................................................... 74 3.4. Gen Ran - protein điều khiển thực bào............................................................ 76 3.4.1. Tạo dòng một phần đoạn gen Ran từ mẫu tôm sú Việt Nam ................... 77 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v 3.4.2. Phân lập đoạn gen 3‟ và 5‟-Ran ................................................................ 78 3.4.3. Tạo dòng gen Ran hoàn chỉnh từ mẫu tôm sú Việt Nam.......................... 82 3.4.4. Xác định và phân tích trình tự gen Ran .................................................... 83 3.5. Gen caspase - protein tham gia vào cơ chế apoptosis ..................................... 84 3.5.1. Tạo dòng gen caspase từ mẫu tôm sú Việt Nam ...................................... 85 3.5.2. Xác định và phân tích trình tự gen caspase .............................................. 86 3.6. Hệ thống các gen mã hóa protein kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus...... 90 3.6.1. Gen mã hóa protein kháng virus PmAV ................................................... 90 3.6.2. Gen mã hóa peptide kháng khuẩn t ương tự crustin (crustin - like antimicrobial peptide) .............................................................................. 94 3.6.3. Gen mã hóa yếu tố kháng khuẩn (ALF - antiliposaccharide factor)......... 99 3.7. Biểu hiện yếu tố kháng khuẩn tái tổ hợp (rALFPm3) ................................... 105 3.7.1. Tạo cấu trúc vector biểu hiện gen ........................................................... 105 3.7.2. Xác định cấu trúc gen ALFPm3 được chuyển vào genome nấm men........ 108 3.7.3. Xác định đoạn peptide ALFPm3 được biểu hiện.................................... 109 3.7.4. Phân tích hoạt tính của rALFPm3........................................................... 111 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 113 1. Kết luận ............................................................................................................ 113 2. Kiến nghị .......................................................................................................... 114 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .............. 115 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Nghĩa tiếng Anh 5‟UTR Vùng 5‟ không dịch mã 5‟ Untranslated region 3‟UTR Vùng 3‟ không dịch mã 3‟ Untranslated region AAP Mồi neo Abridged anchor primer AFLP Đa hình chiều dài DNA được Amplified khuếch đại polymorphism ALF Yếu tố kháng khuẩn Anti-lipopolisaccharide factor ALFPm ALF dạng 1 ở tôm sú Anti-lipopolisaccharide factor Penaeus fragment length monodon isorform 1 ALFPm3 ALF dạng 3 ở tôm sú Anti-lipopolisaccharide factor Penaeus monodon isorform 3 AMP Peptide kháng khuẩn Antimicrobial peptide apoptosis Tế bào chết theo chương trình Programmed cell death bp Cặp base Base pair B.megaterium Bacillus megaterium Bacillus megaterium cDNA DNA bổ sung Complement DNA DP Mồi suy diễn Degenerate primer DNA Axit deoxyribonucelic Deoxyribonucleic acid dNTPs Hỗn hợp các nucleotide (dATP, Deoxyribonucleoside triphosphate dCTP, dGTP, dTTP) ddNTPs Hỗn hợp các deoxynicleotide Dideoxyribonucleoside triphosphate (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) dsRNA RNA sợi kép Double stranded RNA DEPC Chất khử Rnase Diethyl pyrocarbonate E. aerogenes Vi khuẩn Enterobacter aerogenes Enterobacter aerogenes E. coli Vi khuẩn Escherichia coli Escherichia coli EDTA Axit ethylenediaminetetraacetic Ethylenediaminetetraacetic acid EST Đoạn trình tự gen biểu hiện Expressed sequence tag GSP Mồi đặc hiệu gen Gene specific primer Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vii kb Kb Kilo base LB Môi trường LB Luria Bertani mtDNA DNA ty thể Mitochondrial DNA mRNA RNA thông tin Messenger RNA OD Mật độ quang Optical density ORF Khung đọc mở Open reading frame PCR Phản ứng chuỗi polymerase Polymerase chain reaction PmAV Gen kháng virus ở tôm sú Penaeus monodon antivrus PmRab7 Rab7 ở tôm sú Penaeus monodon Rab7 P. pastoris Nấm men Pichia pastoris Pichia pastoris 3‟RACE Khuếch đại nhanh đầu 3‟ cDNA Rapid amplification of cDNA 3' ends 5‟RACE Khuếch đại nhanh đầu 5‟ cDNA Rapid amplification of cDNA 5' ends rALFPm3 ALF tái tổ hợp ở tôm sú dạng 3 từ Recombinant anti-lipopolisaccharide tôm sú factor Penaeus monodon 3 RNA Axit ribonucleic Ribonucleic acid RNAi RNA can thiệp RNA interference RNase Enzyme phân hủy RNA Ribonuclease RT Enzyme phiên mã ngược Reverse transcriptase RT-PCR PCR bằng enzyme phiên mã ngược Reverse transcriptase-PCR siRNA RNA can thiệp nhỏ Small interfering RNA SNP Đa hình các nucleotide đơn Single-nucleotide polymorphism SSC Dung dị ch Natri citrate Solution sodium citrate TSV Virus gây hội chứng taura Taura syndrome virus UAP Mồi khuếch đại chung Universal amplication primer UPM Hỗn hợp mồi chung Universal primer mix v/p vòng/phút rotor/minute WSSV Virus gây bệnh đốm trắng White spot syndrome virus YHV Virus gây bệnh đầu vàng Yellow head virus YP Môi trường YP Yeast peptone YPD Môi trường YPD Yeast peptone dextrose Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thống kê các gen liên quan đến hệ miễn dị ch ở tôm ............................... 26 Bảng 2.1. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ...................................................... 34 Bảng 2.2. Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu ............................................. 47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh tôm sú ......................................................................................... 3 Hình 1.2. Tôm sú nhiễm WSSV ............................................................................... 10 Hình 1.3. Tôm sú nhiễm YHV .................................................................................. 12 Hình 1.4. Tế bào máu tôm sú .................................................................................... 17 Hình 1.5. Hệ thống hoạt hóa proPO và tổng hợp melanin ........................................ 19 Hình 1.6. Cơ chế đông máu ở tôm ............................................................................ 21 Hình 2.1. Sơ đồ phân lập gen .................................................................................... 35 Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế mồi từ gen đã biết trình tự.................................................. 42 Hình 2.3. Sơ đồ thiết kế mồi từ gen đã biết một phần trình tự đầu 3‟ (Invitrogen) ....... 42 Hình 2.4. Sơ đồ thiết kế mồi từ gen đã biết một phần trình tự đầu 3‟ (Clontech) ......... 43 Hình 2.5. Sơ đồ thiết kế mồi khi biết một phần trình tự đầu 5‟ của gen ................... 43 Hình 2.6. Sơ đồ thiết kế mồi phân lập gen syntenin ................................................. 44 Hình 2.7. Sơ đồ thiết kế mồi phân lập gen hemocyanin ........................................... 44 Hình 2.8. Sơ đồ thiết kế mồi phân lập gen Ran ........................................................ 45 Hình 2.9. Sơ đồ thiết kế mồi để phân lập gen hoàn toàn mới ở tôm sú .................... 46 Hình 2.10. Sơ đồ thiết mồi khuếch đại đoạn gen mã hóa peptide ALFPm3 trưởng thành ............................................................................................. 46 Hình 2.11. Sơ đồ biểu hiện ALFPm3 ........................................................................ 51 Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen Rab7 .................. 57 Hình 3.2. Trình tự gen và amino acid suy diễn của Rab7 ......................................... 58 Hình 3.3. So sánh trình tự nucleotide ở gen Rab7 của tôm sú Việt Nam với trình tự đã công bố ................................................................................... 59 Hình 3.4. Mô phỏng cấu trúc bậc hai và phân tích các motif chức năng của protein Rab7............................................................................................. 60 Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng đoạn 5‟-syntenin ...... 62 Hình 3.6. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của đoạn 5‟-syntenin ........... 63 Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen syntenin ............. 64 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn x Hình 3.8. Trình tự gen và amino acid suy diễn của syntenin .................................... 66 Hình 3.9. So sánh trình tự amino acid của protein syntenin giữa các loài khác nhau ....... 67 Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng đoạn 5‟-hemocyanin ...... 70 Hình 3.11. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của đoạn 5‟-hemocyanin ........ 71 Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen hemocyanin ......... 72 Hình 3.13. Trình tự gen và amino acid suy diễn của hemocyanin ............................ 73 Hình 3.14. So sánh trình tự amino acid của protein hemocyanin giữa các loài ........ 75 Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng một phần đoạn gen Ran .................................................................................................... 77 Hình 3.16. Trình tự nucleotide và amino acid đoạn gen Ran ................................... 78 Hình 3.17. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng đoạn gen 3‟-Ran ........ 79 Hình 3.18. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng đoạn gen 5‟-Ran ........ 80 Hình 3.19. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của gen Ran ....................... 81 Hình 3.20. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen Ran .................. 82 Hình 3.21. So sánh trình tự amino acid của protein Ran giữa các loài khác nhau........ 83 Hình 3.22. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen caspase ........... 86 Hình 3.23. Trình tự nucleotide và amino acid của caspase....................................... 87 Hình 3.24. So sánh trình tự nucleotide của gen caspase của tôm sú Việt Nam với trình tự đã công bố ............................................................................. 88 Hình 3.25. So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein caspase tôm sú với các loài tôm khác nhau ...................................................................... 90 Hình 3.26. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen PmAV .............. 92 Hình 3.27. Trình tự gen và amino acid suy diễn của protein PmAV ........................ 93 Hình 3.28. So sánh trình tự amino acid của protein PmAV...................................... 94 Hình 3.29. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen mã hóa peptide kháng khuẩn tương tự crustin ..................................................... 96 Hình 3.30. Trình tự gen và amino acid suy diễn của gen mã hóa peptide kháng khuẩn tương tự crustin .................................................................. 96 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn xi Hình 3.31. So sánh trình tự amino acid của peptide kháng khuẩn t ương tự crustin ở tôm ............................................................................................ 98 Hình 3.32. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen ALF ............... 100 Hình 3.33. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của ALFPm ..................... 101 Hình 3.34. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của ALFPm3 ................... 102 Hình 3.35. So sánh trình tự nucleotide của gen ALFPm ở tôm sú Việt Nam với trình tự đã công bố ........................................................................... 102 Hình 3.36. So sánh trình tự nucleotide của gen ALFPm3 ở tôm sú Việt Nam với trình tự đã công bố ........................................................................... 103 Hình 3.37. So sánh amino acid suy diễn ALF nhóm I ............................................ 104 Hình 3.38. Mô hình cấu trúc biểu hiện cDNA của ALFPm3 ................................. 106 Hình 3.39. Hình ảnh điện di tạo cấu trúc biểu hiện gen ALFPm3 .......................... 107 Hình 3.40. Xác định gen ALFPm3 trong genome nấm men ở các dòng nấm men ...... 108 Hình 3.41. OD600nm tế bào nấm men P. pastoris biến đổi qua các ngày cảm ứng biểu hiện ......................................................................................... 109 Hình 3.42. Hình ảnh điện di phân đoạn protein dịch nuôi các dòng nấm men tái tổ hợp sau 1 ngày cảm ứng biểu hiện ............................................... 110 Hình 3.43. Hình ảnh điện di phân đoạn protein dịch nuôi các dòng nấm men tái tổ hợp sau 2 ngày cảm ứng biểu hiện ............................................... 110 Hình 3.44. Hoạt tính của rALFPm3 đối với chủng B. megaterium ........................ 111 Hình 3.45. Hoạt tính của rALFPm3 đối với chủng E. aerogenes ........................... 112 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Tôm sú là động vật thủy sản dùng làm thực phẩm mang lại lợi nhuận lớn nhờ xuất khẩu tại nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Những năm đầu thập niên 90 của thế kỷ XX, cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm công nghiệp, “dịch bệnh” ở tôm cũng bắt đầu xuất hiện và lan rộng khắp thế giới. Tác nhân gây bệnh chính phải kể đến là vi khuẩn và virus. Hiện nay, các nghiên cứu cho thấy việc giảm sút sản lượng tôm nuôi liên quan đến bệnh vi khuẩn thường do các vi khuẩn thuộc chi Vibrio spp. Trong đó, loài gây bệnh phổ biến nhất là vi khuẩn phát sáng V. harvey. Các tác nhân gây bệnh do virus bao gồm virus gây bệnh đầu vàng (Yellow head virus - YHV), virus gây bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus WSSV)… được xem là các tác nhân gây bệnh nghiêm trọng nhất và làm thiệt hại đáng kể đến nghề nuôi tôm. Cho đến nay, những hiểu biết cơ bản về sự điều khiển sinh trưởng, sinh sản và đặc biệt là hệ thống miễn dịch ở tôm sú còn rất hạn chế do thiếu những thông tin về genome và sự biểu hiện gen của chúng. Kích thước genome tôm sú là rất lớn (khoảng trên 2 tỉ cặp base = 2/3 bộ gen người), nên việc giải mã toàn bộ genome tôm sú đòi hỏi nhiều thời gian và chi phí lớn, ước tính hàng chục triệu đô la. Vì vậy, một trong những hướng nghiên cứu được lựa chọn là lập bản đồ di truyền liên kết genome tôm sú, lập bản đồ di truyền từ DNA vệ tinh, phân tích trình tự đầy đủ genome ty thể (mtDNA), lập bản đồ gen tôm sú bằng giải mã EST/cDNA, nghiên cứu và phân tích các đoạn trình tự gen biểu hiện (Express sequence tag - EST), lựa chọn các chỉ thị phân tử phục vụ công tác chọn giống, nghiên cứu cấu trúc và chức năng của các gen liên quan. Tôm sú không có hệ thống đáp ứng miễn dịch thích ứng thực sự (adaptive immune system), thay vào đó chúng phát triển hệ thống bảo vệ cơ thể khác được gọi là miễn dịch tự nhiên (innate immunity). Những nghiên cứu về phản ứng tế bào và dịch thể ở tôm khi bị nhiễm vi khuẩn, virus đã được các nhà khoa học rất quan tâm, đặc biệt là xác định và phân tích đặc điểm của các gen tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch. Việc phát triển và ứng dụng rộng rãi Công nghệ sinh học trong lĩnh vực thủy sản đã đóng vai trò quan trọng trong giải thích các quá trình phát sinh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 mầm bệnh, phát triển các phương thức chẩn đoán và phòng ngừa, nhằm duy trì sự ổn định của nghề nuôi tôm, kiểm soát hậu quả dịch bệnh, hạn chế thiệt hại do dịch bệnh ở tôm nuôi. Hiện nay, để xử lý tác nhân gây bệnh là vi khuẩn, thuốc kháng sinh và hóa chất là phương pháp chính được sử dụng. Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này là chi phí mua thuốc lớn, tồn dư kháng sinh có thể đe dọa đến sức khỏe cộng đồng, ảnh hưởng đến môi trường, đồng thời xuất hiện các mầm bệnh kháng thuốc và chúng có thể lây nhiễm cho con người. Mặt khác, đối với các dịch bệnh do virus khi đã xảy ra thì chưa có biện pháp nào trị bệnh. Đến nay, những đáp ứng miễn dịch của tôm đối với nguồn bệnh virus vẫn chưa được sáng tỏ. Do đó, việc nghiên cứu cơ chế miễn dịch của tôm ở mức độ phân tử là cần thiết để đưa ra các giải pháp đúng đắn trong phòng trị bệnh cho tôm. Trong những năm gần đây, ở Việt Nam đã bước đầu có các nghiên cứu nhằm nâng cao chất lượng giống và kiểm soát dịch bệnh ở tôm. Các nghiên cứu tập trung phát hiện bệnh tôm và đưa ra giải pháp phòng bệnh cho tôm. Ngoài ra, một vài cấu trúc protein tái tổ hợp của WSSV đã được tạo ra trong phòng thí nghiệm nhằm mục đích nghiên cứu phòng trị bệnh cho tôm. Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu về các gen liên quan đến hệ miễn dịch tôm sú còn ít được biết đến. Do đó, để góp phần làm sáng tỏ cơ chế phân tử đáp ứng miễn dịch và tạo nguyên liệu cho nghiên cứu phòng trị bệnh ở tôm sú, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú (Penaeus monodon)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập và xác định được trình tự một số gen lựa chọn liên quan đến hệ miễn dịch tôm sú, tạo vật liệu nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ cơ chế đáp ứng miễn dịch và giải pháp trong phòng trị bệnh cho tôm sú; - Bước đầu nghiên cứu tạo peptide kháng khuẩn rALFPm3. 3. Nội dung nghiên cứu - Phân lập một số gen lựa chọn liên quan đến hệ miễn dịch tôm sú được tiến hành theo 3 hướng: các gen đã có thông tin trình tự được công bố; các gen chỉ có một phần thông tin trình tự; gen chưa có thông tin về trình tự. - Thiết kế vector mang gen mã hóa peptide kháng khuẩn, biểu hiện trong nấm men và bước đầu phân tích hoạt tính của peptide tái tổ hợp. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TÔM SÚ VÀ CÁC BỆNH THƢỜNG GẶP Ở TÔM SÚ 1.1.1. Giới thiệu về tôm sú Tôm sú có tên khoa học là Penaeus monodon do Fabricius mô tả và đặt tên năm 1798. Ngoài ra, loài tôm này còn được gọi với tên địa phương là tôm rong [11]. Tôm sú là một trong số các loài tôm nuôi quan trọng thuộc họ Penaeidae và được phân loại như sau [38]. Giới: Animalia Ngành: Arthropoda Ngành phụ: Crustatacea Lớp: Malacostraca Bộ: Decapoda Bộ phụ: Natantia Siêu họ: Penaeoidea Họ: Penaeidae Chi: Penaeus Loài: monodon Cơ thể tôm sú có màu xanh đậm, có những vân sắc tố trắng đen ở các đốt bụng. Phần còn lại của thân biến đổi từ màu nâu sang màu xanh hoặc đỏ (Hình 1.1). Trong các loài tôm nuôi, tôm sú là loài có kích thước lớn (có thể lên đến 330 mm hoặc lớn hơn về chiều dài cơ thể) và là loài tôm thương mại quan trọng [209]. Hình 1.1. Hình ảnh tôm sú [14] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 Tôm sú có nguồn gốc từ Ấn Độ Dương, phía Tây Nam Thái Bình Dương và được nuôi chủ yếu ở các nước châu Á [174]. Loài tôm này sống ở nơi chất đáy bùn pha cát với độ sâu từ ven bờ đến 40 m nước và độ mặn từ 5 - 34 0/00. Tôm sú có khả năng sinh trưởng nhanh, trong 3 - 4 tháng có thể đạt cỡ trung bình 40 - 50 g. Tôm sú trưởng thành tối đa đối với con cái có chiều dài từ 220 - 250 mm, trọng lượng đạt từ 100 - 300 g, con đực dài từ 160 - 200 mm, trọng lượng đạt từ 80 - 200 g. Tôm sú có tính ăn tạp, thức ăn ưa thích là thịt các loài nhuyễn thể, giun nhiều tơ và giáp xác. Về mặt phân bố, ở nước ta tôm sú phân bố từ Bắc vào Nam, vùng phân bố chính là vùng biển các tỉnh Trung bộ [11]. Tôm sú là loài giáp xác có vỏ kitin bao bọc bên ngoài cơ thể nên sự phát triển của chúng mang tính gián đoạn và đặc trưng bởi sự gia tăng đột ngột về kích thước và khối lượng. Sau mỗi lần lột xác, cơ thể tôm sú tăng nhanh về kích thước. Quá trình này tùy thuộc vào môi trường nước, điều kiện dinh dưỡng và giai đoạn phát triển của cá thể. Tôm sú thuộc loài dị hình phái tính, con cái có kích thước lớn hơn con đực ở cùng độ tuổi. Có thể phân biệt con đực và cái thông qua hình dạng cơ quan sinh dục bên ngoài. Tuổi thành thục sinh dục của tôm đực và tôm cái trong tự nhiên là từ tháng thứ tám trở đi [11]. Trong tự nhiên, tôm sú sống trong môi trường nước mặn, sinh trưởng tới mùa sinh sản chúng tiến vào gần bờ đẻ trứng. Tôm cái đẻ trứng nhiều hay ít là phụ thuộc vào chất lượng của buồng trứng và trọng lượng của cơ thể. Sau khi trứng được đẻ 14 - 15 giờ, ở nhiệt độ 27 - 280C sẽ nở thành ấu trùng. Ấu trùng theo các làn sóng biển dạt vào các vùng nước lợ. Trong môi trường này, ấu trùng (larvae) tiến sang thời kỳ hậu ấu trùng (postlarvae) rồi tôm giống (juvenile) và bơi ra biển, tiếp tục chu trình sinh trưởng , phát triển và sinh sản của chúng. Ở mỗi giai đoạn trong chu kỳ sinh trưởng, tôm phân bố ở những thủy vực khác nhau như vùng cửa sông, vùng biển ven bờ hay vùng biển khơi và có tính sống trôi nổi hay sống đáy [11], [145], [174]. Thịt tôm sú là một loại thực phẩm thủy sản rất có lợi cho sức khỏe con người và được ưa thích trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Thực phẩm từ tôm rất tốt cho Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 sức khỏe do chứa các protein năng lượng thấp, ít chất béo, có hàm lượng selenium, amino acid cao, ngoài ra còn là nguồn cung cấp các vitamin cho con người. Nhiều vitamin ở tôm rất cần thiết cho làn da khỏe mạnh, xương và răng như B6, E, A, D và B12.... Hàm lượng vitamin B12, axit béo omega-3 cao ở tôm rất có lợi cho tim mạch, ngăn chặn sự tắc nghẽn mạch máu và bảo vệ chống lại bệnh Alzheimer. Các nghiên cứu trước đây cho rằng: thực phẩm từ tôm có chứa cholesterol do đó ảnh hưởng đến tim mạch. Tuy nhiên, khi so sánh với các thực phẩm khác như trứng thì tôm có hàm lượng cholesterol thấp hơn. Do đó, ăn tôm có thể chống lại bệnh rối loạn nhịp tim và huyết áp cao. Hàm lượng các muối khoáng cao, đặc biệt là selenium ở tôm có vai trò cảm ứng tổng hợp và sửa chữa DNA, loại bỏ các tế bào bất thường, ức chế sự sinh sản tế bào ung thư và gây nên sự chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào. Ngoài ra, selenium còn tham gia vào các vị trí hoạt động của nhiều protein quan trọng, bao gồm cả các enzyme chống oxy hóa [143], [231]. Tôm sú là loài động vật thủy sản được khai thác tự nhiên cũng như nuôi, mang lại lợi nhuận rất lớn nhờ xuất khẩu tại nhiều nước trên thế giới, trong đó có các nước châu Á như Thái Lan, Việt Nam, Hàn Quốc, Đài Loan, Malaysia, Indonesia, Ấn Độ...[174]. Nghề nuôi tôm sú có ưu thế rất lớn đối với các nước này vì đây là nguồn tài nguyên bản địa có thể nuôi và khai thác lâu dài, có đóng góp hết sức quan trọng vào vấn đề an toàn lương thực, xoá đói giảm nghèo và phát triển kinh tế xã hội của mỗi nước. Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), năm 2010, diện tích nuôi tôm sú cả nước đạt 613.718 ha, giá trị xuất khẩu tôm sú đạt 1,45 tỷ USD [16]. 1.1.2. Tình hình nuôi và dị ch bệnh tôm sú ở Việt Nam Nước ta có diện tích mặt nước ngọt, lợ và biển khá lớn, bao gồm các sông, suối, ao hồ và gần 3200 km bờ biển với thành phần giống loài thủy sản phong phú là tiềm năng to lớn để phát triển nuôi trồng thủy sản. Tôm sú là đối tượng nuôi phổ biến ở các vùng nước lợ, mặn trên toàn quốc. Nghề nuôi tôm ở nước ta là một thế mạnh của thuỷ sản, Việt Nam đã trở thành một trong 5 quốc gia xuất khẩu tôm lớn nhất thế giới. Tôm sú Việt Nam đã được xuất khẩu sang hơn 80 nước và vùng lãnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 6 thổ [201]. Duy trì sự ổn định của nghề nuôi tôm phụ thuộc rất nhiều vào nguồn tôm khỏe mạnh và sự kiểm soát dịch bệnh hiệu quả. Một trong những vấn đề mà nghề nuôi tôm sú ở Việt Nam cũng như các nước khác trên thế giới đang phải đối mặt là nguồn tôm sú bố mẹ. Cho đến nay, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhưng gia hóa tôm sú vẫn còn nhiều khó khăn, nguồn tôm sú bố mẹ đã được gia hóa thành công, tuy nhiên tôm bố mẹ gia hóa cấp cho các trại sản xuất tôm giống chưa được nhiều. Hàng năm, ước tính có khoảng hơn 10 tỷ con tôm sú giống giai đoạn PL15 (postlarva 15 - tôm giống 15 ngày tuổi) được sản xuất từ hàng nghìn trại sản xuất tôm giống [3]. Sử dụng nguồn tôm bố mẹ còn mang tính thụ động, tự nhiên, cộng với những yếu tố khác do chính điều kiện sản xuất kinh doanh tại các trại sản xuất tôm giống chi phối thường dẫn đến chất lượng tôm sú giống không được đảm bảo, có dấu hiệu suy giảm sinh trưởng, mang mầm bệnh và tiềm ẩn nhiều rủi ro lớn cho người nuôi tôm. Theo thống kê của Bộ Thuỷ Sản (1995), từ năm 1993 - 1995 dịch bệnh tôm sú đã làm thiệt hại hàng trăm tỷ đồng. Trong năm 1994, tổng diện tích nuôi tôm sú có dịch bệnh là 84.558 ha với sản lượng thiệt hại ước tính là 5.225 tấn, trị giá khoảng 294 tỷ đồng. Đến nay, dịch bệnh vẫn tồn tại và lây lan ngày càng rộng gây tổn thất nghiêm trọng. Đồng bằng sông Cửu Long bị thiệt hại lớn nhất do tập trung khoảng 87% diện tích nuôi tôm sú của cả nước. Hiện tượng tôm chết hàng loạt ở các tỉnh ven biển phía Nam từ năm 1993 - 1994 được xác định ở tôm sú có các loại bệnh chính là bệnh đốm trắng và bệnh đầu vàng… [8], [10], [11]. Nước ta đã bước đầu chú ý đến các nghiên cứu nhằm nâng cao chất lượng giống và kiểm soát dịch bệnh. Các nghiên cứu bước đầu tập trung nghiên cứu đa dạng genome tôm sú [9], phát hiện bệnh tôm sú [3], [4], [13], đưa ra giải pháp phòng bệnh cho tôm sú [2], nghiên cứu một vài protein cấu trúc tái tổ hợp của WSSV trong phòng thí nghiệm nhằm mục đích phòng trị bệnh cho tôm sú [1], [12], [15]. Đây là những hướng nghiên cứu phù hợp và có triển vọng, đặt cơ sở khoa học, kỹ thuật cho phép thực hiện các nghiên cứu nâng cao chất lượng của giống thủy sản có giá trị kinh tế cao này. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 7 1.1.3. Các bệnh thƣờng gặp ở tôm sú 1.1.3.1. Bệnh do vi khuẩn Các vi khuẩn liên quan đến bệnh ở tôm có thể là nguồn bệnh trực tiếp hoặc gây bệnh cơ hội. Bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn ở tôm có thể gây chết, tổn thương kitin, hoại tử, sự đổi màu của mang, tăng trưởng chậm, lớp biểu bì lỏng lẻo, ruột trắng, trạng thái hôn mê và hấp thụ thức ăn giảm… Các vi khuẩn gây bệnh chủ yếu ở tôm nuôi là Vibrio, vi khuẩn dạng sợi, vi khuẩn màng nhày, vi khuẩn phân hủy chitin và vi khuẩn ký sinh [103]. Các loài vi khuẩn thuộc chi Vibrio spp là nguồn gây bệnh chính ở tôm, chúng phân bố rộng rãi trong môi trường nước ngọt, nước lợ và biển. Hơn 20 loài thuộc chi này đã được biết đến, một số trong chúng là nguồn bệnh ở người (V. cholerae, V. parahaemolyticus và V. vulnificus) trong khi một số loài là nguồn bệnh của các động vật ở nước bao gồm tôm (V .harveyi, V. spendidus, V. penaecida, V. anguillarum, V. parahaemolyticus, V. vulnificus). Phần lớn các loài trong chi Vibrio spp được cho là nguồn bệnh cơ hội, một số trong chúng có thể là nguồn bệnh chính như V. harveyi. V. harvey là vi khuẩn phát sáng được tìm thấy trên bề mặt cơ thể và ruột của các sinh vật sống ở nước biển, nước lợ và cũng tìm thấy trong các ao nuôi tôm và đáy ao [95], [189]. Tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy là do Proteobacterium alpha. Các vi khuẩn sợi như Leucothrix mucor, Thiothrix sp, Flexibacter sp, Flavobacterium, Cytophaga sp có thể gây bệnh cho tôm ở giai đoạn ấu trùng. Dấu hiệu của bệnh là màu mang thay đổi, tiêu thụ thức ăn thấp, sinh trưởng kém và tỷ lệ chết cao. Bệnh này xuất hiện khi chất lượng nước kém và ở mật độ nhiễm cao có thể dẫn đến sự hoại tử mô mang. Các vi khuẩn gây bệnh phân hủy vỏ kitin bao gồm: Benekea, Pseudomonas, Aeromonas, chi vi khuẩn xoắn và vi khuẩn ký sinh [103]. 1.1.3.2. Bệnh do nấm và ký sinh trùng Đến nay đã có khoảng 50 loài nấm được phân lập từ môi trường nước lợ và nước biển, một số chúng là nguồn gây bệnh cơ hội cho tôm. Hầu như tất cả các giai đoạn ấu trùng tôm bị nhiễm nấm và tác nhân phổ biến là Lagenidium callinectes và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 8 Sero spp. Giai đoạn protozoae và mysis thường bị nhiễm với các triệu trứng bệnh như hôn mê và gây chết do bào tử nấm và hệ sợi nhiễm vào các mô như phần phụ và mang. Bệnh nấm ở ấu trùng phổ biến ở nơi ươm giống tôm. Gopalan và đtg (1980) cho rằng, Lagenidium marina và Siro para là tác nhân nhiễm ở tôm sú [76], chúng gây chết ở ấu trùng tôm sú giai đoạn nauplii, zoea và mysis [163]. Bệnh mang đen và Fusariosis gây ra bởi Fusarium spp có thể gây ảnh hưởng tất cả các giai đoạn phát triển của tôm penaeid. Fusarium spp (F. solani, F. moniliformae) là các nguồn bệnh cơ hội có thể dẫn đến tỷ lệ chết cao (90%). Bệnh được cho là do các ao nuôi có chất lượng nước kém. Sợi nấm được phát hiện ở mô động vật bị nhiễm bằng sử dụng kính hiển vi quang học [103]. Một số sinh vật ký sinh, đặc biệt là động vật nguyên sinh có thể nhiễm vào tôm ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Các động vật nguyên sinh cùng hội sinh có thể phát hiện được ở mang, chân bơi (periopod), các phần phụ khác và các cơ quan bên trong cơ thể. Ở mức độ nhiễm cao, các động vật nguyên sinh có thể gây tắc nghẽn ở mang (mang trở nên màu nâu) dẫn đến chứng biếng ăn, giảm sinh trưởng, vận động và tăng khả năng nhiễm các nguồn bệnh cơ hội khác. Động vật nguyên sinh như Zoothamnium, Epistylis, Vorticella, Anophrys, Acineta sp, Agenophrys và Ephelota có thể là các ký sinh trùng tác động từ bên ngoài. Các ký sinh trùng như Paranophrys spp và Parauronema sp có thể gây chết cho tôm ở giai đoạn ấu trùng và ấu niên. Các ký sinh trùng này đi vào cơ thể tôm qua vết thương và xâm nhiễm vào máu, mang làm tăng tỷ lệ chết, đặc biệt trong trường hợp có sự xâm nhiễm kết hợp với các ký sinh trùng khác như Leptonmonas spp. Tôm bị nhiễm các ký sinh trùng này có thể chẩn đoán bằng kiểm tra độ đục của máu, máu không đông, lượng tế bào máu giảm và số lượng ký sinh trùng tăng rất lớn. Các động vật nguyên sinh kí sinh bên trong tôm thường tồn tại dưới dạng nhóm, chúng có 2 loại vật chủ là động vật thân mềm (giun đốt) và giáp xác. Các nhóm động vật nguyên sinh được phát hiện ở tôm bao gồm: Nematopsis litopenaeus, Paraphioidina scolecoide, Caphalobolus litopenaeus, Caphalobolus petiti và Caphalobolus stenai. Các bào tử trưởng thành và giao tử được tìm thấy ở thành ruột và các khoang của cơ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn