BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO
TẠO
hiên cứu
sinh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
Hồ Thị Hà
Hồ Thị Hà
NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT
CHIẾT TÁCH TỪ LÁ ĐU ĐỦ (Carica papaya Linn)
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Hà Nội – 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
Hồ Thị Hà
NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT
CHIẾT TÁCH TỪ LÁ ĐU ĐỦ (Carica papaya Linn)
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 62420201
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS.TS. Đỗ Thị Hoa Viên
2. TS. Lê Quang Hòa
Hà Nội – 2014
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Những số liệu và kết
quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố.
Hà Nội, ngày tháng
Hồ Thị Hà
i
năm 2014
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành Luận án Tiến sĩ này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi
đã nhận được sự động viên và giúp đỡ rất lớn của nhiều thầy, cô giáo và tập thể nghiên
cứu khoa học.
Tôi xin bày tỏ lòng cảm tạ và đội ơn sâu sắc đến PGS.TS Đỗ Thị Hoa Viên và
TS. Lê Quang Hòa – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, là những người đã tận tình
hướng dẫn, định hướng, đào tạo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn
thành Luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô ở Bộ môn Công nghệ sinh học - Viện
Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - ĐHBKHN đã giảng dạy, chỉ bảo và
tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ
Thực phẩm - ĐHBKHN đã giảng dạy, chỉ bảo và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trau dồi
kiến thức chuyên môn và cuộc sống.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới TS. Phạm Văn Cường, TS. Đoàn
Thị Mai Hương, ThS. Nguyễn Thùy Linh phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa Sinh Biển,
Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn tôi quy trình công nghệ
tách chiết các chất trong lá đu đủ.
Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp trong khoa công nghệ Lương
thực thực phẩn, lãnh đạo trường Cao đẳng Công nghệ và Kinh tế Hà Nội đã tạo điều kiện
giúp đỡ về thời gian và vật chất để tôi hoàn thành Luận án này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng kính yêu và biết ơn tới gia đình, bạn bè đã thực
sự động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại Trường Đại học Bách Khoa
Hà Nội.
Hà Nội, ngày tháng
năm 2014
Nghiên cứu sinh
Hồ Thị Hà
ii
MỤC LỤC
MỤC LỤC ............................................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ........................................................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ .................................................................................. iviii
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................................... ix
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................................. 4
1.1. Giới thiệu về cây đu đủ ............................................................................................... 4
1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ............................................................................... 6
1.2.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá đu đủ ................................................ 6
1.2.2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá đu đủ .................................................. 6
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................................. 7
1.3.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá đu đủ ................................................ 7
1.3.2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá đu đủ ................................................ 10
1.4. Sơ lược về nhóm alkaloid ......................................................................................... 22
1.4.1. Phân bố trong thiên nhiên ............................................................................... 22
1.4.2. Cấu tạo hóa học và phân loại alkaloid ............................................................ 23
1.4.3. Tính chất chung của alkaloid ........................................................................... 24
1.4.4. Các alkaloid có trong lá đu đủ.......................................................................... 25
1.5. Quá trình caspase ..................................................................................................... 27
1.5.1. Khái niệm caspase ............................................................................................ 27
1.5.2. Phân loại caspase.............................................................................................. 27
1.5.3. Cơ chế của quá trình caspase ........................................................................... 28
1.6. Kích thích miễn dịch................................................................................................. 30
1.6.1. Các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch .......................................................... 30
1.6.2. Cơ chế chống ung thư của hệ miễn dịch ......................................................... 32
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................... 33
2.1. Thiết bị nghiên cứu ................................................................................................... 33
2.1.1. Các thiết bị dùng cho nghiên cứu hóa học ....................................................... 33
2.1.2. Các thiết bị dùng cho nghiên cứu sinh học ...................................................... 33
2.2. Vật liệu nghiên cứu................................................................................................... 33
2.2.1. Mẫu thực vật..................................................................................................... 33
iii
2.2.2. Hóa chất và các vật liệu khác ........................................................................... 33
2.3. Các phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hợp chất ....................................... 34
2.3.1. Phương pháp chiết ............................................................................................ 34
2.3.2. Sắc ký cột ........................................................................................................ 34
2.3.3. Sắc ký lớp mỏng .............................................................................................. 35
2.3.4. Phổ hồng ngoại ................................................................................................ 35
2.3.5. Phổ khối lượng ................................................................................................ 35
2.3.6. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân............................................................................. 36
2.4. Các phương pháp thử hoạt tính sinh học .................................................................. 36
2.4.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro............................................................... 36
2.4.2. Phương pháp thử độ độc tế bào (cytotoxic assay)............................................ 36
2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme caspase 3/7 ..................................... 38
2.4.4. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng cách loại bỏ gốc tự do
DPPH ......................................................................................................................... 39
2.4.5. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hoá in vitro bằng thử nghiệm
malonyl dialdehyd (MDA test) ................................................................................. 40
2.4.6. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hoá in vitro trên tế bào gan chuột
.................................................................................................................................... 41
2.4.7. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm ......................................... 42
2.4.8. Phương pháp thử hoạt tính kích thích miễn dịch ............................................. 43
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 45
3.1. Phân lập một số hợp chất có trong lá đu đủ .............................................................. 45
3.1.1. Chiết phân đoạn cặn chiết trong lá đu đủ ......................................................... 45
3.1.2. Chiết tách thu cặn chiết ở phân đoạn CH2Cl2 .................................................. 47
3.1.3. Phân lập cặn chiết phân đoạn CH2Cl2 .............................................................. 48
3.1.4. Phân lập các hợp chất từ một số phân đoạn của cặn chiết CH2Cl2 .................. 49
3.2. Xác định cấu trúc của các hợp chất đã được phân lập .............................................. 52
3.2.1. Hợp chất CP1 ................................................................................................... 52
3.2.2. Hợp chất CP2 ................................................................................................... 55
3.2.3. Hợp chất CP3 ................................................................................................... 60
3.2.4. Hợp chất CP4 ................................................................................................... 61
3.2.5. Hợp chất CP5 ................................................................................................... 65
3.2.6. Hợp chất CP6 ................................................................................................... 68
iv
3.3. Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư của các phân đoạn cặn chiết ................. 71
3.3.1. Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư của các phân đoạn cặn chiết ........ 71
3.3.2. Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư biểu mô KB của các phân đoạn từ
cặn chiết CH2Cl2 ........................................................................................................ 75
3.4. Đánh giá khả năng gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ ............... 77
3.4.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB của các hợp chất
phân lập từ lá đu đủ .................................................................................................... 77
3.4.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư máu HL-60 của các hợp chất
phân lập từ lá đu đủ .................................................................................................... 79
3.4.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư phổi LU-1 của các hợp chất phân
lập từ lá đu đủ ............................................................................................................. 82
3.4.4. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 của các hợp chất phân
lập từ lá đu đủ ............................................................................................................. 83
3.4.5. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào thường NIH 3T3 của các hợp chất phân
lập từ lá đu đủ ............................................................................................................. 85
3.5. Đánh giá khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất carpaine và
pseudocarpaine lên tế bào ung thư phổi LU-1 ................................................................. 89
3.5.1. Đánh giá khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất carpaine lên tế
bào ung thư phổi LU-1 ............................................................................................... 90
3.5.2. Đánh giá khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất pseudocarpaine
lên tế bào ung thư phổi LU-1 ..................................................................................... 91
3.6. Đánh giá khả năng chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ ............... 93
3.6.1. Kết quả chống oxy hóa in vitro bằng phương pháp loại bỏ gốc tự do DPPH của
các hợp chất phân lập từ lá đu đủ ............................................................................... 93
3.6.2. Kết quả chống oxy hóa in vitro bằng thử nghiệm MDA của các hợp chất phân
lập từ lá đu đủ ............................................................................................................. 94
3.6.3. Kết quả chống oxy hóa in vitro trên tế bào gan chuột của các hợp chất phân lập
từ lá đu đủ ................................................................................................................... 95
3.7. Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn và nấm của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ.. 96
3.8. Đánh giá khả năng kích thích tế bào lympho của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ98
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 101
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 103
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ......................................................... 113
v
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
ADN
Acid deoxyribo nucleic
ATCC
American Type Culture Collection
br
Broad
BuOH
Buthanol
CASP
Caspase
CC
Column Chromatography
CH2Cl2
Diclorometan
13
Carbon - 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
C-NMR
d
Doublet
dd
doublet doublet
DEPT
Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DMSO
Dimethylsulfoxide
DPPH
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
ED50
Effetive Dose
ESI-MS
Electron Spray Ionization – Mass Spectroscopy
EtOAc
Ethyl acetate
EtOH
Ethanol
FBS
Fetal bovine serum
HL-60
Human acute promyelocytic leukemia
HMBC
Heteronuclear Multiple Bond Correlation
1
Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
H-NMR
HPLC
High Performance Liquid Chromatography
HR-ESI-MS
High Resolution Electron Spray Ionization – Mass Spectroscopy
HSQC
Heteronuclear Single Quantum Correlation
IC50
Inhibitory concentration 50%
IR
Infrared Spectroscopy
J (Hz)
Spin-spin J(Hz)
KB
Human epidermic carcinoma in the mouth
LU-1
Human lung carcinoma
m
Multiplet
vi
MBC
Minimum bactericidal concentration
MCF-7
Human breast carcinoma
MDA
Malonyl dialdehyd
MEME
Minineal Essential Medium with Eagle’s Salt
MeOH
Methanol
MIC
Minimum inhibitory concentration
MHA
Mueller Hinton Agar
MHB
Mueller Hinton Broth
mp
Melting point
NIH3T3
Mouse embryonic fibroblast
NOESY
Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy
OD
Optical density
PBS
Phosphate Buffer Saline
PSF
Penicillin - Streptomicin - Fungizone
RFU
Fluorescence
RIPs
Ribosome inactivating protein
s
Singlet
SI
Stimulate index
SRB
Sulforhodamine B
t
Triplet
TAC
Acid trichloracetic
TBA
Acid Thiobarbituric
TLC
Thin Layer Chromatography
TSB
Tryptic Soy Broth
δ (ppm)
δ (ppm = part per million)
vii
DANH MỤC CÁC BẢNG,SƠ ĐỒ
Bảng 1.1: Tác dụng của chất chiết từ đu đủ lên các dòng tế bào ung thư khác nhau .......... 13
Bảng 1.2: Hoạt tính chống ung thư của glucosinolate, phenolic và carotenoid trong đu đủ
............................................................................................................................................. 14
Bảng 1.3: Tính chất hoá học của carpaine và dẫn xuất của carpaine trong lá đu đủ Carica
papaya ................................................................................................................................. 26
Bảng 3.1: Kết quả chiết phân đoạn cặn chiết trong lá đu đủ ............................................... 45
Bảng 3.2: Khối lượng các phân đoạn từ cặn chiết CH2Cl2 của lá đu đủ ............................. 48
Bảng 3.3: Số liệu phổ NMR của hợp chất CP1 và chất tham khảo ..................................... 54
Bảng 3.4: Số liệu phổ NMR của hợp chất CP4 và chất tham khảo ..................................... 64
Bảng 3.5: Kết quả thử hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm của các hợp chất phân lập từ lá đu
đủ ......................................................................................................................................... 96
Bảng 3.6: Kết quả kích thích tế bào lympho của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ ........... 98
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phân đoạn các cặn chiết từ lá đu đủ ......................................................... 46
Sơ đồ 3.2: Sơ đồ chiết thu cặn CH2Cl2 từ lá đu đủ .............................................................. 47
Sơ đồ 3.3: Phân lập các hợp chất từ cặn chiết CH2Cl2 của lá đu đủ .................................... 51
viii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Cây và lá đu đủ ...................................................................................................... 5
Hình 1.2: β- sitosterol
Hình 1.3: Daucosterol ................................................................. 6
Hình 1.4: Sterculin A, Hình 1.5: Cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)-diol ............................... 6
Hình 1.6: Carpaine,
Hình 1.7: Pseudocarpaine ............................................................. 8
Hình 1.8: Dehydrocarpaine I, Hình 1.9: Dehydrocarpaine II ............................................ 8
Hình 1.10: Prunasin Hình 1.11: Sambunigrin................................................................ 8
Hình 1.12: 5,7 - dimethoxycoumair Hình 1.13: Axit protocatechuic Hình 1.14: Axit
chlorogenic ............................................................................................................................ 9
Hình 1.15: Axit malic
Hình 1.16: Axit quinic ............................................................... 9
Hình 1.17: Nicotiflorin Hình 1.18: Rutin ...................................................................... 10
Hình 1.19: Caffeoyl malate, Hình 1.20: ρ-coumaroyl malate, Hình 1.21: Feruloyl malate 10
Hình 1.22: Benzyl isothiocyanate Hình 1.23: Benzyl glucosinolate ................................ 14
Hình 1.24: Quá trình hoạt hóa tiền caspase xúc tác bởi các caspase đã hoạt hóa .............. 28
Hình 1.25: Quá trình hoạt hóa caspase hành quyết và qua đó khuếch đại mức độ caspase
hoạt hóa trong tế bào ........................................................................................................... 28
Hình 2.1. Sơ đồ biểu diễn phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất chống oxy hóa ..... 39
Hình 2.2: Tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ DPPH.................................................. 40
Hình 2.3: Phản ứng tạo phức màu giữa MDA và axit thiobarbituric ................................. 41
Hình 3.1: Phổ 1H-NMR của hợp chất CP1 .......................................................................... 53
Hình 3.2: Phổ 13C-NMR của hợp chất CP1 ......................................................................... 53
Hình 3.3: Cấu trúc hóa học của hợp chất danielone ............................................................ 54
Hình 3.4: Phổ HR-ESI-MS (+) của hợp chất CP2 ............................................................... 55
Hình 3.5: Phổ positive [M + Na] của hợp chất CP2 ............................................................ 56
Hình 3.6: Phổ 13C-NMR của hợp chất CP2 ......................................................................... 56
Hình 3.7: Phổ 1H-NMR của hợp chất CP2 .......................................................................... 57
Hình 3.8: Một số tương tác chính trên phổ HMBC và COSY của CP2 .............................. 57
Hình 3.9: Phổ COSY của hợp chất CP2 .............................................................................. 58
Hình 3.10: Phổ HMBC của hợp chất CP2 ........................................................................... 58
Hình 3.11: Phổ HSQC của hợp chất CP2 ............................................................................ 59
Hình 3.12: Cấu trúc hóa học của hợp chất carpainone ........................................................ 59
Hình 3.13: Phổ ESI-MS negative của hợp chất CP3 ........................................................... 60
Hình 3.14: Phổ 1H-NMR của hợp chất CP3 ........................................................................ 61
Hình 3.15: Cấu trúc hóa học của hợp chất axit pluchoic ..................................................... 61
ix
Hình 3.16: Phổ 13C-NMR của hợp chất CP4 ....................................................................... 62
Hình 3.17: Phổ 1H-NMR của hợp chất CP4 ........................................................................ 63
Hình 3.18: Một số tương tác chính trên phổ COSY và HMBC của chất CP4 .................... 63
Hình 3.19: Cấu trúc hóa học của hợp chất apocynol A ....................................................... 64
Hình 3.20: Phổ 13C-NMR của hợp chất CP5 ....................................................................... 65
Hình 3.21: Phổ 1H-NMR của hợp chất CP5 ........................................................................ 66
Hình 3.22: Một số tương tác chính trên phổ HMBC và COSY của hợp chất CP5 ............. 66
Hình 3.23: Phổ DEPT của hợp chất CP5............................................................................. 67
Hình 3.24: Cấu trúc hóa học của hợp chất carpaine ............................................................ 67
Hình 3.25: Phổ 13C-NMR của hợp chất CP6 ....................................................................... 69
Hình 3.26: Phổ 1H-NMR của hợp chất CP6 ........................................................................ 69
Hình 3.27: Phổ DEPT của hợp chất CP6............................................................................. 70
Hình 3.28: Cấu trúc hóa học của hợp chất pseudocarpaine................................................. 70
Hình 3.29: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB của các phân đoạn cặn chiết từ lá
đu đủ .................................................................................................................................... 71
Hình 3.30: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư phổi LU-1 của các phân đoạn cặn chiết từ lá
đu đủ .................................................................................................................................... 72
Hình 3.31: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 của các phân đoạn cặn chiết từ lá
đu đủ .................................................................................................................................... 73
Hình 3.32: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các phân đoạn cặn chiết ...... 74
Hình 3.33: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB của các phân đoạn từ cặn chiết
CH2Cl2 của lá đu đủ ............................................................................................................. 76
Hình 3.34: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB của các hợp chất phân lập từ lá
đu đủ .................................................................................................................................... 78
Hình 3.35: Tác dụng ức chế tế bào ung thư biểu mô KB của hợp chất carpaine ở các nồng
độ 20; 4; 0,8 µg/ml .............................................................................................................. 79
Hình 3.36: Tác dụng ức chế tế bào ung thư biểu mô KB của hợp chất pseudocarpaine ở các
nồng độ 20; 4; 0,8 µg/ml ..................................................................................................... 79
Hình 3.37: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư máu HL-60 của các hợp chất phân lập từ lá đu
đủ ......................................................................................................................................... 80
Hình 3.38: Tác dụng ức chế tế bào ung thư máu HL-60 của hợp chất carpaine ở các nồng
độ 20; 4; 0,8 µg/ml .............................................................................................................. 81
Hình 3.39: Tác dụng ức chế tế bào ung thư máu HL-60 của hợp chất pseudocarpaine ở các
nồng độ 20; 4; 0,8 µg/ml ..................................................................................................... 81
Hình 3.40: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư phổi LU-1 của các hợp chất phân lập từ lá đu
đủ ......................................................................................................................................... 82
Hình 3.41: Tác dụng ức chế tế bào ung thư phổi LU-1 của hợp chất carpaine ở các nồng độ
20; 4; 0,8 µg/ml ................................................................................................................... 83
x
Hình 3.42: Tác dụng ức chế tế bào ung thư phổi LU-1 của hợp chất pseudocarpaine ở các
nồng độ 20; 4; 0,8 µg/ml ..................................................................................................... 83
Hình 3.43: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 của các hợp chất phân lập từ lá đu
đủ ......................................................................................................................................... 84
Hình 3.44: Tác dụng ức chế tế bào ung thư vú MCF-7 của hợp chất carpaine ở các nồng độ
20; 4; 0,8 µg/ml ................................................................................................................... 85
Hình 3.45: Tác dụng ức chế tế bào ung thư vú MCF-7 của hợp chất pseudocarpaine ở các
nồng độ 20; 4; 0,8 µg/ml ..................................................................................................... 85
Hình 3.46: Hoạt tính gây độc tế bào thường NIH 3T3 của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ
............................................................................................................................................. 86
Hình 3.47: Tác dụng ức chế tế bào thường NIH 3T3 của hợp chất carpaine ở các nồng độ
20; 4; 0,8 µg/ml ................................................................................................................... 87
Hình 3.48: Tác dụng ức chế tế bào thường NIH 3T3 của hợp chất pseudocarpaine ở các
nồng độ 20; 4; 0,8 µg/ml ..................................................................................................... 87
Hình 3.49: Tổng hợp kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ lá
đu đủ .................................................................................................................................... 88
Hình 3.50: Kết quả kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất carpaine lên tế bào.......... 90
Hình 3.51: Kết quả kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất pseudocarpaine lên tế bào
............................................................................................................................................. 91
Hình 3.52: Hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp loại bỏ gốc tự do DPPH của các
hợp chất phân lập từ lá đu đủ............................................................................................... 93
Hình 3.53: Hoạt tính chống oxy hóa bằng phép thử MDA của các hợp chất phân lập từ lá
đu đủ .................................................................................................................................... 94
Hình 3.54: Hoạt tính chống oxy hóa trên tế bào gan chuột của các hợp chất phân lập từ lá
đu đủ .................................................................................................................................... 95
xi
ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Tính cấp thiết của đề tài
Việt Nam là nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm, mưa nhiều.
Với điều kiện thuận lợi như vậy nên hệ thực vật Việt Nam phát triển rất đa dạng, các loại
cây ăn quả cũng rất phong phú và mang nhiều nét đặc thù riêng. Chúng là nguồn nguyên
liệu quan trọng trong nhiều ngành kinh tế khác nhau và trong đời sống hàng ngày của con
người.
Cây đu đủ (Carica papaya Linn) là một loại cây ăn quả có nguồn gốc từ vùng nhiệt
đới châu Mỹ. Hiện nay, đu đủ được trồng ở các nước vùng nhiệt đới, những nơi có nhiệt độ
bình quân trong năm không thấp hơn 150C. Sản lượng đu đủ trên thế giới khoảng trên 5
triệu tấn quả/năm [17].
Ở Việt Nam, cây đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh miền Bắc và miền Nam. Tuy
nhiên, chúng được trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên các loại
đất phù sa. Các tỉnh trồng nhiều đu đủ như: Hà Nội, Hưng Yên, Hà Nam, Vĩnh Phúc, Tiền
Giang, Cần Thơ, các tỉnh Tây Nguyên,…. Diện tích trồng đu đủ của cả nước ước khoảng
10000 – 17000 hecta với sản lượng khoảng 200 – 350 nghìn tấn quả [17]. Cây đu đủ có lợi
thế là loại cây dễ trồng, ra quả sớm, năng suất cao đồng thời toàn bộ thân, lá, quả đều được
sử dụng với nhiều mục đích khác nhau. Ngoài việc lấy quả tươi, dùng làm nguyên liệu cho
chế biến, đu đủ còn được trồng để lấy nhựa, dùng làm thức ăn chăn nuôi.
Trong dân gian lá cây đu đủ được sử dụng để sát khuẩn, kháng nấm, kháng viêm,
chữa sốt rét, trừ giun sán,…Đã có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá
đu đủ. Lá đu đủ được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa rất mạnh [32, 88]. Hoạt
tính chống oxy hóa này do các hợp chất phenol gây ra [33]. Lá đu đủ có hoạt tính kháng
khuẩn tốt, có khả năng kháng nhiều loại vi khuẩn gram âm, gram dương, các loại nấm
[2,73]. Ngoài ra, lá đu đủ còn có khả năng kháng viêm, giảm đau [23, 35].
Đặc biệt, người dân Việt Nam đã dùng lá đu đủ chữa trị bệnh ung thư. Ở nước ta,
cao chiết với cồn từ lá đu đủ được nghiên cứu trong một số mô hình ung thư thực nghiệm
và được chứng minh có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u gây bởi tế bào ung thư
Sarcoma TG-180 ở chuột nhắt trắng [10]. Người dân nước Úc đã dùng lá đu đủ chữa trị
bệnh ung thư [96]. Đầu năm 2010, một nhóm nghiên cứu Nhật Bản và Mỹ đã thông báo
dịch chiết nước lá cây đu đủ có tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư người như ung
thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư máu,…. Ngoài ra, dịch chiết từ lá đu đủ còn có tác dụng
1
hỗ trợ hệ miễn dịch để tấn công vào các tế bào ung thư. Bằng cách thúc đẩy sự gia tăng các
sản phẩm cytokine dạng Th1 như là IL-12p40, IL-12p70, INF-γ và TNF-α, các cytokine
này có khả năng chống lại khối u [72].
Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu cho thấy lá đu đủ có tác dụng phòng và điều trị ung
thư. Tuy nhiên, những công bố đều chỉ sơ lược ở dạng dịch chiết và chưa xác định được
thành phần nào là hoạt chất. Vì vậy, việc tìm hiểu thành phần hóa học và cao hơn nữa là
chứng minh được thành phần hoạt chất cụ thể của lá đu đủ là một việc làm hết sức cần
thiết, tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam làm
thuốc điều trị bệnh ung thư. Do đó, tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính sinh học
của một số hợp chất chiết tách từ lá đu đủ (Carica papaya Linn)”
2. Mục tiêu của đề tài
Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất có hoạt tính sinh học và hợp chất
mới có trong lá đu đủ.
Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất đã được phân lập làm cơ sở khoa học
chứng minh cho việc người dân ở một số nước trên Thế Giới sử dụng lá đu đủ chữa trị một
số loại bệnh trong đó có bệnh ung thư.
3. Nội dung nghiên cứu
Luận án gồm các nội dung chính như sau:
- Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất có trong lá đu đủ.
- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các phân đoạn cặn chiết từ lá đu đủ.
- Đánh giá khả năng gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được từ lá đu đủ.
- Đánh giá khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất carpaine và
pseudocarpaine trên dòng tế bào ung thư phổi LU-1.
- Đánh giá khả năng chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ.
- Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn và nấm của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ.
- Đánh giá khả năng kích thích miễn dịch của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ.
4. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Đã phân lập và xác định được cấu trúc của một số hợp chất có trong lá đu đủ. Đây
là những đóng góp đáng tin cậy làm phong phú thêm nguồn tư liệu về cây đu đủ trồng ở
Việt Nam.
Đã đánh giá được một số hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ.
2
5. Tính mới của đề tài
Phân lập và xác định cấu trúc của một hợp chất mới từ lá đu đủ (Carica papaya
Linn) được đặt tên là carpainone.
Đã xác định hoạt tính gây độc lên một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất
phân lập từ lá đu đủ, trong đó hợp chất carpaine và pseudocarpaine thể hiện hoạt tính gây
độc tế bào ung thư rõ rệt.
Lần đầu tiên xác định được khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất
carpaine và pseudocarpaine trên tế bào ung thư phổi LU-1.
Đánh giá được khả năng chống oxy hóa, kháng vi khuẩn, kháng nấm và khả năng
kích thích miễn dịch của một số hợp chất phân lập từ lá đu đủ.
3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về cây đu đủ
Họ đu đủ (Caricaceae) trên thế giới gồm có 4 chi và 45 loài, phân bố ở các vùng nhiệt
đới và cận nhiệt đới [28]. Ở nước ta có 1 chi và một loài. Cây đu đủ có tên khoa học là
Carica papaya Linn. Cây nhỏ hoặc nhỡ, cao từ 2 - 4 mét, thân thẳng, không phân nhánh.
Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn. Cuống lá rất dài, xẻ 5 - 7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu
nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành nhiều thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt
nhẵn [2].
Ở Việt Nam, đu đủ là cây trồng khá lâu đời và chưa xác định được cụ thể thời gian
cây được nhập vào. Đu đủ trồng gồm nhiều giống, gần như ở mỗi vùng sinh thái đều có
một giống khác nhau. Nhưng vài năm gần đây, một vài giống cho quả sớm, năng suất và
chất lượng cao được nhập trồng [17].
Một số giống đu đủ hiện nay đang được trồng ở Việt Nam bao gồm: giống đu đủ ta,
đu đủ Mêhico, đu đủ So Lo, đu đủ Trung Quốc, đu đủ Thái Lan, đu đủ Đài Loan [17].
* Giống đu đủ ta: bao gồm các giống đu đủ có từ lâu đời ở nước ta. Đặc tính chung
của nhóm cây này là sinh trưởng khỏe, lá xanh đậm, song phiến lá mỏng, cuống lá dài,
mảnh nhỏ và thường có màu xanh. Thịt quả màu vàng, mỏng, năng suất thấp.
* Giống đu đủ Mêhico: là giống nhập nội trong những năm 70 của thế kỷ 20. Quả
dài, tương đối đặc ruột, thịt quả màu vàng, năng suất cao. Lá xanh đậm, phiến lá dày,
cuống lá to, màu xanh.
* Giống đu đủ So Lo: còn có tên gọi khác là đu đủ Mỹ, thân cây cao trung bình, sinh
trưởng khỏe. Quả hình quả lê, to, thịt quả màu vàng, chất lượng tốt, năng suất cao. Là
giống yêu cầu nhiệt cao nên được trồng chủ yếu ở các tỉnh phía Nam.
* Giống đu đủ Trung Quốc: là giống nhập từ Quảng Đông, Quảng Tây Trung Quốc.
Cây thấp, sinh trưởng trung bình, năng suất khá cao. Quả dài, thuôn dài, thịt quả dày trung
bình, thịt quả có màu vàng đến đỏ. Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày.
* Giống đu đủ Thái Lan: là giống được nhập trồng trong thời gian gần đây. Cây thấp,
năng suất cao, quả to, ruột quả màu vàng, chất lượng tốt. Tuy nhiên giống này dễ bị nhiễm
bệnh khảm lá.
* Giống đu đủ Đài Loan: là giống mới được nhập trồng trong thời gian gần đây. Cây
thấp, sinh trưởng khỏe, ít nhiễm bệnh, cho năng suất cao, khoảng 60 – 70 kg quả/ cây. Thịt
4
quả màu đỏ, ngọt, thơm, mềm mà không nát, vỏ quả cứng dễ bảo quản và vận chuyển. Lá
có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày.
Ở nước ta, đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh miền Bắc và miền Nam, tuy nhiên
chúng được trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên các loại đất phù
sa và nhiều loại đất khác nhau. Các tỉnh trồng nhiều gồm: Hà Nội, Bắc Giang, Hà Nam,
Hưng Yên, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Tiền Giang, các tỉnh Tây Nguyên. Diện tích trồng đu
đủ cả nước ước khoảng 10000 - 17000 hecta, với sản lượng khoảng 200 - 300 nghìn tấn
quả [19].
Hiện nay ở Việt Nam nói chung và miền Bắc nói riêng, giống đu đủ Đài Loan được
trồng chủ yếu, với diện tích tương đối lớn. Giống đu đủ Đài Loan được trồng là giống lai
F1 được nhập từ Đài Loan. Tại Hà Nội, chỉ có duy nhất giống đu đủ Đài Loan được trồng
ở các huyện: Gia Lâm, Đông Anh, Sóc Sơn, Thạch Thất,…Với mục đích trồng lấy quả nên
cây đu đủ Đài Loan được trồng là đu đủ cái.
Với điều kiện thực tế như vậy nên chúng tôi chọn lá đu đủ Đài Loan cho nghiên cứu
này.
Hình 1.1: Cây và lá đu đủ
5
1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
1.2.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá đu đủ
Ở trong nước, cho đến nay đã có một số công bố về các chất có trong lá đu đủ. Năm
1983, Nguyễn Tường Vân và cộng sự đã chiết xuất và xác định được alkaloid carpaine
trong lá đu đủ [19].
Năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc đã sử dụng kỹ thuật HPLC phân tích các chất
carotenoid trong lá đu đủ. Kết quả cho thấy β-carotene, luteine chiếm tỷ lệ tương ứng là
57,05 và 11,864% so với tổng các chất carotenoid, tuy nhiên không xác định được
lycopene [11].
Gần đây, Trần Thanh Hà đã phân lập được 4 chất từ phân đoạn chiết n-hexan của lá
đu đủ. Bao gồm, β- sitosterol, daucosterol, cycloart -23-ene-3β,25-diol (sterculin A) và
cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)-diol. Trong đó, sterculin A và cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)diol là 2 tritecpen lần đầu tiên phân lập từ lá đu đủ [4].
H 3C
CH3
CH3
CH3
H
H
O
H
H
CH3
OH
O
H
HO
OH
HO
OH
Hình 1.2: β- sitosterol
21
18
Hình 1.3: Daucosterol
22
20
19
21
25
OH
1
2
30
HO
28
29
3
HO
28
Hình 1.4: Sterculin A
4
12
11
19
10
5
29
9
6
20
17
13
14
8
7
16
30
OH
22
18
23
24
25
27
26
15
Hình 1.5: Cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)-diol
1.2.2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá đu đủ
Tác giả Phạm Kim Mãn đã chứng minh cao chiết với cồn từ lá đu đủ có tác dụng ức
chế sự phát triển u báng gây bởi tế bào ung thư Sarcoma TG -180 ở chuột nhắt trắng. Làm
giảm thể tích u, giảm mật độ tế bào ung thư, giảm sự tăng sinh khối u [10].
Theo Đỗ Thị Thảo, cặn chiết methanol của lá đu đủ chỉ có tác dụng gây độc tế bào
ung thư phổi LU với IC50 = 19,2 μg/ml, và không có tác dụng gây độc các dòng tế bào ung
6
thư khác như ung thư biểu mô KB, ung thư vú MCF-7, ung thư máu cấp tính HL-60, ung
thư tiền liệt tuyến LNCaP, ung thư gan Hepa1c1c7. Đồng thời cặn chiết methanol cũng
không gây độc với tế bào gốc tách từ phôi chuột [15].
Năm 1998, Hà Thị Thanh Bình đã ngâm chiết lá đu đủ bằng ethanol, sau đó cặn
chiết được chiết phân bố với n-hexan và nước. Phần dịch nước điều chỉnh đến pH = 3 - 4
và chiết rút bằng etyl axetat. Kiểm tra hoạt động của enzyme peroxidase ở bốn nhóm máu
người A, B, O, AB với nồng độ từ 0 – 20mg% theo trọng lượng khô của lá. Kết quả: cả ba
phân đoạn chiết đều có tác dụng kìm hãm hoạt động của enzyme peroxidase trong máu
người, nhưng với mức độ khác nhau. Trong đó phân đoạn chiết rút bằng nước có hiệu quả
thấp hơn hẳn so với hai phân đoạn còn lại. Hai phân đoạn etyl axetat và n-hexan đều có tác
dụng kìm hãm mạnh hoạt động của enzyme peroxidase máu người. Mức độ kìm hãm của
hai phân đoạn này đối với 4 nhóm máu có mối quan hệ như sau: Phân đoạn etyl axetat: AB
> O > A > B. Phân đoạn n-hexan: A > O > AB > B [3].
Năm 1999, Nguyễn Quốc Khang và Hà Thị Thanh Bình đã nghiên cứu tác dụng
kháng khuẩn của flavonoid chiết từ lá đu đủ. Các tác giả thí nghiệm với 5 chủng vi khuẩn
và 2 chủng nấm gây bệnh. Nồng độ flavonoid thí nghiệm là 0,4 mg/ml. Kết quả, flavonoid
trong lá đu đủ thể hiện tính kháng khuẩn tốt đối với các chủng vi khuẩn và nấm thử nghiệm
bao gồm: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Salmonella typhi
T239, Salmonella typhi T241, Candida albicans, Candida stellaloides [6].
Như vậy, các kết quả nghiên cứu đã khẳng định trong lá đu đủ có các hợp chất
alkaloid carpaine, carotenoid, flavonoid và một số triterpene. Đồng thời, cặn chiết lá đu
đủ đã được chứng minh là có tác dụng gây độc một số dòng tế bào ung thư.
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
1.3.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá đu đủ
Cho đến nay, đã có nhiều công bố về thành phần hóa học của lá đu đủ. Kết quả phân
tích định tính cho thấy trong lá đu đủ ngoài các hợp chất trao đổi sơ cấp còn có các chất:
tannin, alkaloid, saponin, glycosid, phytosterol, phenol, flavonoid, steroid, terpenoid,…
[74, 99, 104]. Alkaloid có khung piperidin, chủ yếu là carpaine, pseudocarpaine,
dehydrocarpaine I, dehydrocarpaine II, choline, …[61, 74]. Ngoài ra còn có vitamin C, E,
nguyên tố khoáng Ca, K, Mg, Zn, Mn, Fe,.. [28, 74]
7
- Xem thêm -