Tài liệu Nghiên cứu một số phương pháp tách chiết adn từ dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự phục vụ công tác giám định adn​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ------------------------ ĐẶNG THỊ THU GIANG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ADN TỪ DẤU VẾT MÁU TRÊN CÁC VẬT MANG LÀ VẢI SAU KHI BỊ GIẶT BẰNG XÀ PHÒNG TRONG CÁC VỤ ÁN HÌNH SỰ PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH ADN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2015 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ------------------------ ĐẶNG THỊ THU GIANG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ADN TỪ DẤU VẾT MÁU TRÊN CÁC VẬT MANG LÀ VẢI SAU KHI BỊ GIẶT BẰNG XÀ PHÒNG TRONG CÁC VỤ ÁN HÌNH SỰ PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH ADN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Văn Hà HÀ NỘI - 2015 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành bản luâ ̣n văn này tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắ c tới Đại tá, PGS.TS Nguyễn Văn Hà - Phó giám đốc T rung tâm giám đinh ̣ Sinh học Pháp lý - Viê ̣n Khoa ho ̣c hiǹ h sự - Bô ̣ Công an đã rấ t tâ ̣n tiǹ h hướng dẫn tôi trong suố t quá trin ̀ h nghiên cứu và hoàn thành bản luâ ̣n văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn Lañ h đa ̣o Viện Khoa học hình sự , Lãnh đạo Trung tâm và các đồng nghiệp trong Trung tâm giám đinh ̣ Sinh ho ̣c Pháp lý Viê ̣n Khoa ho ̣c hin ̀ h sự - Bô ̣ Công an đã đô ̣ng viên, giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình làm luận văn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầ y cô giáo th uô ̣c Viê ̣n Sinh thái và Tài nguyên sinh vật , Viện Công nghệ Sinh học đã tâ ̣n tiǹ h truyề n đa ̣t kiế n thức và giúp đỡ tôi trong suố t quá triǹ h ho ̣c tâ ̣p. Cuố i cùng tôi xin bày tỏ lòng biế t ơn đế n gia điǹ h và ba ̣n bè , đã đô ̣ng viên, góp ý và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu . Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Học viên Đặng Thị Thu Giang Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang MỤC LỤC MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của việc nghiên cứu đề tài .................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................. 3 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................. 4 4. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 4 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................... 5 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 6 1.1. Lịch sử giám định gen trong khoa học hình sự....................................... 6 1.2. Nhận thức chung về dấu vết máu trong khoa học hình sự ...................... 7 1.2.1. Khái niệm về máu ............................................................................ 7 1.2.2. Cơ sở khoa học của giám định dấu vết máu ..................................... 8 1.3. Ảnh hưởng của xà phòng lên dấu vết máu ............................................. 9 1.4. Phát hiện dấu vết máu trên vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng 11 1.4.1. Mục đích ......................................................................................... 11 1.4.2. Phương pháp thu lượm dấu vết máu trên vật mang là vải .............. 12 1.4.3. Giám định định hướng dấu vết máu và xác định tính đặc hiệu loài 12 1.5. Tách chiết ADN từ dấu vết máu ........................................................... 15 1.6. Định lượng ADN................................................................................... 16 1.7. Khuếch đại ADN (PCR) ....................................................................... 17 1.8. Những khó khăn trong nâng cao hiệu quả PCR và chất lượng ADN ... 21 1.9. Kỹ thuật điện di ..................................................................................... 22 1.9.1. Nguyên lý của kỹ thuật điện di ....................................................... 22 1.9.2. Nguyên lý điện di trên máy giải trình tự gen ABI Prism 3130 Genetic Analyzer ...................................................................................... 23 1.10. Phân tích dấu vết ADN khi bị lẫn ....................................................... 23 1.11. Vấn đề nhiễm ADN ............................................................................ 24 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang 1.12. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước đối với lĩnh vực nghiên cứu của đề tài ................................................................................... 26 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............. 28 2.1. Vâ ̣t liê ̣u .................................................................................................. 28 2.1.1. Thiế t bi ̣ máy móc ........................................................................... 28 2.1.2. Dụng cụ ........................................................................................... 28 2.2. Hóa chất ................................................................................................ 29 2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 29 2.3.1. Phương pháp thu lượm dấu vết máu trên vật mang là vải .............. 29 2.3.2. Phương pháp giám định định hướng dấu vết máu .......................... 29 2.3.3. Phương pháp miễn dịch khuếch tán kép – Ouchterlony ................. 30 2.3.4. Phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu ................................ 31 2.3.5. Định lượng ADN ............................................................................ 34 2.3.6. Phương pháp PCR........................................................................... 36 2.3.7. Kỹ thuật điện di trên máy điện di mao dẫn(Capillary Electrophoresis - CE). 36 2.4. Thiết kế bố trí thí nghiệm...................................................................... 37 2.4.1. Các mẫu khảo nghiệm được tạo ra ................................................. 37 2.4.2. Các mẫu tạo ra được ký hiệu 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 3A, 3B, 4A, 4B, 5A, 5B, 5C, 6A, 6B, 7A, 7B, được tiến hành các bước thí nghiệm như sau: ...... 43 2.4.3. Tách chiết ADN bằng dung dịch Chelex 5% và bộ kít PrepFiler .. 44 2.4.4. Thử nghiệm kết quả tách chiết bằng bộ kít PrepFiler trên các mẫu từ các vụ án cụ thể .................................................................................... 44 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................... 47 3.1. Kết quả nghiên cứu ............................................................................... 47 3.1.1. Kết quả xác định định hướng dấu vết máu thu từ các vụ án với dung dịch phenolphthalein ................................................................................. 47 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang 3.1.2. Kết quả xác định protein loài sử dụng kỹ thuật khuếch tán miễn dịch kép theo Ouchterlony ........................................................................ 47 3.1.3. Kết quả thực nghiệm tách chiết bằng phương pháp sử dụng chelex 5% và tách chiết bằng bộ kít PrepFiler ..................................................... 47 3.1.4. Kết quả tách chiết bằng phương pháp PrepFiler ứng dụng vào mẫu vụ án thực tế .............................................................................................. 56 3.1.5. Hình ảnh điện di một số mẫu thực nghiệm, mẫu án thực tế ........... 58 3.2. Thảo luận kết quả nghiên cứu ............................................................... 66 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 69 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang DANH MỤC CÁC TƢ̀ VIẾT TẮT ADN (DNA) : Axit deoxyribonucleic ARN : Axit ribonucleic LR : Likelihood Ratio (tỉ lệ khả dĩ) RFU : Relative Flourescence Units (đơn vị huỳnh quang tương đối) RFLP : Restriction fragment Length Polymorphism (đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng nhân bội gen) ProK : Proteinaza K STR : Short Tandem Repeat (đoạn lặp lại ngắn) VNTR : Variable Number Tandem Repeats (đoạn lặp có độ dài trung bình) KHHS : Khoa học hình sự Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH MINH HỌA Bảng 1.1: Thành phần và thể tích phản ứng PCR ........................................... 36 Bảng 1.2: Các thành phần hóa chất sử dụng để điện di mao quản ................. 37 Bảng 2.1: Kết quả định lượng ADN tách chiết bằng chelex 5% ................... 48 Bảng 2.2: Chất lượng ADN tách chiết bằng chelex 5% ................................. 50 Bảng 2.3: Kết quả định lượng ADN tách chiết bằng bộ kít PrepFiler ........... 52 Bảng 2.4: Chất lượng ADN tách chiết bằng bộ kít PrepFiler ......................... 54 Bảng 3.1: Kết quả định lượng ADN với mẫu máu trên vải đã bị giặt trong vụ án cụ thể ..................................................................................................... 56 Bảng 3.2: Chất lượng ADN thu được từ dấu vết máu đã bị giặt trong các vụ án cụ thể .......................................................................................................... 57 Hình 4.1: Biểu đồ kết quả điện di mẫu 1A, lần thực nghiệm 1.1 ................... 58 Hình 4.2: Biểu đồ kết quả điện di mẫu 1B, lần thực nghiệm 1.2 .................... 59 Hình 4.3: Biểu đồ kết quả điện di mẫu 6B, lần thực nghiệm 1.2 .................... 60 Hình 4.4: Biểu đồ kết quả điện di mẫu MA1.1 ............................................... 61 Hình 4.5: Biểu đồ kết quả điện di mẫu MA2.1 ............................................... 62 Hình 4.6: Biểu đồ kết quả điện di mẫu MA2.2 ............................................... 63 Hình 4.7: Biểu đồ kết quả điện di mẫu MA3.2 ............................................... 64 Hình 4.8: Biểu đồ kết quả điện di mẫu MA4.2 ............................................... 65 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của việc nghiên cứu đề tài Phân tích dấu vết ADN đã trở thành một phần không thể thiếu trong công tác giám định hình sự nói chung và giám định dấu vết sinh học nói riêng và là một công cụ quan trọng cho các nhà điều tra phá án. Thông qua phân tích ADN có thể truy nguyên, nhận dạng cá thể trong các vụ án hình sự, tìm tung tích nạn nhân, người mất tích trong các vụ cháy, vụ tai nạn, thảm họa… hoặc xác định quan hệ huyết thống. Mỗi năm Viện Khoa học hình sự nhận được hàng trăm trưng cầu giám định ADN từ các vụ án, chủ yếu là từ dấu vết máu, tinh trùng, tóc, tế bào, răng xương, mô và tổ chức cơ thể, móng tay móng chân… Thống kê năm 2014 tại Viện Khoa học hình sự có 421 vụ án yêu cầu giám định ADN, trong đó số lượng trưng cầu giám định ADN từ dấu vết máu là 146 vụ và số vụ án có dấu vết máu trên vật mang là vải như quần áo, chăn ga, gối đệm… là 54 vụ với 144 mẫu cần giám định, trong số đó có nhiều vụ án vật mang dấu vết máu là vải được đưa đến giám định trong tình trạng đã qua ngâm giặt bằng xà phòng, dấu vết trên vật mang không còn nguyên vẹn, giảm đáng kể về số lượng và chất lượng ADN. Gây khó khăn rất lớn trong công tác giám định. Trong các vụ án hình sự việc khẳng định dấu vết máu của nạn nhân để lại trên quần áo của đối tượng gây án hay máu của đối tượng bám dính trên các vật mang là vải để lại hiện trường là một nguồn chứng cứ rất quan trọng, thủ phạm có thể do vô tình hay cố ý đã dùng hóa chất như xà phòng, chất tẩy rửa để giặt quần áo, hay các vật mang là vải có bám dính dấu vết máu trên đó. Vì vậy việc tách chiết ADN từ các dấu vết máu này gặp rất nhiều khó khăn. Do chất tẩy rửa tác động lên dấu vết phá hủy và rửa trôi dấu vết. Trong thực tế khi gặp những trường hợp như vậy mà áp dụng phương pháp tách chiết thông thường như đối với các dấu vết máu có chất lượng tốt thì tỉ lệ thành K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật 1 Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang công là rất thấp. Hơn nữa do phải tách chiết, PCR, chạy điện di nhiều lần gây tốn kém hóa chất và mất rất nhiều thời gian, mặt khác do lượng dấu vết thường không nhiều nên đòi hỏi phải có phương pháp tách chiết hiệu quả để tránh sử dụng hết dấu vết mà không cho kết quả phân tích ADN dẫn đến không góp phần giải quyết được vụ án. Trong thực tế các vụ án có dấu vết máu trên các vật mang là vải theo như lời khai của đối tượng là đã qua ngâm giặt bằng xà phòng và thực tế trong giám định quan sát bằng mắt cũng thấy vật mang dấu vết tương đối sạch, lượng dấu vết bám dính trên vật mang là khá mờ nhạt thì với phương pháp tách chiết thông thường hiện nay là dùng chelex 5% không cho hiệu quả cao với lý do: - Lượng ADN tách chiết được không đủ để thực hiện phản ứng PCR. - Không loại bỏ được hết các chất ức chế ảnh hưởng đến chất lượng ADN. - Hình ảnh điện di kém: Mất alen, nhiều alen lặp ảnh hưởng đến việc phân tích kiểu gen. Trong quá trình giải quyết các vụ án thực tế thấy rằng nhiều khi dấu vết máu để lại trên vật mang là nguồn chứng cứ duy nhất nếu không tách chiết được ADN có chứa trên đó để phân tích giám định thì vụ án sẽ đi vào bế tắc. Trước tình hình đó, chúng tôi thấy rằng việc nghiên cứu thử nghiệm các phương pháp tách chiết khác nhau đối với dấu vết máu trên vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng là rất cần thiết, nhằm tạo ra quy trình ổn định trong tách chiết ADN từ dấu vết máu trên các vật mang là vải đã bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án, góp phần giải quyết yêu cầu thực tế đặt ra, cũng như góp phần hoàn thiện quy trình giám định ADN đối với loại dấu vết khó thường gặp và có giá trị này. Vì vậy việc tiến hành triển khai đề tài: “Nghiên cứu một số phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự phục vụ công tác giám định ADN” là một yêu cầu cấp thiết. K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật 2 Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang 2. Mục tiêu nghiên cứu Sử dụng phương pháp tách chiết bằng chelex 5% và bộ kít tách chiết PrepFiler để tách chiế t ADN từ dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng với trang thiết bị, phương tiện, hóa chất của phòng thí nghiệm Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an. Nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục đích phân tích, đánh giá sự tác động qua lại của một số yếu tố lý, hóa như: xà phòng, chất liệu vải, thời gian tồn tại của dấu vết máu trên vải trước khi bị giặt, cách thức giặt … lên dấu vết máu bám dính trên các vật mang là vải như quần áo, chăn ga, gối đệm…. Chất lượng và số lượng của ADN tách chiết được từ các dấu vết máu trên các vật mang là vải như quần áo chăn ga gối đệm…. sau khi đã bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án cụ thể và trên các mẫu khảo nghiệm. Kết quả nghiên cứu giúp đưa ra nhận định với phương pháp tách chiết nào thì tối ưu nhất đối với dấu vết máu trên vải đã bị giặt bằng xà phòng, phục vụ tốt nhất công tác giám định gen hình sự, góp phần hoàn thiện cơ sở lý luận hiện có về quy trình tách chiết ADN nói chung cũng như tách chiết ADN từ những dấu vết có chất lượng kém nói riêng phục vụ cho công tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an. Kết quả đánh giá ADN tách chiết từ dấu vết máu thể hiện qua các bảng kết quả nồng độ ADN tổng số được tách chiết trực tiếp từ dấu vết máu; biểu đồ về hình thái các peak biểu thị cho các alen thu được ở 16 locus gen theo hệ STR (IdentifilerTM), qua đó giúp giám định viên gián tiếp đánh giá số lượng và chất lượng đối với từng alen của ADN tách chiết được từ mẫu máu cần khảo sát. Việc sử dụng kỹ thuật định lượng bằng realtime PCR chỉ là một khâu trong quy trình giám định giúp đánh giá được về hàm lượng ADN tách chiết được từ các dấu vết máu, từ đó định hướng điều chỉnh hàm lượng ADN K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật 3 Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang khuôn đưa vào mỗi phản ứng PCR. Kết quả định lượng bằng Real time PCR không hoàn toàn phản ánh chất lượng ADN phục vụ cho phản ứng PCR các locus hệ Identifiler 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu thực nghiệm các phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu trên vật mang là vải sau khi đã giặt bằng xà phòng. - Mẫu thực nghiệm được tạo ra và thu từ các vụ án mà cơ quan điều tra công an các tỉnh thành trong cả nước gửi giám định ADN tại phòng thí nghiệm của Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an. 4. Nội dung nghiên cứu 4.1. Sử dụng các phương pháp để tách chiết ADN Qua tham khảo tài liệu và thực tế giám định tại Viện Khoa học hình sự hiện nay cho thấy có 2 phương pháp tách chiết thông dụng và đạt hiệu quả đảm bảo cho quá trình giám định ADN từ dấu vết máu đó là: - Phương pháp tách chiết bằng chelex 5%. Phương pháp tách chiết bằng chelex 5% là phương pháp thông dụng nhất, giá thành rẻ, dễ thao tác, nhanh. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi chất lượng của ADN phải tốt, số lượng của ADN phải tương đối nhiều có độ tinh khiết cao. Như vậy dấu vết gửi giám định phải tương đối tốt ít bị biến tính. - Phương pháp tách chiết bằng bộ kít PrepFiler. Phương pháp tách chiết bằng bộ kit tách chiết PrepFiler cho hiệu quả cao và tối ưu nhất hiện nay áp dụng đối với các mẫu có hàm lượng ADN thấp, bị biến tính và lẫn nhiều tạp chất, chất ức chế. Tuy nhiên giá thành cao, dễ bị nhiễm trong quá trình thao tác. Bởi vậy chúng ta phải có những khảo sát để có được sự lựa chọn phù hợp. Xác định phương pháp tách chiết tối ưu với từng loại mẫu vật cụ thể, vì lượng dấu vết trong các vụ án thường không nhiều nếu chúng ta lựa chọn K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật 4 Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang không đúng phương pháp tách chiết thì có thể sẽ sử dụng hết mẫu vật mà vẫn không cho kết quả. Ngoài ra việc lựa chọn đúng phương pháp tách chiết còn vừa tiết kiệm chi phí vừa tiết kiệm thời gian. 4.2. Quy trình đánh giá và kết quả dự kiến - Sản phẩm tách chiết được định lượng bằng phương pháp Real-time. Mỗi mẻ thí nghiệm sau khi tách chiết ADN bằng phương pháp chelex 5% và bộ kít PrepFiler sẽ được chạy phản ứng PCR , sau đó điện di phân tích kết quả. - Toàn bộ sản phẩm tách chiết bởi phương pháp chelex 5% và bộ kít PrepFiler sẽ được so sánh, đánh giá lượng ADN thu được bằng phương pháp định lượng, chạy PCR và phân tích kết quả hình ảnh điện di từ đó rút ra phương pháp tách chiết cho kết quả tốt nhất. - Trên cơ sở kết quả của các phương pháp tách chiết, luận văn dự kiến sẽ áp dụng phương pháp tách chiết phù hợp cho dấu vết máu trên vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 5.1. Ý nghĩa khoa học Từ kết quả nghiên cứu của đề tài, đã tách chiết được lượng ADN hiệu quả nhất nhờ lựa chọn đúng phương pháp phù hợp đối với dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự, góp phần rút ngắn thời gian, tiết kiệm chi phí. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn Ứng dụng để tách chiết thành công ADN đối với các dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự. Giúp truy nguyên được cá thể, có căn cứ để xác định tội phạm, là nguồn chứng cứ để giải quyết các vụ án hình sự. K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật 5 Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Lịch sử giám định gen trong khoa học hình sự [3] Trong giám định kỹ thuật hình sự có nhiều phương pháp để truy nguyên cá thể người, giám định ADN hiện nay là một trong những phương pháp đắc lực nhất để giúp các nhà điều tra hình sự xác định chính xác tội phạm, truy tìm tung tích nạn nhân cũng như xác định quan hệ huyết thống. Giám định ADN ra đời dựa trên nền tảng của sinh học phân tử và gắn liền với sự phát triển của nó. Theo thời gian, cùng với sự phát triển của sinh học phân tử, công nghệ thông tin và các ngành khoa học khác có liên quan… giám định ADN ngày càng được hoàn thiện và phát triển không ngừng, trở thành một phương pháp giám định mang tính toàn cầu Năm 1985, Alec Jeffreys và các cộng sự ở trường đại học Leicester nước Anh khi nghiên cứu các đoạn ADN mã hóa cho myoglobin trong máu người đã phát hiện ra trình tự của các base nitơ được lặp lại một số lần với chiều dài đoạn lặp từ 10 - 15 base pair hoặc vài chục base pair, các đoạn lặp này được gọi là tiểu vệ tinh (Minisatellite) hay VNTR (Variable Number Tandem Repeats). Ông cũng phân lập được hai đoạn và nhân bội chúng, sử dụng làm đầu dò (probe) để phát hiện những vùng mà Jeffreys gọi là vùng siêu biến (hypervariable regions) ở các vật liệu di truyền khác nhau. Kỹ thuật để Jeffreys phân tích các đoạn lặp VNTR là kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Đây được coi là bước ngoặt lớn trong lịch sử phát triển của Khoa học hình sự thế giới nói chung và Sinh học pháp lý nói riêng. Các tiểu vệ tinh được phát hiện thấy trong mọi tế bào và ở những vị trí khác nhau trong genome của người. Điều đáng chú ý là số lần lặp lại các đoạn lặp này ở các cá thể khác nhau thì khác nhau. Alec Jeffreys coi đây là đặc điểm quan trọng để phân biệt sự khác nhau giữa các cá thể. Giám định ADN cho mục đích tư pháp ra đời từ đây. Phương pháp RFLP lần đầu tiên được sử K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật 6 Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang dụng để xác định đối tượng trong một vụ hiếp dâm xảy ra tại Anh vào năm 1986. Kể từ đó, việc kiểm tra truy nguyên cá thể bằng giám định ADN được phổ biến rộng rãi. Cũng vào thời điểm năm 1985, tác giả Kary Mullis đã công bố kết quả thử nghiệm thành công phản ứng chuỗi nhân gen PCR. Phản ứng PCR có ưu điểm vượt trội so với các phương pháp sử dụng kỹ thuật RFLP là chỉ cần một lượng rất ít ADN khuôn ban đầu sau hơn 20 - 30 chu kỳ phản ứng đã tạo ra được hàng triệu bản sao tạo điều kiện dễ dàng trong việc phát hiện và nghiên cứu phân tích. Năm 1991, một phương pháp mới trong giám định ADN được giới thiệu, đó là phương pháp phân tích sử dụng các đoạn lặp ngắn (STR - Short Tandem Repeats) có gắn chất huỳnh quang hay còn gọi là Microsatellite. Các STR thường có đoạn lặp từ 2 - 6 base pair. Hiện nay các hãng sản xuất đã đưa ra các bộ kít PCR cho các locus STR rất thuận lợi cho việc thiết lập phản ứng PCR và Identifiler là một trong những bộ kít như vậy. 1.2. Nhận thức chung về dấu vết máu trong khoa học hình sự 1.2.1. Khái niệm về máu [8] Máu là chất lỏng có màu đỏ chảy trong hệ thống mạch của người và động vật, có vai trò quan trọng nhiều mặt đối với sự sống của cơ thể Theo các nhà tổ chức học thì máu là mô liên kết đặc biệt mà chất căn bản ở thể lỏng. Trong cơ thể do sức đẩy của tim, máu được lưu thông trong hệ tuần hoàn máu theo một chiều xác định. Thành phần lỏng của máu là huyết tương và thành phần hữu hình là các tế bào máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu). Khi ra khỏi hệ tuần hoàn, máu bị đông lại, chất fibrinogen, một protein ở dạng hòa tan trong huyết tương, biến thành lưới sợi fibrin không hòa tan bao lấy tế bào máu, tạo thành cục máu đông. Khối này dần dần co lại tiết ra chất lỏng màu vàng nhạt, đó là huyết thanh. K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật 7 Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang Máu chiếm một vị trí đặc biệt quan trọng trong cơ thể người và động vật bởi nhiều chức năng khác nhau: Điều hòa hoạt động tuần hoàn, duy trì huyết áp, cung cấp oxy, đào thải CO2, bảo vệ cơ thể...và là một loại dấu vết hình sự quan trọng trong giám định sinh học pháp lý. 1.2.2. Cơ sở khoa học của giám định dấu vết máu [8] Giám định dấu vết máu trong điều tra hình sự để truy tìm thủ phạm đã được ứng dụng từ những năm đầu của thế kỷ XX (Uhlenhuth 1900 – 1901) bằng việc phân biệt giữa máu người và máu động vật trong các vụ án giết người. Về sau với việc phát hiện ra hệ thống nhóm máu ABO (Landsteiner và cộng sự 1901) và các hệ thống nhóm máu khác thì việc sử dụng dấu vết máu để phục vụ cho công tác điều tra ngày càng được mở rộng. Mỗi thành phần có trong huyết thanh và tế bào máu đều có vị trí quan trọng, chứa đựng các thông tin cần thiết về một cá thể mà không ai giống ai (tính cá biệt). Đây là vấn đề mấu chốt để truy nguyên cá thể thông qua dấu vết máu. Tuy nhiên để đáp ứng yêu cầu này đòi hỏi một quá trình lâu dài của phát triển khoa học và công nghệ. Mỗi giai đoạn phát triển của ngành huyết học và giám định sinh học pháp lý thì các chỉ số khai thác được từ dấu vết máu đều có những giá trị nhất định. Mọi sự tương tác đều để lại dấu vết – Đây là nguyên lý nổi tiếng trong Khoa học hình sự do Giáo sư Edmund Lo- Card trường đại học Y khoa Jurisprudence ở Lyon đề ra và được gọi là Nguyên lý Locar. Có rất nhiều ví dụ chứng minh cho nguyên lý này. Chẳng hạn, trong những hoạt động hàng ngày, con người luôn để lại những dấu vết của mình như: Lông tóc rụng khi chải đầu, tế bào da tay khi cầm điện thoại, tế bào niêm mạc khi hút thuốc lá…Trong một vụ án hiếp, giết người ta có thể phát hiện được dấu vết tinh dịch, tế bào biểu bì của đối tượng trong âm đạo, trong móng tay của nạn nhân và dấu vết máu của nạn nhân trên quần áo đối tượng và từ đó có thể phân tích K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật 8 Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang ADN để truy nguyên đối tượng hoặc tìm tung tích nạn nhân. ADN có trong tất cả các tế bào có nhân vì vậy sẽ có trong các chất sinh học có nguồn gốc từ cơ thể người như máu, lông tóc, nước bọt, tinh dịch…để lại hiện trường vụ án. Giám định gen từ máu chủ yếu là phân tích ADN trong bạch cầu vì bạch cầu chiếm số lượng lớn trong máu là những tế bào có nhân. Bạch cầu được chia làm 2 loại: - Bạch cầu hạt gồm: +Trung tính: 55% - 56% +Ưa xít: 2% - 4% +Ưa bazơ: 0,5% - Bạch cầu không hạt gồm: + Lymphoxit: 20% - 40% + Monoxit: 4% - 7% Trung bình trong 1 ml máu người có khoảng 6.000 – 9.000 bạch cầu, mỗi bạch cầu chứa khoảng 5-6 pg (picrogam) ADN, khi tách chiết 1ml máu có thể thu được từ 20-50 ng (nanogam) ADN. Do vậy khả năng phân tích được ADN từ dấu vết máu là rất cao. 1.3. Ảnh hƣởng của xà phòng lên dấu vết máu Khái niệm về xà phòng: Xà phòng là những muối natri (hoặc muối kali) của axit béo cao. Những muối natri của axit béo cao RCOONa là xà phòng rắn, còn muối kali của chúng, RCOOK là xà phòng mềm. Các dầu mỡ giàu axit béo no cũng cho xà phòng rắn và các dầu chứa nhiều axit chưa no cho xà phòng mềm hơn. Xà phòng là những chất hoạt động bề mặt. Nó có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt giữa các chất bẩn và quần áo, đồng thời xà phòng làm cho khả năng thấm ướt của quần áo nhanh hơn. Xà phòng có cấu tạo như sau: R _COO Na K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật 9 Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang Phần gốc hidrocacbon –R là phần kỵ nước, tan tốt trong các dung môi hữu cơ, dầu mỡ nhưng không tan trong nước. Nhóm – COONa là phần ưa nước bị tan trong nước, ít tan trong các dung môi hữu cơ. Khi giặt giũ quần áo bằng nước xà phòng thì phần kỵ nước (các gốc R khá dài) hòa nhập vào các hạt dầu mỡ (vì chúng dễ dàng tan vào nhau). Trong khi đó, phần ưa nước (các gốc _COONa) lại ở trên bề mặt các hạt bẩn đó và làm cho sức căng bề mặt của hạt bẩn giảm đi vì chúng có điện tích cùng dấu. Khi sức căng bề mặt giảm đi thì các hạt bẩn sẽ bị chia nhỏ ra, lực liên kết giữa hạt bẩn và quần áo yếu đi làm tăng khả năng thấm ướt và hạt bẩn tan dần vào trong nước. Ngày nay khi sản xuất xà phòng người ta còn cho thêm các enzym và cơ chế tác dụng làm sạch vết bẩn của enzym là phân giải chất bẩn thành các đoạn, các phần có khối lượng phân tử thấp hơn, dễ hòa tan hơn. Ví dụ: protease, amylase, lipase có thể thủy phân các vết bẩn protein, tinh bột, dầu/mỡ ngay cả khi nó ở dạng rắn, nhiệt độ thấp hơn 400C[ 2 ]. Chính vì những cơ chế nêu trên nên dấu vết máu tồn tại trên vật mang là vải sau khi đã bị giặt bằng xà phòng thường có số lượng rất ít và chất lượng rất kém, dẫn đến lượng và chất của ADN thu được cũng giảm đáng kể. Chất lượng ADN giảm là do chúng bị rửa trôi, biến tính, bị phân hủy. Mặt khác các hóa chất trong xà phòng cũng gây ức chế phản ứng PCR nên hiệu quả PCR thường không cao. Các phương pháp phân tích dựa vào PCR ngày nay như phân tích phức hợp các locus STR (multiplex Short Tandem Repeat typing) trở nên rất ưu việt bởi lẽ chỉ cần những lượng cực nhỏ ADN cũng có thể khuếch đại chúng đến một mức nào đó mà chúng ta có thể được phát hiện ra. Với lượng chỉ nhỏ hơn 1 ng ADN cũng có thể được phân tích nhờ sự khếch đại PCR với một phức hợp các locus STR so với việc yêu cầu lượng 100 ng hay nhiều hơn khi sử dụng kỹ thuật RFLP trong những năm trước đây. Tuy nhiên, khi sử dụng kỹ thuật với độ K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật 10 Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang nhạy cao đòi hỏi lượng ADN nguồn vào thấp cũng đem lại nhiều rủi ro, rất khó trong việc tránh sự tạp nhiễm gây ra bởi các cán bộ điều tra vụ án, hay các cán bộ khám nghiệm hiện trường, những người có nhiệm vụ thu thập, bảo quản các mẫu chứng cứ sinh học mà cụ thể là các dấu vết máu ở hiện trường. Để việc khuyếch đại PCR được diễn ra thành công, ADN khuôn cũng cần phải được nguyên vẹn ở một mức độ nhất định, đặc biệt ở vị trí gắn cặp mồi cũng như vị trí giữa các mồi sao cho việc tổng hợp kéo dài có thể được diễn ra. Trong trường hợp không có được một mạch ADN nguyên vẹn xung quanh vùng lặp STR đóng vai trò như một mạch khuôn, thì phản ứng PCR sẽ không thành công bởi vì việc kéo dài đoạn mồi sẽ bị tạm dừng ở vị trí đứt gãy trên mạch khuôn. Với một mẫu ADN bị phân hủy càng nhiều thì sẽ có càng nhiều sự đứt gãy xảy ra trong ADN khuôn và càng ít phân tử ADN có được chiều dài đầy đủ, cần thiết cho sự nhân bội được chính xác trong mỗi phản ứng PCR. Vấn đề quan trọng đặt ra là làm cách nào có thể tách chiết được một lượng ADN đủ về số lượng và đảm bảo chất lượng để có thể thực hiện được phản ứng PCR như đã nói ở trên. 1.4. Phát hiện dấu vết máu trên vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng 1.4.1. Mục đích Trong số các loại dấu vết ADN hình sự thì dấu vết máu là loại dấu vết dễ bị phân hủy và biến tính nhất vì bản thân máu là chất lỏng, đó là môi trường thuận lợi để các vi sinh vật, các enzym dễ dàng xâm nhập và phân hủy dấu vết máu. Việc phát hiện, thu lượm dấu vết máu trên vật mang là vải là một công việc rất khó khăn vì không phải loại vải nào cũng là vải sáng màu và dễ phát hiện dấu vết máu và việc phát hiện dấu vết máu trên vật mang là vải đã bị giặt là một công việc còn khó khăn hơn rất nhiều. Do đó việc tìm kiếm phát hiện phải tỉ mỉ và không được bỏ sót bất kỳ một dấu vết nghi ngờ nào. Nếu thu được K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật 11 Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang tối đa dấu vết máu có trên vật mang thì giúp ích rất nhiều cho việc tách chiết ADN, có thể phân tích được đầy đủ kiểu gen của cá thể để lại dấu vết máu. 1.4.2. Đánh giá, tìm dấu vết máu trên vật mang là vải Dấu vết máu xuất hiện chủ yếu do tác động của ngoại lực làm rách phần mềm cơ thể. Việc tìm kiếm dấu vết máu cần chú ý đến những điểm sau: Nắm vững các thông tin có liên quan đến vụ việc để có định hướng xem loại dấu vết nào có thể xuất hiện, vị trí dấu vết xuất hiện. Đồng thời xác định phương pháp, tìm kiếm và thu dấu vết [7]. Đánh giá mức độ thương tích trên cơ thể nạn nhân để phán đoán lượng máu có thể để lại trên vật mang nhiều hay ít. Máu khi ra khỏi cơ thể có màu đỏ, quá trình khô làm cho máu chuyển thành màu nâu, nâu sẫm, thậm chí màu đen, nên khó phát hiện hoặc dễ nhầm lẫn với các dấu vết khác [7]. Xem xét toàn diện tỉ mỉ tất cả các vị trí có khả năng có dấu vết để lại, trên vật mang, đặc biệt những vị trí khó quan sát. Đối với các vật mang là quần áo, mũ, tất… phải tìm dấu vết không chỉ ở mặt ngoài mà phải xem xét ở cả mặt trong, vì khi quần áo bị giặt tuy mặt ngoài không nhìn thấy máu nhưng vẫn có thể nhìn thấy ở mặt trong, nhất là ở đường chỉ may, mặt trong túi áo…[7]. 1.4.3. Giám định định hướng dấu vết máu và xác định tính đặc hiệu loài + Giám định định hướng dấu vết máu: Sử dụng dung dịch phenolphthalein để xác định định hướng dấu vết máu. Nguyên lý chung của các phương pháp giám định định hướng dấu vết máu Sơ đồ 1: Nguyên lý của các phương pháp định hướng dấu vết máu[9] K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật 12