Tài liệu Nghiên cứu qui trình phân lập, nhân giống dạng dịch thể để nuôi trồng nấm đầu khỉ (hericium erinaceus (bull fr.) pers.) và tách chiết một số polysaccharide có hoạt tính sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI =====***===== Cồ Thị Thùy Vân NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH PHÂN LẬP, NHÂN GIỐNG DẠNG DỊCH THỂ ĐỂ NUÔI TRỒNG NẤM ĐẦU KHỈ (HERICIUM ERINACEUS (BULL.: FR.) PERS.) VÀ TÁCH CHIẾT MỘT SỐ POLYSACCHARIDE CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI =====***===== Cồ Thị Thùy Vân NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH PHÂN LẬP, NHÂN GIỐNG DẠNG DỊCH THỂ ĐỂ NUÔI TRỒNG NẤM ĐẦU KHỈ (HERICIUM ERINACEUS (BULL.: FR.) PERS.) VÀ TÁCH CHIẾT MỘT SỐ POLYSACCHARIDE CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Lê Mai Hương 2. PGS.TS. Trần Liên Hà Hà Nội - 2015 CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi; các số liệu, kết quả, hình ảnh nêu trong Luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình của tác giả nào khác. Hà Nội, ngày TM tập thể Giáo viên hƣớng dẫn tháng năm 2015. Nghiên cứu sinh Giáo viên HD 1 PGS.TS. Lê Mai Hƣơng Cồ Thị Thuỳ Vân CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Lê Mai Hương, Phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam và PGS.TS. Trần Liên Hà, Bộ môn Vi sinh – Hóa sinh – Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Đại học Bách khoa Hà Nội, đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu để tôi hoàn thành Luận án này; Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Đại học Bách khoa Hà Nội đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quí báu cũng như giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập tại trường; Đồng thời xin được gửi lời cảm ơn tới sự giúp đỡ, cộng tác của các cán bộ phòng Nghiên cứu – Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp; các cán bộ phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam; Tôi xin cảm ơn GS.TSKH. Trịnh Tam Kiệt đã cho tôi những lời khuyên và chỉ dẫn cho tôi rất nhiều kiến thức về nấm lớn. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc cùng toàn thể cán bộ công nhân viên Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập được giao. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Cồ Thị Thùy Vân CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ MỤC LỤC TRANG MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 5 1.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất và sử dụng nấm dƣợc liệu 5 1.1.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm dược liệu 5 1.1.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng nấm dược liệu trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng 10 1.1.2.1. Tình hình nghiên cứu tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm dược liệu 15 1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm dược liệu ở nước ta 16 1.2. Nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers. 17 1.2.1. Giới thiệu về nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers. 17 1.2.2. Vị trí nấm Đầu khỉ trong phân loại nấm học 18 1.2.3. Đặc điểm hình thái quả thể và một số đặc tính sinh học của nấm Đầu khỉ 18 1.2.4. Thành phần hóa học của nấm Đầu khỉ H. erinaceus 19 1.2.4.1. Một số thành phần dinh dưỡng trong nấm Đầu khỉ 1.2.4.2. Một số thành phần hóa học mang lại giá trị dược liệu cho nấm Đầu khỉ 1.2.5. Tình hình nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên thế giới và trong nước 19 20 25 1.2.6. Một số phương pháp được sử dụng để tách polysaccharide từ quả 30 thể và hệ sợi nấm dược liệu 1.2.6.1. Phương pháp tách chiết trong cồn 30 1.2.6.2. Phương pháp tách chiết trong nước nóng 30 1.2.6.3. Phương pháp tách chiết trong kiềm nóng kết hợp với sự hỗ trợ của lò vi sóng và siêu âm 31 1.2.6.4. Phương pháp tách chiết trong nước nóng kết hợp với sự hỗ trợ của lò vi sóng và siêu âm 32 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1. Vật liệu 34 2.2. Các loại môi trƣờng 36 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 39 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu tuyển chọn, xây dựng QTCN phân lập giống nấm Đầu khỉ i 39 CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 2.3.1.1. Khảo nghiệm, tuyển chọn giống nấm Đầu khỉ 39 2.3.1.2. Phân lập giống nấm Đầu khỉ 40 2.3.1.3. Nghiên cứu độ tuổi của quả thể nấm thích hợp để phân lập giống gốc 41 2.3.1.4. Nghiên cứu các điều kiện nhân giống gốc nấm Đầu khỉ 41 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu xây dựng QTCN nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể các cấp. 42 2.3.2.1. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 1 (dung tích 200 ml) 42 2.3.2.2. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 2 (dung tích 2000 - 5000 ml) 43 2.3.2.3. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể sử dụng trong nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp (dung tích 120 lít) 44 2.3.2.4. Phương pháp kiểm tra chất lượng giống nấm dạng dịch thể 45 2.3.3. Phương pháp nghiên cứu xây dựng QTCN nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp sử dụng giống nấm dạng dịch thể. 46 2.3.3.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu nuôi trồng nấm Đầu Khỉ 46 2.3.3.2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp, sử dụng giống nấm dạng dịch thể. 47 2.3.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 47 2.3.4. Phương pháp xác định một số thành phần dinh dưỡng, vitamin, axit amin trong nấm Đầu khỉ 49 2.3.5. Phương pháp nghiên cứu một số điều kiện tách chiết thu nhận polysaccharide trong quả thể nấm Đầu khỉ 49 2.3.5.1. Phương pháp thu nhận polysaccharide trong mẫu quả thể nấm nấm Đầu khỉ 49 2.3.5.2. Lựa chọn hóa chất kiềm thích hợp 50 2.3.5.3. Nghiên cứu nồng độ dung dịch NaOH thích hợp 50 nấm 50 2.3.5.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 50 2.3.5.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư người nuôi cấy invitro 2.3.5.7. Phương pháp kiểm tra hoạt tính ức chế hình thành khối u 3 chiều trên thạch mềm (anti-tumor promoting assay) in vivo 2.3.5.8. Phương pháp nghiên cứu trên động vật thực nghiệm 2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu 51 52 53 54 ii CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tuyển chọn, phân lập lại giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus 55 50 3.1.1. Kết quả so sánh, đánh giá và khảo nghiệm 4 giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus trên diện hẹp 51 3.1.1.1. Một số đặc trưng hình thái của 4 giống nấm Đầu khỉ nghiên cứu tuyển chọn 51 3.1.1.2. Thời gian sinh trưởng của 4 giống nấm Đầu khỉ khảo nghiệm 52 3.1.1.3. Đánh giá khả năng chống chịu đối với các loại sâu bệnh hại của 4 giống Đầu khỉ nghiên cứu 57 3.1.1.4. Kết quả phân tích một số thành phần dinh dưỡng trong nấm Đầu khỉ He1 59 3.1.2. Kết quả phân lập lại giống nấm Đầu khỉ 61 3.1.2.1. Ảnh hưởng của phương pháp phân lập đến sự mọc của hệ sợi nấm Đầu khỉ 61 3.1.2.2. Xác định thời điểm phân lập 63 3.1.2.3. Kết quả nghiên cứu môi trường dinh dưỡng phân lập giống nấm Đầu khỉ 65 a. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của hệ sợi giống gốc 65 b. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của hệ sợi 66 c. Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của sợi nấm 68 3.1.2.4. Xác định nhiệt độ thích hợp nuôi giống gốc nấm Đầu khỉ 70 3.2. Kết quả nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể 73 3.2.1. Nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể (dung tích 200ml) 73 3.2.1.1. Kết quả nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng 73 3.2.1.2. Kết quả nghiên cứu môi trường nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 1 74 3.2.1.3. Ảnh hưởng của pH môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể đến 76 iii CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể 3.2.1.4. Kết quả xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp khi cấy chuyển sang môi trường dịch thể 76 3.2.1.5. Kết quả nghiên cứu nhiệt độ nuôi giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể 77 3.2.1.6. Chế độ nuôi giống 77 a. Nghiên cứu chế độ nuôi giống trung gian cấp 1 trên máy lắc 80 b. Nghiên cứu các chế độ nuôi giống trên máy khuấy từ 81 3.2.1.7. Kết quả nghiên cứu đường cong sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể 82 3.2.2. Nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể (dung tích 2000ml – 5000ml) 85 3.2.2.1. Kết quả nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng 85 3.2.2.2. Kết quả nghiên cứu thành phần môi trường nhân giống trung gian cấp 2 nấm Đầu khỉ dạng dịch thể 86 3.2.2.3. Kết quả nghiên cứu tuổi giống trung gian cấp 1 dạng dịch thể cấy chuyển sang giống trung gian cấp 2 87 3.2.2.4. Kết quả xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp khi cấy chuyển sang môi trường dịch thể 88 3.2.2.5. Kết quả nghiên cứu chế độ sục khí cho bình lên men dung tích 2-5 lít 89 3.2.2.6. Kết quả nghiên cứu chế độ sục khí cho bình lên men dung tích 2-5 lít 90 3.2.2.7. Kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng của giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể 92 3.2.3. Lên men nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể qui mô 120 lít 95 3.2.3.1. Kết quả nghiên cứu thành phần môi trường nhân giống thể tích 120 lit 95 3.2.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện khử trùng môi trường dinh dưỡng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng 95 3.2.3.3. Kết quả nghiên cứu tuổi giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể cấy chuyển sang bình lên men nhân giống thể tích 120 lít 96 iv CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 3.2.3.4. Kết quả nghiên cứu tỷ lệ giống cấy chuyển sang nồi lên men thể tích 120 lít 97 3.2.3.5. Kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng của nuôi trồng dạng dịch thể, thể tích 120lit (nghiên cứu thời gian lên men) 98 3.3. Kết quả nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống dạng dịch thể. 104 3.3.1. Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất phối trộn đến khả năng nhiễm bệnh trong môi trường nuôi cấy và sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ 104 3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng phối trộn và phương pháp khử trùng đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong quá trình nuôi trồng thu quả thể 107 3.3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy vào bịch nguyên liệu đến sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ 111 3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong nuôi trồng 113 3.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành và phát triển quả thể 114 3.3.6. Hiệu quả kinh tế mang lại khi áp dụng qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống dạng dịch thể 116 3.4. Kết quả tách chiết và thử hoạt tính sinh học của polysaccaride từ nấm Đầu khỉ H. erinaceus 120 3.4.1. Nghiên cứu quy trình tách chiết 120 3.4.1.1. Lựa chọn hóa chất kiềm thích hợp 120 3.4.1.2. Nghiên cứu tối ưu hóa nồng độ dung dịch NaOH 120 3.4.2. Xác định hàm lượng polysaccharide trong quả thể nấm Đầu khỉ He1 trong từng thời điểm nuôi 122 3.4.3. Kết quả kiểm tra hàm lượng polysaccharide trong quả thể nấm Đầu khỉ khô mới thu hái và sau thời gian bảo quản 6 tháng 124 3.4.4. Kết quả thử hoạt tính của polysaccharide thu nhận được 125 3.4.4.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial assay) 125 3.4.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxicity assay) 126 v CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 3.4.4.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế hình thành khối u trên thạch mềm của các phân đoạn polisaccarid 127 3.4.4.4. Kết quả thử nghiệm in vivo tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm polysaccharide tổng HT1 trên động vật thực nghiệm 128 a. Kết quả nghiên cứu an toàn của chế phẩm HT1 128 a1. Tác dụng của HT1 đối với trọng lượng cơ thể thỏ 129 a2. Tác dụng của HT1 trên điện tim của thỏ khi dùng chế phẩm HT1 6 tuần 129 a3. Tác dụng của HT1 đến một số chỉ số huyết học trên thỏ khi dùng HT1 6 tuần 131 a4. Tác dụng của HT1 đối với hoạt độ enzym SGOT, SGPT của thỏ 133 a5. Tác dụng HT1 đối với hàm lượng Creatinin của thỏ 134 b. Kết quả nghiên cứu tác dụng bảo vệ phóng xạ của chế phẩm HT1 134 c. Tác dụng của HT1 đối với quá trình tạo máu 135 Chƣơng 4. KẾT LUẬN 138 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TRONG PHẠM VI LUẬN ÁN 141 TÀI LIỆU THAM KHẢO 142 Phụ lục 149 vi CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. CT CTĐC CTNT CSH DMEM DMSO FAO PGA 9. PSF Công thức Công thức đối chứng Công thức nuôi trồng Chứng sinh học Dulbecco’s Modified Eagle Medium Dimethylsulfoxide Tổ chức Nông nghiệp và Thực phẩm thế giới Potato glucose agar Dịch kháng sinh: 100đơn vị/ ml Penicilin, 100 g /ml Streptomycin sulfate, 0,25 g /ml Amphotericin B Polysaccharide tách chiết từ Hericium erinaceus Sắc ký lỏng cao áp 10. 11. HEP HPLC 12. KH&CN Khoa học và Công nghệ 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. KLC IC50 LD50 MEME MTĐC NAA NCS QTCN TCVN TCPTN TSB YF Khuẩn lạc cầu Inhibitory concentration 50% - Nồng độ ức chế tối thiểu 50% Lethal dose 50, Liều độc cấp tính Minimum Essential Medium with Eagle’s salt Môi trường đối chứng Nonessential Amino Axit Nghiên cứu sinh Qui trình công nghệ Tiêu chuẩn Việt Nam Tiêu chuẩn phòng thử nghiệm Trypcase Soya Broth Quả thể nấm khi còn non 25. YM Hệ sợi nấm 26. 27. 28. YE SKS XPĐ Dịch lọc môi trường nuôi cấy nấm Đầu khỉ Sinh khối sợi Xuất phát điểm vii CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DANH MỤC CÁC BẢNG TRANG Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng của quả thể nấm Đầu khỉ 19 Bảng 1.2: Thành phần và hàm lượng axit amin trong quả thể nấm Đầu khỉ H. erinaceus 20 Bảng 1.3: Hàm lượng một số thành phần hóa sinh của nấm Đầu khỉ 20 Bảng 1.4: Một số thành phần có hoạt tính sinh học mang lại lợi ích sức khỏe của H. erinaceus 21 Bảng 2.1: Thành phần môi trường phân lập nấm Đầu khỉ 37 Bảng 2.2: Thành phần các môi trường nuôi cấy giống Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể 37 Bảng 2.3: Thành phần các môi trường nuôi cấy giống Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể 38 Bảng 2.4. Thành phần môi trường nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể 38 Bảng 2.5: Thành phần môi trường nuôi trồng nấm Đầu khỉ 38 Bảng 3.1: Đặc trưng hình thái hệ sợi và quả thể của các giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus khảo nghiệm trên môi trường PGA và CTNT 1 55 Bảng 3.2: Thời gian sinh trưởng, phát triển của các giống nấm Đầu khỉ khảo nghiệm 57 Bảng 3.3: Thành phần và mức độ sâu bệnh hại trên bốn giống nấm Đầu khỉ 57 Bảng 3.4: Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng và vitamin cuả nấm Đầu khỉ He1 59 Bảng 3.5: Kết quả phân tích thành phần axit amin cuả nấm Đầu khỉ He1 60 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của phương pháp phân lập đến sự mọc của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên môi trường thuần khiết 62 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của độ tuổi quả thể nấm đến chất lượng giống gốc 64 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đối với sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ 65 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ 67 Bảng 3.10: Đặc điểm của hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau 69 Bảng 3.11: Đặc điểm của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên môi trường thuần khiết nuôi trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau 70 Bảng 3.12: Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng (dungtích 200 ml) 73 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của giống dịch thể trung gian cấp 1 74 viii CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Bảng 3.14: Ảnh hưởng của pH môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong môi trường CT8 76 Bảng 3.15: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến sự sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 trong môi trường CT8 76 Bảng 3.16: Ảnh hưởng của chế độ nuôi lắc và khuấy đến sự sinh trưởng của giống Đầu khỉ trung gian cấp 1 trong môi trường CT8 79 Bảng 3.17: Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến hình thái và sinh khối hệ sợi nấm Đầu khỉ trong môi trường CT8 80 Bảng 3.18: Ảnh hưởng của tốc độ khuấy từ đến hình thái và sinh khối hệ sợi Nấm Đầu khỉ trong môi trường CT8 81 Bảng 3.19: So sánh giống dịch thể trung gian cấp 1 khi nuôi ở 2 chế độ: nuôi lắc, nuôi khuấy từ 81 Bảng 3.20: Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng (dung tích 2000 – 5000 ml) 85 Bảng 3.21: Sự sinh trưởng giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau 86 Bảng 3.22: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến kích thước và đặc điểm hệ sợi nấm Đầu khỉ trong CT12 87 Bảng 3.23: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến sự sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể trong CT12 88 Bảng 3.24: Ảnh hưởng của chế độ sục khí đến sự sinh trưởng của giống dịch thể trong môi trường CT12 Bảng 3.25: Ảnh hưởng của chất phá bọt trong quá trình nhân giống Đầu khỉ trung gian cấp 2 89 91 Bảng 3.26. Sự sinh của giống Đầu khỉ trung gian cấp 2 trong môi trường CT12 ở từng thời điểm nuôi 92 Bảng 3.27: Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng trong bình lên men 120lit 95 Bảng 3.28: Sinh khối sợi nấm Đầu khỉ trong nồi lên men 120 lít ở từng thời điểm nuôi 98 Bảng 3.29: Ảnh hưởng của công thức phối trộn nguyên liệu và phương pháp khử trùng đến tỷ lệ nhiễm 107 Bảng 3.30: Ảnh hưởng của công thức phối trộn nguyên liệu nuôi trồng đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ và năng suất nấm thương phẩm 110 Bảng 3.31: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy vào bịch nguyên liệu đến sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên CTNT3 112 Bảng 3.32. So sánh tổng thời gian nuôi trồng và năng suất nấm Đầu khỉ khi sử dụng giống dịch thể và giống trên cơ chất hạt 113 Bảng 3.33: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến đặc điểm hệ sợi nấm Đầu khỉ trên CTNT3 114 ix CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Bảng 3.34: Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Đầu khỉ trên CTNT3 117 Bảng 3.35: Hoạch toán đầu vào cho 1 tấn nguyên liệu đã xử lý để nuôi trồng nấm Đầu khỉ 119 Bảng 3.36: Bảng tổng hợp năng suất trung bình nuôi trồng nấm Đầu khỉ qua 3 lần sản xuất lặp lại 119 Bảng 3.37: Bảng tổng hợp hiệu quả kinh tế thu được khi nuôi trồng nấm đầu khỉ sử dụng giống dạng dịch thể 120 Bảng 3.38. Khả năng chiết của các loại dung dịch kiềm khác nhau 120 Bảng 3.39. Độ chiết (tương ứng với độ nhớt) thay đổi theo nồng độ của NaOH 121 Bảng 3.40: Hàm lượng polysaccharide của các mẫu nấm thu hái tại các thời điểm khác nhau 123 Bảng 3.41: Hàm lượng polysaccharide trong hai mẫu Đầu khỉ mới thu hái và qua bảo quản 124 Bảng 3.42: Hoạt tính kháng vi khuẩn cuả hai phân đoạn polysaccharide thu được 125 Bảng 3.43: Hoạt tính kháng nấm cuả hai phân đoạn polysaccharide thu được 125 Bảng 3.44: Hoạt tính gây độc tế bào trên 4 dòng ung thư người của hai phân đoạn polysaccharide thu được 126 Bảng 3.45: Hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân đoạn polisaccaride 127 Bảng 3.46 : Sự thay đổi trọng lượng cơ thể thỏ khi dùng HT1 trong 6 tuần (n = 8) 129 Bảng 3.47: Sự thay đổi tần số tim thỏ (chu kỳ/phút) ở đạo trình D II khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) 129 Bảng 3.48: Sự thay đổi biên độ sóng điện tim thỏ (mV) ở đạo trình DII khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) 130 Bảng 3.49: Sự xuất hiện sóng điện tim bệnh lý thỏ ở đạo trình D II khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) 130 Bảng 3.50: Sự thay đổi số lượng hồng cầu ( 1012/l) ở thỏ khi dựng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) 131 Bảng 3.51: Sự thay đổi hàm lượng hemoglobin (g/l)ở thỏ khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) 131 Bảng 3.52: Sự thay đổi số lượng bạch cầu ( 109/l) ở thỏ khi dựng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) 132 Bảng 3.53: Sự thay đổi số lượng tiểu cầu ( 109/l) ở thỏ khi dựng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) 132 Bảng 3.54: Sự thay đổi hoạt độ enzym SGOT của thỏ khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) 133 x CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Bảng 3.55: Sự thay đổi hoạt độ enzym SGPT của thỏ khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) 133 Bảng 3.56: Sự thay đổi hàm lượng Creatinin của thỏ khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) 134 Bảng 3.57: Tác dụng bảo vệ phóng xạ của HT1 khi dùng 30 ngày liều 0,5g/kg/24 giờ 134 Bảng 3.58: Số lượng tế bào ở nhóm chuột nhắt trắng dưới tác dụng của chiếu xạ và chiếu xạ + HT1 135 xi CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DANH MỤC HÌNH TRANG Hình 1.1: Sản lượng nuôi trồng nấm trên thế giới 5 Hình 1.2: Hiệu quả kinh tế khi canh tác một số sản phẩm nông nghiệp trên cùng một đơn vị diện tích (1 mẫu) trong một năm 6 Hình 1.3: Sản lượng một số loại nấm chủ lực nuôi trồng ở Việt Nam trong năm 2011 7 Hình 1.4: Một số hình ảnh mô tả các công đoạn nuôi trồng nấm sử dụng giống nấm dạng dịch thể ở một số công ty Hàn Quốc 9 Hình 1.5: Liên kết β -1, 3 và β -1, 6 trong chuỗi polysaccharide 12 Hình 1.6: Nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus trong tự nhiên 17 Hình 1.7: Hình thái quả thể nấm Đầu khỉ nuôi trồng nhân tạo 18 Hình 3.1: Một số sâu bệnh hại trên nấm Đầu khỉ trong giai đoạn ươm sợi và ra quả thể 58 Hình 3.2: Bào tử chủng nấm Đầu khỉ (He1) 61 Hình 3.3: Bào tử chủng nấm Đầu khỉ (He1) dày đặc, đảm hình chuỳ mang 4 bào tử với các mụn gai trên bề mặt 61 Hình 3.4: Hệ sợi nấm Đầu khỉ được phân lập từ bào tử và mô nấm 62 Hình 3.5: Các giai đoạn phát triển của quả thể nấm Đầu khỉ tính từ khi xuất hiện mầm quả thể trên bịch nguyên liệu nuôi trồng 63 Hình 3.6: Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên môi trường thuần khiết khi sử dụng quả thể phân lập ở các giai đoạn phát triển khác nhau 64 Hình 3.7: Hệ sợi phát triển trên MTĐC có bổ sung thêm các nguồn các bon khác nhau 66 Hình 3.8: Hệ sợi phát triển trên MTĐC có bổ sung các nguồn nito khác nhau 68 Hình 3.9: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau 69 Hình 3.10: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ trên các công thức môi trường dinh dưỡng khác nhau 70 Hình 3.11: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau 71 Hình 3.12: Qui trình phân lập giống gốc nấm Đầu khỉ 72 Hình 3.13: Sinh khối sợi nấm Đầu khỉ trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau 75 Hình 3.14: Sinh khối sợi nấm trong các công thức môi trường khác nhau 75 Hình 3.15: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trong môi trường CT8 ở chế độ nuôi lắc tạo thành dạng khuẩn lạc cầu có nhiều tua gai xung quanh 76 Hình 3.16: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến sinh khối hệ sợi nấm trong môi trường CT8 77 Hình 3.17: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong môi trường CT8 78 xii CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Hình 3.18: Hình thái hệ sợi nấm Đầu khỉ trong môi trường CT8 ở các chế độ nuôi 79 Hình 3.19: Sự phát triển của giống trung gian cấp 1 nuôi trên máy lắc lắc và nuôi trên máy khuấy từ khi cấy chuyển sang bình lên men 5 lít, thời gian nuôi 7 ngày 82 Hình 3.20: Đường cong sinh trưởng của giống Đầu khỉ trong môi trường nuôi dưỡng CT8 82 Hình 3.21: Qui trình nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể, dung tích 200ml Hình 3.22: Môi trường khử trùng ở 115oC trong thời gian lần lượt là 30, 40, 50, 60, 70phút 84 85 Hình 3.23: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trong môi trường khử trùng ở 115oC trong thời gian 70 phút và môi trường khử trùng ở 115oC trong thời gian 70 phút 87 Hình 3.24: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trong các công thức môi trường dinh dưỡng khác nhau 88 Hình 3.25: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến sinh khối hệ sợi nấm trong môi trường CT12 89 Hình 3.26: Giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 trong môi trường CT12 sau 7 ngày nuôi 90 Hình 3.27: Ảnh hưởng của chế độ sục khí đến sự sinh trưởng của giống dịch thể trong môi trường CT12 và mức độ tạo bọt 91 Hình 3.28: Tác dụng của chất phá bọt trong quá trình lên men có sục khí, chế độ sục khí 0,4 - 5,5lit khí/1lit dịch nuôi/phút 93 Hình 3.29: Đường cong sinh trưởng của giống trong môi trường nuôi dưỡng dạng dịch thể trung gian cấp 2 94 Hình 3.30: Qui trình nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể, dung tích 5000ml 95 Hình 3.31: Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trong môi trường dịch thể 96 Hình 3.32: Ảnh hưởng của tuổi giống trung gian cấp 2 sử dụng để cấy chuyển sang thể tích 120lit đến sinh khối sợi nấm Đầu khỉ trong môi trường CT16 97 Hình 3.33: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống trung gian cấp 2 sử dụng để cấy chuyển sang bình dung tích 120 lít đến sinh khối sợi nấm Đầu khỉ trong môi trương CT16 99 Hình 3.34: Đường cong sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trong môi trường CT16 dung tích 120lit 100 Hình 3.35: Sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trong bình lên men dung tích 120 lít, sau 5 ngày nuôi cấy 102 xiii CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Hình 3.36: Qui trình sản xuất giống nấm các cấp 103 Hình 3.37: QTCN lên men nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể dung tích 120 lít 105 Hình 3.38: Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất phối trộn đến tỷ lệ nhiễm bịch nguyên liệu nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên CTNT1 106 Hình 3.39: Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất phối trộn đến tốc độ phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên CTNT1 109 Hình 3.40: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên các công thức nuôi trồng khác nhau khi sử dụng giống cấy dạng hạt và giống cấy dạng dịch thể 99 Hình 3.41: Giống dạng hạt và giống dạng dịch thể phát triển trong CTNT3 112 Hình 3.42: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên CTNT3 113 Hình 3.43: Quả thể nấm Đầu khỉ trên công thức CTNT 3 nuôi trồng ở các khoảng nhiệt độ khác nhau 115 Hình 3.44: QTCN nuôi trông nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể 116 Hình 3.45: So sánh QT sử dụng giống dạng hạt và QT sử dụng giống dạng dịch thể trong nuôi trồng nấm Đầu khỉ 118 Hình 3.46: Qui trình chiết polysaccharide 121 Hình 3.47: Phổ MS của Polysaccharide thu được 122 Hình 3.48: Sự tích lũy polysaccharide theo thời gian của quả thể nấm Đầu khỉ He1 124 Hình 3.49: Hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân đoạn Polysaccharide 127 Hình 3.50: Thử nghiệm HT1 trên chuột 136 Hình 3.51: Kết quả thử hoạt tính in vivo chiết phẩm của nấm Đầu khỉ 136 xiv CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ MỞ ĐẦU Nấm lớn có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống, chúng có vai trò trong nền kinh tế, khoa học và tham gia vào các chu trình chuyển hóa vật chất - năng lượng trong tự nhiên. Nhiều loài nấm lớn được sử dụng làm thực phẩm giàu dinh dưỡng, một số được sử dụng làm dược phẩm để chữa trị một số bệnh nguy hiểm như tim mạch, béo phì, giải độc và bảo vệ tế bào gan, phòng và điều trị loãng xương… Trên thế giới có khoảng hơn 2000 loại nấm có thể ăn và dùng làm thuốc, ngoài nguồn nấm thu hái từ thiên nhiên, người ta đã trồng được hơn 60 loại theo phương pháp thủ công, bán công nghiệp, công nghiệp với hiệu quả và năng suất cao. Nhiều nhà khoa học cho rằng nấm sẽ là một trong những thực phẩm rất quan trọng và thông dụng của con người trong tương lai [16]. Việt Nam là một nước nông nghiệp, giàu tiềm năng lâm nghiệp do đó nguồn phế liệu từ nông, lâm nghiệp như rơm rạ, mùn cưa, bã mía, thân ngô, lõi ngô… rất dồi dào, đây là nguồn nguyên liệu thích hợp để trồng nấm; Bên cạnh đó điều kiện tự nhiên của nước ta rất phù hợp với việc nuôi trồng nấm. Trong mười năm trở lại đây, ngành sản xuất nấm ăn – nấm dược liệu ở nước ta đã có những bước tiến đáng kể nhưng vẫn chậm phát triển hơn rất nhiều so với các nước trên thế giới do ít đầu tư vào nghiên cứu, ứng dụng công nghệ tiên tiến cũng như thiết bị hiện đại để sản xuất nấm ăn – nấm dược liệu. Công nghệ nhân giống và nuôi trồng nấm ở nước ta hiện nay chỉ sử dụng giống nhân trên cơ chất rắn như nhân giống trên môi trường thạch, trên mùn cưa, thóc, que sắn; đây là phương pháp truyền thống tuy được sử dụng một cách phổ biến do quá trình sản suất đơn giản nhưng lại có một số nhược điểm sau: + Thời gian nhân giống các cấp kéo dài; + Giống nấm nhân trên cơ chất rắn có chất lượng không ổn định, tuổi giống không đồng nhất trong toàn bộ chai giống hay túi giống; + Phương pháp nhân giống trên cơ chất rắn gặp nhiều khó khăn trong việc sản xuất giống với số lượng lớn do hệ số nhân giống thấp; + Thao tác cấy chuyển giống khó tự động hóa, chịu nhiều tác động của yếu tố ngoại cảnh làm tăng nguy cơ nhiễm. Việc kiểm soát nhiễm đối với giống nấm nhân trên cơ chất rắn cũng gặp nhiều khó khăn; + Nguyên liệu nhân giống đắt, chi phí nhân công, chi phí khấu hao điện năng, khấu hao nhà xưởng cao; Hiện nay, công nghệ nhân giống nấm lớn dạng dịch thể đang là hướng nghiên cứu được các nhà nghiên cứu nấm đặc biệt quan tâm vì giống nấm dạng dịch thể so với giống trên cơ chất tổng hợp dạng rắn (mùn cưa, thóc, que sắn…) có rất nhiều ưu điểm vượt trội như: + Chu kỳ phát triển của giống nấm trong môi trường dịch thể nhanh, qua đó rút ngắn được thời gian nhân giống các cấp và nuôi trồng nấm; + Tuổi giống nấm dạng dịch thể đồng đều, chất lượng giống nấm ổn định do được kiểm soát một cách nghiêm ngặt với các phương pháp thử đơn giản, có kết quả tức thì, độ chính xác cao; 1 CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ + Sinh lực giống khỏe do giống phát triển trong môi trường dịch thể được cung cấp đầy đủ dinh dưỡng và được sử dụng trong đúng giai đoạn sinh trưởng mạnh nhất của hệ sợi; + Công nghệ nhân giống dạng dịch thể đáp ứng được mọi nhu cầu về giống từ qui mô nhỏ đến lớn, với hệ số nhân giống cao; + Giá thành sản xuất giống thấp do quá trình sản xuất tiết kiệm được nguyên nhiên vật liệu nhân giống, điện năng, nhân công. Ngoài ra, phương pháp này còn thuận lợi trong việc sản xuất nấm trên qui mô công nghiệp. Đối tượng nghiên cứu của Luận án là nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers., đây là một loại nấm quí có giá trị dinh dưỡng và dược liệu cao, được sử dụng để hỗ trợ điều trị hiệu quả một số bệnh như ung thư, bệnh tim mạch, bệnh về đường tiêu hóa, bệnh mất trí nhớ… Với các lợi ích lớn về giá trị dinh dưỡng, dược liệu và kinh tế mà loại nấm này mang lại, hiện nay các nhà khoa học trong nước cũng như trên thế giới đang rất quan tâm nghiên cứu nhằm hoàn thiện qui trình nhân giống, nuôi trồng, chế biến sau thu hoạch… để tạo ra các sản phẩm phục vụ công tác phòng chữa bệnh, tăng cường sức khỏe cộng đồng. Nhận định được tầm quan trọng trong việc ứng dụng công nghệ mới vào sản xuất giống nấm và nấm thương phẩm, góp phần thúc đẩy quá trình công nghiệp hóa ngành sản xuất nấm trong nước, qua đó tạo ra nguồn nguyên liệu có giá trị dược học cao cung cấp cho ngành công nghiệp chế biến thực phẩm và dược phẩm, tạo ra các sản phẩm chức năng phục vụ mục đích nâng cao sức khỏe cộng đồng, Nghiên cứu sinh đã lựa chọn thực hiện Luận án: “Nghiên cứu quy trình phân lập, nhân giống dạng dịch thể để nuôi trồng nấm Đầu khỉ (Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers.) và tách chiết một số polysaccharide có hoạt tính sinh học” Luận án là một phần nội dung của Đề tài thuộc Chương trình KH&CN trọng điểm cấp nhà nước KC.06/11-15 do Bộ Khoa học và Công nghệ chủ trì: “Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể để sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu”; mã số KC06.01/11-15; thời gian thực hiện từ tháng 01/2012 đến tháng 6/2014, do Nghiên cứu sinh làm chủ nhiệm và Đề tài nghị định thư cấp nhà nước: “Nghiên cứu quá trình chuyển hóa các polymer tự nhiên bởi enzyme từ nấm Việt Nam”, thời gian thực hiện 2011-2013, do PGS.TS Lê Mai Hương làm chủ nhiệm. Mục tiêu của Luận án - Đưa ra được qui trình công nghệ phân lập lại giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus; - Đưa ra được qui trình công nghệ nhân giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus dạng dịch thể các cấp với dung tích từ 200ml đến 120 lít; - Đưa ra được qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ H. erinaceus trên nguồn cơ chất tổng hợp sử dụng giống nấm dạng dịch thể; - Đưa ra được qui trình công nghệ tách chiết polysaccharide từ quả thể nấm Đầu khỉ H. erinaceus thành phẩm, đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất này; 2