Tài liệu Nghiên cứu khả năng tái sinh cây khoai từ [dioscorea esculenta (lour.) burkill] bằng kỹ thuật in vitro.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ------------------------ LÀN VĂN ĐÔNG Tên đề tài: T NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH CÂY KHOAI TỪ [Dioscorea esculenta (lour.) burkill] BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2010 - 2014 Thái Nguyên, 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ------------------------ LÀN VĂN ĐÔNG Tên đề tài: T NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH CÂY KHOAI TỪ [Dioscorea esculenta (lour.) burkill] BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Lớp : 42 - CNSH Khoá học : 2010 - 2014 Giảng viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Tình Thái Nguyên, 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Th.S Nguyễn Thị Tình đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và hướng dẫn tận tình chu đáo trong quá trình thực tập. Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến KS. Lã Văn Hiền đã dành nhiều thời gian trực tiếp hướng dẫn em thực hiện nghiên cứu đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể giáo viên Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã dạy bảo em trong suốt quá trình học tập. Và cuối cùng, em xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ, động viên tinh thần của người thân và bạn bè trong suốt thời gian qua. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng 6 năm 2014 Sinh viên Làn Văn Đông DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT AND : Acid deoxyribonucleic B1 : Thiamin B3 : Nicotinic acid B5 : Gamborg’s B6 : Pyridoxine BA : 6-Benzylaminopurine CV : Coefficient of Variation CT : Công thức Đ/C : Đối chứng IAA : Indol axetic acid iP : N6-(2-isopentyl)adenin Kinetin : 6-Furfurylaminopurine KIN : Kinetin LSD : Least Significant Difference Test MS : Murashige and Skoog’s NAA : α - Naphlene axetic acid TN : Thí nghiệm WPM : Woody Plant Medium DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS, B5 và WPM đến khả năng tái sinh chồi cây Khoai Từ (sau 3 tuần nuôi cấy) ..............................26 Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ khoáng MS tới khả năng tái sinh chồi cây Khoai Từ (sau 3 tuần nuôi cấy) ...................................................28 Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ GA3 tới khả năng tái sinh chồi cây Khoai Từ (sau 3 tuần nuôi cấy) ...........................................................29 Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Khoai Từ (sau 6 tuần nuôi cấy) ...........................................................31 Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi cây Khoai Từ (sau 6 tuần nuôi cấy)................................33 Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ cây Khoai Từ (sau 4 tuần nuôi cấy).............................................................................34 Bảng 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với IAA đến khả năng ra rễ chồi cây Khoai Từ (sau 4 tuần nuôi cấy) ...........................36 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Sơ đồ quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật .................4 Hình 2.2. Cây Khoai Từ ............................................................................................12 Hình 4.1. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM đến khả năng tái sinh chồi cây Khoai Từ (Dioscorea esculenta ) (sau 20 ngày nuôi cấy) ....................................................................................................................27 Hình 4.2. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng nồng độ khoáng MS tới khả năng tái sinh chồi cây Khoai Từ (Dioscorea esculenta) (sau 3 tuần nuôi cấy) ................28 Hình 4.3. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng nồng độ GA3 tới khả năng tái sinh chồi cây Khoai Từ (Dioscorea esculenta) (sau 3 tuần nuôi cấy). .............................30 Hình 4.4. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Khoai Từ (Dioscorea esculenta) (sau 6 tuần nuôi cấy) ..............................32 Hình 4.5. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của BA kết hợp Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi cây Khoai Từ (Dioscorea esculenta) (sau 6 tuần nuôi cấy) .....33 Hình 4.6. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ cây Khoai Từ (Dioscorea esculenta) (sau 4 tuần nuôi cấy)...............................................35 Hình 4.7. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với IAA đến khả năng ra rễ cây Khoai Từ (Dioscorea esculenta) (sau 4 tuần nuôi cấy)......36 MỤC LỤC Trang Phần 1: MỞ ĐẦU ......................................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1 1.2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................2 1.3. Yêu cầu đề tài .......................................................................................................2 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................2 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................3 2.1. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................................3 2.1.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật........................3 2.1.1.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật ................................................................3 2.1.1.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào ............................................................3 2.1.1.3. Cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bào ................................................4 2.1.2. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ....................................5 2.1.2.1. Khử trùng mẫu và cấy khởi động ...................................................................5 2.1.2.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy ....................................................................................5 2.1.2.3. Giai đoạn nhân nhanh chồi .............................................................................5 2.1.4.4. Tạo cây hoàn chỉnh ........................................................................................5 2.1.2.5. Giai đoạn đưa cây ra đất.................................................................................6 2.1.3. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật ............6 2.1.3.1. Các muối khoáng đa lượng và vi lượng .........................................................6 2.1.3.2. Nguồn cacbon.................................................................................................7 2.1.3.3. Các vitamin và acid amin ...............................................................................8 2.1.3.4. Các chất điều hòa sinh trưởng ........................................................................8 2.1.3.5. Các chất bổ sung, làm thay đổi trạng thái môi trường ...................................9 2.1.3.6. pH môi trường ..............................................................................................10 2.1.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật .............10 2.1.4.1. Điều kiện vô trùng ........................................................................................10 2.1.4.2. Môi trường vật lý .........................................................................................10 2.2. Giới thiệu về cây Khoai Từ ................................................................................11 2.2.1. Nguồn gốc và phân loại..................................................................................11 2.2.2. Đặc điểm thực vật học của cây Khoai Từ .......................................................12 2.2.3. Phân bố và sinh thái ........................................................................................13 2.2.4. Công dụng của cây Khoai Từ..........................................................................14 2.3. Tình hình nghiên cứu cây Khoai Từ trong nước và trên thế giới ......................15 2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................................................15 2.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ....................................................................16 Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......18 3.1. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu .........................................................................18 3.1.1. Vật liệu thực vật ..............................................................................................18 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu .........................................................................................18 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................................18 3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng ..............................................................................18 3.3.1. Hóa chất ..........................................................................................................18 3.3.2. Thiết bị ............................................................................................................18 3.4. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ...............................................................19 3.4.1. Nội dụng nghiên cứu .......................................................................................19 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................19 3.4.2.1. Phương pháp nghiên cứu nội dung 1: nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM đến khả năng tái sinh chồi cây Khoai Từ. ........................................19 3.4.2.2. Phương pháp nghiên cứu nội dung 2 nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ GA3 tới khả năng tái sinh chồi cây Khoai Từ. ..................................................................21 3.4.2.3. Phương pháp nghiên cứu nội dung 3: nghiên cứu ảnh hưởng của một số Cytokinin (BA, Kinetin) đến khả năng nhân nhanh cây Khoai Từ...........................22 3.4.2.4. Phương pháp nghiên cứu nội dung 3: nghiên cứu ảnh hưởng một số auxin (NAA, IAA) đến khả năng ra rễ chồi cây Khoai Từ. ................................................23 3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu ..............................................................24 3.5.1. Phương pháp đánh giá .....................................................................................24 3.5.2. Phương pháp xử lý số liệu ...............................................................................25 Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................................26 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS, B5 và WPM đến khả năng tái sinh chồi cây Khoai Từ (Dioscorea esculenta ). ..................................................26 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ khoáng MS tới khả năng tái sinh chồi cây Khoai Từ (Dioscorea esculenta) ........................................................................28 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ GA3 tới khả năng tái sinh chồi cây Khoai Từ (Dioscorea esculenta). ..............................................................................29 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Khoai Từ (Dioscorea esculenta). ..............................................................................31 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi cây Khoai Từ (Dioscorea esculenta)......................................................33 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ cây Khoai Từ (Dioscorea esculenta) ...............................................................................................34 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với IAA đến khả năng ra rễ cây Khoai Từ (Dioscorea esculenta) ......................................................36 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................38 5.1. Kết luận ..............................................................................................................38 5.2. Kiến nghị ............................................................................................................38 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................39 I. Tiếng Việt ..............................................................................................................39 II. Tiếng Anh .............................................................................................................40 1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Khoai Từ [Dioscorea esculenta (Lour.) Burkill] thuộc họ củ nâu, chi Dioscorea là một cây có củ truyền thống, còn được gọi với nhiều tên khác nhau là củ từ, từ lông, từ gai. Chúng có đặc điểm thân leo, là loài giàu tinh bột. Củ Khoai Từ giàu nguồn carbohydrate và chất xơ, hàm lượng chất béo ở mức thấp tốt cho nguồn dinh dưỡng [22]. Cùng với một số loài khác như Khoai Mỡ, củ Khoai Từ trở thành nguồn lương thực, thực phẩm có ý nghĩa quan trọng đối với người nông dân các quốc gia vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt là các nước châu Phi [25]. Củ Khoai Từ là nguồn nguyên liệu quan trọng trong công nghiệp dược phẩm và y học, chất Diosgenin có trong củ Khoai Từ được sử dụng để tổng hợp Cortisone, Pregnenolone, progesterone và các sản phẩm steroid khác có hoạt tính estrogen làm giảm cholesterol trong máu [37]. Trong thực tế, nhân giống in vitro các loài Dioscorea đã được các tác giả tiến hành nghiên cứu cách đây khoảng 30 năm và sau đó tăng lên khá nhanh. Các tác giả sử dụng các bộ phận nuôi cấy khác nhau cho đối tượng nghiên cứu của họ. Kohmura và cs (1995) sử dụng lá non làm mẫu nuôi cấy [36]. Theo Alizadeh và cs (1998) [21]. Twyford và Mantell, (1996) sử dụng mẫu cấy là rễ [50]. Tor và cs (1998) dùng tế bào và protoplasts [49]. Nhiều tác giả như Mantell và Hugo (1989), Jasik và Mantell (2000), Fotso và cs (2013), Borges và cs (2004) đã thực hiện nghiên cứu trên đối tượng cây Khoai Mỡ với mẫu là củ bi [29], [30], [32], [40]. Tuy nhiên, có rất ít công trình nghiêm cứu hoàn thiện nhân giống cây Khoai Từ bằng phương pháp in vitro được công bố. Hầu hết các nghiên cứu chỉ dừng lại ở việc tách chiết các hợp chất hữu cơ có hoạt tính hóa học và sinh học trong củ Khoai Từ Trong tự nhiên, Khoai Từ tái sinh thông qua hạt hay đoạn thân tươi hay củ. Nhưng năng suất củ giảm do nhiễm virus và các loài tuyến trùng, củ bị nhiễm được truyền cho thế hệ sau làm giảm chất lượng củ [49]. Nhân giống Khoai Từ bằng phương pháp truyền thống đã trở nên phổ biến đối với hầu hết người nông dân, song kỹ thuật nhân giống trên cho hiệu quả thấp. Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một phương pháp nhân giống hiệu quả cao. Với phương pháp nhân giống invitro đảm bảo chủ động số lượng lớn cây giống, đồng đều, sạch bệnh. Xuất phát từ những yêu cầu trên, chúng tôi 2 tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng tái sinh cây Khoai Từ [Dioscorea esculenta (Lour.) Burkill] bằng kỹ thuật in vitro”. 1.2. Mục đích nghiên cứu Đưa ra quy trình tái sinh cây Khoai Từ [Dioscorea esculenta (Lour.) Burkill] bằng kỹ thuật in vitro. 1.3. Yêu cầu đề tài - Xác định được môi trường tái sinh chồi từ đốt thân cây Khoai Từ (Dioscorea esculenta). - Xác định được nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh chồi cây Khoai Từ (Dioscorea esculenta). - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số cytokinin (BA, Kinetin) tới khả năng nhân nhanh cây Khoai Từ (Dioscorea esculenta). - Xác định được nồng độ một số Auxin đến khả năng ra rễ chồi cây Khoai Từ (Dioscorea esculenta). 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - Ý nghĩa khoa học: + Kết quả nghiên cứu sẽ xây dựng được quy trình nhân giống cây Khoai Từ bằng kỹ thuật in vitro. + Kết quả nghiên cứu đạt được có thể bổ sung vào quy trình nhân giống danh mục cây trồng. - Ý nghĩa thực tiễn: Đề xuất quy trình hoàn chỉnh nhân giống cây Khoai Từ bằng kỹ thuật in vitro, từ đó đảm bảo chủ động trong sản xuất cây giống với số lượng lớn, sạch bệnh, chất lượng đồng đều, đáp ứng nhu cầu cây giống cho sản xuất, nâng cao hiệu quả sản xuất, phục vụ nhu cầu lương thực, thực phẩm và dược liệu. 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.1.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào. Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20 nhà sinh lí học thực vật người Đức Haberlandt (1902) đã phát biểu tính toàn năng của tế bào như sau: mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh [16]. Mỗi tế bào bất kì của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của hệ gen (genome) của thực vật đó. Do đó, khi gặp điều kiện thuận lợi, cơ quan, mô, tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ [10]. Trong nuôi cấy in vitro, tế bào thực vật thể hiện tính toàn năng thông qua sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào. 2.1.1.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào Cơ thể thực vật là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục biệt hóa thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau. Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau của cơ thể. Tuy nhiên, khi các tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ cho ra các tế bào mới có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào. 4 Sự giãn tế bào: tế bào giãn ra cả về chiều ngang và chiều dọc làm tăng kích thước của từng cơ quan nói riêng và toàn bộ cơ thể nói chung. Sau hai giai đoạn này cùng với quá trình cùng với quá trình biệt hóa tế bào phân hóa thành các mô chức năng chuyên hóa chuyên biệt, đảm nhận các vai trò khác nhau trong cùng một cơ thể sống [3]. Phân hóa Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hóa Phản phân hóa Hình 2.1 Sơ đồ quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [12]. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. 2.1.1.3. Cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bào Theo quan niệm sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Cho đến nay các tác giả đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [3]. 5 2.1.2. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.2.1. Khử trùng mẫu và cấy khởi động Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro.. Mục đích của giai đoạn này là tạo được nguyên liệu thực vật vô trùng để đưa vào nuôi cấy. Mẫu sau khi được vô trùng đảm bảo các yêu cầu sau: tỉ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao và tốc độ sinh trưởng nhanh. Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời gian xử lý diệt khuẩn. Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là: đỉnh sinh trưởng, chồi nách, hoa, đoạn thân, mảnh, lá, rễ [2]. Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỉ lệ mẫu sống cao, môi trường thích hợp sẽ đạt tốc độ nhân nhanh cao [2]. 2.1.2.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy Đây là giai đoạn tái sinh một cách có định hướng sự phát triển của mô nuôi cấy. Quá trình được điều khiển bằng các chất kích thích sinh trưởng (auxin/cytokinin), các chất bổ sung khác như là nước dừa, dịch chiết nấm men…vào môi trường kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp nhằm tạo ra tỷ lệ tái sinh cao nhất. Tuổi mẫu đem vào nuôi cấy cần được chú ý, thường các mô non chưa phân hóa có khả năng tái sinh cao hơn những mô đã chuyển hóa [2]. 2.1.2.3. Giai đoạn nhân nhanh chồi Giai đoạn này là giai đoạn tạo ra hệ số nhân nhanh cao nhất, được coi là then chốt của quá trình. Điều khiển quá trình này bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất kích thích sinh trưởng, các chất bổ sung khác như: nước dừa, dịch chiết nấm men,…. kết hợp với yếu tố nhiệt độ và ánh sáng [2]. Tùy thuộc vào vào đối tượng nuôi cấy, có thể tiến hành nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển cuả các chồi nách hoặc thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính. 2.1.4.4. Tạo cây hoàn chỉnh Khi các chồi đạt được kích thước nhất định sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ. Thường sau 2 - 3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta bổ sung các vào môi trường nuôi cấy các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin là nhóm hoocmon thực vật quan trọng có chức năng 6 tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Trong nhóm này các chất IAA, IBA, NAA, 2,4-D thường sử dụng để tạo rễ cho chồi. 2.1.2.5. Giai đoạn đưa cây ra đất Đây là giai đoạn cuối cùng quyết định khả năng ứng dụng của quá trình nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất. Trong giai đoạn này cây con được chuyển từ môi trường nhân tạo sang môi trường tự nhiên, do đó cần đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp (nhiệt độ và độ ẩm) để cây có thể đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong sản xuất. 2.1.3. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy. Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành công của nuôi cấy mô thế bào thực vật. Thành phần của môi trường nuôi cấy tế bào thay đổi tùy theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan được nuôi cấy. Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhưng mục đích nuôi cấy không giống nhau, môi trường nuôi cấy sử dụng cũng khác nhau khá cơ bản. Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu nuôi cấy [19]. Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như MS, LS, WPM, B5. Tuy có nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau [9]. + Các muối khoáng đa lượng và vi lượng. + Nguồn cacbon. + Các vitamin và amino acid. + Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường. + Các chất điều hoà sinh trưởng. 2.1.3.1. Các muối khoáng đa lượng và vi lượng Thành phần vô cơ bao gồm các muối khoáng (cả đa lượng và vi lượng) được đưa vào nuôi cấy. Nhu cầu về muối khoáng của tế bào và mô thực vật tách rời là không khác nhiều so với nhu cầu của cây trong điều kiện tự nhiên. Trong thành 7 phần muối khoáng đa lượng, các nguyên tố cần phải cung cấp là nitơ, phospho, kali và sắt [19]. Nitơ vô cơ được đưa vào môi trường ở hai dạng: Nitrat (NO3) và amon (NH4). Đa số các môi trường có chứa dạng nitrat nhiều hơn dạng amon. Hàm lượng nitrat trong môi trường khoảng 25mM, còn của amon khoảng từ 2-20mM. Trong môi trường MS, amon được cung cấp ở dạng muối NH4NO3, còn môi trường B5 của Gamborg có amon dạng muối (NH4)2SO4. Các gốc nitrat được đưa vào môi trường dưới dạng muối nitrat canxi, nitrat kali, nitrat natri hoặc nitrat amon. Trong số các nguyên tố của môi trường, nitơ có hàm lượng lớn nhất [19]. Hai dạng phospho thường được dùng là: NaHPO4.7H2O và KH2PO4 [19]. Kali được cung cấp cho môi trường dưới dạng kali nitrat (KNO3); Kali Clorua (KCl); Kali phosphate (KH2PO4). Nồng độ kali trong môi trường nuôi cấy thay đổi từ 2-25mM [19]. Nguồn Canxi trong môi trường cung cấp dưới dạng muối canxi nitrat Ca(NO3)2.4H2O; canxi clorua CaCl2.6H2O. Nồng độ Ca2+ trong môi trường nuôi cấy thay đổi từ 1-3,5µM [19]. Nguồn magiê: Magiê được cung cấp dưới dạng magiê sunphat MgSO4. 7H2O. Với nồng độ trong môi trường từ 0,5-3µM [21]. Nguồn Mg và S được cung cấp dưới dạng MgSO4.H2O hoặc (NH4)2SO4 [19]. Sắt: thiếu sắt tế bào mất khả năng phân chia, thiếu sắt làm giảm hàm lượng ARN và sinh tổng hợp protein nhưng làm tăng tổng hợp ADN và axit tự do dẫn đến giảm phân bào. Các môi trường cổ điển dùng sắt dưới dạng clorua sắt FeCl2, FeCl3.6H2O, sunfat sắt FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3 [19]. Các ion Na+ và Cl- cần ở hàm lượng thấp được đưa vào môi trường cùng với các muối khoáng khi điều chỉnh pH môi trường [19]. Các loại muối khoáng vi lượng: là những nguyên tố thường được sử dụng với hàm lượng thấp hơn 30 mg/l dung dịch nhưng rất nhiều nguyên tố vi lượng được chứng minh là không thể thiếu đối với sự phát triển của mô: Fe, Cu, Zn, Mn, Mo,I, Bo, Co. Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các enzyme [16]. 2.1.3.2. Nguồn cacbon Khi nuôi cấy in vitro, các tế bào thực vật thường không có khả năng quang hợp, do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của tế bào. 8 Nguồn cacbon được ưa chuộng nhất hiện nay trong nuôi cấy là đường saccarose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế cho saccarose nhưng chúng thường nghèo cacbon hydrate so với nhu cầu của thực vật. Ngoài ra, khi khử trùng môi trường, cần chú ý không nên kéo dài thời gian để tránh xảy ra hiện tượng caramen hoá, làm cho môi trường chuyển sang màu vàng dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào [16]. 2.1.3.3. Các vitamin và acid amin Các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy có khả năng tổng hợp được hầu hết các vitamin nhưng không đủ về số lượng, do đó để mô có thể sinh trưởng, tốt nhất phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin và amino acid, đặc biệt là vitamin nhóm B như: B1, B2, B3, B5, B6,…Các vitamin đặc biệt quan trọng như Myo-inositol…đóng vai trò sinh tổng hợp thành tế bào và được sử dụng với lượng lớn từ 50-100mg/l [16]. Các vitamin được pha ở dạng dung dịch mẹ có nồng độ cao từ 500 đến 1000 lần dung dịch làm việc. Dung dịch vitamin dễ bị hỏng do nấm, khuẩn nhiễm tạp và dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao, vì vậy cần bảo quản trong điều kiện lạnh dưới 0oC hoặc chỉ pha chế trước khi sử dụng [16]. 2.1.3.4. Các chất điều hòa sinh trưởng Thông thường trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật phổ biến 3 nhóm chất sinh trưởng sau: auxin, cytokinin và gibberelin. Các chất sinh trưởng tương tác với nhau và tương tác với các chất ức chế sinh trưởng (axit abscisis, ethylen) quyết định sự hình thành, phát triển, phát sinh hình thái của thực vật nuôi cấy [16]. - Auxin: Auxin được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô tế bào thực vật và thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy từ đầu. Auxin cùng với cytokinin có tác dụng thúc đẩy sự phát sinh và phát triển chồi, huyền phù tế bào và cơ quan. Đồng thời điều hòa quá trình phát sinh hình thái. Ở mức độ tế bào, auxin điều khiển các quá trình cơ bản của tế bào như phân chia và kéo dài tế bào [16]. Auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic acid (IAA). IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự hình thành rễ. Ngoài IAA, còn có các dẫn xuất của nó là napthyl axetic acid (NAA) và 2,4- 9 dichlorophenoxy acetic acid (2,4 D). Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình hình thành rễ [16]. Trong cây auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát triển và vùng đỉnh chồi. Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các phần phía dưới của cây [2]. - Cytokinin: Cytokinin là chất kích thích sinh trưởng có tác dụng kích thích sử dụng protein, điều khiển chu trình tế bào và tăng sự phân chia tế bào. Các cytokinin thường được sử dụng rộng rãi là kinetine, benzyadenin (BA), 6benzyl aminopurin (BAP) và thidiazuzon (TDZ). Đây là các cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn nhiều các cytokinin tự nhiên như zeatin hay iP. Các cytokinin có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự già hóa của tế bào [16]. - Gibberellin: Gibberellin được phát hiện đầu tiên bởi nhà nghiên cứu người nhật Kurosawa (1920) khi nghiên cứu bệnh ở mạ lúa do nấm Gibberella Fujikuroi gây ra. Năm 1939, ông đã tách chiết được gibberellin từ nấm G. Fujikuroi và được gọi là gibberellin A. Vào thời điểm năm 2003, đã có 126 chất được biết đến thuộc nhóm Gibberellic acid, thông dụng nhất trong nuôi cấy mô là GA3. Hợp chất này có tác dụng kích thích sự giãn tế bào theo chiều dọc, giúp kéo dài lóng đốt thân cây, phá ngủ của phôi, ức chế tạo rễ phụ cũng như tạo chồi phụ. Ngoài ra GA3 còn ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số thực vật và rút ngắn thời gian sinh trưởng của cây. Tuy nhiên GA3 rất mẫn cảm với nhiệt độ, nó bị mất hoạt tính sinh lý tới 90% sau khi hấp vô trùng. Vì vậy sử dụng GA3 thường phải đem lọc qua màng lọc vô trùng, sau đó đưa vào môi trường nuôi cấy [16]. 2.1.3.5. Các chất bổ sung, làm thay đổi trạng thái môi trường - Nước dừa: Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng [14]. Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hoá và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây. Nước dừa thường được lấy từ quả dừa để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản. Nước dừa thường sử dụng với hàm lượng 5-20% thể tích môi trường, kích thích phân hoá và nhân nhanh chồi [19]. - Dịch chiết nấm men: 10 Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô và tế bào. Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động vật với hàm lượng thích hợp. Ngoài ra, có thể sử dụng dịch thuỷ phân casein hydrolyase (0,1-1%) hoặc bột chuối với hàm lượng 40g bột khô trong 100g/l (xanh) nhằm tăng cường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy [19]. - Agar: Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắn hoá môi trường. Hàm lượng agar sử dụng thường là 0,6-1% đây là loại tinh bột đặc chế từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường hoặc bị chết vì thiếu O2 nếu nuôi trong môi trường lỏng và tĩnh [11]. 2.1.3.6. pH môi trường Mỗi loại cây trồng yêu cầu một loại môi trường khác nhau nhưng pH của môi trường thường là 5,6-6,0 [18]. Môi trường thấp có pH hơn 5 hay cao hơn 6 đều có ảnh hưởng đến trạng thái của môi trường nuôi cấy và sự hòa tan các chất dinh dưỡng [13]. 2.1.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.4.1. Điều kiện vô trùng Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị nhiễm. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến cả quy trình nuôi cấy mô in vitro [18]. Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hoá học, đèn tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn. Đây là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa tiên quyết. Song nếu tìm được nồng độ và thời gian xử lí thích hợp sẽ cho mẫu tỉ lệ sống cao và tỉ lệ nhiễm thấp. Các hóa chất thường dùng để khử trùng như: HgCl2 0,1%, nước Clolox, cồn 700, Ca(ClO)2… 2.1.4.2. Môi trường vật lý - Nhiệt độ: Là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao đổi chất trong nuôi cấy mô, nhiệt độ nuôi cấy thường giữ ổn định ở 25-270C; nhiệt độ còn ảnh hưởng tới hoạt động của auxin [19]. Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 25±20C [16]. 11 - Ánh sáng: Các nghiên cứu cho thấy ánh sáng rất cần thiết cho sự phát sinh hình thái mẫu nuôi cấy. Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo. Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi. Và các loại mẫu cấy khác nhau có nhu cầu về thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng khác nhau. Thời gian chiếu sáng với đa số các loài cây thích hợp là 12-18h/ngày. Cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000-10000lux [19]. - Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn luôn là 100%. 2.2. Giới thiệu về cây Khoai Từ 2.2.1. Nguồn gốc và phân loại Theo hệ thống thực vật [4] cây Khoai Từ được phân loại như sau: Giới (regum) : Thực vật (Plantae) Ngàng (Phylum) : Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp (Class) : Hành (Liliospida) Phân lớp : Hành (Lilianae) Liên bộ : Hành (Liliales Bộ (Ordo) : Củ nâu (Dioscoreales) Họ (family) : Củ nâu (Dioscoreaceae) Chi (genus) : Củ nâu (Dioscorea L.) Loài (species) : Esculenta L. Chi Dioscorea được đặt theo tên bác sĩ Hy Lạp cổ đại và nhà thực vật học Dioscorides. Theo Ayensu ES. và cs (1972) chi này bao gồm hơn 600 loài, thuộc nhóm cây một lá mầm chủ yếu được trồng ở Nam Mỹ, Châu Á và Tây Phi [22]. Ở Việt Nam phổ biến 2 loài gồm Khoai Mỡ (Dioscorea alata L) và Khoai Từ (Dioscorea esculenta L), là 2 loài trong số 10 loài quan trọng nhất có giá trị kinh tế của chi Dioscorea, thường được người dân Việt Nam gọi là “Từ Vạc”, được trồng ở hầu khắp các tỉnh từ Bắc vào Nam, tập trung nhiều ở các vùng trung du, bán sơn địa và các vùng mới khai hoang [5]. Theo Jean M. và cs (1992) bộ Dioscoreales được xác định có niên đại khoảng 124 triệu năm trước [33]. Hầu hết các loài thuộc chi Dioscorea đều có nguồn gốc ở Châu Á, Châu Phi, Châu Mỹ và Châu Đai Dương, xuất hiện cách ngày nay khoảng