Tài liệu Nghiên cứu đặc tính enzyme chitinase từ nấm sợi​

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ENZYME CHITINASE TỪ NẤM SỢI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 i ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------- NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ENZYME CHITINASE TỪ NẤM SỢI Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Dƣơng Văn Hợp PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà Hà Nội - 2014 ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Dƣơng Văn Hợp và PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà đã tận tình giúp đỡ, dìu dắt và hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Lê Thị Hoàng Yến, Ths. Nguyễn Anh Tuấn cùng toàn thể cán bộ trong Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC) Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học - Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình hƣớng dẫn và chỉ bảo cho tôi suốt thời gian qua. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn đến gia đình, bạn bè và ngƣời thân đã giúp đỡ và động viên tôi rất nhiều. Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báo nói trên. Hà Nội, tháng 06 năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Hồng Nhung iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1 Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3 1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CHITIN VÀ CHITOSAN ...................................... 3 1.1.1. Chitin ........................................................................................................... 3 1.1.2. Chitosan ....................................................................................................... 4 1.2. SẢN XUẤT CHITIN, CHITOSAN VÀ OLIGO CHITOSAN .......................... 4 1.2.1. Sản xuất chitin, chitosan và oligo chitosan bằng con đƣờng hoá học ......... 4 1.2.2. Sản xuất chitin, chitosan và oligo chitosan bằng con đƣờng sinh học ........ 6 1.3. VAI TRÕ CỦA CHITIN/CHITIN OLIGOSACCARIT .................................... 6 1.3.1. Đối với nông nghiệp .................................................................................... 6 1.3.2. Đối với môi trƣờng ...................................................................................... 7 1.3.3. Ứng dụng trong y học .................................................................................. 7 1.3.4. Trong công nghiệp ....................................................................................... 8 1.3.5. Trong thực phẩm .......................................................................................... 8 1.4. KHÁI QUÁT VỀ CHITINASE.......................................................................... 9 1.4.1. Định nghĩa chitinase .................................................................................... 9 1.4.2. Những nguồn chính sản sinh chitinase ........................................................ 9 1.4.3. Phân loại chitinase ..................................................................................... 11 1.4.4. Cơ chế tác động của các loại enzyme chitinase ......................................... 13 1.4.5. Các đặc tính cơ bản của enzyme chitinase ................................................ 14 1.5. VAI TRÕ CỦA CHITINASE .......................................................................... 17 1.5.1. Trong nông nghiệp ..................................................................................... 17 iv 1.5.2. Trong Y học ............................................................................................... 18 1.6. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME CHITINASE TỪ NẤM SỢI .......... 18 1.6.1. Trên thế giới ............................................................................................... 18 1.6.2. Trong nƣớc ................................................................................................. 20 Chƣơng 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 22 2.1. ĐỐI TƢỢNG .................................................................................................... 22 2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU ........................ 22 2.3. MÔI TRƢỜNG................................................................................................. 22 2.3.1. Môi trƣờng PDA (Potato Dextro Agar) nuôi cấy và giữ giống (g/l) ......... 22 2.3.2. Môi trƣờng LCA (Low Carbon Agar) để phân loại hình thái học (g/l) ..... 23 2.3.3. Môi trƣờng LB (Luria-Bertani)-agar (g/l) ................................................. 23 2.3.4. Môi trƣờng lên men dịch thể (g/l) nghiên cứu chitinase ........................... 23 2.3.5. Môi trƣờng thử hoạt tính enzyme chitinase trên đĩa thạch ........................ 23 2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................... 23 2.4.1. Phƣơng pháp sàng lọc sơ bộ hoạt tính chitinase của các chủng nấm sợi .. 23 2.4.2. Phƣơng pháp nuôi cấy nấm sợi sinh tổng hợp chitinase ........................... 24 2.4.3. Phƣơng pháp định tính enzyme chitinase .................................................. 24 2.4.4. Phƣơng pháp định lƣợng chitinase [58 ..................................................... 25 2.4.5. Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng (TLC- Thin layer chromatography)......... 28 2.4.6. Phƣơng pháp xác định khả năng kháng vi sinh vật ................................... 29 2.4.7. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm sợi ....................................................................................... 29 2.4.8. Tinh sạch sơ bộ enzyme chitinase ............................................................. 31 2.4.9. Điện di SDS-PAGE ................................................................................... 32 v 2.4.10. Xác định hoạt tính chitinase trên Semi-Native PAGE ........................... 33 2.4.11. Xác định một số đặc tính của enzyme chitinase tinh sạch ..................... 34 2.4.12. Phân loại chủng nấm sợi nghiên cứu ...................................................... 35 Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 40 3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CHITIN CAO ............................................................................................................. 40 3.2. KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE CỦA 44 CHỦNG NẤM SỢI ĐÃ TUYỂN CHỌN ............................................................................................ 41 3.3. ĐỊNH LƢỢNG CHITINASE 10 CHỦNG NẤM SỢI TUYỂN CHỌN .......... 42 3.4. NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CHỦNG VN10-1103 ....................................... 43 3.4.1. Đặc điểm hình thái ..................................................................................... 43 3.4.2. Phân loại dựa trên phƣơng pháp sinh học phân tử..................................... 44 3.5. LỰA CHỌN MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY SINH TỔNG HỢP CHITINASE CỦA CHỦNG VN10-1103 .................................................................. 45 3.5.1. Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy................................................................... 45 3.5.2. Lựa chọn pH môi trƣờng ........................................................................... 46 3.5.3. Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy........................................................................ 47 3.5.4. Lựa chọn nguồn carbon ............................................................................. 49 3.5.5. Nồng độ nguồn carbon phù hợp ................................................................ 50 3.5.6. Lựa chọn nguồn nitơ .................................................................................. 51 3.5.7. Ảnh hƣởng của nồng độ nitơ ..................................................................... 52 3.5.8. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy ............................................................. 53 3.6. TINH SẠCH SƠ BỘ CHITINASE .................................................................. 54 3.7. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CHITINASE TINH SẠCH ....... 56 vi 3.7.1. pH tối ƣu cho hoạt động của enzyme ........................................................ 56 3.7.2. Nhiệt độ tối ƣu cho phản ứng enzyme ....................................................... 57 3.7.3. Độ bền nhiệt của enzyme ........................................................................... 58 3.7.4. Độ bền pH của enzyme .............................................................................. 59 3.7.5. Ảnh hƣởng của các ion kim loại ................................................................ 60 3.7.6. Khả năng phân giải cơ chất của enzyme.................................................... 62 3.7.7. Khả năng kháng vi sinh vật của chế phẩm ................................................ 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 65 Tài liệu Tiếng Việt...................................................................................................... 65 Tài liệu tiếng Anh ....................................................................................................... 65 PHỤ LỤC .................................................................................................................... - 1 - vii DANH MỤC VIẾT TẮT T n ầy Viết tắt Axit deoxyribonucleic riboxom ADNr Cacboxymethyl cellulose CMC Đối chứng ĐC Môi trƣờng 1 MT1 Internal Transcripbed Spacer ITS Môi trƣờng 2 MT2 Môi trƣờng 3 MT3 Môi trƣờng 4 MT4 Môi trƣờng 5 MT5 Môi trƣờng 6 MT6 N–acetyl- D- glucosamine GlcNAc Optical Density OD Polymerase Chain Reaction PCR (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Sodium dodecyl sulfat viii SDS DANH MỤC HÌNH ẢNH MINH HỌA Hình 1. Cấu trúc phân tử chitin ...................................................................................... 3 Hình 2. Cấu trúc phân tử chitosan ................................................................................. 4 Hình 3. Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase ở Trichoderma ............................. 14 Hình 4. Đồ thị chuẩn biểu diễn độ hấp thụ của N-acetyl glucosamin ở bước sóng 500nm ............................................................................................................................. 27 Hình 5. Quy trình tinh sạch enzyme chitinase sinh tổng hợp bởi chủng nấm sợi lựa chọn ................................................................................................................................ 32 Hình 6. hả n ng phân giải cơ chất chitin của c c chủng nấm sợi .............................. 42 Hình 7. Hình ảnh khuẩn lạc (A) và bào tử (B) chủng VN10-1103 ............................... 44 Hình 8. Sản phẩmPCR ITS –D1D2 ADNr của chủng VN10-1103 trên gel agarose)... 44 Hình 9. Cây phát sinh chủng loại của chủng VN10-1103 và c c loài có mối quan hệ họ hàng gần, cây được xây dựa vào phân tích trình tự gen ADNr dựa vào trình tự đoạn ITS và D1D2 .......................................................................................................... 45 Hình 10. Hoạt tính chitinase của chủng VN10-1103 nuôi cấy trên c c pH môi trường kh c nhau ........................................................................................................... 47 Hình 11. Hoạt tính chitinase của chủng VN10-1103 nuôi cấy ở c c nhiệt độ kh c nhau ................................................................................................................................ 48 Hình 12. hả n ng sinh chitinase của chủng VN10-1103 trên c c nguồn carbon khác nhau ....................................................................................................................... 49 Hình 13. hả n ng sinh chitinase của chủng VN10-1103 khi nuôi cấy ở c c nồng độ colloidal chitin khác nhau ......................................................................................... 51 Hình 14. hả n ng sinh tổng hợp chitinase của chủng VN10-1103 khi nuôi cấy trên c c nồng độ cao nấm men kh c nhau ............................................................................ 53 Hình 15. hả n ng sinh tổng hợp chitinase của chủng VN10-1103 tại c c thời gian nuôi cấy .......................................................................................................................... 53 Hình 16. Biểu đồ biểu thị c c phân đoạn trong tinh sạch chitinase VN10-1103 .......... 55 ix Hình 17. Sản phẩm điện di SDS-PAGE (A) và Semi-native PAGE (B) của chitinase VN10-1103 ..................................................................................................................... 56 Hình 18. Ảnh hưởngcủa pH lên hoạt tính chitinase của B.bassiana VN10-1103 ........ 57 Hình 19. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt động của chitinase từ B.bassiana VN101103 ................................................................................................................................ 58 Hình 20. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ bền của enzyme chitinase từ B.bassiana VN10-1103 ..................................................................................................................... 59 Hình 21. Ảnh hưởng của pH lên độ bền chitinase của B. bassiana VN10-1103 ........... 60 Hình 22. Ảnh hưởng của c c ion kim loại lên hoạt tính chitinase của chủng VN101103 ................................................................................................................................ 61 Hình 23. hả n ng phân cắt c c cơ chất kh c nhau của chitinase sinh tổng hợp bởi chủng VN10-1103........................................................................................................... 62 Hình 24. hả n ng kh ng Fusarium oxysporum (A) và Shigella flexneri (B) của chế phẩm của chủng VN10-1103 .......................................................................................... 63 x DANH MỤC BẢNG Bảng 1. C c loại m y móc dùng trong nghiên cứu ........................................................ 22 Bảng 2. Nồng độ pha loãng N-acetyl glucosamin (mg/ml) ............................................ 26 Bảng 3. ết quả đo độ hấp thụ của đường N-acetyl glucosamin ở bước sóng 500nm.. 26 Bảng 4. Thành phần bản gel SDS-PAGE (12,5% polyacrylamid) ................................ 32 Bảng 5. Thành phần bản gel semi- native PAGE (12,5% polyacrylamide) ................. 33 Bảng 6. Hoạt tính enzyme chitinase của 438 chủng nấm sợi nghiên cứu..................... 40 Bảng 7. ết quả hoạt tính enzyme của 44 chủng nấm sợi nghiên cứu trên MT1 .......... 41 Bảng 8. Hoạt tính chitinase của 10 chủng nấm sợi ...................................................... 43 Bảng 9. Hoạt tính chitinase của chủng VN10-1103 trên c c môi trường nuôi cấy ...... 46 Bảng 10. hả n ng sinh chitinase của chủng VN10-1103 khi nuôi cấy trên c c nguồn nitơ kh c nhau ..................................................................................................... 51 Bảng 11. ết quả tinh sạch chitinase từ B.bassiana VN10-1103 ................................. 54 Bảng 12. Sàng lọc sơ bộ hoạt tính chitinase của 438 chủng nấm sợi ....................... - 2 - xi MỞ ĐẦU Chitin, chitosan và oligochitosan đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣ: thực phẩm, nông nghiệp, y học, sản xuất mỹ phẩm, bảo quản nông sản, xử lý môi trƣờng…[26]. Chitin là một polysaccharide có nhiều trong cua, tôm, giáp xác, côn trùng và thành tế bào nấm, thực vật [28]. Việt Nam là nƣớc có nguồn thuỷ sản rất dồi dào, công nghiệp chế biến thuỷ sản cũng rất phát triển tạo ra một lƣợng lớn phụ phẩm nhƣ đầu tôm, vỏ cua, mai mực, đó chính là nguồn nguyên liệu phong phú cho công nghiệp sản xuất chitin và các dẫn xuất của nó. Hiện nay, phƣơng pháp hóa học thƣờng đƣợc sử dụng để sản xuất chitin, protein trong đầu và vỏ tôm đƣợc loại bỏ bằng cách xử lý với NaOH, sau đó đƣợc xử lý với axit HCl loãng nhằm loại muối. Sản xuất chitosan và oligo chitosan đƣợc bắt đầu bằng quá trình loại nhóm axetyl từ chitin đƣợc thực hiện nhờ xử lý trong kiềm ở nhiệt độ cao, sau đó chitosan đƣợc xử lý với axit HCl để thu đƣợc sản phẩm là chitosan oligome. Quá trình sản xuất này cần một lƣợng hoá chất rất lớn, sự tích lũy các hóa chất này gây hại cho môi trƣờng, hơn nữa con đƣờng xử lý hoá học làm giảm chất lƣợng cũng nhƣ mức độ an toàn của sản phẩm chitosan. Để giải quyết vấn đề trên, quy trình sản xuất theo con đƣờng sinh học bằng cách sử dụng enzyme chitinase và chitin deaxetylase để sản xuất ra sản phẩm chitin, chitin oligosaccarit, chitosan có chất lƣợng cao, không gây ô nhiễm môi trƣờng đang đƣợc quan tâm. Enzyme chitinase thƣờng gặp trên nhiều loài vi sinh vật, kể cả những loài không chứa chitin, nhƣ vi khuẩn, xạ khuẩn, virut, nấm, côn trùng. Trong đó, nấm là nhóm vi sinh vật có tiềm năng rất lớn trong việc sinh tổng hợp nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, phân giải nhiều hợp chất phức tạp, có vai trò quan trọng trong các chu trình vật chất ngoài tự nhiên. Đặc biệt, nấm có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme thủy phân có hoạt tính cao. Nguồn chitinase từ nấm cho hoạt tính cao, sản lƣợng lớn và ổn định. Với mong muốn tiếp tục nghiên cứu này, đề tài: Nghi n cứu các ặc tính enzyme chitinase từ nấm sợi” đƣợc thực hiện nhằm: a) Tuyển chọn chủng nấm sợi 1 sinh tổng hợp chitinase cao; b) Nắm đƣợc đặc tính enzyme chitinase từ nấm sợi. 2 Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CHITIN VÀ CHITOSAN 1.1.1. Chitin Trong lịch sử, chitin đƣợc phát hiện lần đầu tiên trong cặn lắng dịch chiết của nấm. Chấtnày đƣợcđặt tên"Fungine" đểghi nhớnguồn gốccủa nó[14]. Năm 1823, Odiertách chiếtmột chấttừbọ cánh cứng, màônggọi làchitinhoặc"chiton" (tiếng Hy Lạp có nghĩalàáo giáp). Tuy nhiên, ông đã không phát hiệnsự có mặtcủanitơtrongchấtnày. Odiercuối cùngkết luậnchitincócông thứcgiống nhƣcellulose[47]. Hình1. Cấu trúc phân tử chitin[23] Chitinlàpolymer đứng thứ hai sau sinh khối thực vật trên trái đất vớiƣớc tính sản lƣợng sản xuấthàng nămtừ1010 đến 1011tấn. Chitin là polysaccarit mạch thẳng, công thức chung là (C8H13O5N)ncó thể xem nhƣ là dẫn xuất của cellulose, trong đó nhóm hyđroxyl (-OH) ở nguyên tử C(2) đƣợc thay thế bằng nhóm axetyl amino (NHCOCH3) (cấu trúc I). Nhƣ vậy chitin là poly (N-axetyl-2-amino-2-deoxi-β-Dglucopyranose) liên kết với nhau bởi các liên kết β-1,4- glycoside. Trong đó các mắt xích của chitin cũng đƣợc đánh số giống nhƣ ở glucose[23]. Chitinrất phổ biếnvà có thểđƣợctìm thấyở mộtloạt cácloàinhƣtrongvỏcủađộng vật giáp xác, tronglớp biểu bìcủacôn trùngvà trongcácvách tế bàocủanấmvàmột sốtảo. Làmộtchất rắnvô định hình, chitinmang tính chất đặc trƣng của các nhóm nàylàphần lớnkhông hòa 3 tantrongnƣớc, tan tốt trong axit loãngvàkiềm[34]. Mặc dùchitinđƣợcbiết đến với rất nhiềuứng dụng, nhƣng giá trị lớn nhất của chitin lại là chitosan – một dẫn xuất của chitin nhờ quá trình deacetyl hóa [34]. 1.1.2. Chitosan Chitosan là một dạng chitin đã bị deacetyl hóa, nhờ enzyme chitin deacetylase xúc tác cho việc loại gốc acetyl trong các đơn vị N-acetyl glucosaminetrong phân tử chitin, chitooligosaccharit để tạo thành chitosan, oligo chitosan và glucosamine[34]. Đây là những hợp chất đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: xử lí nƣớc thải, dƣợc học, y học, nông nghiệp và công nghiệp...[34]. Hình 2. Cấu trúc phân tử chitosan[23] Chitosan có một số đặc tính nhƣ sau[34]: - Có màu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị - Là một chất rắn, xốp, nhẹ, hình vảy, có thể xay nhỏ theo các kích cỡ khác nhau. - Không tan trong nƣớc, dung dịch kiềm và axit đậm đặc nhƣng tan trong axit loãng (pH6), tạo dung dịch keo trong, có khả năng tạo màng tốt, nhiệt độ nóng chảy 309 – 3110C. 1.2. SẢN XUẤT CHITIN, CHITOSAN VÀ OLIGO CHITOSAN 1.2.1. Sản xuất chitin, chitosan và oligo chitosan bằng con ƣờng hoá 4 học + Sản xuất chitin: Nguồn chitin thô (vỏ tôm, cua, mai mực…) đầu tiên đƣợc khử khoáng bằng cách xử lý với axit HCl loãng (0,5N-1N) nhiệt độ phòng, thời gian 24h, rửa trung tính. Sau đó mẫu đƣợc xử lý với NaOH (0,5N-1N) để loại protein trong nhiệt độ phòng, thời gian 24h, rửa trung tính, sấy thu đƣợc chitin. Tuỳ thuộc vào loại mẫu mà quá trình xử lý cần lặp lại ở khâu axít hay bazơ để thu đƣợc mẫu chitin tinh khiết. Sản phẩm chitin thu đƣợc dạng bột không màu và tỷ lệ Nacetylglucosamine chiếm 90-95%. Đây là nguyên liệu dùng cho sản xuất chitosan, oligo chitosan [34]. + Sản xuất chitosan: Chitin đƣợc deacetyl hóa bằng cách loại nhóm acetyl bằng NaOH đặc (40-50%) thời gian 12h, nhiệt độ cao (trên 80oC). Sản phẩm chitosan sẽ đƣợc kiểm tra bằng các chỉ tiêu chất lƣợng nhƣ: màu sắc, độ ẩm (%), hàm lƣợng tro (%), hàm lƣợng protetin (%), độ nhớt (cps), độ deacetyl hóa (%), độ tan (%), độ đục (NTU) [34]. + Sản xuất oligo chitosan: Chitosan sau khi thu đƣợc lại đƣợc xử lý với axit HCl để thu đƣợc sản phẩm là oligo chitosan (hay chitosan oligosaccharit) hoặc glucosamine GLcN (dạng monome)[34]. Các quy trình sản xuất chitin đang sử dụng hiện nay là các quy trình hóa học có sử dụng HCl và NaOH ở nồng độ cao, thời gian dài để khử khoáng và protetin nên chất lƣợng chitin, chitosan không cao, đặc biệt là sản phẩm có độ nhớt thấp, độ đục cao. Mặc dù một số nghiên cứu gần đây cho thấy chất lƣợng chitin, chitosan có thể nâng lên khi kết hợp công đoạn tiền xử lý bằng một số axit hữu cơ nhƣ axit acetic và axit benzoic [34]. Tuy nhiên các quy trình hóa học vẫn bộc lộ nhiều nhƣợc điểm nhƣ sử dụng số lƣợng lớn hoá chất (axit, bazơ, chất tẩy rửa ôxy hoá) gây ô nhiễm môi trƣờng, và không đảm bảo an toàn của sản phẩm cho ngƣời tiêu dùng [34]. 5 1.2.2. Sản xuất chitin, chitosan và oligo chitosan bằng con ƣờng sinh học Để giải quyết những nhƣợc điểm trên, quy trình sản xuất chitin, chitosan theo con đƣờng sinh học để sản xuất ra sản phẩm chitin, chitin oligosaccarit, chitosan có chất lƣợng cao, không gây ô nhiễm môi trƣờng đang đƣợc quan tâm. Trong quá trình sản xuất chitin/chitosan theo con đƣờng sinh học, các loại enzyme thƣờng đƣợc sử dụng để thay thế các loại axit và kiềm trong phƣơng pháp hóa học. Legarreta và cộng sự đã sử dụng enzyme protease để tách protein khỏi vỏ tôm thay thế phƣơng pháp hóa học [37]. Hall và Da Silva đã đề xuất phƣơng pháp khử khoáng đơn giản bằng việc sử dụng lên men lactic [37]. Ngoài ra, chitin còn đƣợc tách chiết từ vỏ tôm bằng cách sử dụng enzyme bromelain trong dịch ép vỏ dứa [5]. Quy trình tách chiết chitin nhờ sử dụng bromelain đƣợc tiến hành theo sơ đồ sau: 100g nguyên liệu đƣợc rửa bỏ để loại bớt thịt sau đó hòa cặn vào 300 ml dịch chiết enzyme bromelain (dịch ép bã dứa), 1 ngày thay dịch enzyme 2 lần (sang và chiều); xử lý nhƣ vậy trong thời gian 6-7 ngày, tiến hành rửa sạch thu cặn, xử lý 2 lần với NaOH 1% ở 900C trong 45 phút. Quy trình này hoàn toàn không cần sử dụng HCl để loại khoáng và cần đến một lƣợng kiềm rất ít trong quá trình xử lý [5]. Vỏ tôm sau khi đƣợc khử khoáng và protein thu đƣợc chế phẩm chitin có hàm lƣợng khoáng và protein rất thấp, màu sắc đẹp [5]. Chế phẩm này tiếp tục đƣợc phân đoạn thành các chitin oligosaccarit nhờ enzym chitinase và đƣợc chuyển hóa thành chitosan nhờ enzym chitin deacetylase [9]. 1.3. VAI TRÕ CỦA CHITIN/CHITIN OLIGOSACCARIT 1.3.1. Đối với nông nghiệp Theo các nhà khoa học, chitin là một chất rất hữu ích giúp thực vật phát triển. Nó tham gia vào cơ chế bảo vệ trong thực vật. Sản lƣợng lƣơng thực tăng lên đáng kể khi sử dụng chitin làm phân bón. Ở Mỹ, chitin cũng đƣợc sử dụng trong nông nghiệp do cơ quan bảo vệ môi trƣờng Hoa Kỳ quy định. Bên cạnh đó, 6 trong nông nghiệp và ngành sản xuất rau quả, chitosan đƣợc sử dụng nhƣ thuốc trừ sâu sinh học [34]. Chitin oligosaccarit cũng đƣợc biết đến nhƣ một chất giúp mở nhanh cơ chế kháng của thực vật chống lại sự xâm nhập của một số nấm, do đó, giúp tăng cƣờng khả năng kháng bệnh của cây trồng. Trong một số cây cộng sinh nhƣ đậu và cỏ ba lá, các vi khuẩn cộng sinh sống xung quanh rễ cây có thể giải phóng chitin oligosaccarit tạo ra tín hiệu hình thành các nốt sần ở rễ, là vị trí cho sự cố định nitơ [55]. Sử dụng màng từ chitin và chitosan tạo ra độ thoáng khí cho sản phẩm, duy trì điều kiện tối ƣu trong bảo quản. Màng chitosan cũng khá dai, khó xé rách, có độ bền tƣơng đƣơng với một số chất dẻo vẫn đƣợc dùng làm bao gói [51]. Trong thực tế ngƣời ta đã dùng màng chitosan để đựng và bảo quản các loại rau quả nhƣ đào, dƣa chuột, đậu, bƣởi v.v... 1.3.2. Đối với môi trƣờng Các hợp chất hóa học có mặt trong nƣớc xuất phát từ nhiều nguồn chất thải độc hại chẳng hạn nhƣ các kim loại, thuốc nhuộm, các phân tử chất thơm…gây ô nhiễm môi trƣờng nghiêm trọng, ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời [66]. Bằng cách sử dụng kết hợp một polymer tự nhiên nhƣ chitin và chitosan vào hệ thống xử lý nƣớc ngƣời ta có thểtăng hiệu quả xử lý nƣớc; loại bỏ các hợp chất hóa học tổng hợp độc hại chẳng hạn nhƣ sulfat nhôm và polymer tổng hợp [66]. 1.3.3. Ứng dụng trong y học Nhờ đặc tính làm liền sẹo, oligo chitin đƣợc bổ sung vào thành phần trong các loại băng (nhƣ da nhân tạo, băng giác mạc...), làm chỉ khâu phẫu thuật, cấy ghép nha khoa, tái tạo lại xƣơng và nƣớu răng. Một kỹ thuật đặc biệt hiện nay đang phát triển đó là sử dụng chitin thay thế cho da ngƣời hay da động vật (da nhân tạo) và sản xuất chỉ khâu phẫu thuật có thể hấp thu sau ca mổ và kính sát tròng [34]. 7 Chitin là polymer của N-acetyl glucosamin, trong khi đó N-acetyl glucosamin sau khi deacetyl hóa tạo glucosamin là một đƣờng hiếm cần cho công nghiệp dƣợc và nghiên cứu hóa sinh. Nó làm tăng khả năng hấp thu kháng sinh vào máu cũng nhƣ góp phần điều trị bệnh viêm khớp và các khối u. Ngoài ra, glucosamin còn là vật liệu ban đầu để điều chế các chất trung gian D-arabrinose và D-arabonic acid cần thiết để sản suất riboflavin và vitamine B6 [34]. 1.3.4. Trong công nghiệp Chitin và oligo chitin là một chất có giá trị lớn đối với các ngành công nghiệp. Chitin tham gia vào nhiều quá trình xử lý trong công nghiệp, chẳng hạn nhƣ đƣợc sử dụng làm một chất phụ gia và chất ổn định trong thực phẩm [25]. Bên cạnh đó, chitin đóng vai trò nhƣ một chất kết dính trong thuốc nhuộm, vải và các chất kết dính khác. Từ chitin có thể sản xuất đƣợc màng tách công nghiệp và nhựa trao đổi ion. Trong công nghiệp sản xuất giấy, chitin đƣợc sử dụng nhƣ một chất giúp cải thiện kích thƣớc và độ dai của giấy [25]. Trong lĩnh vực phẫu thuật, chitin đƣợc sử dụng để sản xuất chỉ khâu vết thƣơng, với đặc tính đẩy nhanh quá trình lành vết thƣơng ở ngƣời, mở ra một tiềm năng mới về sản xuất sợi nhân tạo [34]. 1.3.5. Trong thực phẩm Tại châu Âu, Mỹ, Nhật Bản, chitosan đƣợc ứng dụng rộng rãi trong sản xuất, bảo quản thực phẩm và trong phác đồ chế độ ăn kiêng [56]. Vì có đặc tính bẫy lipit” nên chitin đƣợc coi là một chất đột phá có vai trò quan trọng trong ăn kiêng. Với chitosan, khi uống vào đến ruột đƣợc dịch tiêu hoá hoà tan tạo thành dạng gel, sẽ bẫy chất béo (chứa triglycerid và cholesterol) có trong thức ăn thức uống không cho hấp thu vào ruột [56]. Theo nghiên cứu cho thấy rằng 20-30% cholesterol có thể liên kết với chitosan, do đó, làm giảm hàm lƣợng cholesterol trong máu [56]. 8 1.4. KHÁI QUÁT VỀ CHITINASE 1.4.1. Định nghĩa chitinase Trong công nghệ sinh học, chitooligomer đƣợc tạo ra nhờ tác dụng của chitinase[23]. Chitinase là một thành viên của họ enzyme glucoside hydrolyse, đặc trƣng bởi khả năng xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết β-1,4 glycoside giữa C1 và C4 của hai monomer N-acetyl glucosamine trong mạch chitin[22]. Dƣới tác động của các enzyme chitinase, chitin đƣợc chuyển hóa thành các dẫn xuất có trọng lƣợng phân tử thấp hơn: chitooligosacharit, diacetylchitobiose và sản phẩm cuối cùng là N-acetylglucosamine[7,22]. 1.4.2. Những nguồn chính sản sinh chitinase Chitinase đã đƣợc phát hiện trong nhiều loài sinh vật, chẳng hạn nhƣ vi khuẩn, nấm, virut, thực vật và côn trùng, đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình trao đổi chất của chúng[44]. 1.4.2.1. Chitinase vi khuẩn Enzyme chitinase đƣợc tìm thấy ở các vi khuẩn: Chromobacterium,Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio và đặc biệt là nhóm Streptomycetes.Hoạt tính exo và endo của chitinase đã đƣợc xác định ở Streptomyces plicatus, Streptomyces erythraeus, có khối lƣợng phân tử là 30.000 Da, pI 3,7 và pH tối ƣu nhất cho hoạt động của enzyme là 5,0. Chitinase của Streptomyces erythraeus gồm 290 axit amin, và có hai cầu disulfite ở Cys 45-Cys 49 và Cys 265-Cys 272[31]. Trong các môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật, ngƣời ta thƣờng cho thêm chitincơ chất của enzyme chitinase để làm tăng khả năng tổng hợp chitinase đồng thời ổn định hoạt tính enzyme sau quá trình chiết tách. Vi khuẩn tổng hợp enzyme chitinase nhằm phân giải chitin trong môi trƣờng tạo nguồn carbon cho vi khuẩn sinh trƣởng[44]. 1.4.2.2. Chitinase c a nấm 9