Tài liệu Nghiên cứu khả năng gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus) và thử nghiệm môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn edwardsiella ictaluri đột biến gen pura trong điều kiện thí nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN THỊ BÍCH THỦY NGHIEÂN CÖÙU KHAÛ NAÊNG GAÂY BEÄNH GAN THAÄN MUÛ TREÂN CAÙ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) VAØ THÖÛ NGHIEÄM MOÂI TRÖÔØNG NUOÂI CAÁY CHUÛNG VI KHUAÅN EDWARDSIELLA ICTALURI ÑOÄT BIEÁN GEN PURA TRONG ÑIEÀU KIEÄN THÍ NGHIEÄM LUẬN VĂN THẠC SĨ Nha Trang, năm 2012 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN THỊ BÍCH THỦY NGHIEÂN CÖÙU KHAÛ NAÊNG GAÂY BEÄNH GAN THAÄN MUÛ TREÂN CAÙ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) VAØ THÖÛ NGHIEÄM MOÂI TRÖÔØNG NUOÂI CAÁY CHUÛNG VI KHUAÅN EDWARDSIELLA ICTALURI ÑOÄT BIEÁN GEN purA TRONG ÑIEÀU KIEÄN THÍ NGHIEÄM Chuyên ngành: Nuôi trồng thuỷ sản Mã số: 60 62 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. ĐỖ THỊ HÒA Nha Trang, năm 2012 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả đã nêu trong luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi cùng với sự cho phép sử dụng chung số liệu của nhóm tác giả thực hiện đề tài thuộc chương trình Công nghệ sinh học cấp Nhà nước do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III chủ trì, những số liệu này là trung thực, chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả iii LỜI CẢM ƠN Luận văn này đã được thực hiện với sự giúp đỡ của nhóm nghiên cứu đề tài Công nghệ sinh học cấp Nhà nước: “Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri nhược độc dùng làm vắc xin phòng bệnh gan thận mủ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bằng kỹ thuật gây đột biến gen” do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III chủ trì, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quí báu đó. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc sự chỉ dẫn nhiệt tình, chu đáo của cô giáo hướng dẫn PGS.TS Đỗ Thị Hoà đã giúp tôi trong suốt quá trình xây dựng đề cương, triển khai thực hiện các nội dung và hoàn thiện bản luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của các cán bộ thuộc Phòng nghiên cứu Bệnh Thủy sản và dự báo, Trung tâm quốc gia quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực miền Trung-Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III để tôi hoàn thành bản luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Nuôi trồng Thuỷ sản, Khoa sau Đại học, Trường Đại học Nha Trang, cùng quý thầy cô đã tận tình giảng dạy tôi trong suốt thời gian qua. Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình đã động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tác giả iv MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa ………………………………………………………………… i LỜI CAM ĐOAN ……………………………………………………………... ii LỜI CẢM ƠN ……………………………………………………………......... iii MỤC LỤC ……………………………………………………………............... iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT….…………………... vii DANH MỤC CÁC BẢNG …………………………………………………….. viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ……………………………………… ix MỞ ĐẦU …………………………………………………………….................. 1 Chương 1 – TỔNG QUAN ……………………………………………………. 3 1.1 Nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thương phẩm trên Thế giới và Việt Nam …………………………………………………………. 3 1.1.1 Thế giới …………………………………………………………. 3 1.1.2 Việt Nam ……………………………………………………………... 3 1.2 Những nghiên cứu về bệnh gan thận mủ cá tra nuôi trên Thế giới và Việt Nam ……………………………………………………………......... 5 1.2.1 Thế giới …………………………………………………………….... 5 1.2.2 Việt Nam ……………………………………………………………... 5 1.3 Những nghiên cứu về đặc điểm sinh học, khả năng gây bệnh trên cá tra nuôi của vi khuẩn E. ictaluri …………………………………………… 1.3.1 Đặc điểm sinh học vi khuẩn E. ictaluri ………………………………… 6 6 1.3.2 Những nghiên cứu về khả năng gây bệnh trên cá tra nuôi của vi khuẩn E. ictaluri ……………………………………………………………............ 8 1.4 Những công nghệ đột biến gen được ứng dụng để tạo chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến dùng làm nguyên liệu sản xuất vaccine phòng bệnh hiện nay trên Thế giới và Việt Nam ……………………………… 9 1.4.1 Thế giới …………………………………………………………….... 9 1.4.2 Việt Nam ……………………………………………………………... 13 1.5 Một số môi trường thường sử dụng trong nuôi cấy tăng sinh chủng vi khuẩn E. ictaluri hoang dại và chủng E. ictaluri bị đột biến gen …………... 14 v Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………. 16 2.1 Vật liệu nghiên cứu ………………………………………………………... 16 2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ………………………………………... 16 2.2.1 Thời gian nghiên cứu …………………………………………………….. 16 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu …………………………………………………….. 16 2.3 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu của đề tài ……………………………... 16 2.4. Phương pháp nghiên cứu ………………………………………………… 17 2.4.1 Phương pháp quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc; đo kích thước của vi khuẩn; nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ……………………………………………………... 17 2.4.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng gây bệnh gan thân mủ trên cá tra của vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA ……………………. 19 2.4.3. Phương pháp tiêm khẳng định lại khả năng gây bệnh gan thận mủ cá tra của chủng E. ictaluri đột biến gen purA phân lập từ mẫu cá tra cảm nhiễm nhân tạo trên môi trường EIM agar có bổ sung adenine ………………….. 20 2.4.4 Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy vi khuẩn E.ictaluri đột biến gen purA trong điều kiện thí nghiệm ……………………………………… 2.4.5 Phương pháp cắt mô gan, thận, lách cá tra 21 22 2.4.6 Phương pháp xác định một số chỉ tiêu môi trường nước ở các bể thí nghiệm ……………………………………………………………............. 24 2.4.7. Phương pháp phân tích, xử lý số liệu ……………………………………. 24 Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ……………………………………… 26 3.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) và vi khuẩn E. ictaluri chưa bị đột biến (E. ictaluri WT) …………………………………………………………….................. 26 3.1.1 Đặc điểm hình thái ……………………………………………………….. 26 3.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ……………………………………………….. 28 3.1.3 Đặc điểm sinh trưởng …………………………………………………….. 31 3.2 Kết quả nghiên cứu khả năng gây bệnh gan thận mủ trên cá tra của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị đột biến gen purA ………………… 32 3.2.1 Kết quả theo dõi một số chỉ tiêu môi trường nước ở các bể thí nghiệm 32 vi 3.2.2 Kết quả nghiên cứu khả năng gây bệnh gan thận mủ trên cá tra của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri sau khi đột biến gen purA ………………… 32 3.2.3 Kết quả tiêm khẳng định lại khả năng gây bệnh gan thận mủ cá tra của chủng E. ictaluri sau đột biến gen purA phân lập từ mẫu cá tra cảm nhiễm nhân tạo trên môi trường EIM agar có bổ sung Adenine+Kanamycine …. 37 3.2.3.1 Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh lại chủng E. ictaluri PAM trên cá tra cảm nhiễm nhân tạo dùng để làm thí nghiệm ……………………… 37 3.2.3.2 Kết quả tiêm khẳng định lại khả năng gây bệnh gan thận mủ cá tra của chủng E. ictaluri PAM phân lập từ cá tra nhiễm bệnh gan thận mủ nhân tạo ……………………………………………………………..................... 38 3.3 Kết quả nuôi cấy chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị đột biến gen purA ở các môi trường khác nhau ……………………………………… 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ………………………………………………… 44 KẾT LUẬN 44 KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO …………………………………………………….. 46 PHỤ LỤC ……………………………………………………………................ vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT API 20E: Hệ thống định danh vi khuẩn họ Enterobacteriaceae và vi khuẩn Gram âm hình que BHIA: Brain Heart Infusion Agar (Môi trường thạch Brain Heart Infusion) BHIB: Brain Heart Infusion Broth (Môi trường dịch canh Brain Heart Infusion) CFU: Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) Cs: Cộng sự DMM: Defined Minimal Medium (Môi trường tối thiểu cho vi khuẩn E. ictaluri) EIM: Edwardsiella Ictaluri Medium (Môi trường chọn lọc vi khuẩn E. ictaluri) ESC: Enteric Septicemia of Catfish (Bệnh xuất huyết nội tạng trên cá nheo Mỹ) KIA: Klegler Iron Agar LB: Luria Bertami (Môi trường Luria Bertami) LDC: Lysine decarboxylase MAC: Mac Conkey Agar (Môi trường thạch Mac-Conkey) NN&PTNT: Nông nghiệp và phát triển nông thôn OD: Optical Density (mật độ quang) ODC: Ornithine decarboxylase O/F: Oxydation/Fermentation ONPG: β- Galactosidase TSA: Tryptone Soya Agar (Môi trường thạch Tryptone Soya) viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng gây bệnh gan thân mủ trên cá tra của vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA………………….................... 19 Bảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc, hình dạng và kích thước chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA…………………………………………......... 26 Bảng 3.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn E. ictaluri PAM, E. ictaluri WT…………………………………………………………………….. 28 Bảng 3.3 Một số yếu tố môi trường nước trong bể nuôi thí nghiệm……….......... 32 Bảng 3.4 Tỉ lệ chết tích lũy trung bình (%) của cá tra sau 14 ngày thí nghiệm. 33 Bảng 3.5 Tỉ lệ chết tích lũy trung bình (%) của cá tra sau 14 ngày thí nghiệm tiêm chủng E. ictaluri PAM đã “hoàn độc” một lần trên cá tra khỏe 39 ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Diện tích (ha) nuôi cá tra các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long 20082010…………………………………………………………………... Hình 1.2 4 Sản lượng nuôi (nghìn tấn) cá tra các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long 2008-2010............................................................................................. 4 Hình 1.3 Con đường tổng hợp adenylosuccinate synthetase từ gen purA........... 10 Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu của đề tài........................................... 17 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tiêm khẳng định lại khả năng gây bệnh gan thận mủ cá tra của chủng E. ictaluri đột biến gen purA....................... Hình 2.3 21 Thí nghiệm chọn môi trường phù hợp nuôi cấy chủng E. ictaluri PAM....................................................................................................... 22 Hình 2.4 Sơ đồ tiến hành làm tiêu bản mô học mẫu cá tra................................... Hình 3.1 Khuẩn lạc vi khuẩn E. ictaluri (A, B) trên môi trường BHIA............... 27 Hình 3.2 Vi khuẩn E. ictaluri hoang dại chưa đột biến gen purA và vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA ................................................................ Hình 3.3 23 27 Sinh trưởng quần thể vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA trên môi trường DMM có bổ sung adenine (E. ictaluri PAM+Ad.0,05) và không bổ sung adenine (E. ictaluri PAM)............................................. 30 Hình 3.4 Đường cong sinh trưởng (theo mật độ) vi khuẩn E. ictaluri PAM và E. ictaluri WT trên môi trường nuôi cấy BHIB.................................... Hình 3.5 31 Đường cong sinh trưởng (theo giá trị OD) vi khuẩn E. ictaluri PAM và E. ictaluri WT trên môi trường nuôi cấy BHIB................................ 31 Hình 3.6 Tỉ lệ chết tích lũy trung bình (%) của cá tra theo thời gian thí nghiệm 33 Hình 3.7 Một số dấu hiệu bệnh lý của cá tra cảm nhiễm nhân tạo....................... 35 Hình 3.8 Nội quan cá tra khỏe mạnh và bệnh được gây cảm nhiễm nhân tạo..... 35 Hình 3.9 Mô học gan, thận và lách của cá tra bệnh gan thận mủ và cá tra khỏe.. 36 Hình 3.10 Sự phát triển của chủng E. ictaluri PAM trên các môi trường và nồng độ adenine khác nhau………………………………………………… 40 Hình 3.11 Sự phát triển của chủng E. ictaluri PAM trên các môi trường nuôi cấy có nồng độ adenine khác nhau…………………………………… 40 Hình 3.12 Sự phát triển của chủng E. ictaluri PAM trên các môi trường khác nhau…………………………………………………………………... 41 1 MỞ ĐẦU Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là đối tượng nuôi nước ngọt chủ lực, cung cấp thực phẩm trong nước và là mặt hàng thủy sản xuất khẩu quan trọng của Việt Nam trong nhiều năm qua. Để đạt được sản lượng cao, ngoài việc mở rộng diện tích, người nuôi cá tra đã phát triển nhiều loại hình nuôi như: Nuôi ao, nuôi lồng bè với mật độ thâm canh rất cao. Chính vì vậy, nhiều loại bệnh đã xuất hiện, trong đó bệnh gan thận mủ đã và đang gây thiệt hại lớn đến năng suất và sản lượng cá nuôi. Tỷ lệ cá mắc bệnh chết từ 10-90% tùy thuộc vào mức độ nhiễm bệnh và kích thước cá nuôi [3]. Ở Việt Nam, bệnh gan thận mủ xuất hiện đầu tiên vào mùa lũ năm 1998 ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh: An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ. Những năm gần đây bệnh xuất hiện hầu như quanh năm, nhưng cao điểm là tháng 6, 7 và 9 ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá, đặc biệt là cá giống [3]. Khi cá tra bị bệnh gan thận mủ biểu hiện bên ngoài không có gì đặc biệt, một số trường hợp cá bệnh có hiện tượng xuất huyết ở các vây, có khi xuất huyết toàn thân, khi giải phẫu và quan sát nội tạng thấy có nhiều đốm trắng trên gan, thận và lá lách [3, 15]. Các nghiên cứu của Crumlish (Đại học Stirling-Anh); Công ty Bayer Việt Nam; Công ty Pharma Nauy và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II kết hợp với NAVETCO đã cùng đi đến kết luận tại hội thảo ở Tp.Hồ Chí Minh tháng 9/2007: “Mặc dù có thể phát hiện nhiều tác nhân vi khuẩn trên cá tra bệnh nhưng chỉ có duy nhất vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là tác nhân thực sự gây bệnh gan thận mủ trên cá tra”. Gần đây nhất, vào ngày 11/8/2009 hội thảo bàn về tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra do Bộ NN&PTNT tổ chức tại thành phố Hồ Chí Minh cũng đã đi đến kết luận rằng: Vi khuẩn E. ictaluri là một tác nhân thực sự gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi tại Việt Nam. Vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra đã kháng với một số loại thuốc kháng sinh như Oxytetracylin, Oxolinic acid, Sulphonamid [3]; Bactrime, Colistin, Amoxicilin, Tetracyclin, Doxycyclin [5, 14]. Hơn nữa, các sản phẩm thủy sản sau đó thường không được ưa chuộng do sự tích lũy thuốc, hoá chất trong thịt cá. Do vậy, việc phòng bệnh gan thận mủ cá tra bằng vaccine là vấn đề được đặt ra cho công nghiệp nuôi cá tra hiện nay. Nghiên cứu về vi khuẩn E. ictaluri cho thấy vi khuẩn này có đặc tính sinh miễn 2 dịch rất mạnh [43, 46]. Do đó, hiện nay các nghiên cứu đang tập trung phát triển vaccine nhược độc không chỉ kích thích sinh miễn dịch dịch thể mà còn kích hoạt sinh miễn dịch trung gian tế bào. Các vaccine như vậy đã và đang được phát triển ở Mỹ nhờ vào công nghệ gây đột biến loại bỏ gen aroA hoặc purA hoặc cả 2 của chủng vi khuẩn E. ictaluri. Việc sản xuất vaccine nhược độc phòng bệnh gan thận mủ cá tra cần có nguồn nguyên liệu là chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA đã bị nhược độc và có khả năng sinh miễn dịch. Do vậy, việc nghiên cứu xác định khả năng gây bệnh gan thận mủ trên cá tra của chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA để từ đó làm cơ sở cho sản xuất vaccine là việc làm đầu tiên hết sức cần thiết. Trước thực tế trên, cùng với việc hoàn thành khóa học, được sự đồng ý của Trường Đại học Nha Trang, tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) và thử nghiệm môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri đột biến gen purA trong điều kiện thí nghiệm” với mục tiêu và nội dung nghiên cứu như sau: * Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá khả năng gây bệnh gan thân mủ cá tra của chủng Edwardsiella ictaluri sau khi đột biến gen purA và tìm ra môi trường nuôi cấy tăng sinh phù hợp chủng vi khuẩn này trong điều kiện thí nghiệm. * Nội dung nghiên cứu: 1. Các đặc điểm của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri sau khi đột biến gen purA. 2. Xác định khả năng gây bệnh gan thận mủ trên cá tra của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri sau khi đột biến gen purA. 3. Thử nghiệm nuôi cấy chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri sau khi đột biến gen purA ở các môi trường khác nhau. 3 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thương phẩm trên Thế giới và Việt Nam 1.1.1 Thế giới Trên thế giới, cá tra được nuôi phổ biến ở hầu hết các nước Ðông Nam Á, là một trong các loài cá nuôi quan trọng nhất của khu vực này. Bốn nước vùng hạ lưu sông Mê Kông đã có nghề nuôi cá tra truyền thống là Thái Lan, Campuchia, Lào và Việt Nam do có nguồn cá tra tự nhiên phong phú. Ở Campuchia, tỷ lệ cá tra thả nuôi chiếm 98% trong 3 loài thuộc họ cá tra, chỉ có 2% là cá ba sa và cá vồ đém, sản lượng cá tra nuôi chiếm một nửa tổng sản lượng các loài cá nuôi. Tại Thái Lan, trong số 8 tỉnh nuôi cá nhiều nhất, số trại nuôi cá tra chiếm 50%, đứng thứ hai sau cá rô phi. Một số nước trong khu vực như Malaysia, Indonesia cũng đã nuôi cá tra có hiệu quả từ những thập niên 70-80 của thế kỷ XX [52]. Ở Indonesia, cá tra có vai trò rất quan trọng và được xem là nguồn cung cấp thực phẩm chủ yếu cho nước này. Gần đây, nuôi cá tra ở Indonesia đã phát triển nhanh chóng nhờ vào khả năng cung cấp giống của Trung tâm phát triển nuôi nước ngọt Jambi và sự hợp tác kỹ thuật với JICA (Nhật). Cá tra được nuôi nhiều ở các đảo Java và Sumatra vì đặc tính dễ nuôi và khả năng chống chịu bệnh [50]. 1.1.2 Việt Nam Nghề nuôi cá da trơn thương phẩm, đặc biệt là cá tra tại Việt Nam thật sự bắt đầu phát triển mạnh vào đầu năm 2000 tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre khi kỹ thuật sản xuất giống nhân tạo cá tra thành công và có thể sản xuất ở quy mô lớn tại các vùng nuôi [35]. Nuôi cá tra thương phẩm ở đồng bằng sông Cửu Long được coi là một thành công của nuôi trồng thủy sản Việt Nam. Theo thống kê của Tổng cục Thủy sản, Bộ NN&PTNT, sản lượng và doanh thu xuất khẩu từ cá tra khoảng 1,2 triệu tấn, đạt 1,0 tỷ USD trong năm 2007; 1,48 tỷ USD vào năm 2008 và 1,5 tỷ USD vào năm 2010 [16]. Nó đã tạo ra một ngành chế biến cung cấp 150.000 việc làm, chủ yếu là cho phụ nữ nông thôn, và nhiều hơn nữa trong các lĩnh vực dịch vụ khác liên quan. Năng suất trung bình đạt 400-600 tấn/vụ, và 4 có lẽ là cao nhất không chỉ trong nuôi trồng thủy sản mà còn trong bất kỳ lĩnh vực sản xuất chính nào [35]. 2000 Tiền Giang 1800 Bến Tre Diện tích nuôi (ha) 1600 1400 Trà Vinh 1200 Sóc Trăng 1000 An Giang 800 Đồng Tháp 600 Vĩnh Long 400 Hậu Giang 200 Cần Thơ 0 Năm 2008 Năm 2009 Năm 2010 Hình 1.1 Diện tích (ha) nuôi cá tra các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long 2008-2010 (nguồn: Tổng cục thủy sản, Bộ NN&PTNT, 2011) [16] 350.000 Tiền Giang Sản lượng nuôi (nghìn tấn) 300.000 Bến Tre Trà Vinh 250.000 Sóc Trăng 200.000 An Giang 150.000 Đồng Tháp 100.000 Vĩnh Long 50.000 Hậu Giang Cần Thơ 0.000 Năm 2008 Năm 2009 Năm 2010 Hình 1.2 Sản lượng nuôi (nghìn tấn) cá tra các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long 20082010 (nguồn: Tổng cục thủy sản, Bộ NN&PTNT, 2011) [16] 5 1.2 Những nghiên cứu về bệnh gan thận mủ cá tra nuôi trên Thế giới và Việt Nam 1.2.1 Thế giới Năm 2002, Indonesia đã xảy ra dịch bệnh trên cá tra nuôi và gây chết cá hàng loạt ở các trại nuôi, tỉ lệ cá chết lên đến 50-100%. Nhóm nghiên cứu của Yuasa và cộng sự cũng lần đầu tiên phát hiện cá tra nuôi trong ao ở Sumatra có dấu hiệu bệnh lý tương tự như bệnh xuất huyết nội tạng và xác định tác nhân gây bệnh là E. ictaluri [50]. Ngoài ra, Kasornchandra (1987), Thune và cộng sự (1997) cũng đã phát hiện vi khuẩn E. ictaluri không những gây bệnh trên cá nheo Mỹ mà còn gây bệnh trên cá trê trắng (Clarias batrachus) ở Thái Lan và trên một số loài cá da trơn khác ở Indonesia và Trung Quốc [3, 43] Tại Hoa Kỳ, căn bệnh nghiêm trọng nhất, gây thiệt hại đến ngành công nghiệp nuôi cá nheo (catfish) là bệnh xuất huyết nội tạng (ESC-Enteric Septicemia of Catfish) [32]. Edwardsiella ictaluri, trực khuẩn gram âm, là nguyên nhân gây bệnh xuất huyết nội tạng trên cá nheo Ictalurus punctatus tại Hoa Kỳ [43]. Vi khuẩn này lần đầu tiên được phân lập và định danh bởi Hawke vào năm 1976 sau khi được thu nhận từ các trang trại nuôi cá nheo ở Georgia và Alabama [25]. Từ đó, vi khuẩn E. ictaluri luôn được xem là tác nhân gây bệnh với tỷ lệ chết cao (trên 60%) và thiệt hại hàng năm trên 50 triệu USD cho ngành nuôi cá nheo công nghiệp ở Mỹ [32]. 1.2.2 Việt Nam Bệnh trong nuôi cá tra là một trong những trở ngại lớn cho sự phát triển bền vững nghề nuôi đối tượng này tại Việt Nam. Quá trình tăng cường các hoạt động nuôi đã dẫn đến bùng phát dịch bệnh. Một số tác nhân gây bệnh đã được thông báo có liên quan đến bệnh trên cá tra nuôi bao gồm: Các bệnh do nấm, ký sinh trùng, đặc biệt là các bệnh do vi khuẩn gây tổn thất lớn và ảnh hưởng nghiêm trọng đến nghề nuôi cá tra ở Việt Nam. Tỉ lệ thất thoát do bệnh ở vi khuẩn có thể lên đến 50% so với các bệnh khác [34]. Trong các bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá tra, bệnh gan thận mủ gây thiệt hại nặng nề nhất, tiếp đến là bệnh xuất huyết. Theo Từ Thanh Dung và cộng sự (2004), ở vùng đồng bằng sông Cửu Long, bệnh gan thận mủ ảnh hưởng đến nghề nuôi cá tra thâm canh ở các tỉnh/thành phố như: An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ, sau đó bệnh lây lan sang các vùng lân cận và hiện tại bệnh cũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển nuôi cá tra như: Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng [3]. Bệnh này xuất hiện hầu như 6 ở mọi kích cỡ cá, tuy nhiên tỉ lệ hao hụt lớn và gây thiệt hại chủ yếu ở cá nuôi cỡ 3 tháng tuổi, có khối lượng từ 300-500 g/con [3, 7]. Bệnh thường xảy ra vào thời điểm giao mùa, nhưng tập trung vào mùa mưa từ tháng 7-11 [7]. Sự bùng phát của dịch bệnh chủ yếu gây ra bởi các yếu tố stress và có tính thời vụ. Các nghiên cứu đã cho thấy, các yếu tố gây suy thoái môi trường, chất thải từ hoạt động nông nghiệp, chăm sóc không đúng cách, mật độ thả cao, và chất lượng con giống thả kém làm cho cá dễ bị nhiễm bệnh [34]. 1.3 Những nghiên cứu về đặc điểm sinh học, khả năng gây bệnh trên cá tra của vi khuẩn E. ictaluri 1.3.1 Đặc điểm sinh học vi khuẩn E. ictaluri Trong hệ thống phân loại của Bergey, vi khuẩn Edwardsiella ictaluri thuộc giống Edwardsiella, họ Enterobacteriaceae, bộ Enterobacteriales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria. Giống Edwardsiella có các đặc điểm là: vi khuẩn dạng hình que thẳng, nhỏ, kích thước 1μm x 2-3 μm, gram âm, có khả năng di động bằng vành lông rung (peritrichous flagella) ở nhiệt độ 25oC, không di động ở 37oC, yếm khí tùy tiện. Có khả năng sử dụng D-glucose và một số đường khác kết quả sinh ra acid và thường sinh hơi. Oxidase âm tính, catalase dương tính, Vogesproskauer và simmon citrate âm tính, LDC dương tính, ODC dương tính, khử Nitrate. Tất cả các loài thuộc giống này đều có khả năng lên men đường maltose và Dmannose. Các loài trong giống vi khuẩn này là nguyên nhân gây bệnh ở cá da trơn và một số động vật khác, hiếm khi là tác nhân gây bệnh cơ hội cho người [28]. Loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là vi khuẩn hình que, gram âm, kích thước khoảng 0,75 x 2,5 µm ở 26oC [25], hay kéo dài 5-7 µm khi ở 37oC [37] hoặc có thể biến thiên 1,2-15 µm [50]. Vi khuẩn có khả năng chuyển động bằng tiêm mao, di động yếu ở 25-30oC nhưng không di động ở nhiệt độ cao hơn, không chịu được độ muối cao hơn 1,5% [38]. Edwardsiella ictaluri là một trong những loài khó tính nhất trong số các loài thuộc giống Edwardsiella. Chúng sinh trưởng yếm khí tùy tiện ở khoảng nhiệt độ tối ưu 22 -28oC và phát triển chậm trên môi trường BHIA. Sau 48 giờ nuôi cấy ở 28oC, vi khuẩn tạo nên khuẩn lạc hình tròn, bóng có kích thước khoảng 2 mm [54]. E. ictaluri thường được phân lập từ môi trường nuôi, từ nội quan hoặc mô não cá bị bệnh. Trong môi trường nước, vi khuẩn E. ictaluri có thể tồn tại khoảng 9 ngày [36]. 7 Vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá tra nhiễm bệnh gan thận mủ ở Đồng bằng sông Cửu Long Việt Nam được xác định là kháng lại với một số loại thuốc kháng sinh thông thường và rất có hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh xuất huyết nội tạng (ESC) trên cá nheo Mỹ như: Oxytetracylin, Oxolinic acid, Sulphonamid [3, 7, 23]; Bactrime, Colistin, Amoxicilin, Tetracyclin, Doxycyclin [5]. Vi khuẩn E. ictaluri có đặc tính sinh miễn dịch rất mạnh, tiêu biểu là kết quả của Thune và cộng sự (1997), Vinitnantharat và Plumb (1993) đã phát hiện sự tương quan ở nồng độ pha loãng huyết thanh 1/2048 và 1/256 [43, 46]. Do đó, hiện nay các nghiên cứu đang phát triển vaccine nhược độc không chỉ kích thích sinh miễn dịch dịch thể mà còn kích hoạt sinh miễn dịch trung gian tế bào. Các vaccine như vậy đã và đang được phát triển ở Mỹ nhờ vào công nghệ gây đột biến gen loại bỏ gen aroA hoặc purA hoặc cả 2 của vi khuẩn E. ictaluri. Chủng E. ictaluri đột biến không có khả năng hoàn nguyên độc lực do không có khả năng lấy lại gen đã bị loại bỏ. Các loại vaccine từ các chủng đột biến không những được sử dụng để phòng bệnh vi khuẩn E.ictaluri mà còn được sử dụng làm đường truyền kháng nguyên cho các tác nhân khác gây bệnh ở cá kể cả tôm [43]. Vi khuẩn E. ictaluri có thể xâm nhiễm vào cá tra theo hai con đường chủ yếu: từ môi trường nước qua da hoặc mang cá và qua miệng theo đường thức ăn gây bệnh gan thận mủ. Vi khuẩn có thể xâm nhập vào cơ quan khứu giác, sau đó lên não gây viêm não. Ngoài ra, vi khuẩn E. ictaluri còn có thể xâm nhiễm từ đường tiêu hóa qua niêm mạc ruột vào máu và gây hiện tượng nhiễm trùng máu. Nghiên cứu của Baldwin và Newton (1993) cho thấy vi khuẩn có thể vượt qua lớp màng nhầy ruột sau khi gây nhiễm 15 phút, xuất hiện trong không bào của phagocyte sau 24 giờ và trong các không bào đã thoái hóa sau 72 giờ. Trong vòng 2 tuần sau khi nhiễm bệnh, vi khuẩn gây viêm ruột, viêm gan và viêm cầu thận. Các cơ quan nội tạng bị hoại tử hoặc xuất hiện đốm trắng, trong ruột chứa đầy dịch máu [17]. 1.3.2 Những nghiên cứu về khả năng gây bệnh trên cá tra nuôi của vi khuẩn E. ictaluri Vi khuẩn E. ictaluri lần đầu tiên được xác định là tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long bởi Crumlish và cộng sự năm 2002 [23]. Các kết quả nghiên cứu của Từ Thanh Dung (2004), Trần Thị Minh Tâm (2003), Nguyễn 8 Hữu Thịnh và cộng sự (2007), Lý Thị Thanh Loan (2007) trên cá tra bị bệnh gan thận mủ cho thấy một phức hợp gồm nhiều tác nhân gây bệnh gồm: Edwardsiella ictaluri, E. tarda, Aeromonas sp., Pseudomonas, Hafnia alvei, Plesiomonas shigelloides, Vibrio, Klebsiella, Bacillus, Entercoccus, Enterobacter, Clostridinium spp. [3, 6, 11, 13]. Tuy nhiên, có hai nghiên cứu đáng chú ý nhất đó là: Kết luận của đề tài “Nghiên cứu bệnh đốm trắng trên cá tra nuôi công nghiệp” của Trần Thị Minh Tâm (2003) đã phỏng đoán tác nhân gây bệnh đốm trắng tức bệnh gan thận mủ trên cá tra là do vi khuẩn Hafnia alvei và Plesiomonas shigelloides dựa trên tần suất bắt gặp cao nhất (73,1% cho Hafnia alvei và 31,9% cho Plesiomonas shigelloides), kết quả cảm nhiễm để thử độc lực và phản ứng vi ngưng kết với kháng nguyên toàn phần [11]. Tuy nhiên, thông tin gần đây lại cho thấy, sau khi kiểm chứng lại bằng kỹ thuật PCR thì vi khuẩn Hafnia alvei chính là vi khuẩn E. ictaluri [51]. Nghiên cứu thứ 2 đó là sản phẩm hợp tác của trường Đại Học Stirling (Anh) với Trường Đại học Cần Thơ kết luận: tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri [23]. Sau đó, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II phối hợp với Công ty thuốc thú y trung ương II (NAVETCO) tiến hành điều tra thu mẫu cá tra bệnh tại các vùng địa lý khác nhau ở các ổ dịch và xác định chính vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là tác nhân gây bệnh gan thận mủ nhờ vào kết quả phân lập định danh vi khuẩn, kiểm tra sinh hóa và kiểm chứng bằng kỹ thuật PCR [12, 41]. Cho đến nay, các nghiên cứu về tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long Việt Nam như: Crumlish (Đại học Stirling-Anh); nghiên cứu của nhóm Công ty Bayer Việt Nam; nghiên cứu của nhóm công ty Pharma Na uy; nghiên cứu của Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II kết hợp với NAVETCO; nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương (Đại học Cần Thơ) năm 2009; nghiên cứu của Đồng Thanh Hà và Đỗ Thị Hòa (Đại học Nha Trang) năm 2009 đã cùng đi đến kết luận mới nhất tại hội thảo bàn về tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra do Bộ NN&PTNT tổ chức tại Tp. Hồ Chí Minh vào ngày 11/8/2009: Vi khuẩn E. ictaluri là một tác nhân thực sự gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi tại Việt Nam. Thêm vào đó, nhóm nghiên cứu của Crumlish (Đại học Stirling-Anh) khẳng định rằng chủng vi khuẩn E. ictaluri ở Hoa Kỳ và chủng vi khuẩn E. ictaluri ở Việt Nam có một số sai khác đáng kể [23]. 9 Cá tra bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E. ictaluri có thể có hoặc không xuất hiện dấu hiệu bất thường ở bên ngoài. Đa số thể hiện dấu hiệu xuất huyết nhẹ ở các gốc vây, xung quanh miệng và vùng bụng, hoặc kèm theo dấu hiệu trắng mang (mang nhợt nhạt, tiết nhiều nhớt). Giải phẫu nội tạng cho thấy 100% cá bệnh đều tồn tại của các đốm trắng có đường kính 0,5-3,0 mm ở các tổ chức nội tạng như gan, thận, lá lách. Các đốm trắng thường xuất hiện trước tiên ở thận, làm thận sưng to gấp 2-3 lần bình thường và mềm nhũn, khi bệnh nặng mới có thể quan sát thấy ở tỳ tạng và gan, các đốm trắng ở gan thường thưa và nhỏ hơn ở thận [4]. Bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra trên cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long xuất hiện hàng năm và theo mùa vụ, thường vào tháng 8-11 trong đó đỉnh cao nhất vào tháng 9 [7]. Vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh cho cá tra ở mọi lứa tuổi, thường gặp nhất và gây chết nhiều nhất ở cá tra dưới 3 tháng tuổi [7]. Việc phòng và trị bệnh do vi khuẩn E. ictaluri cho cá tra hiện nay ở Việt Nam vẫn hoàn toàn dựa vào kháng sinh và hóa chất [7, 10]. Phần lớn khi có bệnh xảy ra trên cá tra, người nuôi sử dụng nhiều loại kháng sinh kết hợp nhằm điều trị có hiệu quả cho tất cả các bệnh nhiễm khuẩn nói chung. Việc sử dụng thuốc như vậy dẫn đến tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn ngày một gia tăng, đồng thời gây ảnh hưởng lớn đến chất lượng thực phẩm và gây ô nhiễm môi trường [7]. Do vậy, phòng bệnh gan thận mủ cá tra bằng vaccine là vấn đề được đặt ra cho công nghiệp nuôi cá tra hiện nay. 1.4 Những công nghệ đột biến gen được ứng dụng để tạo chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến dùng làm nguyên liệu sản xuất vaccine phòng bệnh hiện nay trên Thế giới và Việt Nam 1.4.1 Thế giới Trong sản xuất vaccine thủy sản, nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn E. ictaluri đột biến dùng làm vaccine đã được thực hiện với những phương pháp gây đột biến khác nhau: Đột biến mất đoạn gen, đột biến chuyển vị (đột biến nhảy), đột biến làm mất biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình sinh trưởng, các gen quy định tính dộc của vi khuẩn. 1.4.1.1 Đột biến làm hỏng gen (knock out gen) Lawrence và cộng sự (1997) lần đầu tiên đã tạo thành công chủng vi khuẩn E. ictaluri đột biến hỏng gen purA, mất khả năng tổng hợp adenine, dùng làm nguyên liệu sản xuất vaccine nhược độc [30]. Đoạn gen purA, mã hóa cho enzyme tổng hợp 10 adenine, bị gây đột biến mất đoạn 598 bp và thay bằng gen kháng kanamycin. Khi loại bỏ gen purA, gen mã hóa cho enzyme adenylosuccinate synthase là enzyme đầu tiên xúc tác cho quá trình tổng hợp AMP- tham gia vào quá trình tổng hợp purin ribonucleotide [53]. Do vậy, nếu đột biến gen purA thì enzyme adenylosuccinate synthase không được tạo thành và quá trình chuyển hóa inosine monophosphate (IMP) thành adenylosuccinate sẽ không xảy ra, dẫn đến ATP không được hình thành để cung cấp năng lượng cho quá trình chuyển hóa từ XMP thành GMP), tạo ra GTP tham gia quá trình tổng hợp DNA và RNA (Hình 1.3) [1]. Từ đó làm ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh trưởng vi khuẩn E. ictaluri, gây ảnh hưởng gián tiếp đến độc lực của chủng vi khuẩn này. Hình 1.3 Con đường tổng hợp adenylosuccinate synthetase từ gen purA (trích bởi Nguyễn Quốc Bình, 2010) [1] Chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA (LSU-E2) không gây chết cá nheo Mỹ khi tiến hành gây bệnh thực nghiệm bằng phương pháp cho ăn hay ngâm nhưng gây chết khoảng 50% khi sử dụng phương pháp tiêm với liều khoảng 107-108 cfu/cá (gây chết 46,7% cá thí nghiệm ở liều tiêm 107 cfu/cá và 53,3% ở liều tiêm 108 cfu/cá). Điều này có thể do các gen quy định độc tính của chủng vi khuẩn LSU-E2 vẫn nguyên vẹn [30]. Wise và cộng sự (2000) đã sử dụng chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA ở nồng độ 3,65 x 107 CFU/ml cấp theo đường ngâm chỉ một lần cho cá nheo Mỹ nhỏ sạch bệnh. Kết quả cho thấy tỷ lệ sống của cá đạt 66,3% [48].