Tài liệu Nghiên cứu điều kiện lên men ethanol từ dịch thủy phân rong lục

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI --------------------------------------- PHẠM THỊ MIỀN NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN ETHANOL TỪ DỊCH THỦY PHÂN RONG LỤC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã đề tài: CNTP13B-15 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN THANH HẰNG Hà Nội - 2015 LỜI CAM ĐOAN Học viên: Phạm Thị Miền Nơi đào tạo: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Người hướng dẫn : PGS. TS Nguyễn Thanh Hằng Tên luận văn: Nghiên cứu điều kiện lên men ethanol từ dịch thủy phân Rong Lục. Nội dung cam đoan: Tôi xin cam đoan, trong suốt quá trình nghiên cứu luận văn thạc sĩ, dưới sự hướng dẫn chỉ bảo tận tình của giáo viên hướng dẫn. Tôi đã tiến hành nghiên cứu luận văn một cách trung thực, toàn bộ nội dung trong báo cáo luận văn được tôi trực tiếp thực hiện. Tất cả các nghiên cứu không sao chép từ các báo cáo khoa học, luận văn tiến sĩ, thạc sĩ hay sách của bất cứ tác giả nào. Học viên Phạm Thị Miền i LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thanh Hằng, người thầy đã trực tiếp giúp đỡ và chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình học tập và thực hiện nghiên cứu đề tài. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới tập thể các Thầy giáo, Cô giáo của Viện công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm trường đại học Bách Khoa Hà Nội đã chỉ bảo và cung cấp cho tôi những kiến thức bổ ích cũng như đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu thạc sĩ. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến người thân, bạn bè đã quan tâm giúp đỡ trong suốt quá trình nghiên cứu. Học viên PHẠM THỊ MIỀN ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iii DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................v DANH MỤC BIỂU ĐỔ ........................................................................................... vi MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN .....................................................................................2 1.1. Sự phát triển ethanol từ nguyên liệu rong biển ...........................................2 1.1.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất ethanol trên thế giới. ...........................2 1.1.2. Những nghiên cứu và triển vọng sản xuất ethanol sinh học từ rong biển ở Việt Nam. .............................................................................................................4 1.2. Nguyên liệu sản xuất ethanol từ rong biển...................................................5 1.2.1. Thành phần hóa học và những đặc điểm nổi bật của Rong Lục ...............5 1.2.2. Tiềm năng rong biển sản xuất ethanol. .....................................................6 1.3. Công nghệ sản xuất ethanol từ rong biển...................................................10 1.3.1. Quá trình thủy phân rong biển. ...............................................................11 1.3.2. Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong biển. ........................13 1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men ethanol ..............................16 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................19 2.1. Vật liệu ...........................................................................................................19 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..............................................................................19 2.1.2. Vi sinh vật lên men ethanol ......................................................................19 2.2. Phƣơng pháp phân tích ................................................................................20 2.2.1. Xác định thành phần môi trường lên men ...............................................20 2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng Carbonhydrat tổng số theo phương pháp Dubois .......................................................................................................22 2.2.3. Xác định hàm lượng ethanol theo phương pháp Bennet 1971 ................24 2.2.4. Xác định hàm lượng ethanol theo phương pháp sắc ký lỏng ..................26 2.2.5. Xác định hiệu suất lên men. .....................................................................26 2.2.6 Phân tích xử lý số liệu trên phần mềm excel 2003. .................................27 iii 2.3. Quá trình thực nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục. .........................................................27 2.3.1. Thủy phân rong biển bằng axit . ..............................................................27 2.3.2. Hoạt hóa các chủng nấm men trên môi trường Hasen. ...........................27 2.3.3. Xác định số lượng tế bào nấm men..........................................................27 2.3.4. Tiến hành lên men các chủng nấm men. ..................................................27 2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ ............................................................28 2.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của pH. ...................................................................28 2.3.7. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ..........................................................28 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................29 3.1. Xác định thành phần dịch thủy phân rong lục ..........................................29 3.2. Tuyển chọn các chủng nấm men lên men từ dịch thủy phân rong Lục ..30 3.2.1 Xác định số lượng tế bào nấm men...........................................................30 3.2.2. Theo dõi số tế bào của các chủng nấm men trong quá trình lên men (Thermosacch, Candida ablican, Red ethanol) .................................................30 3.2.3. Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục của Thermosacch..31 3.2.4 Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục của Red ethanol 32 3.2.5. Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục của Candida ablican ...............................................................................................................33 3.2.6. So sánh quá trình sử dụng Cacbonhydrate hòa tan của ba chủng nấm men (Thermosacch, Candida ablican, Red ethanol) .........................................34 3.2.7. So sánh quá trình sinh ethanol của ba chủng nấm men (Thermosacch, Candida ablican, Red ethanol) ..........................................................................35 3.2.8. Xác định hiệu suất lên men của ba chủng nấm men. ...............................36 3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men của Red Ethanol...... 36 3.3.1.Ảnh hưởng của thời gian ..........................................................................36 3.3.2. Ảnh hưởng của pH ...................................................................................37 3.3.3. Ảnh hưởng nhiệt độ..................................................................................38 3.4 Phân tích săc ký quá trình lên men của Red Ethanol. ...............................39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................42 PHỤ LỤC .................................................................................................................45 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học tế bào rong ...............................................................6 Bảng 1.2. So sánh năng suất nuôi trồng của các nguồn sinh khối ..............................8 Bảng 1.3. Vi sinh vật lên men ethanol, buthanol từ sinh khối rong biển ..................15 Bảng 2.1. Các mức nồng độ đường glucose pha loãng và giá trị OD tương ứng đo tại bước sóng 490 nm ...............................................................................23 Bảng 2.2. Các mức nồng độ ethanol pha loãng và giá trị OD tương ứng đo tại bước sóng 580 nm .............................................................................................25 Hình 2.2. Biểu đồ đường chuẩn ethanol đo được từ mẫu chuẩn ...............................26 Bảng 3.1. Thành phần dịch thủy phân rong lục ........................................................29 Bảng 3.2. Số lượng tế bào nấm men của các chủng nấm men nghiên cứu ...............30 Bảng 3.3. Hiệu suất lên men của ba chủng nấm men ...............................................36 v DANH MỤC BIỂU ĐỔ Hình 1.1. Sơ đồ công nghệ sản xuất ethanol từ rong biển ........................................10 Hình 2.1. Biểu đồ đường chuẩn từ các kết quả đo được của mẫu chuẩn .................24 Hình 2.2. Biểu đồ đường chuẩn ethanol đo được từ mẫu chuẩn ...............................26 Hình 3.2. Sơ đồ thể hiện quá trình lên men của Thermosacch đối với dịch thủy phân rong Lục theo thời gian............................................................................31 Hình 3.3. Sơ đồ thể hiện quá trình lên men của Red ethanol đối với dịch thủy phân rong Lục theo thời gian............................................................................32 Hình 3.4. Sơ đồ thể hiện quá trình lên men của Candida ablican đối với dịch thủy phân rong Lục theo thời gian ...................................................................33 Hình 3.5. Quá trình sử dụng cacbonhydrate hòa tan của ba chủng nấm men ..........34 Hình 3.6. Quá trình sinh ethanol của ba chủng nấm men .........................................35 Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình lên men .......................................37 Hình 3.8. Ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men ................................................37 Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men ........................................38 vi MỞ ĐẦU Việt nam có hệ động vật, thực vật vô cùng phong phú, có nhiều gen quý hiếm đặc trưng cho khí hậu nhiệt đới nóng ẩm. Một trong những điều kiện tạo nên sự phong phú và giàu có ấy chính là vùng biển nhiệt đới rộng với bờ dài hơn 3000 km bao bọc hết phía đông và nam đất nước. Một trong những nguồn tài nguyên phong phú và có giá trị mà vùng biển ban tặng cho chúng ta là rong biển. Trên thế giới Rong biển thuộc vào loại tài nguyên có giá trị kinh tế và được khai thác từ nhiều năm nay phục vụ nhiều mục đích khác nhau của nền kinh tế quốc dân. Một trong lĩnh vực sản xuất đang được thế giới quan tâm chính là sản xuất nhiên liệu sinh học nhằm thay thế cho nhiên liệu hóa thạch đang dần cạn kiệt. Rong biển ngoài đa dạng về chủng loại, phong phú về sản lượng, khả năng sinh sản, sinh trưởng nhanh, chúng còn chứa các thành phần hóa học quan trọng như: chất khoáng vô cơ, lipid, protein, cacbonhydrate…Hầu hết sinh khối từ thực vật cạn là gỗ có chứa nhiều lignin, mà hiện nay phương pháp thủy phân lignin này còn gặp nhiều khó khăn. Rong biển không có lignin, do đó qui trình sản xuất nhiên liệu từ rong biển đơn giản và thuận lợi hơn. Đặc biệt hàm lượng carbonhydrate trong một số loài rong rất cao từ 40%- 79,4% cùng với hiệu suất chuyển hóa của quá trình lên men ethanol khoảng 70%. Bên cạnh đó, rong biển có sản lượng tự nhiên lớn, vòng đời sinh trưởng ngắn, dễ thu hoạch, giá thành rẻ, không cạnh tranh với đất nông nghiệp, không sử dụng nước ngọt. Đây là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho công nghệ sản xuất cồn sinh học tại Việt Nam. Mục đích nghiên cứu: nghiên cứu điều kiện lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục và ứng dụng trong sản xuất cồn nhiên liệu. Đối tƣợng nghiên cứu: Rong lục Chaetomorpha sp Ý nghĩa khoa học của đề tài: Góp phần tìm nguồn nguyên liệu mới thay thế cho các nguồn nguyên liệu phổ biến trong sản xuất bioethanol hiện nay đang ảnh hưởng đến an ninh lương thực và chất đốt. Tìm ra những điều kiện lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục và ứng dụng sản xuất cồn nhiên liệu. 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. Sự phát triển ethanol từ nguyên liệu rong biển. 1.1.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất ethanol trên thế giới. Xã hội ngày càng phát triển, nhu cầu năng lượng ngày một tăng, kéo theo đó nguồn cung dầu mỏ ngày càng lớn. Nhằm đối phó với giá dầu không ngừng tăng, nhiều quốc gia trên thế giới đề ra biện pháp khẩn cấp nhằm khuyến khích phát triển các nguồn nhiên liệu thay thế, trong đó sản xuất nhiên liệu sinh học được nhiều nước lựa chọn vì lợi ích lớn về kinh tế và môi trường. Với sự phát triển mạnh mẽ khoa học kỹ thuật nhiều loại nhiên liệu có nguồn gốc sinh học đã được phát hiện và ứng dụng rộng rãi. Phân tích tổng thể toàn bộ quá trình sản xuất cho thấy nhiên liệu sinh học có lợi thế hơn so với nhiên liệu hóa thạch. Từ việc giảm được lượng Carbon khí thải dẫn đến hiệu ứng nhà kính đến việc nhiên liệu sinh học ít độc hại và có thể phân hủy tạo ra các chất gây ô nhiễm ít hơn so với nhiên liệu dầu khí. Trong tất cả các loại nhiên liệu đã được phát hiện, ethanol là nhiên liệu được sử dụng phổ biến nhất trên nhiều quốc gia. Ethanol là nhiên liệu sinh học dễ sản xuất, có nguồn nguyên liệu sản suất đa dạng và phong phú. Các nguồn nguyên liệu đã được nghiên cứu sản xuất ethanol bao gồm lignocellulose từ gỗ, phụ phẩm nông nghiệp, tinh bột từ các loại hạt, đường mía, rong tảo. Trong đó các nguồn sinh khối từ gỗ, phụ phẩm nông nghiệp, đường mía, tinh bột là những nguyên liệu gây tác động đến an ninh lương thực, kỹ thuật sản xuất và môi trường sản xuất. Do vậy rong tảo biển là nguồn sinh khối thích hợp cho sản xuất bioethanol. Rong biển có thể được coi như là vũ khí chống lại sự ấm dần của Trái Đất. Sinh khối rong biển là nguồn polysaccharid vô tận và rong Lục là rong có chứa nhiều loại đường thích hợp cho sản xuất ethanol. Trên thế giới, nhiều quốc gia đang tập trung nghiên cứu sản xuất ethanol từ nguồn sinh khối rong biển, số lượng các nghiên cứu ngày một gia tăng và quy mô ngày càng lớn. 2 Ở Đan Mạch, các viện nghiên cứu và trường đại học như National Evironmental Research Institute (NERI), Technological University of Denmark (Rio DTU), Danish Technology Institute đã chuẩn bị dự án nghiên cứu tiềm năng sản xuất Ethanol từ rong lục Ulva sp. Ở Irael, với dự án kỹ thuật xanh “Green Technology”, đã sản xuất thành công ethanol từ rong biển và tính toán được rằng cứ 5 kg rong khô sẽ sản xuất được 1 lít nhiên liệu sinh học. (Irael Seambiotic Ltd) Dự án giữa Indonesia và Hàn Quốc phát triển nhiên liệu sinh học dựa trên các nguồn nguyên liệu rong biển của Indonesia và sử dụng công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học của Hàn Quốc. Tương tự một dự án giữa chính phủ Philippin và Viện Kỹ thuật công nghệ Hàn Quốc, đầu tư 5 triệu USD để trồng 250 acre rong biển và sản xuất ethanol từ công nghệ Hàn Quốc. Dự án Sea Gardens Project của trường University of Costa Rica với tài trợ của World Bank để nuôi trồng rong biển sản xuất bioethanol. Dự án Biomara, phối hợp giữa Hiệp hội Khoa học Biển Scotland và Liên minh châu Âu với sự điều hành của 2 chính phủ Ailen và Scotland, với mục tiêu sản xuất nhiên liệu sinh học thế hệ thứ ba từ sinh khối tảo. Đã đầu tư 8 triệu USD vào năm 2009, để đánh giá tiềm năng rong biển và chọn dòng miccroalgae để sản xuất quy mô công nghiệp. Tại Hàn Quốc, dự án 275 triệu USD trong 10 năm để sản xuất 400 triệu gallon vào năm 2020 xấp xỉ 13% nhu cầu tiêu thụ trong nước. Dự án sẽ nuôi trồng rong biển trên diện tích 8.600 ha. Tại Chile, dự án sản xuất ethanol từ rong biển của Chile giữa BioArchitecture Lab (BAL) với Công ty dầu khí ENAP và trường Đại học Los Angeles. Đã đầu tư 5 triệu USD từ năm 2010 để sản xuất 165 triệu lít ethanol vào năm 2012. Tại Ý, dự án giữa thành phố Venice JV và Nhà máy điện, đã đầu tư 200 triệu Euro để sản xuất 40 MW bằng nhiên liệu từ rong biển cung cấp cho 1/2 nhu cầu 3 điện của thành phố và cảng. Tại Mỹ, các công ty tham gia vào dự án Nghiên cứu Năng lượng sản xuất nhiên liệu từ rong biển gần đây và đã được Oilgae (2010) thống kê vào danh sách các công ty tham gia sản xuất nhiên liệu sinh học từ rong biển. Năm 2007, các nhà nghiên cứu của trường Đại học Công nghệ và Khoa học biển (Tokyo University of Marine Science and Technology), viện nghiên cứu Mitsubishi (Mitsubishi Research Institute), Viện Công nghiệp nặng (Mitsubishi Heavy Industries) có kế hoạch triển khai dự án mang tên “Ocean Sunrise Project”, dự án sẽ thành lập nông trại rong biển và xây dựng nhà máy sản xuất ethanol từ rong biển. Dự kiến sản xuất 5,3 tỉ gallons ethanol mỗi năm. Tại Nhật, dự án Sunrise [12] sản xuất biethanol từ rong biển Sargassum được nuôi trồng ở ngoài biển Nhật Bản. Kế hoạch của họ bắt đầu vào năm 2012, phát triển công nghệ nuôi rong biển vào năm 2016, và thiết lập một quy trình sản xuất khoảng năm 2020. Tại Na Uy, dự án sản xuất ethanol và các sản phẩm Lipids, Proteins, Iodine từ rong biển theo quỹ tài trợ của BAL’s R&D bắt đầu từ cuối năm 2010. 1.1.2. Những nghiên cứu và triển vọng sản xuất ethanol sinh học từ rong biển ở Việt Nam. Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa với hệ thống sông suối dày đặc cùng hơn 3260km bờ biển, 3000 đảo và quần đảo đã tạo ra hệ sinh thái ngập mặn có diện tích vô cùng lớn, điển hình là hệ sinh thái rừng ngập mặn, chuỗi đầm phá ven biển, hệ cửa sông. Các hệ sinh thái này là môi trường thích hợp cho các đối tượng rong Lục phát triển. Vì thế, ở Việt Nam đã hình thành hướng nghiên cứu chuyển hóa sinh khối rong biển thành nhiên liệu sinh học ethanol. Nhóm nghiên cứu đề tài Biomass, xử lý chế phẩm nông nghiệp do tiến sỹ Phan Đình Tuấn trường Đại Học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh phụ trách. Năm 2004 phân viện vật liệu thành phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu hình 4 thành sản xuất dầu biodiesel từ mỡ động vật. Trong đó nhóm nghiên cứu của tiến sỹ Nguyễn Đình Thành đã ra mắt công nghệ dầu biodiesel từ mỡ cá ba sa, cá tra tại tỉnh An Giang nhằm giải quyết lượng mỡ thừa. Phòng nghiên cứu tảo của Viện Công Nghệ Sinh Học đã và đang nghiên cứu diesel sinh học được sản xuất từ sinh khối vi tảo của Việt Nam. Ngoài ra còn một nhóm nghiên cứu quá trình tiền xử lý và chuyển hóa sinh khối rong Lục (Enteromorpha intestinalis ) thành đường lên men ứng dụng trong công nghệ sản xuất ethanol của Viện Sinh học Nhiệt đới. [1] Tuy vậy các nghiên cứu trên vẫn còn đang đứng trên nhiều thách thức và mới chỉ được tiến hành trên quy mô phòng thí nghiệm. 1.2. Nguyên liệu sản xuất ethanol từ rong biển. 1.2.1. Thành phần hóa học và những đặc điểm nổi bật của Rong Lục Rong Lục là thực vật bậc thấp có khả năng quang tự dưỡng, tổng hợp các chất hữu cơ xây dựng tế bào. Trong rong Lục có chứa lượng lớn sắc tố diệp lục vì vậy rong có khả năng tổng hợp ra tinh bột và cellulose cao. Theo nghiên cứu của tác giả Võ Thành Trung – viện công nghệ và ứng dụng Nha Trang cho thấy trong thành phần hóa học của một số loài rong lục hàm lượng carbonhydrat là cao nhất, hàm lượng này chiếm trên 50% trong đó hàm lượng cellulose chiếm khoảng 50%. Ngoài ra theo kết quả của tác giả, loài rong Lục Cladophora socialis đã được tiến hành thủy phân và lên men ethanol thành công. Dưới đây là thành phần hóa học của một số loài rong biển: 5 Bảng 1.1. Thành phần hóa học tế bào rong [20] Rong Rong Lục Rong Đỏ Rong Nâu Tỷ lệ nước. % 70 – 85 70 – 80 79 – 90 Chất khoáng. % 10 – 25 25 – 35 30 – 50 Carbonhydrat. % (thành phần) Protein. % 25 – 50 Cellulose, tinh bột 10 – 15 30 – 60 (Agar, Carrageenan) 7 – 15 30 – 50 (Alginate, Fucoidan) 7 – 15 Lipits. % 1–2 1-5 2–5 1.2.2. Tiềm năng rong biển sản xuất ethanol. 1.2.2.1. Nhiên liệu sinh học từ rong biển Nhiên liệu sinh học như ethanol và buthanol được sản xuất từ rong biển thông qua quá trình chuyển đổi sinh học từ sinh khối rong biển bằng nấm men hoặc vi khuẩn. Bởi trong thành phần rong biển giàu carbonhydrat chính là lợi thế để sử dụng cho quá trình lên men sản xuất nhiên liệu sinh học. Sinh khối rong biển có thể thu được bằng nuôi trồng hay thu thập rong biển trôi dạt trong tự nhiên. Sau đó được rửa bằng nước để đảm bảo quá trình lưu trữ và vận chuyển cho quá trình sản xuất sau này. Trong sản xuất ethanol sinh học, rong biển được thủy phân để giải phóng đường sau đó có thể được dùng cho sản xuất ethanol hoặc các nhiên liệu cao cấp khác. 1.2.2.2. Lợi ích của việc sản xuất nhiên liệu sinh học từ rong biển Mặc dù trên thế giới đã hình thành nhiều hướng nghiên cứu và phát triển sản xuất nhiên liệu sinh học tuy nhiên vẫn còn gặp nhiều thách thức. Hiện nay, hai phương pháp khả thi nhất cho sản xuất nhiên liệu sinh học quy mô lớn là sản xuất ethanol từ ngô, mía và diesel sinh học từ cây dầu như dầu đậu nành hoặc dầu cọ, những loại cây lương thực bởi đó là nguồn nguyên liệu dễ kiếm, chứa nhiều tinh bột, đường hoặc dầu…. Tuy nhiên thực trạng cây lương thực chỉ đáp ứng một phần 6 nhỏ chứ không thể đáp ứng hoàn toàn nhu cầu sử dụng nguyên liệu thay thế. Hơn nữa, nhu cầu sử sụng cây lương thực làm nguyên liệu cho sản xuất nhiên liệu sinh học dẫn đến những lo ngại về sự khan hiếm nguồn thực phẩm, giá thành các mặt hàng thực phẩm tăng cao cùng với những lo ngại về ô nhiễm môi trường đất nông nghiệp. Nguồn nguyên liệu thay thế đáng tin cậy được tập trung nghiên cứu sâu rộng là nguồn nguyên liệu phi thực phẩm như chất thải nông nghiệp, chất thải gỗ, hoặc rong biển,… Đặc biệt, nguồn sinh khối rong biển thực sự là nguồn nguyên liệu chiếm ưu thế vì nó không chỉ có giá thành thấp, diện tích nuôi trồng có thể thay đổi, không gây ảnh hưởng tới an ninh lương thực và sự cạnh tranh về đất nông nghiệp. Tại Mỹ đã có hàng trăm ngàn ôtô chạy bằng ethanol sản xuất từ ngũ cốc và xăng chạy xe được trộn đến hơn 40% ethanol. Thứ nhiên liệu này ra đời từ quy trình lên men ngô hoặc lúa mạch. Tuy nhiên thứ rượu của ôtô này đang bị chỉ trích. Một mẫu ngô mỗi năm chỉ cung cấp gần 4.000 lít ethanol và để sản xuất một lít ethanol phải tiêu tốn 8.000 lít nước ngọt. Bên cạnh đó, đất nông nghiệp quý giá để sản xuất lương thực bị mất đi. Vụ ngô năm ngoái, lần đầu tiên nông dân Mỹ thu hoạch ngô để sản xuất ethanol nhiều hơn là để chăn nuôi. Sản xuất nhiên liệu sinh học bùng phát đã đẩy giá lương thực, thực phẩm tăng vọt. Vì thế hiện nay nhiều nhà sinh thái học cho rằng trồng trọt các loại cây năng lượng là hướng đi sai trái. Trong khi đó tảo không cần đất nông nghiệp. Mặt trời, nước mặn, một chút phân bón và CO2 là đủ để loài sinh vật nhỏ bé này sinh trưởng. Vì khi quang hợp, chúng tiêu thụ lượng CO2 tương tự như lượng CO2 thải ra khi đốt dầu được sản xuất từ chúng, nên nhiên liệu tảo vô hại với khí hậu. Một kết quả so sánh dưới đây chứng minh sản xuất cồn sinh học từ rong biển thuận lợi hơn so với thực vật trên cạn 7 Bảng 1.2. So sánh năng suất nuôi trồng của các nguồn sinh khối Thực vật trên cạn Thực vật biển Đường- Tinh bột Nguyên liệu thô Thời gian thu hoạch Năng suất (tấn tươi/ha) Khả năng hấp thụ CO2 (tấn/ha) Quá trình sản xuất Điều kiện nuôi trồng Gỗ Đường, bắp, các Rong biển Gỗ mục, giấy Các loài rong biển 1-2 lần/ năm Ít nhất 8 năm 4-6 lần/ năm 180 9 565 5-10 4,6 36,7 Phức tạp Đơn giản (do tách ligin) (không chứa ligin) loại củ Đơn giản Ánh sáng, CO2, Ánh sáng, CO2, thuỷ lợi, đất, phân thuỷ lợi, đất, bón phân bón Ánh sáng, CO2, nước biển Tảo biển như một nguồn nguyên liệu hấp dẫn cho sản xuất nhiên liệu thay thế cho nhiên liệu hóa thạch. Tảo bao gồm các sinh vật quang hợp sống dưới nhiều môi trường khác nhau và chịu áp lực của tất cả các hệ sinh thái trên trái đất. Trong điều kiện bình thường tảo sử dụng ánh mặt trời và CO2 trong không khí cho quá trình đồng hóa được khai thác để sản xuất nhiên liệu sinh học. Tảo biển có rất nhiều lợi thế, thứ nhất, tảo biển có hiệu suất chuyển đổi photon tương đối cao và có thể nhanh chóng tổng hợp sinh khối từ chính những nguồn lực dồi dào trong tự nhiên như ánh sáng mặt trời, CO2 , và các chất dinh dưỡng vô cơ. Ngoài ra tảo biển còn có khả năng cố đinh CO2 tốt hơn. Thứ hai, tảo biển không chứa hemicellulose và ligin – thành phần cốt lõi tạo cấu trúc cho hầu hết thực vật trên đất liền, điều đó giúp quá trình lên men diễn ra một cách dễ dàng hơn. Cuối cùng, tảo biển không cạnh tranh 8 đất canh tác với cây lương thực, nó có thể thích ứng và sống dưới nhiều môi trường khác nhau như nước ngọt, nước mặn, nước thải sinh hoạt. Khả năng phát triển của tảo biển trong việc sản xuất nhiên liệu sinh học là một yếu tố vô cùng quan trọng trong việc sản xuất nhiên liệu sinh học ổn định và bền vững trong tương lai. Cho đến nay các nhà nghiên cứu đã tìm thấy trong ngành rong Lục có trên dưới 360 chi và hơn 5700 loài, phần lớn là sống trong nước ngọt, còn nước mặn chủ yếu là những chi sau đây : Monostroma, Enteromorpha, Ulva, Ulothrix, Rhizoclonium, Cladophora, Chaetomorpha, Cladophoropsỉs, Boergesenm, Valonia, Valoniopsis, Struvea, Boodlea, Microdyction, Caulerpa, Bryopsis, Codium, Acetabularia v.v... Nét đặc trưng nhất của các loài trong ngành là có màu lục, sản phẩm quang hợp là tinh bột. Về cấu tạo, rong có dạng một tế bào đơn giản hoặc chia nhánh phức tạp; nhiều tế bào dạng phiến, dạng sợi, chia nhánh hoặc không; trừ một vài trường hợp rong chỉ là một tế bào trần không có vỏ, còn đại đa số đều có vỏ riêng bằng chất pectin hoặc cellulose. Chất nguyên sinh thành lớp mỏng, ngay sát thành vỏ tế bào; giữa tế bào là một túi lớn (vacuole) chứa dầy dịch bào. Trong chất nguyên sinh còn có những túi nhỏ chứa sản phấm của quá trình trao đổi chất. Đường trong rong lục gồm cellulose, tinh bột, xylane, mannose, fructan, paramylon. Trong đó cellulose và tinh bột là 2 thành phần chính, cellulose và tinh bột khoảng 40-50% [16]. Do vậy khi thủy phân rong lục sẽ thu được một lượng lớn glucose, ngoài ra glucose còn được thu nhận từ thủy phân paramylon (β-1,3glucan), tạo ra nguồn glucose dồi dào. Rong lục rất thích hợp làm nguồn nguyên liệu để sản xuất ethanol. Rong lục với thời gian sinh trưởng phát triển nhanh, năng suất vượt trội so với rong đỏ và rong nâu. Nguồn sinh khối từ rong lục sẽ là sự lựa chọn thích hợp cho sản xuất ethanol. 9 1.3. Công nghệ sản xuất ethanol từ rong biển. Hình 1.1. Sơ đồ công nghệ sản xuất ethanol từ rong biển Rong nguyên liệu Chủng giống Rửa mặn Cắt/nghiền Dịch đường Lên men Xử lý sơ bộ Thủy phân Chưng cất Tách nước Thu hồi ethanol Sau thu hoạch, rong biển được tiền xử lý và thủy phân. Hầu hết các dạng sinh khối phải được xử lý trước khi ứng dụng sản xuất nhiên liệu sinh học. Bước đầu tiên của tiền xử lý là loại bỏ sơ bộ các mảnh vụn như đá, cát, ốc, hoặc rác có trong sinh khối thường thao tác bằng tay hoặc rửa [15]. Sau đó, sinh khối được xay nhỏ giảm diện tích bề mặt giúp nâng cao hiệu quả của quá trình thủy phân [26]. Cuối cùng, sinh khối được làm mất nước 20-30% để kéo dài thời gian bảo quản và giảm chi phí vận chuyển trong trường hợp phải được bảo quản trong thời gian dài hoặc vận chuyển trên quãng đường dài trước khi tiếp tục xử lý [15,26]. Theo các tác giả rong biển tươi sau thu hoạch được loại tạp, loại muối sau đó rong được sấy khô mang lưu giữ chuẩn bị cho quá trình thủy phân. Trước khi thủy phân rong được xử lý cơ học, xây nghiền nhằm làm nhỏ kích thước rong giúp cho 10 quá trình thủy phân diễn ra dễ dàng. Thủy phân là quá trình phân hủy các polysaccharid thành các oligo-monosaccharid. Quá trình này được tiến hành dưới xúc tác của nhiệt độ cao kết hợp với hóa học (axit, base), hoặc sinh học (enzym) Kết quả của quá trình thủy phân tạo ra hỗn hợp dung dịch đường và bã rong. 1.3.1. Quá trình thủy phân rong biển. Sau khi tiền xử lý, quá trình thủy phân sinh khối rong biển được diễn ra, các dạng polysaccharid bị thủy phân thành monosaccharid làm nguyên liệu cho quá trình lên men. Rong biển được thủy phân bằng hai phương pháp chính gồm thủy phân bằng axit và thủy phân bằng enzyme. Thủy phân bằng axit Dưới xúc tác của axit các polysaccharid của rong sẽ bị cắt nhỏ thành các oligo hoặc mono saccharid. Axit chứa ion H+ có tác động trực tiếp đến polyme saccharid tại các liên kết mắt xích nối các monosacchadid tạo ra các oligo hoặc monosaccharid. Quá trình thủy phân rong của axit tạo ra hỗn hợp dung dịch đường cần cho quá trình lên men ethanol. Các dạng acid sử dụng thủy phân sinh khối rong có tính oxi hóa mạnh (HCl, H2SO4, HCHO….) nhưng đa phần trong các nghiên cứu thủy phân sinh khối rong biển các tác giả thường sử dụng acid H2SO4 với nồng độ dao động (0,1-5 % V/V) kết hợp nhiệt độ cao (120-200 oC). Ngoài thủy phân bằng axit ta còn có thể tiến hành thủy phân bằng enzym. Thủy phân bằng enzym giúp quá trình thủy phân đạt hiệu quả triệt để hơn tuy nhiên, trong phạm vi của bài tập trung vào quá trình lên men lên lựa chọn thủy phân bằng axit sẽ làm giảm được thời gian thủy phân. Thủy phân bằng enzym Rong biển được tiền xử lý, trước khi được thủy phân bằng enzym. Tiền xử lý rong nhằm đảm bảo khả năng tiếp cận của enzym đến các liên kết của các polysaccharid. Quá trình tiền sử lý sinh khối rong biển phụ thuộc vào cấu trúc sinh 11 học của mỗi loại rong. Trong sản xuất ethanol đối tượng rong Nâu, Đỏ có quá trình tiền xử lý đơn giản hơn rong Lục. Sinh khối rong Lục có kết cấu vỏ tế bào bền vững hơn rong Nâu và rong Đỏ, nguyên nhân sản phẩm cellulose được tổng hợp từ rong Lục cao hơn các loại rong khác, do vậy quá trình tiền xử lý cho thủy phân bằng enzym phức tạp hơn. Rong Lục Chaetomorpha linum được tiền sử lý ở nhiệt độ cao (180, 190, 200 oC trong 10 phút) sau đó sinh khối Chaetomorpha linum được oxi hóa trong nồng độ oxi 12 bars. Ngoài ra một phương pháp xử lý khác, sinh khối Chaetomorpha linum được gây nổ bởi áp suất hơi (1,9 Mpa) sau đó được sử lý ở nhiệt độ 200-210oC trong 5 phút. Phương pháp thứ ba cho sử lý sinh khối giàu cellulose sử dụng các bước sóng plasma trong thời gian (20-60 phút), điều kiện bước sóng (ø: 7 cm, length: 2 cm) [16]. Sau quá trình tiền xử lý, rong Lục được thủy phân bởi nhóm enzym hydrolase là phức hệ enzym cellulase được thu nhận từ giống vi sinh vật. Trong số những vi sinh vật có khả năng thủy phân sinh khối rong biển, nấm mốc Trichoderma reesei được quan tâm nhiều hơn cả. Nấm mốc T. reesei có khả năng sinh một loạt các enzym phân hủy cellulose thành đường và các cấu thành khác. Hiện nay có nhiều nghiên cứu tập trung vào đánh giá và phát triển khả năng phân hủy một số chất ức chế có trong dịch thủy phân nhằm tăng hoạt độ lên men của s. cerevisiae và làm giảm chi phí cho các công đoạn khử độc dịch thủy phân. Trong công đoạn sản xuất enzym, một loạt các gene sinh cellulase của Envinia chrysantheiììi, Acidothermus cellulolyticus đã được tách dòng và thế hiện. Ngoài ra các vi sinh vật thuộc nhóm sản xuất cellulase truyền thống như Clostriiỉium. Cellulomonas. Trichoderma, Penicillium, Neurospora. Fusarium, Aspergillus cũng đang được sử dụng. Nhóm phức hệ enzym này tác động đặc hiệu đến các polysaccharid bao gồm (arabinose, celluose, β-glucan, hemicellulose, xylan) các polysaccharid này sẽ bị enzym cắt tại các vị trí đặt hiệu tạo ra các sản phẩm olygosaccharid và các monosaccharid (glucose, arabinose, xylose, manose). Đây là các loại đường đơn cần cho quá trình lên men ethanol của vi sinh vật. 12 1.3.2. Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong biển. Sự lên men rượu là một quá trình sinh học có liên hệ mật thiết tới hoạt động của nấm men. Đường và các chất dinh dưỡng được hấp thụ qua bề mặt tế bào và thẩm thấu vào bên trong. Ở đó, các enzym sẽ tác dụng qua nhiều giai đoạn trung gian để cuối cùng tạo ra sản phẩm là rượu và cacbonic. Trên cơ sở đó, phương trình phản ứng tổng quát của quá trình lên men rượu như sau: C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 Rượu và cacbonic là hai sản phẩm được khuếch tán và tan vào môi trường xung quanh. Rượu do linh động nên hòa tan nhanh vào dịch lên men còn cacbonic hòa tan kém và khuếch tán chậm. Trong sản xuất cồn etylic, nấm men là vi sinh vật được sử dụng phổ biến nhất. Nấm men có khả năng lên men đường thành rượu và khí cacbonic. Trong mỗi ngành sản xuất có những đòi hỏi đặc thù về nấm men. Nấm men dùng trong sản xuất cồn phải có khả năng lên men các đường nhanh và càng triệt để càng tốt, phải có năng lực lên men mạnh đồng thời phải ổn định và chịu được những thay đổi của canh trường. Trong các nhóm vi sinh vật sinh ethanol, nấm men Saccharomycess cerevisiae vẫn là vi sinh vật ứng dụng rộng rãi nhất. S. cerevisiae có khả năng tích lũy 18% ethanol trong môi trường có thành phần tương đối đơn giản. Nấm men S. cerevisiae có thể lên men nhiều đường đơn như glucose, fructose hoặc đường đôi saccharose, maltose. Với năng lực lên men cao và là đối tượng được tìm hiểu kỹ nhất, nấm men S. cerevisiae là ứng cử viên tiềm năng nhất cho công đoạn chuyển hóa glucose thành ethanol trong sản xuất cồn nhiên liêu từ sinh khối. Quá trình thủy phân chuyển đổi carbonhydrat dự trữ của rong biển thành đường lên men giúp cho vi sinh vật dễ dàng sử dụng để lên men sinh ethanol. S. cerevisiae là một loại nấm men đã được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu trước 13