Tài liệu Nghiên cứu hoạt động của gen điều khiển quá trình ra hoa ở cây hoa cúc chiếu sang phá đêm bằng đèn led​

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN Nguyễn Thị Thu Hiền Nghiên cứu hoạt động của gen điều khiển quá trình ra hoa ở cây hoa cúc chiếu sang phá đêm bằng đèn led Chuyên ngành: sinh học thực nghiệm Hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Chu Quang Hà Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn i MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. iv DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ v LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... vii LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................. vii DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ......................................................... ix MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................ 3 1.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY HOA CÚC ........................... 3 1.1.1. Giới thiệu về cây hoa cúc........................................................................ 3 1.1.2. Nhu cầu ánh sáng cho quá trình sinh trƣởng, phát triển của cây hoa cúc . 5 1.2. TỔNG QUAN VỀ SỰ RA HOA Ở THỰC VẬT .......................................... 9 1.2.1. Con đƣờng ra hoa tự khiển.................................................................... 10 1.2.2. Con đƣờng phụ thuộc gibberellin đòi hỏi mức hoocmon gia tăng ......... 11 1.2.3. Con đƣờng ra hoa phụ thuộc nhiệt độ ( sự xuân hóa) ............................ 11 1.2.4. Quang chu kì ........................................................................................ 13 1.3. TỔNG QUAN VỀ ĐÈN LED ..................................................................... 21 1.3.1. Giới thiệu về đèn LED .......................................................................... 21 1.3.2. Ảnh hƣởng của ánh sáng LED đến sự phát triển của thực vật................ 22 1.3.3. Ƣu, nhƣợc điểm của đèn LED .............................................................. 23 1.4. CÁC NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘ DÀI THỜI GIAN CHIẾU SÁNG ĐẾN QUANG CHU KỲ CỦA THỰC VẬT ......... 24 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 28 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 38 3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ SỰ SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY HOA CÚC DƢỚI ĐIỀU KIỆN CHIẾU SÁNG BẰNG ĐÈN LED .................... 38 3.1.1. Đánh giá sinh trƣởng và phát triển của cây Hoa cúc 40 ngày tuổi ......... 39 3.1.2. Đánh giá sinh trƣởng và phát triển cây Hoa cúc 50 ngày tuổi ................ 40 3.1.3. Đánh giá sinh trƣởng và phát triển của cây Hoa cúc 70 ngày tuổi ......... 42 3.1.4. Đánh giá sinh trƣởng và phát triển của cây Hoa cúc 110 ngày tuổi ....... 45 3.1.5. Hiệu quả tiết kiệm điện năng của đèn LED ........................................... 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn ii 3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN CO ĐIỀU KHIỂN QUÁ TRÌNH RA HOA Ở CÂY HOA CÚC ................................................................................................ 51 3.2.1. Tách chiết RNA tổng số........................................................................ 51 3.2.2. Kết quả phân lập gen CO ...................................................................... 54 3.2.3. Kết quả đánh giá sự biểu hiện của gen CO và FT cảm ứng ra hoa ở cây Hoa cúc .......................................................................................................... 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 68 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.2: Các gen điều khiển quá trình ra hoa ở cây Arabidopsis ........................... 17 Bảng 2.1: Trình tự nucleotide các cặp mồi sử dụng .................................................. 28 Bảng 2.2: Sơ đồ bố trí đèn trong các ô thí nghiệm .................................................... 29 Bảng 2.3: Kí hiệu mẫu thí nghiệm ............................................................................ 31 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR ...................................................................... 33 Bảng 2.5: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR .............................................................. 33 Bảng 2.6: Thành phần phản ứng gắn gen vào vector pBT......................................... 35 Bảng 3.1: Sinh trƣởng và phát triển cây hoa cúc sau 50 ngày tuổi ............................ 40 Bảng 3.2: Sinh trƣởng và phát triển của hoa cúc 70 ngày tuổi .................................. 43 Bảng 3.3: Sinh trƣởng và phát triển của hoa cúc sau 110 ngày tuổi .......................... 45 Bảng 3.4: Hiệu quả tiết kiệm năng lƣợng ................................................................. 50 Bảng 3.5: Kết quả định lƣợng RNA tổng số bằng Nano Drop .................................. 53 Bảng 3.6: Mã số trong Ngân hàng dữ liệu gen và vùng phân lập của các thể phân lập thuộc chi cúc Chrysanthemum sử dụng trong phân tích, so sánh trình tự gen CO ..... 58 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.2: Cây hoa cúc vàng pha lê ............................................................................. 5 Hình 1.3. Sự ra hoa ở cây ngày ngắn và cây ngày dài ............................................... 13 Hình 1.4: Con đƣờng quang chu kỳ điều khiển sự ra hoa ở cây Arabidopsis ............ 19 Hình 1.5: Ảnh hƣởng của ánh sáng đỏ và đỏ xa đến sự ra hoa của cây ngày ngắn và cây ngày dài ............................................................................................................. 20 Hình 1.6: Hình ảnh đèn Led và đèn Led sử dụng trong nuôi cấy mô ........................ 22 Hình 3.1: Cây hoa cúc 40 ngày tuổi.......................................................................... 39 Hình 3.2: Hình ảnh cây hoa cúc 50 ngày tuổi .......................................................... 41 Hình 3.3: Ảnh hƣởng của đèn Led đến thời gian ra hoa của cây hoa cúc 50 ngày tuổi ................................................................................................................................. 42 Hình 3.4: Ảnh hƣởng của đèn Led đến thời gian ra nụ của cây 70 ngày tuổi ........... 44 Hình 3.5: Hình ảnh Hoa cúc sinh trƣởng ở 70 ngày tuổi ........................................... 44 Hình 3.6: Hình ảnh hoa cúc ở 110 ngày tuổi............................................................. 47 Hình 3.7: Ảnh hƣởng của đèn Led đến đƣờng kính hoa ............................................ 48 Hình 3.8:Tổng năng lƣợng sử dụng trong một vụ ..................................................... 51 Hình 3.9: Kết quả điện di tách chiết RNA tổng số trên gel agarose 1% .................... 52 Hình 3.10: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi MTP ..................... 55 Hình 3.11: Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR dùng cặp mồi đặc hiệu (CS_CO F/R) sử dụng khuôn là cDNA tổng hợp từ RNA tổng số của các mẫu hoa cúc.......... 55 Hình 3.12: Kết quả điện di sản phẩm colony PCR với cặp mồi pUC18F/R............... 57 Hình 3.13 : Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide gen CO của thể phân lập COLclone36 với bốn thể phân lập khác thuộc chi Chrysanthemum trên Ngân hàng dữ liệu gen. .......................................................................................................................... 59 Hình 3.14: Hình ảnh so sánh trình tự axit amin gen CO của thể phân lập COL-clone36 với bốn thể phân lập khác thuộc chi Chrysanthemum trên Ngân hàng dữ liệu gen. ... 60 Hình 3.15: Cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự nucleotide của gen CO chi Chrysanthemum. Thể phân lập COL-clone36 nghiên cứu đƣợc so sánh với bốn thể phân lập khác đƣợc công bố trên Ngân hàng dữ liệu gen. ......................................... 60 v Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn Hình 3.16: Kết quả phân tích mức độ biểu hiện ở cấp độ phiên mã của gen CO ở lá của cây hoa cúc ở 42, 49, 56 và 63 ngày tuổi............................................................ 62 Hình 3.17: Biểu hiện của gen FT ở các giai đoạn phát triển khác nhau ở mẫu lá bánh tẻ , lá non và đỉnh chồi của cây hoa cúc .................................................................... 64 Hình 3.18: Kết quả phân tích mức độ biểu hiện ở cấp độ phiên mã của gen CO ở lá của cây hoa cúc ở 42, 49, 56 và 63 ngày tuổi............................................................ 65 vi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, chƣa đƣợc công bố trong bất kể công trình nghiên cứu nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả Nguyễn Thị Thu Hiền vii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy PGS.TS. Chu Hoàng Hà, đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Phạm Bích Ngọc đã dành thời gian chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình làm việc. Đã có những lúc khó khăn nhƣng Cô luôn bên cạnh động viên và hƣớng dẫn giúp tôi có thể hoàn thành đƣợc luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơnThs Phạm Thị Vân, Ths Hoàng Đăng Hiếu, CN. Nguyễn Văn Đoài cùng tập thể cán bộ phòng Công nghệ tế bào thực vật, những ngƣời anh, ngƣời chị,những ngƣời đồng nghiệp đã luôn chia sẻ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm việc. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, những ngƣời thân luôn bên tôi, ủng hộ và giúp đỡ tôi để tôi có thể hoàn thành tốt công việc cũng nhƣ luận văn này. Hà Nội, tháng 1 năm 2016 Học viên Nguyễn Thị Thu Hiền viii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Led :Light-emitting diode cDNA : Complementary DNA DNA : Deoxirybonucleotide acid E.coli : Escherichia coli Bp : base pair PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleotide acid CO : CONSTANS FT : FLOWERING LOCUS T C/N : Carbonhydrat/ nitrogen GA : Gibberellin TSF : TWIN SISTEROF FT CFL : Compact fluorescent lamp RT-PCR : Reverse transcriptpolymerase chain reaction FREL : Far red light ix Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây nền kinh tế thị trƣờng phát triển, một hƣớng chuyển đổi cơ cấu cây trồng nông nghiệp sang phát triển hoa cây cảnh đang đƣợc xã hội quan tâm vì nó không chỉ mang lại giá trị về tinh thần mà còn mang lại lợi ích kinh tế cao cho ngƣời sản xuất. Trong các loài hoa, cây hoa cúc đƣợc trồng phổ biến, phát triển nhanh vì nó là loại hoa đẹp, đƣợc dùng nhiều trong các dịp lễ tết. Cây hoa cúc vừa có giá trị trang trí lại có thể sử dụng làm dƣợc liệu chính vì vậy nó đƣợc trồng rộng rãi ở nhiều địa phƣơng bởi khả năng thích nghi cao, dễ sản xuất và dễ dàng trong việc vận chuyển. Nhiều giống hoa cúc có phản ứng rất chặt với ánh sáng ngày ngắn ( cúc vàng pha lê, chi trắng…) chính vì vậy ngay khi mới trồng mà gặp điều kiện ánh sáng ngày ngắn cây đã ra hoa, không đủ thời gian để cây sinh trƣởng điều này làm giảm đáng kể chất lƣợng của cành hoa. Để khắc phục hiện tƣợng này, ngƣời ta thƣờng sử dụng đèn compact, hay đèn sợi đốt để chiếu sáng bổ sung cho cây hoa cúc nhằm tăng thời gian sinh trƣởng đến khi cây đạt chiều cao cần thiết mới ra hoa. Tuy nhiên, khi sử dụng đèn compact hay đèn sợi đốt lƣợng điện năng tiêu thụ lớn, tuổi thọ không cao, mất nhiều chi phí. Chính vì vậy trong những năm gần đây đèn Led đƣợc đƣa vào nghiên cứu và sử dụng nhằm loại bỏ những hạn chế trên của đèn compact và đèn sợi đốt. Nhƣng câu hỏi đặt ra đó là chất lƣợng ánh sáng của đèn Led ảnh hƣởng nhƣ thế nào đến quá trình ra hoa của cây, không chỉ ở mức độ hình thái, sinh trƣởng mà ở cả mức độ phân tử. Xuất phát từ những băn khoăn này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hoạt động của gen điều khiển quá trình ra hoa ở cây hoa cúc chiếu sáng phá đêm bằng đèn Led” với mục tiêu, nội dung và phạm vi nghiên cứu nhƣ sau: 1 Mục tiêu nghiên cứu: (1). Lựa chọn đƣợc chế độ chiếu sáng thích hợp đối với sự sinh trƣởng và phát triển của cây hoa cúc. (2). Phân lập đƣợc một gen liên quan đến sự điều khiển quá trình ra hoa ở cây hoa cúc. (3). Đánh giá sự biểu hiện của gen điều khiển quá trình ra hoa ở cây hoa cúc. Nội dung nghiên cứu: (1). Khảo sát sự ảnh hƣởng của một số công thức đèn Led đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây hoa cúc, so sánh với các công thức chiếu sáng truyền thống. (2). Tách dòng và xác định trình tự gen CO- một gen quan trọng điều khiển quá trình ra hoa. (3). Đánh giá biểu hiện của gen CO và gen FT. Phạm vi nghiên cứu: (1). Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật- Viện Công nghệ Sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. (2). Trại thực nghiệm Sinh học Cổ Nhuế- Viện Công nghệ Sinh họcViện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY HOA CÚC 1.1.1. Giới thiệu về cây hoa cúc Cây hoa cúc có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản và một số nƣớc Châu Âu Giới (Regnum) Thực vật (Plantae) Ngành (Divisio) Thực vật hạt kín (Angiospermae) Lớp (Class) Hai lá mầm (Eudicots) Bộ (Ordo) Hƣớng dƣơng (Asterales) Họ (Familia) Cúc (Asteraceae) Chi (Genus) Chrysanthemum Loài điển hình (Species) Chrysanthemum indicum Hoa cúc đƣợc trồng ở nhiều nơi trên thế giới nhƣ: Hà Lan, Italia, Trung quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc....Ở nƣớc ta cây hoa Cúc (Chrysanthemum sp) đã du nhập vào từ thế kỷ XV, đến đầu thế kỷ XIX đã hình thành một số vùng chuyên canh nhỏ cung cấp hoa cho thị trƣờng. Hiện nay Cúc có mặt ở khắp nơi từ nông thôn đến thành thị, từ miền núi đến đồng bằng. Các vùng trồng nhiều mang tính tập trung là Hà Nội (450 ha), thành phố Hồ Chí Minh (370 ha), Đà Lạt (160 ha), Hải Phòng (110 ha). Tại vùng trồng hoa Tây Tựu-Từ Liêm-Hà Nội, hoa hồng và hoa cúc là hai loại hoa có diện tích trồng và sản lƣợng cao nhất. Hoa cúc đứng hàng thứ hai với chu kỳ 3 tháng một lần cho thu hoạch. Hoa cúc của vùng không chỉ 3 đƣợc tiêu thụ tại các thị trƣờng phía Bắc mà đang đƣợc đƣa dần vào thị trƣờng phía Nam và xuất khẩu sang Trung Quốc .Trong diện tích gần 136 ha trồng hoa của vùng Trung du và miền núi phía Bắc, diện tích trồng hoa hồng đã chiếm tới trên 55,27% với sản lƣợng 26,53 triệu bông/năm. Diện tích trồng hoa cúc lớn thứ hai với 14,5 ha, sản lƣợng 5 triệu cành/năm (Đề án Phát triển sản xuất, xuất khẩu rau, quả và hoa tƣơi Việt Nam). Hoa Cúc có tác dụng sơ phong tiết nhiệt, làm nhẹ đầu mắt. Trong phòng chống cảm cúm, hiệu quả kháng viêm và cải thiện hệ miễn dịch của hoa Cúc có thể rút ngắn thời gian bệnh và làm giảm các triệu chứng ho, sốt, nhức đầu, nghẹt mũi. Tất cả các loài hoa Cúc đều có thể dùng làm thuốc. Tuy nhiên, do hiệu suất cao, hoa Cúc vàng (hoàng Cúc), tên khoa học Chrysanthemum indicum L. thƣờng đƣợc sử dụng trong Đông y. Hoàng Cúc đƣợc trồng để lấy hoa làm cảnh, làm thuốc, ƣớp chè hoặc cất rƣợu. Trong những năm gần đây, các nhà khoa học phƣơng Tây đặc biệt quan tâm đến giá trị dƣợc học của hoa Cúc tím (Cúc dại), tên khoa học là Echinacea purpurea. Theo nghiên cứu của Tiến sĩ Jurg Gertsch, thuộc Việc Công nghệ Swiss, những hoạt chất alkylamides trong hoa Cúc dại có khả năng điều chỉnh 1 trong những yếu tố quan trọng nhất của hệ miễn dịch đƣợc gọi là tumor necrosis factor alpha (TNF-a). Alkylamides kích thích hoạt động của TNF-a để gia tăng sức đề kháng chống lại những tác động có hại vủa vi trùng, vi khuẩn. Hoa Cúc là loại dƣợc thảo có tác dụng giải độc tốt nhất cho hệ thống tuần hoàn và hệ thống hô hấp. Hoạt chất trong hoa Cúc không chỉ giúp giải tỏa những áp lực ở mắt từ bệnh cảm cúm theo mùa hoặc hiện tƣợng khí nghịch của Đông y mà còn có khả năng cải thiện hoạt động ở những mao mạch, tăng cƣờng lƣu thông khí huyết đến mắt. Những chất chống oxy hóa trong hoa Cúc có khả năng trung hòa những gốc tự do để bảo vệ những cấu trúc collagen ở 4 mắt. Hoa Cúc rất thông dụng ở các dân tộc Bắc Mỹ và châu Âu. Các nhà khoa học cho biết các hoạt chất của hoa Cúc vừa có tính kháng viêm giống nhƣ cortisone vừa có tác dụng kháng khuẩn Hình 0.1: Cây hoa cúc vàng pha lê Cây hoa cúc là cây ngày ngắn, ƣa đêm lạnh. Thời kỳ đầu cây non mới ra rễ, cây cần ít ánh sáng; trong quá trình sinh trƣởng, ánh sáng quá mạnh sẽ làm cây chậm lớn và chất lƣợng hoa giảm. Ngày nay cùng với tiến bộ khoa học kỹ thuật trong nông nghiệp, thì việc trồng cây nói chung và việc trồng hoa cúc nói riêng đã đƣợc áp dụng nhiều giống mới, nhiều thiết bị kỹ thuật hiện đại nhƣ nhà lƣới, nhà kính, kỹ thuật canh tác..., sử dụng các chất kích thích sinh trƣởng, ánh sáng, phân bón...Và trong đó, việc điều chỉnh các cƣờng độ chiếu sáng khác nhau cho hoa cúc để đem lại năng suất, chất lƣợng tốt nhất, có hiệu quả kinh tế cao nhất là vấn đề mà mỗi ngƣời trồng cần quan tâm. 1.1.2. Nhu cầu ánh sáng cho quá trình sinh trƣởng, phát triển của cây hoa cúc Sự sinh trƣởng phát triển của thực vật nói chung và của cây hoa cúc nói riêng đều chịu tác động của các yếu tố ngoại cảnh nhƣ ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, đất trồng, dinh dƣỡng, quang chu kỳ bổ sung, cơ sở hạ tầng... Trong đó ánh sáng (quang chu kỳ và quang chu kỳ bổ sung) và nhiệt độ thấp (sự xuân hóa) là hai yếu tố quan trọng nhất ảnh hƣởng đến giai đoạn cảm ứng hình thành hoa. Hoa Cúc là loại cây hoa ngày ngắn, sự phân hoá và phát dục của hoa đƣợc tác động dƣới tác dụng đồng thời của quang chu kì và nhiệt độ. Trong quá 5 trình sinh trƣởng, phát dục, dƣới tác dụng phối hợp của độ dài chiếu sáng trong ngày và nhiệt độ ở mức độ nhất định mới có thể ra hoa, trong đó độ dài chiếu sáng là yếu tố quan trọng hơn, yêu cầu khắt khe hơn. Khi thời gian chiếu sáng kéo dài thì thời gian sinh trƣởng của cây hoa Cúc dài hơn, thân cao, lá to, chất lƣợng hoa tăng. Thời gian chiếu sáng ngắn thì sẽ kích thích phân hóa mầm hoa sớm: cây ngắn, chất lƣợng hoa kém. Thời kỳ để phân hóa mầm hoa tốt nhất là 10 giờ chiếu sáng trên ngày với nhiệt độ là 20-25ºC. Khống chế chiều cao cây: Tuỳ theo các mục đích sử dụng khác nhau mà yêu cầu độ cao của cây cũng khác nhau, vì vậy khống chế chiều cao cây cũng là một biện pháp kĩ thuật không thể thiếu đối với hoa cúc. Chiều cao cây do yếu tố di truyền của giống và điều kiện thâm canh chăm sóc quyết định. Giống thấp cây nhất chỉ cao khoảng 20–30cm, giống cao nhất có thể cao trên 3m. Thời gian sinh trƣởng dài, ngắn ảnh hƣởng trực tiếp đến chiều cao cây. Trong thời gian sinh trƣởng dinh dƣỡng với điều kiện thích hợp mỗi tuần có thể tăng 2–4 đốt, với giống sinh trƣởng nhanh có thể dài thêm 6–13cm. Vì vậy điều chỉnh thời gian cắm cành, thời vụ trồng rút ngắn độ dài thời ki sinh trƣởng dinh dƣỡng là biện pháp khống chế chiều cao đơn giản, nhanh nhạy nhất. Yếu tố ánh sáng gây tác động lên độ dài thời gian sinh trƣởng sinh dƣỡng nên cũng gây ảnh hƣởng đến chiều cao cây. Ảnh hưởng đến độ lớn của hoa: Độ lớn của hoa là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lƣợng hoa Cúc. Trong trồng trọt ngƣời ta thƣờng dùng các biện pháp tăng cƣờng bón phân, tƣới nƣớc, phun phân qua lá, phun chất kích thích sinh trƣởng, biện pháp ghép… để làm tăng đƣờng kính hoa. Có thể dùng biện pháp kéo dài độ chiếu sáng trong ngày sau khi mầm hoa đã phân hoá để tăng đƣờng kính hoa. Sau khi xử lí chiếu sáng ngày ngắn 35 ngày để cho mầm hoa phân hoá, khi đã có nụ và sau khi tỉa bớt nụ, đặt cây trong điều kiện chiếu sáng ngày dài cho đến khi hoa nở. Điều này có thể làm cho rất nhiều giống tăng đƣờng kính hoa. 6 Điều chỉnh sự ra hoa: thời gian ra hoa ở cây cúc có thể điều chỉnh bằng hoá chất và nhiệt độ hoặc khống chế quang chu kỳ. Độ dài chiếu sáng tới hạn trong ngày có tác dụng điều tiết quá trình sinh trƣởng phát triển của cây và phụ thuộc vào các loài khác nhau gọi là hiện tƣợng quang chu kỳ. Mỗi loài thực vật có độ dài ngày tới hạn nhất định, trong đó cây ra hoa trong điều kiện thời gian chiếu sáng trong ngày ngắn hơn thời gian chiếu sáng tới hạn gọi là cây ngày ngắn và cây ra hoa trong điều kiện thời gian chiếu sáng trong ngày dài hơn thời gian chiếu sáng tới hạn gọi cây ngày dài. Hoa cúc thuộc lớp hai lá mầm và là loại cây ngày ngắn nghĩa là sự hình thành và phát triển của hoa diễn ra trong điều kiện ngày có thời gian chiếu sáng ngắn hơn 12-13 giờ. Cây hoa cúc cần trên 16 giờ chiếu sáng để phân hóa hoa và sinh trƣởng mạnh, vì vậy khi độ dài ngày tự nhiên ít hơn 16 giờ thì cần phải bổ sung thêm ánh sáng đèn để giúp cây phát triển chiều cao. Ví dụ: ở Đà lạt, vào mùa hè độ dài ngày từ 12 đến 13 giờ, vì vậy cần bổ sung quang chu kỳ từ 3 đến 4 giờ vào ban đêm sẽ đảm bảo đủ ánh sáng ngày dài cho sự sinh trƣởng của cây. Vào mùa đông, độ dài ngày từ 11 đến 12 giờ, vì vậy cần bổ sung quang chu kỳ từ 4 đến 5 giờ vào ban đêm. Thời gian bắt đầu chiếu sáng bổ sung hiệu quả nhất là từ 22 giờ đêm đến 2 giờ sáng. Những giống hoa cúc có nguồn gốc từ Châu âu cơ bản là nở vào mùa thu đông nhƣng những năm gần đây ngƣời ta đã phát hiện ra phản ứng với quang chu kỳ của cúc kết hợp với việc tạo giống với các nguồn gen khác nhau, có thể khống chế làm cho cúc ra hoa theo ý muốn. Hiện nay các nhà sản xuất thông qua khống chế quang chu kỳ kết hợp với khống chế nhiệt độ có thể làm cho cúc quanh năm có hoa. Nhiệt độ không chỉ ảnh hƣởng đến tốc độ phát triển của nụ của cây hoa cúc mà còn ảnh hƣởng đến sự phân hóa và phát dục của hoa. Nụ đã đƣợc phân hóa nếu gặp nhiệt độ thấp, quá trình phát dục sẽ bị chậm nên hoa cũng nở muộn. Thời gian nở hoa sớm hay muộn tùy thuộc vào chế độ nhiệt và đặc tính di truyền của giống. Khi nghiên cứu về ảnh hƣởng của nhiệt độ tới sự ra hoa của các giống Cúc tại Châu Âu, Karlson, chia cúc làm 3 nhóm: 7  Nhóm giống không bị ảnh hƣởng bởi nhiệt độ: trong phạm vi từ 10 27ºC, nhiệt độ không ảnh hƣởng gì đến sự phân hóa và phát dục của hoa. Nhƣng nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn nhiệt độ trên sẽ ức chế sự ra hoa.  Nhóm giống bị nhiệt độ thấp ức chế ra hoa: bình thƣờng chúng bắt đầu phân hóa mầm hoa từ 16ºC trở lên, nhiệt độ thấp hơn 16ºC sẽ ức chế sự phân hóa hoa.  Nhóm giống bị nhiệt độ cao ức chế ra hoa: thời điểm bắt đầu phân hóa hoa của nhóm này ở nhiệt độ cao (>20ºC), nhƣng nếu nhiệt độ quá cao (>35ºC) thì kéo dài sự phát dục của nụ bị ngừng trệ. Cúc là cây ngày ngắn, ƣa ánh sáng và đêm lạnh. Thời kỳ đầu non mới ra rễ cây cần ít ánh sáng, nhƣng trong quá trình sinh trƣởng ánh sáng mạnh cũng làm cho cây chậm lớn. Ngoài ra Jong (1989) và Strojuy (1985) đã khẳng định, thời gian chiếu sáng rất quan trọng cho cây hay nói cách khác ngày đêm dài hay ngắn có tác dụng khác nhau đối với loại hoa này, hầu hết các giống Cúc trong thời kỳ sinh trƣởng sinh dƣỡng cần ánh sáng ngày dài trên 13h, còn trong giai đoạn trổ hoa cây chỉ cần ánh sáng ngày ngắn từ 10-11h và nhiệt độ không khí < 20ºC. Bởi vậy trong điều kiện Việt Nam cây Cúc rất phù hợp với thời tiết thu đông, nhƣng hiện nay một số giống Cúc nhập nội có thể ra hoa trong điều kiện ngày dài. Theo Wang và Chen (1990) nhiệt độ, ánh sáng không tác động một cách riêng rẽ mà phối hợp nhau, kìm hãm hay thúc đẩy sự sinh trƣởng và phát triển của cây hoa Cúc. Fukuda và các cộng sự (1987), đã cho rằng đối với nhóm Cúc ra hoa mùa thu, sự hình thành và phát triển chồi là trong điều kiện ngày ngắn, chồi hoa hình thành ≥ 15ºC, ở nhiệt độ cao không gây ức chế. Còn nhóm ra hoa mùa đông dù trong điều kiện ngày ngắn, nhƣng nếu ở nhiệt độ cao sẽ ức chế sự phát triển của chồi hoa. Riêng nhóm ra hoa ở mùa hè, chồi hoa thƣờng hình thành ở 10ºC trong điều kiện ngày trung tính. Nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy độ dài ngày có ảnh hƣởng đến sự ra hoa của cây Cúc, theo 8 Novatna (1988) vào thời kỳ ra hoa, cây yêu cầu thời gian chiếu sáng là 10 giờ, nhiệt độ thích hợp là 18ºC, nếu thời gian chiếu sáng dài Cúc sẽ kéo dài thời gian sinh trƣởng, cây cao, lá to và ra hoa muộn. * Biện pháp kéo dài thời kỳ sinh trưởng dinh dưỡng làm chậm sự nở hoa bằng: chiếu sáng bổ sung:Mục đích của chiếu sáng bổ sung là giảm thời gian tối của mỗi ngày chứ không phải là kéo dài thời gian chiếu sáng liên tục vì vậy nếu chiếu sáng thực hiện vào lúc nửa đêm để chia cắt thời gian tối liên tục thành hai giai đoạn tối, đồng thời cũng là để tăng số giờ chiếu sáng thì hiệu quả hơn nhiều. Nguyên tắc xác định thời gian chiếu sáng bổ sung là làm cho thời gian tối liên tục trong đêm mỗi đoạn ngắn hơn 7 h. Nói chung đƣợc thực hiện vào khoảng 11h đêm đến 4h sáng hôm sau. Nhƣ vậy mỗi nửa kỳ tối đều không vƣợt quá 7h. * Biện pháp rút ngắn thời kỳ sinh trưởng dinh dưỡng, kích thích sự nở hoa của cúc Ở thực tế sản xuất song song với việc chiếu sáng bổ xung để làm chậm sự nở hoa của cúc, ngƣời ta cũng còn sử dụng biện pháp ngƣợc lại là che sáng để kích thích hoa nở sớm hơn. 1.2. TỔNG QUAN VỀ SỰ RA HOA Ở THỰC VẬT Trong suốt cuộc đời mình, cơ thể thực vật chịu nhiều biến đổi đặc trƣng phù hợp với từng giai đoạn khác nhau của vòng đời. Ở thực vật có hoa, sự ra hoa là bƣớc chuyển quan trọng đánh dấu bƣớc phát triển mới của thực vật và có ý nghĩa quyết định đối với sự tồn tại của thực vật. Hoa đƣợc thành lập từ chồi ngọn hay chồi nách qua ba giai đoạn chính: chuyển tiếp ra hoa; hình thành cơ quan hoa; tăng trƣởng và nở hoa. Sự chuyển tiếp ra hoa gây nên các biến đổi sâu sắc của mô phân sinh ngọn, từ mô phân sinh dinh dƣỡng thành mô phân sinh tiền hoa. Các biểu hiện đầu tiên của sự chuyển tiếp ra hoa không thấy đƣợc bằng mắt thƣờng, chỉ biết đƣợc bởi các phân tích tế bào học hay sinh hóa học, với sự tăng mạnh hoạt tính 9 biến dƣỡng (tổng hợp RNA, ribosome, protein), đặc biệt trong vùng đỉnh. Sự chuyển tiếp ra hoa xảy ra đồng thời với sự biến đổi rất rõ của bộ máy dinh dƣỡng, đặc biệt là sự kéo dài lóng thân do hoạt động mạnh của vùng dƣới ngọn của mô phân sinh tiền hoa. Sự hình thành cơ quan hoa: Sự chuyển tiếp ra hoa cần khoảng 2-3 ngày để dẫn tới hình thành cơ quan hoa (quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi). Sự phát triển của các sơ khởi hoa nói chung xảy ra nhanh chóng, làm chồi phồng lên thành nụ hoa (dễ thấy dƣới kính lúp, qua lát cắt dọc). Sự tăng trƣởng và nở hoa: Khi sự tƣợng hoa hoàn thành, nụ hoa có thể tiếp tục tăng trƣởng và nở (trƣờng hợp các cây nhất niên). Tuy nhiên nụ hoa có thể vào trạng thái ngủ Ngày nay, đã nhận biết đƣợc bốn con đƣờng tạo hoa đƣợc di truyền điều phối. (1) con đƣờng phụ thuộc tuổi (tự khiển), (2) con đƣờng phụ thuộc gibberellin, (3) con đƣờng phụ thuộc nhiệt độ, (4) con đƣờng phụ thuộc ánh sáng. 1.2.1. Con đƣờng ra hoa tự khiển Ra hoa tự khiển là con đƣờng tạo hoa không phụ thuộc vào các điều khiện ngoại cảnh. Khi cây sinh trƣởng đến một độ tuổi nhất định nào đó cây sẽ ra hoa. Tùy theo các loài thực vật khác nhau mà có chu kỳ phát triển khác nhau. Nhƣ cây lạc ở pha chồi lá mầm đã sẵn sàng ra hoa,hay nhƣ cây lúa mạch đen chỉ ra hoa khi có ít nhất 7 lá hoàn chỉnh, một số cây cà chua sau khi có 5 lá đã bắt đầu chuyển sang trạng thái phát triển sinh sản. Cây sồi ra hoa sau 10 đến 12 năm, một số loài tre bắt đầu chuyển sang pha trƣởng thành ra hoa sau 50 năm. Sự chuyển đổi nhƣ vậy gọi là sự chuyển đổi pha trog mô phân sinh đỉnh cành, nó xảy ra dƣới tác động của các nhân tố nhất định, trong trƣờng hợp này đó là các nhân tố nội tại. 10 1.2.2. Con đƣờng phụ thuộc gibberellin đòi hỏi mức hoocmon gia tăng Mỗi thời kỳ sinh trƣởng và phát triển của thực vật có nhu cầu dinh dƣỡng khác nhau. Trong thời kỳ ra hoa cây cần nhu cầu dinh dƣỡng không nhiều nhƣng phải cân đối. Lƣợng dinh dƣỡng phải đảm bảo nằm trong giới hạn cho phép: Giới hạn trên là giới hạn mà ở đó sự phát triển dinh dƣỡng chiếm ƣu thế. Giới hạn dƣới là giới hạn mà dƣới đó, dinh dƣỡng không đủ cho sự ra hoa. Thông thƣờng, sự dinh dƣỡng nhiều đạm kích thích sự phát triển dinh dƣỡng và ngƣợc lại, sự dinh dƣỡng giàu carbon kích thích sự ra hoa. Do đó, việc lựa chọn tỉ lệ C/N ( carbonhydrat/ nitrogen) cao thích hợp sẽ kích thích sự ra hoa, nếu tỉ lệ này thấp sẽ làm cây phát triển sinh dƣỡng cao, nếu tỉ lệ này quá cao hoặc quá thấp sẽ ức chế sinh trƣởng của thực vật. Tóm lại, có nhiều yếu tố dinh dƣỡng ảnh hƣởng tới sự ra hoa, tuy nhiên quan trọng nhất là: sự cạnh tranh giữa phát triển dinh dƣỡng và phát triển sinh sản, sự thiếu dinh dƣỡng nhẹ (trên mức tối thiểu), và cân bằng C/N. Tƣơng quan hoocmon Đỉnh sinh trƣởng của cành nhận đƣợc từ những phần còn lại của cây các hoocmon và các chất khác ngoài cacbon hidrat và các chất dinh dƣỡng. Trong Arabidopsis và một số loài khác, giảm thiểu các mức gibberellin đã làm chậm trễ sự nở hoa. Vai trò của GA nội sinh trong sự điều tiết sinh sản cũng đã đƣợc chứng minh trong cách xử lí khác vốn xúc tiến sự ra hoa của cây thông cũng thƣờng do sự gia tăng lƣợng GA trong cây. Mặt khác, trong khi GA xúc tiến sự trƣởng thành sinh sản ở các loài cây Hạt trần và nhiều thực vật Hạt kín thân cỏ, xử lí GA3 đã gây nên sự trẻ lại ở cây thƣờng xuân và một số thực vật Hạt kín thân gỗ 1.2.3. Con đƣờng ra hoa phụ thuộc nhiệt độ ( sự xuân hóa) Xuân hóa là mối phụ thuộc của phát triển thực vật vào nhiệt độ. Nhiệt độ lạnh có thể gia tăng hoặc cho phép tạo hoa trong nhiều loài. Hiện tƣợng xuân hóa ở thực vật là hiện tƣợng cảm ứng thực vật nảy chồi hoặc ra hoa bằng xử lý 11