Tài liệu Nghiên cứu sản xuất limo ni trích từ hạt neem azadirachtin indica dùng để giảm thiểu ô nhiễm môi trường, đồng thời nâng cao hiệu quả phân đạm và thương mại hóa sản phẩm

MỤC LỤC DANH SÁCH BẢNG.............................................................................................................. 6 DANH SÁCH HÌNH .............................................................................................................. 7 PHẦN MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 8 I. TỔNG QUAN .................................................................................................................... 11 1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC ĐỀ TÀI ......................................11 1.1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................................. 11 1.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .......................................................................... 12 1.3.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước .......................................................................... 13 1.1.4. Tính cần thiết của đề tài......................................................................................... 14 ..................................................................................14 1.2.1. Giới thiệu về cây neem .......................................................................................... 14 1.2.2. Hoạt chất limonoid trong cây neem ...................................................................... 17 ....................................................19 II. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................................. 20 2.1. NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU LY TRÍCH HOẠT CHẤT ARL TRONG HẠT NEEM VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ARL KHỬ MẠNH NHẤT VI SINH VẬT NITRIT HÓA PHÂN ĐẠM .......................................................................................................................20 2.1.1. Mô tả nội dung ....................................................................................................... 20 2.1.2. Phương pháp .......................................................................................................... 20 2.2. NỘI DUNG 2: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÔNG THỨC ĐIỀU CHẾ CHẾ PHẨM LIMO NI .............................................................................................................................24 2.2.1. Nội dung và phương pháp ..................................................................................... 24 2.2.2. Thử độ bền nhiệt và bền nhũ của Limo NI ............................................................ 25 2.3. NỘI DUNG 3: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM ĐO LƯỢNG NITRAT HÒA TAN TRONG NƯỚC VÀ THẤM SÂU VÀO ĐẤT. ...............................................25 2.3.1. Mô hình thử nghiệm .............................................................................................. 25 2.3.2. Chỉ tiêu theo dõi .................................................................................................... 25 2.3.3. Phương pháp .......................................................................................................... 25 1 2.4. NỘI DUNG 4: NGHIÊN CỨU CÁC TỶ LỆ PHỐI TRỘN LIMO NI VỚI URÊ VÀ ĐO LƯỢNG NITRAT BỊ THẤT THOÁT.........................................................................26 2.4.1. Thay đổi tỷ lệ trộn Limo NI và urê........................................................................ 26 2.4.2. Đo hàm lượng nitrat đối với mỗi nghiệm thức ...................................................... 26 2.5. NỘI DUNG 5: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NHIỆM ĐO LƯỢNG NITRAT ĐƯỢC CÂY TRỒNG HẤP THU – NGHIÊN CỨU CÁC TỶ LỆ PHỐI TRỘN LIMO NI VỚI URÊ VÀ ĐO LƯỢNG NITRAT ĐƯỢC CÂY TRỒNG HẤP THU. ........................26 2.5.1. Mô hình thử nghiệm ........................................................................................... 26 2.5.2. Phương pháp thử nghiệm ................................................................................... 26 2.6. NỘI DUNG 6: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NHIỆM XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG LÀM TĂNG NĂNG SUẤT CÂY TRỒNG CỦA LIMO NI – NGHIÊN CỨU CÁC TỶ LỆ PHỐI TRỘN LIMO NI VỚI URÊ VÀ XÁC ĐỊNH NĂNG SUẤT CÂY TRỒNG DƯA CHUỘT, CẢI NGỌT)...............................................................................................27 2.6.1. Mô hình thử nghiệm ........................................................................................... 27 2.6.2. Phương pháp thử nghiệm ................................................................................... 28 III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................................... 29 3.1. NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU LY TRÍCH HOẠT CHẤT ARL TRONG HẠT NEEM AZADIRACHTA INDICA .......................................................................................29 3.1.1. Ly trích hoạt chất ARL trong hạt neem ................................................................ 29 3.1.2. Phân lập và nhân giống 2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp................... 34 3.1.3. Thử nghiệm tính sát khuẩn của 6 hoạt chất ARLx trích từ hạt neem đối với 2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp theo phương pháp kháng sinh đồ ................. 39 3.2. NỘI DUNG 2: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÔNG THỨC ĐIỀU CHẾ LIMO NI...47 3.2.1. Ly trích 3 hoạt chất azadirachtin, salannin, nimbin trong nhân hạt neem............ 47 3.2.2. Điều chế chất làm bền ESO ................................................................................... 55 3.2.3. Điều chế chất tạo nhũ sucroester ........................................................................... 58 3.2.4. Lập công thức pha chế Limo NI bền nhiệt và bền nhũ ......................................... 60 3.2.5.Giá thành sản phẩm .......................................................................... 66_Toc387343560 3.2.6. Xác định LD50 của hoạt chất ARL trong Limo NI đối với chuột bạch ................. 69 3.3. NỘI DUNG 3: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM ĐO LƯỢNG NITRAT HÒA TAN TRONG NƯỚC VÀ THẤM SÂU VÀO ĐẤT ................................................70 3.3.1. Mô hình thử nghiệm .............................................................................................. 70 3.3.2. Định lượng nitrat ................................................................................................... 70 2 3.4. NỘI DUNG 4: NGHIÊN CỨU CÁC TỶ LỆ PHỐI TRỘN LIMO NI VỚI URÊ VÀ ĐO LƯỢNG NITRAT BỊ THẤT THOÁT .........................................................................72 3.4.1. Mô hình thử nghiệm .............................................................................................. 72 3.4.2. Kết quả định lượng nitrat ....................................................................................... 72 3.5. NỘI DUNG 5: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM ĐO LƯỢNG NITRAT ĐƯỢC CÂY TRỒNG HẤP THU – NGHIÊN CỨU CÁC TỶ LỆ PHỐI TRỘN LIMO NI VỚI URÊ VÀ ĐO LƯỢNG NITRAT ĐƯỢC CÂY TRỒNG HẤP THU .........................75 3.5.1. Xây dựng mô hình thử nghiệm .............................................................................. 75 3.5.2. Kết quả thử nghiệm ............................................................................................ 77 3.6. NỘI DUNG 6: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG LÀM TĂNG NĂNG SUẤT CÂY TRỒNG CỦA LIMO NI – NGHIÊN CỨU CÁC TỶ LỆ PHỐI TRỘN LIMO NI VỚI URÊ VÀ VÀ XÁC ĐỊNH NĂNG SUẤT CÂY TRỒNG (DƯA CHUỘT, CẢI NGỌT) .............................................................................................79 3.6.1. Xây dựng mô hình thử nghiệm .............................................................................. 79 3.6.2. Kết quả thử nghiệm ............................................................................................... 84 3.6.3. Hiệu quả kinh tế ..................................................................................................... 88 IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 89 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 91 1 13 1 13 - ………………………………………………………………97 - ……………………………………………………………...98 - ………………………………………………………….99 - azadirachtin………………………………………………………..100 . ………...101 5b salannin …………………101 salannin T . ………………………………………………...…..102 . …………………………………………………………..103 . …………………………………......104 …………………………………….….105 = f(c ……………………....106 ……106 ……………………………………………….107 3 (SGT)…..108 …………………..109 /urê (%) ……….110 /urê (%) …...111 = f( /urê (%) ....112 ……………………………………………………………………………………..………..113 neem …………………………………………………………….…………………………....115 Azadirachta indica ………………………………………………………………………….………….117 19: Alpha-glucosidase inhibitory limonoids from the leaves of Azadirachta indicaA. Juss ………………………………………………………………………………………….....123 ...133 4 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮC A AZ ARL ASTM CFU CIPA 13 C-NMR Dd EPA ESO FAB-MS 1 H-NMR HPLC-UV HR MS LD Limo NI NI NVL ODS PA RT SA SPE SGT TL TGT UV Cary 50 VSV THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT Absorbance Azadirachtin Azadirachtin Related Limonoid (Các chất limonoid có cấu trúc và tác dụng tương tự azadirachtin) American Society Testing Materials Colony Forming Unit Collaborative International Pesticides Analytical Council Máy cộng hưởng từ hạt nhân phổ 13C Dung dịch Environment Protection Agency Epoxidised Soybean oil Máy khối phổ bắn phá tự do nguyên tử Máy cộng hưởng từ hạt nhân phổ 1H Máy sắc ký hiệu năng cao, ghép máy quang phổ tử ngoại Máy khối phổ có độ phân giải cao Lethal dose Limonoid Nitrification Inhibitor Nimbin Nguyên vật liệu Octadecyl silica gel Peak area Retention time Salannin Cột sắc ký tách chất rắn Sau gia tốc Trích ly Trước gia tốc Máy quang phổ tử ngoại hiệu Cary 50 Vi sinh vật 5 DANH SÁCH BẢNG STT Tên Trang 1 Bảng 3.1: Thuốc thử biệt tính để xác định các nhóm chứa hóa học. 30 2 Bảng 3.2: Kết quả xác định thành phần hóa học cơ bản của 5 loại cao TL. 31 3 Bảng 3.3 : Các đặc điểm phân loại vi khuẩn Nitrosomonas sp. 33 4 Bảng 3.4: Mật độ chủng Nitrosomonas sp thay đổi theo thời gian nuôi cấy ở pH = 7 và to = 30oC. 35 5 Bảng 3.5: Các đặc điểm phân loại vi khuẩn Nitrobacter sp. 35 6 Bảng 3.6: Mật độ chủng Nitrobacter spsau 5 ngày nuôi cấy ở pH = 7 và to 36 o = 30 C. 7 Bảng 3.7: Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của các hoạt chất ARLx đối với 2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp. 40 8 Bảng 3.8: Thành phần hóa học của dầu đậu nành. 56 9 Bảng 3.9: Độc tính của chế phẩm Margosan-O. 70 10 Bảng 3.10 theo tỷ lệ bao Limo NI/urê. 11 Bảng 5.1: Hàm lượng đổi theo tỷ lệ bao NI/urê. 12 Bảng 5.2: Hàm lượng (NO3– thay đổi 73 c(N) và c(NO3–) trong cây cải ngọt thay 77 c(N) và c(NO3–) trong trái dưa chuột thay 78 13 Bảng 6.1: Một số chỉ tiêu về thời tiết, khí hậu trong vụ Hè Thu 2013 tại Ninh Thuận. 84 14 Bảng 6.2: Ảnh hưởng của chế phẩm Limo NI đến chiều cao và số lá của cây cải ngọt thay đổi theo số ngày sau gieo hạt (NSG). 84 15 Bảng 6.3: Ảnh hưởng của chế phẩm Limo NI đến năng suất thu hoạch của cây cải ngọt. 85 16 Bảng 6.4: Ảnh hưởng của chế phẩm Limo NI đến năng suất thu hoạch dưa chuột. 85 c(N) đổi theo tỷ lệ bao NI/urê. 6 DANH SÁCH HÌNH STT Tên Trang 1 Hình 2.1: Quy trình ly trích và tách các hoạt chất ARL trong hạt neem. 21 2 Hình 3.1: Máy tách vỏ hạt neem. 32 3 Hình 3.2 : Máy ép dầu neem. 32 4 Hình 3.3 : Trích hoạt chất ARL trong bánh neem trong hình Soxhlet. 33 5 Hình 3.4 : Tách dung môi trong máy cô quay dưới áp suất thấp. 33 6 Hình 3.5: Hình dạng khuẩn lạc Nitrosomonas sp. 37 7 Hình 3.6: Hình dạng khuẩn lạc Nitrobacter sp. 38 8 Hình 3.7: Đường kính vòng vô khuẩn của ARL1, ARL4, ARL5 đối với chủng Nitrosomonas spso với mẫu trắng. 41 9 Hình 3.8: Đường kính vòng vô khuẩn của ARL1, ARL4, ARL5 đối với chủngNitrobacter sp so với mẫu trắng. 42 10 Hình 3.9: Quy trình ly trích azadirachtin trong nhân hạt neem. 47 11 Hình 3.10: Máy HPLC-UV dùng để đo hàm lượng azadirachtin. 49 12 Hình 3.11: Quy trình ly trích salannin trong nhân hạt neem. 50 13 Hình 3.12: Máy UV Cary 50 dùng để đo hàm lượng salannin, nimbim và ARL. 52 14 Hình 3.13. Quy trình ly trích nimbin trong nhân hạt neem. 53 15 Hình 3.14: Quy trình điều chế ESO. 16 Hình 3.15: Quy trình điều chế sucroester. 55 59 17 Hình 3.16: Dung dịch nhũ dầu trong nước (o/w) của Limo NI. 65 18 Hình 3.17: Thùng thử nghiệm đo nitrat trong nước. 73 19 20 Hình 3.18: Chảo quay bao urê với Limo NI. Hình 5.1: Hình cây cải ngọt được bón phân Limo NI/urê 0,6% và Limo NI/ urê 0% đối chứng. Hình 5.2: Hình cây dưa chuột được bón phân Limo NI/urê 0,6% và Limo NI/ urê 0% đối chứng. Hình 6.1: Hình cây cải ngọt được bón phân Limo NI/urê 0,6%, 0,4% và 0% đối chứng. Hình 6.2: Hình cây dưa chuột được bón phân Limo NI/urê 0,6% và Limo NI 74 80 21 22 7 81 87 79 23 0% đối chứng. PHẦN MỞ ĐẦU 1. Tên đề tài:Nghiên cứu sản xuất Limo NI trích từ hạt neem Azadirachta indica dùng để giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng, đồng thời nâng cao hiệu quả phân đạm và thƣơng mại hóa sản phẩm. Chủ nhiệm đề tài: GS.TS Trần Kim Qui Cơ quan chủ trì : Viện Công Nghệ Hóa Sinh ứng dụng Thời gian thực hiện đề tài: 18 tháng (từ tháng 01/2012 đến tháng 7/2013) Kinh phí đƣợc duyệt: 580.000.000đ Kinh phí đã cấp: 350.000.000đ theo TB số: 180/TB-SKHCN ngày 15/12/2011 : 172.000.000đ theo TB số: 25/TB-SKHCN ngày 31/10/2013 2. Mục tiêu: Nghiên cứu sản xuất chế phẩm Limo NI (Nitrification inhibitor) trích từ hạt neem Azadirachta indica L.Juss dùng bao phân đạm, để khi bón vào đất phần lớn phân đạm không bị thất thoát dưới dạng nitrat làm ô nhiễm môi trường, như thế nâng cao được hiệu quả sử dụng phân đạm.  Mục tiêu cụ thể: – Dùng chế phẩm Limo NI để khử các vi sinh vật gây ra các phản ứng nitrit hóa phân đạm sinh ra các chất như NO2–, NO3–một phần ngấm dần theo nước vào đất làm ô nhiễm nguồn nước ngầm, một phần được cây trồng hấp thu làm ô nhiễm nguồn thực phẩm. – Đo lượng NO3– sinh ra trong nước ngầm và trong cây trồng để đánh giá tác dụng khử các vi sinh vật nitrit hóa của chế phẩm Limo NI. – Chứng tỏ mặc dù sử dụng phân đạm bao Limo NI ít hơn phân đạm không bao nhưng năng xuất cây trồng vẫn cao hơn. 3. Nội dung nghiên cứu:  Chiết xuất hoạt chất limonoid ARL trong hạt neem Azadirachta indica dùng để sản xuất chế phẩm Limo NI.  Nghiên cứu tác dụng của chế phẩm Limo NI làm giảm lượng nitrat hòa tan trong nước gây ô nhiễm nguồn nước. 8  Nghiên cứu tác dụng của chế phẩm Limo NI làm giảm lượng nitrat được cây trồng hấp thu gây ô nhiễm nguồn thực phẩm.  Nghiên cứu tác dụng của chế phẩm Limo NI làm tăng năng suất một số cây trồng như dưa chuột, cải ngọt… do làm tăng hiệu quả sử dụng phân đạm. 3.1. Những nội dung thực hiện ở giai đoạn 1 (đối chiếu với hợp đồng đã ký) TT Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện 1 Nghiên cứu ly trích hoạt chất ARL trong hạt neem Azadirachta indica. Xác định được 3 hoạt chất ARL trích từ hạt neem có tác dụng khử mạnh nhất VSV nitrit hóa phân đạm. 2 Nghiên cứu xác định công thức điều chế chế phẩm Limo NI. Chế phẩm Limo NI với 3 hoạt chất ARL có tính bền nhiệt và tạo nhũ tốt. 3 Xây dựng mô hình thử nghiệm do lượng nitrat hòa tan trong nước thấm sâu vào đất. Thiết kế mô hình thử nghiệm dùng để đo hàm lượng nitrat thất thoát và thấm vào đất. 4 Nghiên cứu các tỷ lệ phối trộn Limo NI với urê và đo lượng nitrat bị thất thoát. Xác định được tỷ lệ Limo NI/urê làm giảm thấp nhất lượng nitrat bị thất thoát. 5 Viết báo cáo giám định và giám định đề tài. Viết báo cáo giám định trình Hội đồng thông qua. 3.2. Những công việc còn lại (tổng quát) TT Sản phẩm cần đạt Tóm tắt nội dung 1 Xây dựng mô hình thử nghiệm đo lượng nitrat được cây trồng hấp thu. Xây dựng mô hình thử nghiệm đo lượng nitrat được cây trồng hấp thu. 2 Nghiên cứu các tỷ lệ phối trộn Limo NI với urê và đo lượng nitrat được cây trồng hấp thu. Xác định được tỷ lệ Limo NI/urê làm giảm thấp nhất lượng nitrat được cây trồng hấp thu. 3 Xây dựng mô hình thử nghiệm xác định khả năng làm tăng năng suất cây trồng của Limo NI. Mô hình thử nghiệm dùng để đo khả năng làm tăng năng suất cây trồng của Limo NI. 4 Nghiên cứu các tỷ lệ phối trộn Limo NI với urê và xác định năng suất cây trồng (dưa chuột, cải ngọt). Xác định được tỷ lệ Limo NI/urê làm tăng cao nhất năng suất cây trồng (dưa chuột, cải ngọt). 9 5 Nghiệm thu đề tài cấp cơ sở. Báo cáo được Hội đồng nghiệm thu cấp cơ sở thông qua. 6 Nghiệm thu đề tài cấp thành phố. Báo cáo được Hội đồng nghiệm thu cấp thành phố thông qua. 4. Sản phẩm của đề tài TT 1 Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học, kinh tế Đạt yêu cầu của một báo cáo khoa học, đạt mục tiêu đề xuất của đề tài. Báo cáo tổng hợp. Đảm bảo các yêu cầu của Sở KH&CN. 2 Phương pháp ly trích và định lượng hoạt chất limonoid trong hạt neem. Phương pháp có tính khoa học, dựa vào các quang phổ kế hấp thu hiện đại như HPLC-UV, NMR1H, 13C. 3 Quy trình công nghệ điều chế Limo NI. Chế phẩm NI có những tính chất sau:  Hàm lượng hoạt chất tan trong CH3OH ≥ 15%.  Tỷ trọng d = 0,91 – 0,98 g/cc.  Hàm lượng C% > 70 (w/w).  Ẩm độ M% ≤ 20 (w/w). 4 5 Báo cáo kết quả xác định chế phẩm Limo NI làm giảm lượng nitrat hòa tan trong nước và trong rau đồng thời tăng năng suất cây trồng (dưa chuột, cải ngọt). Kết quả phân tích có độ chính xác cao, xác định được: Báo cáo khoa học. Đăng trên tạp chí trong nước, hội nghị khoa học trong nước và quốc tế. 10  Tỷ lệ bao Limo NI/urê để hàm lượng nitrat trong nước và trong rau thấp nhất, giảm thiểu ô nhiễm môi trường.  Lương urê bao Limo NI sử dụng thấp hơn nhưng năng suất tăng cao hơn so với đối chứng. I. TỔNG QUAN 1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC ĐỀ TÀI 1.1.1. Đặt vấn đề Phân đạm, đặc biệt urê là một loại phân rất quan trọng trong nông nghiệp được nông dân sử dụng rất rộng rãi để bón cho cây trồng. Tuy nhiên phân đạm ngay sau khi bón vào đất bị các VSV trong đất tác dụng làm thất thoát một lượng lớn đạm trong phân. Trước tiên enzym urease thủy giải phân đạm như urê sinh ra carbonat amonium, chất này không bền nên thủy giải tiếp theo phương trình : [1,2,3] NH2 C NH2 urease (NH4)2CO3 2 NH3 + CO2 + H2O O Chỉ có một phần nhỏ NH3 được cây trồng hấp thu dưới dạng NH4+, còn phần lớn NH3 bị thất thoát do bốc hơi vào không khí và bị nitrit hóa thành nitrit NO2– do các vi khuẩn Nitrosomonas sp trong đất,sau đó thành nitrat NO3- do vi khuẩn Nitrobacter sp theo các phương trình sau đây: [4,5,6] Nitrosomonas sp NH3 NH2OH NO2– – Nitrobacter sp– NO2 NO3 Nitrosomonassp là một loại vi khuẩn hóa tự dưỡng hình cầu, một ít hình bầu dục, hoạt động háo khí biến NH4+ và NH3 thành NO2– trong điều kiện to= 20-35oC và pH=6,09,0. Nitrosomonas sử dụng điện tử sinh ra trong phản ứng oxid hóa để tạo ra năng lượng và hấp thu CO2 để cấu tạo tế bào. [7,8] Nitrobactersp cũng là một vi khuẩn hóa tự dưỡng háo khí hình cầu sống cộng sinh với Nitrosomonassp, oxid hóa NO2– thành NO3– ở nồng độ oxy ≥ 0,5ppm, to= 30-40oC, pH=7,5-8,5. [9,10] Nitrat có tính hòa tan tốt trong nước nên một phần nitrat sinh ra bị nước kéo theo thấm sâu vào đất làm ô nhiễm nguồn nước ngầm; một phần nitrat khác được cây trồng hấp thu làm ô nhiễm nguồn thực phẩm [11, 12]. VSV khử nitrit dùng nguồn C làm thực phẩm để sống và hấp thu oxy trong các hợp chất nitrat để hoạt động và phát triển. Phản ứng khử nitrit xảy ra mạnh nhất trong điều kiện háo khí ở pH=7,0-8,5 , to=5-30oC. [13,14] Nitrat vào cơ thể con người từ nguồn thực phẩm và nước uống, trong hệ tiêu hóa nitrat được khử thành nitrit là chất chuyển hemoglobin trong máu thành chất methemoglobin không hoạt động làm giảm hô hấp của tế bào và ảnh hưởng đến hệ tuyến 11 giáp, gây đột biến và phát triển khối u dẫn đến bệnh ung thư.Theo WHO và cộng đồng kinh tế Châu Âu, giới hạn hàm lượng nitrat trong thực phẩm và nước uống là 50ppm [15,16]. Quá trình phân giải phân đạm trong đất do VSV kết thúc trong vòng 15 – 20 ngày, trong lúc này cây trồng chỉ có thể hấp thu được khoảng 45 – 50% lượng phân đạm bón vào đất dưới dạng NH4+, phần còn lại bị thất thoát vào không khí dưới dạng NH3, N2 và dưới dạng NO3-trong đất làm ô nhiễm môi trường nước và thực phẩm [17,18]. Sơ đồ chu trình phân giải phân đạm trong đất: Cây trồng hấp thu Thất thoát vào không khí Phân đạm urease NH4+ NH3 Nitrosomonas sp NO2– (nitrit) Nitrobacter sp NO3– (nitrat) Hòa tan trong nước Thấm sâu vào đất 1.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc Nhằm giảm thất thoát phân đạm làm ô nhiễm môi trường và gây ra nhiều vụ ngộ độc và bệnh hiểm nghèo như bệnh ung thư...., một số nhà nghiên cứu trong nước đã điều chế phân nhả chậm để điều chỉnh lượng phân đạm cung cấp cho cây trồng. Theo hướng này có các nhà nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ Hóa học Tp.Hồ Chí Minh đã tổng hợp được phân bón ure formaldehyd (UF) với tỷ lệ ure và formaldehyd thay đổi. Kết quả cho thấy sản phẩm UF nhả nitơ chậm hơn và đều hơn so với ure đối chứng, lượng nitơ nhả ra càng chậm khi hàm lượng formaldehyd trong UF càng cao[29]. Năm 2004, chất Agrotain [25,26] được đưa từ Mỹ sang Việt Nam. Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long khảo nghiệm Agrotain trên cây lúa ở Cần Thơ và Sóc Trăng, Viện KHKTNN miền Nam cũng khảo nghiệm trên cây lúa và các cây trồng cạn như dưa chuột, mướp đắng, cải bẹ xanh ở các tỉnh miền Đông. Kết quả cho thấy nếu phối trộn Agrotain vào ure để bón cho cây trồng thì giảm được khoảng 25-30% lượng ure mà năng xuất cây trồng vẫn cao hơn đối chứng (tức cây trồng bón đủ 100% urê). Với những kết quả khảo nghiệm 12 nói trên Công ty Phân bón Bình Điền ở huyện Bình Chánh Tp Hồ Chí Minh nhập độc quyền Agrotain từ công ty Agrotain International LLC (Mỹ) để phối chế ra phân bón NPK đầu trâu TE+ Agrotain và phân đạm hạt vàng 46A+ bán ra thị trường từ năm 2010 [30]. Nhưng do giá bán cao nên không được nông dân ưa chuộng. 1.3.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc Để giải quyết các vấn đề thất thoát phân đạm trong đất dưới dạng NO3– làm ô nhiễm môi trường nước và thực phẩm đồng thời làm giảm lượng phân đạm sử dụng, nhiều nhà hóa học trên thế giới đã nghiên cứu dùng 1 trong 2 biện pháp sau đây: – Khử enzyme urease để ngăn chặn quá trình thủy giải phân đạm trong đất. – Khử các chủng vi sinh vật Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp để ngăn chặn các quá trình nitrit hóa NH4+ và NH3 do phân đạm sinh ra trong đất. Nhiều hóa chất đã được tổng hợp để trộn vào phân đạm nhằm khử enzyme urease hoặc khử các vi sinh vật gây ra quá trình nitrit hóa NH4+ và NH3. Một số hóa chất đã được thử nghiệm có kết quả tốt và đang được thương mại hóa trên toàn thế giới như:  Nitrapyrin tên hóa học 2-chloro-6-(trichloromethyl) pyridine do Công ty Dow Chemical sản xuất, được cơ quan Bảo vệ Môi trường (EPA) Mỹ cho phép sử dụng trên toàn liên bang dùng để khử các VSV nitrit hóa [19].  Dicyandiamide (DCD) tên hóa học dicyanodiamide do Công ty SKW Trostberg AG (Anh) sản xuất dùng để khử các VSV nitrit hóa [20,21,22].  DMPP tên hóa học 3,4-dimethylpyrazole phosphate do Công ty The International Fertilizer (Mỹ) sản xuất dùng để khử các VSV nitrit hóa [23,24]  nBTPT còn gọi Agrotain, tên hóa học N-(n-butyl)thiophosphoric triamide do Công ty Summit-Quinphos Ltd (Mỹ) sản xuất dùng để khử enzyme urease [25,26] Trong những năm gần đây một số nhà hóa học Ấn Độ ly trích hoạt chất từ hạt neem Azadirachta indica dùng để ngăn chặn sự nitrit hóa phân đạm do vi sinh vật trong đất. Kết quả là đã giảm được khoảng 10% phân đạm bón vào đất mà năng xuất cây trồng lại tăng khoảng 10–15% [27] Công ty phân bón NICO ORGO của Ấn Độ nghiên cứu sản xuất chế phẩm N–Guard với hoạt chất trích từ cao hạt neem Azadirachta indica để bao phân đạm theo tỷ lệ 0,6%, kết quả là đã giảm được lượng phân đạm sử dụng khoảng 25% mà năng xuất cây trồng trong 3 mùa vụ tăng đến 55%. Kết quả này được công bố tại Hội nghị Quốc tế về "Các biện pháp nâng cao hiệu quả sử dụng phân bón" tổ chức tại Miami, FL, USA tháng 3 năm 2010 [28] 13 1.1.4. Tính cần thiết của đề tài Như đã trình bày trên đây, phân đạm đặc biệt urê một loại phân bón quan trọng nhất được nông dân sử dụng để tăng năng suất cây trồng. Nhưng khi bón vào đất, phân đạm này bị các enzym thủy phân urease và cặp vi khuẩn nitrit hóa Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp tác dụng sinh ra nitrat NO3– làm thất thoát khoảng 45-50% lượng phân đạm trong thời gian ngắn khoảng 15-20 ngày, làm ô nhiễm nguồn nước ngầm do có chứa nhiều chất nitrat sinh ra các bệnh như ung thư… đồng thời làm ô nhiễm nguồn thực phẩm do làm tăng hàm lượng nitrat trong các loại rau, củ, quả dẫn đến nhiều chứng bệnh khác về gan, thận… rất nguy hại [15,16]. Mặc khác, chu kỳ sinh trưởng của cây trồng thường kéo dài từ 30-100 ngày mà phân đạm chỉ có thể tồn tại trong đất khoảng 15 ngày nên cây trồng chỉ sử dụng được khoảng 5055% lượng đạm bón vào đất trong thời gian ngắn 15 ngày ban đầu, sau đó cây trồng không còn đạm để sử dụng. Người nông dân phải mua một lượng lớn phân đạm, giá ngày càng tăng để bón thêm mà năng suất cây trồng vẫn không cao như mong muốn. Nhà nước cũng phải bỏ ra một lượng lớn ngoại tệ để nhập siêu mỗi năm hơn 3 triệu tấn phân urê và các loại phân đạm khác. Với mục đích nâng cao hiệu quả sử dụng phân đạm đồng thời bảo vệ môi trường nhiều nhà hóa học trên thế giới đã tổng hợp một số hóa chất có giá thành cao để khử cặp vi khuẩn nitrit hóa phân đạm như Nitrapyrin, DCD, DMPP nói ở phần trên nhưng bản thân các hóa chất này cũng làm ô nhiễm không ít môi trường nước, đất và cũng không phải hoàn toàn vô hại đối với các vi sinh vật hữu ích trong đất. Một số nhà khoa học Ấn Độ đã nghiên cứu sử dụng hoạt chất ly trích từ hạt neem để điều chế chất N-Guard nhằm khống chế sự nitrit hóa do cặp vi khuẩn Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp, nhưng các tác giả này cũng chỉ công bố tác dụng của N-Guard là đã giảm được 25% lượng phân đạm sử dụng và năng xuất cây trồng tăng được khoảng 5–15%. Các vấn đề khác như phương pháp điều chế, thành phần của chế phẩm N-Guard và nhất là các tác động tích cực của N-Guard đến môi trường thì không được đề c p đến. Trong nước ta thì chưa ai nghiên cứu vấn đề này. Do đó việc nghiên cứu sản xuất một chế phẩm từ cây neem như các nhà khoa học Ấn Độ đang làm,nhằm ngăn chặn sự nitrit hóa phân đạm sinh ra chất NO3– gây ô nhiễm môi trường đất, nước và nguồn thực phẩm, đồng thời làm tăng năng suất cây trồng và giảm lượng phân đạm sử dụng là rất cần thiết đối với chúng ta hiện nay. 1.2. 1.2.1. Giới thiệu về cây neem Cây neem tên khoa học Azadirachta indica A. Juss, họ xoan (Meliaceae) xuất xứ từ Ấn Độđược trồng đại trà thành rừng khắp nước này và là nguồn l i rất lớn cho Ấn Độ [31]. 14 Neem là cây thân gỗ to, cao 5-10 m, ở điều kiện thích hợp đạt độ cao khoả chịu hạn tốt. Nó là loại cây có lá xanh quanh năm, phát triển tốt ngay trên đất cát nghèo kiệt, khô cằn. Cây có nhánh rộng, tán lá hình oval hay tròn đường kính khoảng 15-20 cm. Thân cây ngắn, thẳng, vỏ cây cứng, xù xì, có nhiều rãnh nứt, bên ngoài màu xám và đỏ lợt bên trong, có mùi tỏi, vị rất đắng. Đặc điểm bên ngoài và độ dày của vỏ phụ thuộc vào tuổi của cây và điều kiện môi trường. Vỏ thân cây non thường nhẵn, màu xanh nhạt pha đồng, có độ dày khoảng 1,25-2,5 cm. Lá neem thuộc loại lá kép lông chim một lần, dạng mác, bìa lá có khía hình răng cưa, cuống lá ngắn. Cây ra lá non vào tháng 3 – 4 và bộ lá thường xanh tốt quanh năm, không có thời kỳ rụng lá. Hoa mọc thành chùm ở nách lá, màu trắng, hương thơm, cuống ngắn và có 5 cánh. Hoa lưỡng tính và hoa đực có thể xuất hiện trên cùng một cây, cánh hoa rời, xếp lớp, phủ đầy lông mịn. Ống nhụy hình trụ, cao khoảng 3 – 5mm, miệng hơi loe. Ở Sri Lanka, Ấn Độ và Việt Nam, cây thường ra hoa từ tháng 3 đến tháng 4. Tuy nhiên ở vài vùng của Ấn Độ, cây có thể ra hoa quanh năm. Trái neem có hình bầu dục, trơn láng và dài khoảng 2cm. Trái hình thành, phát triển và chín trong vòng 1 – 2 tháng. Thời điểm thu hoạch trái tốt nhất là lúc trái vừa chuyển sang màu xanh vàng và nên hái trái khi còn trên cây không để trái rụng xuống đất chất lượng bị giảm. Cây trưởng thành mỗi năm có thể cho 30 – 50kg trái. Thông thường, trái chín từ tháng 6 đến tháng 8. Mỗi hecta có thể trồng từ 100 – 200 cây, sản lượng trái hàng năm khoảng 5 – 10 tấn. Tại Ấn Độ, cây neem từ lâu đã được xem là một tài nguyên quý giá do tính chất đa dụng của nó và là một trong số ít loài thực vật mà tất cả bộ phận đều có công dụng tốt. * Lá: Một cây neem cao 7,5 – 8m cho trung bình hàng năm khoảng 350kg lá tươi (khoảng 50kg lá khô). Tại một số vùng ở Ấn Độ, nông dân thường cho gia súc ăn lá neem sau khi sinh con để gia tăng sự tiết sữa. Ngoài ra, lá neem còn có tác dụng phòng trị bệnh giun sán cho gia súc, kiểm soát nhiều loại tác nhân gây bệnh cho người, gia súc và cây trồng do lá có chứa nhiều hợp chất như nimbin, nimbinene, nimbandiol, nimbolide, quercetin…. Nhiều nơi lá neem non còn được dùng làm rau ăn vừa bổ sung khoáng chất, vừa phòng ngừa giun sán hoặc viêm nhiễm đường ruột ( Srivastav và ctv, 1998). * Trái: Trái neem khi chín có vị ngọt, có thể ăn được hoặc sử dụng trong công nghệ lên men. Trái neem được làm thuốc tẩy giun, thuốc giảm đau và thuốc trị bệnh đường tiết 15 niệu, bệnh trĩ. Quả khô ngâm nước có thể trị một số bệnh ngoài da. Nước thịt quả khi phun lên cây có thể xua đuổi nhiều côn trùng, đặc biệt rất hữu hiệu đối với châu chấu. * Nhân: Nhân hạt neem chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học như azadirachtin, salanin, nimbin, meliantriol… Dầu chiết từ nhân hạt neem được dùng để sản xuất thuốc giảm đau, thuốc sát trùng và thuốc ngừa thai. Ngoài ra, dầu hạt neem còn được sử dụng trong ngành mỹ phẩm, xà phòng và nhiều công nghiệp khác. Tại Ấn Độ và Sri Lanka, khoảng 25% hạt neem được sử dụng cho ngành dược, số còn lại được dùng làm thuốc trừ sâu. * Bánh dầu neem: Bánh dầu neem chứa khoảng 1,00 – 1,40% hợp chất sulfur, khoảng 1,5 – 2,5% N, khoảng 0,7 – 1,2% P2O5 và 1,2 – 1,5% K2O. Bánh dầu neem là nguồn phân hữu cơ rất tốt, vừa cung cấp chất dinh dưỡng cho cây, vừa diệt được các loại tuyến trùng, kiến mối trong đất và có khả năng ức chế quá trình nitrat hóa trong đất làm tăng hiệu quả sử dụng đạm của đất trồng. Theo Rao (1993), khi bón phân ure trộn với dầu neem, mức hấp thụ đạm, lân và kali ở cây cỏ hương (Cymbopogon winterianus Jowitt.) tăng theo thứ tự 17, 15 và 25% so với khi chỉ bón phân ure. Lượng đạm mất do bay hơi NH3 cũng giảm 31%. * Vỏ cây: Dịch chiết từ vỏ cây neem được dùng làm thuốc chữa đau răng, trị bệnh sốt rét, bệnh vàng da hoặc dùng để nhuộm lụa. Vỏ cây có chứa nimbin, nimbidin, nimbinin nên cũng được dùng để điều chế thuốc bảo vệ thực vật và một số thuốc trị bệnh ngoài da. Từ năm 1960, cây neem đã nổi tiếng trên khắp thế giới do từ cành, lá và hạt neem các nhà hóa học đã trích được một số hoạt chất limonoid có tác dụng gây ngán ăn và xua đuổi côn trùng rất có hiệu quả. Các loại thuốc bảo vệ thực vật như Neemgold, Margocide CK… điều chế từ cây neem rất được ưa chuộng ở Ấn Độ. Nhiều nước trên thế giới đã mang cây neem về trồng trên đất nước họ để sử dụng. Hai sản phẩm Neem Azal và Neem Azal F sản xuất từ cây neem tại Đức được bán khắp châu Âu. Năm 1975, Bộ Nông nghiệp Mỹ đã xây dựng kế hoạch trồng cây neem trên khắp nước Mỹ. Đến năm 1985, Cơ quan Bảo vệ Môi trường Mỹ đã cho phép bán ra trên khắp nước Mỹ hai loại thuốc bảo vệ thực vật trích ly từ lá và hạt cây neem với tên thương mại Margosan-O và Izatin. Từ năm 1985, Bộ Nông nghiệp Nhật, Bộ Nông nghiệp Trung Quốc cũng đã đưa cây neem về trồng và đến nay họ cũng đã sản xuất ra nhiều loại thuốc bảo vệ thực vật và thuốc trị bệnh cho người, gia súc, gia cầm. Hai chế phẩm Yu Teng và Ku Seng chiết xuất từ hạt neem để xua đuổi côn trùng rất được nông dân Trung Quốc ưa chuộng. Từ năm 1980 đến nay đã có 8 hội nghị khoa học quốc tế về cây neem tổ chức tại CHLB Đức (lần 2, 1983), Pakistan (1986), Kenya (lần 3, 1987), Mỹ (1992), Ấn Độ (1993), Philippin (IRRI,1994), Úc (1996), Anh(1999). Họ đã khẳng định giá trị của cây neem trong lĩnh vực thuốc bảo vệ thực vật, diệt trừ sâu mọt, nấm mốc và trị bệnh cho người. Đến nay 16 người ta đã xác định được trên 150 limonoid trong cây neem, trong đó có khoảng 30 chất có cấu trúc và tác dụng tương tự như azadirachtin. Các limonoid chỉ gồm các nguyên tố C, H, O, N không có Cl, P và các nhóm có độc tính khác nên không hại đối với người và gia súc gia cầm, không làm ô nhiễm môi trường và không có dư lượng độc trong rau quả như các loại thuốc trừ sâu tổng hợp. Cây neem ở nước ta được GS Lâm Công Định mang hạt giống từ Senegal về trồng từ năm 1993 trên các vùng đất khô cằn Tuy Phong tỉnh Bình Thuận. Đến nay tỉnh Ninh Thuận đã trồng được khoảng 4.700 ha cây neem làm rừng phòng hộ và có kế hoạch đến năm 2015 trồng được 7.000 ha. Cây neem ở 2 tỉnh Bình Thuận và Ninh Thuận phát triển tốt, hàng năm có thể cho trên 10.000 tấn trái và hơn 15.000 tấn cành lá để đưa ra sản xuất. 1.2.2. Hoạt chất limonoid trong cây neem [32,33,34] Hoạt chất đầu tiên có tác dụng gây ngán ăn cho loại châu chấu Schistocerca gregaria được 2 nhà hóa học Morgan và Butterworth ly trích từ năm 1968 và đặt tên là azadirachtin (AZ). Kết quả thử nghiệm sau đó cho thấy azadirachtin ở nồng độ 50ppm gây ngán ăn cho loài Earias fabia (Phytoparasiteca 9/1, 27, 1981), ở nồng độ 5 – 10 ppm ngăn chặn sự phát triển của loài Spodoptera litura (Indian J. Exp. Biol, 23(3), 16,1985) và ở nồng độ 10 – 100 ppm ngăn chặn sự phát triển và sự sinh sản của loài Epilachna verivestis (Z. Angew Entomol, 93, 12, 1982). LD50 của azadirachtin đối với S.litura là 1,1 γ/g (J. Entomol. Res. 11/2, 166, 1987). Tác dụng lưu dẫn của azadirachtin từ rễ đến lá cũng được Saxena và ctv chứng minh (J. Econ. Entomol. 77/2, 502, 1984). Từ đó đến nay có gần 100 tetranortriterpenoid (limonoid) trong đó có khoảng 30 dẫn xuất của azadirachtin được cô lập từ các dịch trích của cây neem được gọi tên chung là ARL (Azadirachtin related limonoid) azadirachtin A, B, D, E, F, G, H, I, K, L nồng độ 1 – 10 ppm có tác dụng ngăn chặn sự phát triển đối với Epilachna verisestis (Insectisides of Plant Origin ACS Symposium series, 387, 150, 1989), azadirachtin do Morgan và Butterworth trích ra trước đây nay được gọi là azadirachtin A. 3-Tigloylazadirachtol nồng độ 1 ppm có tác dụng gây ngán ăn 97% nhiều loại côn trùng (Tetrahedron 45, 5175, 1989). Các hợp chất khác đều có ít nhiều tác dụng gây ngán ăn, diệt sâu bọ hay xua đuổi hoặc ngăn chặn sự phát triển và sự sinh sản của côn trùng (Proceeding, 3rd International Neem Conference, 1997). Ngoài ra, các chế phẩm neem chứa limonoid còn có tác dụng diệt được vi khuẩn và nấm bệnh hại cây trồng. Nhiều thí nghiệm chứng tỏ dầu neem có tác dụng bảo vệ các loại đậu chống các loại nấm bệnh như Rhizocionia solani, Sclerotium solfsii, Sclerrotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum. Bánh dầu neem trộn trong đất diệt được nấm R. solani. Dịch trích hạt neem có tác dụng trị được các bệnh nấm lá. Dịch trích dầu neem trị được các 17 loại mốc sương trên cây (tốt hơn thuốc diệt nấm Benlat) và trị được 90% bệnh rỉ sét và bệnh cháy lá. Dịch trích lá neem có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Fusarium equiseti, F. semitectum, Aspergillus flavus, A.niger và nấm bệnh gây bệnh cháy lá lúa Pyricularia oryzae (Rajeswari and Mariappan, 1993). Loại vi nấm rất dễ lây lan do nhiều loại côn trùng nhiễm vi nấm mang từ nơi này sang nơi khác. Đến nay vẫn chưa có thuốc đặc trị. Các chế phẩm neem cho kết quả khá tốt. Một số thí nghiệm ở Philippines cho thấy khi phun dung dịch dầu neem trên cánh đồng lúa bị nhiễm vi nấm hoại sinh, sau 3 ngày các cây lúa dần dần hồi phục. Một số thí nghiệm ở Ấn Độ cho thấy dịch trích lá neem có thể ngăn chặn sự lây lan của vi nấm gây bệnh đốm lá trên vườn rau quả. Chế phẩm neem chứa ARL diệt được nhiều loại tuyến trùng trong đất. Điều này rất có ý nghĩa vì tuyến trùng rất khó trị, một số thuốc tổng hợp trị tuyến trùng đều rất độc nên bị cấm sử dụng ở nhiều nơi. Theo Siddiqui và Alam (1985) dịch trích từ lá, trái và nhân hạt neem trị được nhiều loại tuyến trùng như Helicotylenchus indicus, Tylenchus filiformis, Rotylenchus reniformis. Trong bánh dầu neem sau khi ép dầu và trích hoạt chất còn chứa một ít limonoid nên khi trộn với phân bón như phân ure có thể diệt được các tuyến trùng gây bệnh bướu rể, một loại bệnh lây lan nhanh và có tác hại rất lớn cho cây trồng. Việc nghiên cứu chiết xuất hoạt chất ARL trong cây neem ở nước ta còn rất hạn chế:  Năm 2002, Dương Anh Tuấn và CTV thuộc Viện Hóa học Trung tâm KHTN – CNQG và Viện Bảo vệ thực vật Bộ NN – PTNT đã trích ly được hoạt chất azadirachtin từ nhân hạt cây neem lấy ở Thuận Hải và cũng đã thử nghiệm thấy nó có tác dụng gây ngán ăn mạnh đối với sâu khoang Spodoptera litura [35].  Năm 2004, Nguyen Thuong Dong và CTV thuộc Viện Dược liệu Bộ Y Tế nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa học và tác dụng dược lý của lá neem, Tạp chí Dược liệu, tập 9 số 01/2004 [36].  Năm 2011, Vũ Văn Độ Viện Sinh học Nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh đã nghiên cứu thành công đề tài cấp Thành phố “Thử nghiệm tạo một số dạng chế phẩm diệt muỗi truyền bệnh sốt rét và sốt xuất huyết từ dịch chiết lá và nhân hạt neem Azadirachta indica A. Juss trồng tại Việt Nam [37].  Năm 2012, Nguyễn Thị Ý Nhi dưới sự hướng dẫn của Trần Lê Quan và Trần Kim Qui đã bảo vệ thành công luận án Tiến sĩ “Nghiên cứu thành phần limonoid của lá cây neem Azadirachta indica trồng ở Ninh Thuận”, trong luận án này tác giả đã chiết được 20 18 limonoid trong đó có 16 limonoid mới mà thế giới chưa công bố (kiểm tra theo phần nềm Scifinder) [38].  Từ năm 2006 đến năm 2013 Trần Kim Qui cùng các cộng sự đã thực hiện thành công các đề tài và dự án sau đây:  Đề tài NCKH: Ly trích hoạt chất từ cành, lá cây neem và cây cóc hành (còn gọi là cây neem địa phương) làm thuốc trị bệnh cho người và gia súc, gia cầm; đề tài cấp Tỉnh Ninh Thuận nghiệm thu tháng 10 năm 2007, được Hội đồng nghiệm thu đánh giá đạt loại 1 [39].  Đề tài NCKH: Hoàn thiện quy trình trích ly hoạt chất limonoid ARL trên quy mô pilot từ cây neem và điều chế các phụ gia thích hợp để làm nguyên liệu pha chế thuốc bảo vệ thực vật; Đề tài cấp Tp Hồ Chí Minh nghiệm thu tháng 9 năm 2006, được Hội đồng nghiệm thu đánh giá đạt loại Khá [40].  Dự án NCKH: Ly trích hoạt chất Azadirachtin≥ 3% trong hạt neem để làm thuốc bảo vệ thực vật; Dự án cấp Thành phố Hồ Chí Minh nghiệm thu tháng 12 năm 2011, được Hội đồng nghiệm thu đánh giá đạt loại Khá [41].  Dự án CGCN: Xây dựng mô hình ứng dụng công nghệ chiết xuất hoạt chất Azadirachtin limonoid ARL từ cây neem (Azadirachta indica) làm nguyên liệu để sản xuất chế biến một số sản phẩm khác; Dự án cấp Nhà nước chuyển giao công nghệ cho Trung tâm Thông tin và ứng dụng tiến bộ KHCN Ninh Thuận, Sở Khoa học Công nghệ tỉnh Ninh Thuận, nghiệm thu tháng 4 đánh giá đạt loại khá [42]. 1.3. Như đã trình bày trên đây khi bón phân đạm vào đất thì chỉ trong vòng 15 ngày khoảng 45-50% phân đạm bị thất thoát do cặp vi sinh vật nitrit hóa tác dụng sinh ra chất nitrat làm ô nhiễm môi trường đất, nước và nguồn thực phẩm. Để giải quyết vấn đề trên,nhất thiết phải khử cặp vi khuẩn nitrit hóa này. Việc nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ chiết xuất một số limonoid trong hạt cây neem trồng ở Ninh Thuận để phối chế ra một chế phẩm mới đặt tên là Limo NI từ những nguyên liệu trong nước có khả năng khử được cặp vi khuẩn nitrit hóa phân đạm trong đất là một đề tài có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Nếu đề tài được thành công thì chẳng những nó góp phần đáng kể vào việc bảo vệ nguồn nước ngầm và rau củ quả không bị nhiễm độc nitrat mà còn giúp nông dân sử dụng một lượng đạm ít hơn mà năng suất cây trồng vẫn tăng cao; như thế người nông dân được tăng thêm thu nhập và Nhà nước không phải chi nhiều ngoại tệ để nhập nhiều phân đạm như hiện nay. 19 II. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU LY TRÍCH HOẠT CHẤT ARL TRONG HẠT NEEM VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ARL KHỬ MẠNH NHẤT VI SINH VẬT NITRIT HÓA PHÂN ĐẠM 2.1.1. Mô tả nội dung 2.1.1.1. Ly trích và tách các hoạt chất ARL trong hạt neem a. Dùng 5 dung môi thông dụng có độ phân cực khác nhau như: hexane, ether dầu, ethyl acetate, ethanol, dichlorometane lần lượt trích ly các ARL trong bánh neem. Chưng cất áp xuất thấp, tách dung môi, thu cao ARL của các dung môi khác nhau. b. Chạy sắc ký điều chế bản mỏng với các dung môi giải ly có độ phân cực khác nhau, chọn chất giải ly thích hợp để tách các ARL. c. Pha thuốc thử Salkowski (dung dịch vanillin, H2SO4 trong methanol tạo ra màu xanh lục khi có sự hiện diện của limonoid) phun vào bản sắc ký đểphát hiện các chất ARL,hiện ra với màu xanh lục trên bản sắc ký. d. Tách các chất ARL, tìm dung môi thích hợp hòa tan từng chất ARL. 2.1.1.2. Phân lập và nhân giống 2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp trong đất trồng rau (có bón phân đạm) và nhân giống 2 chủng vi khuẩn này. a. Phân lập chủng Nitrosomonas sp trong môi trường Winogradsky P1 và phân lập chủng Nitrobacter sp trong môi trường Winogradsky P2. b. Nhân giống Nitrosomonas sp trong môi trường Watson và nhân giống Nitrobacter sp trong môi trường Hall-Murphy. 2.1.1.3. Thử tính sát khuẩn của các chất ARL đối với 2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp theo phƣơng pháp kháng sinh đồ dựa vào vòng tròn vô khuẩncủa các ARL trên bề mặt môi trƣờng Nutrient agar nuôi cấy vi khuẩn. a. Chọn 3 chất ARL có tác dụng khử mạnh nhất 2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp (có vòng tròn vô khuẩn lớn nhất). b. Dùng phương pháp phổ nghiệm để định danh 3 chất ARL có tác dụng khử mạnh nhất 2 chủng vi khuẩn này. 2.1.2. Phƣơng pháp 2.1.2.1. Ly trích và tách các hoạt chất ARL trong hạt neem Hoạt chất ARL trong hạt neem được ly trích và tách ra theo hình sau đây: (Hình 2.1) 20