Tài liệu Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ___________________________________________________________________ LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp này tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của ThS. Huỳnh Quang Phước, Trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh. Những kết quả có được của đồ án tốt nghiệp này là hoàn toàn không sao chép kết quả của người khác dưới bất cứ hình thức nào. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ án tốt nghiệp của mình. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2015 Sinh viên thực hiện đề tài Phạm Ngọc Yến Trinh i ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ___________________________________________________________________ LỜI CẢM ƠN Đầu tiên xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến cha mẹ, người đã nuôi nấng dạy dỗ khuyến khích và tạo mọi điều kiện cho con học tập để con có được thành quả như ngày hôm nay. Qua bốn năm học tập tại Trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh em đã được các thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập tại trường cũng như trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp. Em xin chân thành tỏ lòng biết ơn đến quý thầy cô, nhờ các thầy cô đã trang bị cho chúng em kiến thức cần thiết để tự tin bước vào đời. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn ThS. Huỳnh Quang Phước, thầy đã tận tình quan tâm, hướng dẫn và giúp đỡ em để em có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp này. Em cũng xin cảm ơn các thầy cô trong phòng thí nghiệm và bạn bè đã quan tâm giúp đỡ và tạo điều kiện cho em thực hiện đồ án tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2015 Sinh viên thực hiện đề tài Phạm Ngọc Yến Trinh ii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ___________________________________________________________________ MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ........................................................................... viii LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................... 1 2. Mục đích nghiên cứu ........................................................................................ 1 3. Nhiệm vụ nghiên cứu ....................................................................................... 1 4. Tình hình nghiên cứu ............................................................................................. 1 4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước ................................................................... 1 4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước .................................................................... 3 5. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................. 5 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................. 7 1.1 Sự chuyển hóa nitơ ................................................................................................ 7 1.1.1 Vai trò của nitơ đối với thực vật ................................................................... 7 1.1.2 Sự hấp thụ đạm ở thực vật ............................................................................ 9 1.1.2.1 Sự dùng đạm khoáng bởi thực vật có vài đặc tính đáng chú ý ............9 1.1.2.2 Sự khử nitrate .....................................................................................10 1.1.2.3 Sự tổng hợp amino acid .....................................................................10 1.1.2.4 Sinh tổng hợp protein .........................................................................12 1.1.2.5 Liên hệ giữ khử nitrate với hô hấp và quang hợp .............................. 12 1.1.3 Chu trình nitơ tự nhiên ............................................................................... 12 1.1.3.1 Quá trình amon hóa ............................................................................15 1.1.3.2 Quá trình nitrate hóa ..........................................................................16 1.1.3.3 Quá trình phản nitrite hóa ..................................................................17 1.1.3.4 Quá trình cố định nitơ phân tử ...........................................................17 1.1.3.5 Các vi sinh vật cố định nitơ phân tử ..................................................19 iii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ___________________________________________________________________ 1.2 Vi khuẩn Paenibacillus ....................................................................................... 21 1.2.1 Phân loại ..................................................................................................... 21 1.2.2 Đặc điểm hình thái ...................................................................................... 21 1.2.3 Sự phân bố của Paenibacillus .................................................................... 23 1.2.4 Một số đặc tính khác của Paenibacillus ..................................................... 23 1.3 Phân bón vi sinh cố định đạm ............................................................................. 23 1.3.1 Định nghĩa .................................................................................................. 23 1.3.2 Phân loại ..................................................................................................... 24 1.3.3 Nguyên liệu sản xuất phân bón .................................................................. 25 1.3.3.1 Mật rỉ đường.......................................................................................25 1.3.3.2 Than bùn ............................................................................................27 1.3.4 Quy trình sản xuất....................................................................................... 28 1.3.4.1 Quy trình sản xuất tổng quát .............................................................. 28 1.3.4.2 Thuyết minh .......................................................................................29 1.3.5 Các yêu cầu về phân bón vi sinh cố định đạm ........................................... 30 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................. 31 2.1 Vật liệu, thiết bị ................................................................................................... 31 2.1.1 Vật liệu ....................................................................................................... 31 2.1.1.1 Mật rỉ ..................................................................................................31 2.1.1.2 Than bùn ............................................................................................31 2.1.1.3 Nguồn phân lập vi sinh vật ................................................................ 31 2.1.2 Thiết bị ........................................................................................................ 31 2.2 Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 31 2.2.1 Phương pháp xác định một số chỉ tiêu của mật rỉ ...................................... 31 2.2.1.1 Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS ................31 2.2.1.2 Xác định hàm lượng đường tổng .......................................................32 2.2.1.3 Xác định hàm lượng chất khô hòa tan bằng phương pháp đo độ khúc xạ ....................................................................................................................32 2.2.2 Phương pháp xác định một số chỉ tiêu của than bùn .................................. 32 iv ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ___________________________________________________________________ 2.2.2.1 Xác định carbon hữu cơ tổng số bằng phương pháp Walkley – Black (TCVN 9294-2012) ........................................................................................32 2.2.2.2 Xác định acid humic và acid fulvic (TCVN 8561-2010) ...................33 2.2.2.3 Xác định N tổng số (TCVN 8557-2010)............................................33 2.2.2.4 Xác định N hữu hiệu (TCVN 9295-2012) .........................................33 2.2.2.5 Xác định P2O5 tổng số (TCVN 8563 – 2010) ....................................34 2.2.2.6 Xác định P2O5 hữu hiệu (TCVN 8559-2010)....................................34 2.2.2.7 Xác định K2O tổng số (TCVN 8660-2011) .......................................35 2.2.2.8 Xác định K2O hữu hiệu (TCVN 8662-2011) .....................................35 2.2.2.9 Xác định pH (TCVN 5979-2007) ......................................................35 2.2.2.10 Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy đến độ ẩm không đổi ........36 2.2.3 Phương pháp phân tích vi sinh ................................................................... 36 2.2.3.1 Phương pháp phân lập ........................................................................36 2.2.3.2 Phương pháp nhuộm Gram ................................................................ 36 2.2.3.3 Phương pháp nhuộm bào tử ............................................................... 36 2.2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính của vi sinh vật ......................................... 37 2.2.4.1 Định tính nitơ trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp so màu với thuốc thử Nessler............................................................................................37 2.2.4.2 Định lượng nitơ trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp Kjeldahl. ...37 2.2.4.3 Xác định khả năng tổng hợp acid indole-3-acetic (IAA) của vi khuẩn bằng phương pháp Salkowski (Glickmann và Dessaux, 1995) .....................38 2.2.5 Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật .................................................. 39 2.2.5.1 Đếm khuẩn lạc ...................................................................................39 2.2.5.2 Xác định mật độ vi sinh vật bằng phương pháp đo mật độ quang.....39 2.2.6 Định danh vi sinh vật .................................................................................. 39 2.3 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................. 41 2.3.1 Xác một số chỉ tiêu của mật rỉ .................................................................... 42 2.3.2 Xác định một số chỉ tiêu của than bùn ....................................................... 42 2.3.3 Phân lập vi sinh vật ..................................................................................... 43 v ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ___________________________________________________________________ 2.3.4 Xác định hoạt tính của vi sinh vật .............................................................. 43 2.3.5 Khảo sát điều kiện lên men......................................................................... 43 2.3.5.1 Xây dựng đường cong tăng trưởng ....................................................44 2.3.5.2 Xác định hàm lượng mật rỉ bổ sung ...................................................45 2.3.5.3 Xác định hàm lượng khoáng bổ sung ................................................45 2.3.6 Khảo sát điều kiện phối trộn với than bùn.................................................. 46 2.3.7 Phương pháp kiểm tra chất lượng chế phẩm .............................................. 47 2.3.7.1 Kiểm tra mật độ vi sinh vật ................................................................ 47 2.3.7.2 Kiểm tra các chỉ tiêu than bùn ...........................................................47 2.4 Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................... 48 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ........................................................... 49 3.1 Kết quả khảo sát các chỉ tiêu của nguyên liệu .................................................... 49 3.1.1. Mật rỉ ......................................................................................................... 49 3.1.2 Than bùn ..................................................................................................... 49 3.2 Kết quả phân lập và đặc điểm hình thái, sinh hóa............................................... 50 3.2.1 Kết quả phân lập và đặc điểm hình thái khuẩn lạc ..................................... 50 3.2.2 Tuyển chọn các chủng cố định nitơ mạnh ................................................. 53 3.2.3 Khả năng tổng hợp acid indole-3-acetic (IAA) của vi sinh vật .................. 54 3.2.4 Định danh bằng sinh học phân tử chủng P2 ............................................... 55 3.3 Khảo sát thời gian và môi trường tối ưu để lên men thu sinh khối ..................... 55 3.3.1 Khảo sát thời gian lên men ......................................................................... 55 3.3.2 Khảo sát tỉ lệ mật rỉ bổ sung ....................................................................... 56 3.3.3 Khảo sát hàm lượng khoáng bổ sung ......................................................... 58 3.4 Kết quả khảo sát điều kiện phối trộn với than bùn. ............................................ 59 3.5 Kết quả kiểm tra chế phẩm phân bón sau khi phối trộn với than bùn ................ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 63 PHỤ LỤC A: CÁC CÁCH TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM ..................................... 1 PHỤ LỤC B: THỐNG KÊ CÁC KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM.............................. 35 vi ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ___________________________________________________________________ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Tóm tắt các quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên ............................ 20 Bảng 1.2. Phân loại vi khuẩn Paenibacillus ............................................................ 21 Bảng 1.3. Ưu và nhược điểm của chất mang khử trùng và không khử trùng.......... 25 Bảng 1.4. Thành phần dinh dưỡng của rỉ mật mía .................................................. 26 Bảng 1.5. Thành phần hóa học của rỉ đường mía .................................................... 27 Bảng 1.6. Thành phần hóa học của than bùn ở các vùng khác nhau ....................... 28 Bảng 2.1. Tên các loại thiết bị sử dụng trong thí nghiệm........................................ 32 Bảng 2.2. Các chỉ tiêu của mật rỉ ............................................................................. 42 Bảng 2.3. Các chỉ tiêu của than bùn ........................................................................ 42 Bảng 2.4. Xác định hoạt tính của vi sinh vật ........................................................... 43 Bảng 2.5. Xây dựng đường cong tăng trưởng của vi sinh vật ................................. 44 Bảng 2.6. Mật độ của vi sinh vật trên môi trường bổ sung mật rỉ qua các mốc thời gian ........................................................................................................................... 45 Bảng 2.7. Mật độ của vi sinh vậttrên môi trường bổ sung khoáng qua các mốc thời gian ........................................................................................................................... 46 Bảng 2.8. Mật độ tế bào thay đổi theo độ ẩm .......................................................... 47 Bảng 3.1. Một số chỉ tiêu của mật rỉ ........................................................................ 49 Bảng 3.2. Các chỉ tiêu của than bùn trước khi ủ với vi sinh vật. ............................. 50 Bảng 3.3. Đặc điểm khuẩn lạc của 4 chủng vi sinh vật ........................................... 51 Bảng 3.4. Kết quả nhuộm Gram và nhuộm bào tử .................................................. 52 Bảng 3.5. Hàm lượng nitơ trong dịch nuôi cấy của các chủng vi sinh vật .............. 54 Bảng 3.6. Khả năng sinh IAA của các chủng vi sinh vật ........................................ 54 Bảng 3.7. Mật độ của vi sinh vật ở các mốc thời gian khác nhau trên môi trường bổ sung mật rỉ ................................................................................................................ 57 Bảng 3.8. Mật độ của các vi sinh vật ở các mốc thời gian khác nhau trên môi trường bổ sung khoáng ........................................................................................................ 58 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của độ ẩm đến sự phát triển của vi sinh vật ......................... 60 Bảng 3.10. Các chỉ tiêu của phân bón ..................................................................... 61 vii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ___________________________________________________________________ DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Con đường glutamin (sự gia nhập của NH3 và glutamin) ....................... 11 Hình 1.2. Vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên ........................................................ 14 Hình 1.3. Sơ đồ chuyển điện tử trong quá trình khử và oxy hóa nitơ ..................... 19 Hình 1.4. Liên kết giữa các bào tử P. stellifer trưởng thành với nhau .................... 22 Hình 1.5 Quy trình sản xuất phân bón vi sinh ......................................................... 29 Hình 2.1. Sơ đồ các bước tiến hành......................................................................... 41 Hình 3.1. Phản ứng màu với thuốc thử Nessler....................................................... 53 Hình 3.2. Khả năng tăng trưởng của chủng P2 trên môi trường NB....................... 56 Hình 3.3. Biến đổi mật độ tế bào của chủng P2 trong các môi trường qua các mốc thời gian trên môi trường bổ sung mật rỉ ................................................................. 57 Hình 3.4. Biến đổi mật độ tế bào của chủng P2 trong các môi trường bổ sung khoáng qua các mốc thời gian. ................................................................................. 59 viii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ___________________________________________________________________ LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trong nền kinh tế của nước ta hiện nay, nông nghiệp chiếm vị trí quan trọng. Một trong những biện pháp hàng đầu để đẩy mạnh sản xuất nông nghiệp là sử dụng phân bón. Do nhu cầu xã hội ngày càng phát triển cao đòi hỏi con người sử dụng nhiều biện pháp khác nhau để tăng năng suất sản lượng sản phẩm. Tuy nhiên, đa số nông dân cung cấp nitơ cho cây trồng đều ở dạng phân bón hóa học với hiệu suất thấp, vì thế dư lượng các chất hóa học trong các loại phân này gây ô nhiễm môi trường đất làm đất bị thoái hóa, chua hóa, làm cho môi trường nước mặt cũng như nước ngầm tích lũy nhiều NO3-, NO2-, gây ra hiện tượng phì hóa nước,…Ngoài ra, bón nhiều phân đạm vào thời kỳ thu hoạch đã làm tăng đáng kể lượng nitơ có trong sản phẩm mà con người sử dụng hàng ngày cũng rất có hại cho sức khỏe. Đồng thời, nồng độ nitrate trong nước cao làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người, đặc biệt đối với trẻ em dưới 4 tháng tuổi. Trong đường ruột, các nitrate bị khử thành nitrite, các nitrite tạo ra được hấp thụ vào máu kết hợp với hemoglobin làm khả năng chuyên chở oxy của máu bị giảm. Nitrite còn là nguyên nhân gây ung thư tiềm tàng. Vì vậy, việc tìm ra nguồn phân bón hữu cơ vi sinh để giảm sử dụng phân bón hóa học là vấn đề cấp thiết hiện nay. Đó cũng là lý do để sinh viên thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm”. 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn cố định đạm Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm trên nền chất mang than bùn 4. Tình hình nghiên cứu 4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 1 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ___________________________________________________________________ Năm 1896 phân bón vi sinh do Noble Hiltner sản xuất đầu tiên tại Đức được đặt tên là Nitragin. Nitragin là loại phân được chế tạo bởi vi khuẩn Rhizolium do Beijerink phân lập năm 1888 và được Fred đặt tên vào năm 1889 dùng để bón cho các loại cây thích hợp họ đậu. Ở Mỹ sản xuất chế phẩm Nitroculture, ở Anh sản xuất loại phân Nitrbacterin. Tới nay hầu hết các nước đều sử dụng chế phẩm vi khuẩn nốt sần cho cây bộ đậu đặc biệt là cây đậu tương. Khả năng cố định đạm của vi khuẩn đạm cố định hội sinh Azospirillum được phát hiện từ 1922, nhưng vai trò của nó trong hoạt động cố định đạm vùng rễ của cây hòa thảo chỉ được biết đến vào những năm thập kỷ 70 nhờ việc tìm ra nơi trú ngụ của chúng. Năm 1976 đã phát hiện Azospirillum bên trong và bên bề mặt của mô rễ, tạo ra mối quan hệ cộng sinh với cây, chúng có thể tồn tại trong đất vùng rễ, trên bề mặt rễ. Đây là loài vi khuẩn có khả năng cố định đạm lớn, chúng nhận các chất hữu cơ như pectin, acid hữu cơ làm nguồn dinh dưỡng để phát triển và cố định đạm, đồng thời cung cấp các hợp chất nitơ cho cây chủ. Nghiên cứu của Puneet (1998) cho thấy nếu phối hợp Azotobacter sp. với các chủng phân giải phosphate như Aspergillus niger sẽ làm tăng năng suất lúa mì tăng 17,7%, trong khi Azotobacter chỉ tăng 9%. Kapoor cũng cho kết quả tương tự khi phối hợp chủng Azotobacter sp. với các chủng phân giải phosphate như Bacillus sp., Pseudomonas sp. Thí nghiệm làm tăng năng suất lúa, bông vải lên 10 – 20%. Năm 2008, Anelise Beneduzi và cộng sự đã phân lập được một số chủng Bacillus và Paenibacillus từ cánh đồng lúa ở miền nam Brazil. Việc phân lập vi khuẩn này từ đất ôn đới và cận nhiệt đới, kết hợp khả năng cố định đạm với việc sản xuất các chất có khả năng kích thích tăng trưởng thực vật, cũng có thể làm tăng đáng kể năng suất của cây trồng ngũ cốc ở Brazil. Năm 2013, chế phẩm sinh học Nano-Gro được sản xuất bởi công ty Custom Biologicals, Inc. Hoa Kỳ và được độc quyền phân phối tại Việt Nam bởi công ty Trách Nhiệm Hữu Hạn MBT. Chế phẩm này có chứa nhiều loại vi sinh vật có tác dụng tăng cường hệ vi sinh vật có ích trong đất và có lợi cho cây, ức chế và cô lập 2 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ___________________________________________________________________ các vi sinh vật gây hại như Trichoderma viride, Bacillus subtilis, đặc biệt loài vi khuẩn cố định đạm Paenibacillus polymyxa có mật số tối thiểu lên đến 5.109 CFU/gram. Hình 1 Chế phẩm sinh học Nano-Gro 4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam, phân vi sinh vật cố định đạm cây họ đậu và phân vi sinh vật phân giải lân đã được nghiên cứu từ năm 1960. Đến năm 1987, phân Nitragin trên nền chất mang than bùn mới được hoàn thiện. Năm 1991 đã có hơn 10 đơn vị trong cả nước tập trung nghiên cứu phân vi sinh vật. Các nhà khoa học đã phân lập được nhiều chủng vi sinh vật cố định đạm và một số vi sinh vật phân giải lân. Phân vi sinh vật cố định nitơ hội sinh được nghiên cứu và phát triển từ những năm 90 của thế kỷ XX trong khuôn khổ của đề tài khoa học cấp Nhà nước KC.08.01. Sản phẩm được gọi dưới tên azogin, Rhizolua. Các thử nghiệm sử dụng phân vi sinh vật cố định nitơ hội sinh (azogin) ở 15 tỉnh miền Bắc, Trung và miền Nam trên điện tích hàng chục ngàn hecta cho thấy, trong cùng điều kiện sản xuất, ruộng lúa được bón phân azogin đều tốt hơn so với đối chứng, biểu hiện qua bộ lá phát triển tốt hơn, tỷ lệ nhánh hữu hiệu và số bông/khóm nhiều hơn đối chứng. Năng suất hạt tăng 4 - 25%, đặc biệt nhiều nơi bón azogin và giảm 20% phân khoáng vẫn cho năng suất lúa cao hơn so với đối chứng. Bón phân vi sinh vật cố định nitơ cho cây trồng có thể thay thế một phần phân đạm khoáng. Kết quả nghiên cứu của các đề tài cấp Nhà nước KC.08.01 (1991 1995) và KHCN.02.06 (1996 - 2000) cho biết, có thể tiết kiệm được lượng phân 3 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ___________________________________________________________________ đạm khoáng nhất định, từ 10,80 đến 22,40 KgN/ha/vụ tùy theo từng loại đất và mùa vụ gieo trồng. Lâm Minh Tú, Trần Văn Tuân (2003) nghiên cứu sản xuất một số phân bón đơn chủng, đa chủng cho cây trồng. Các chủng sử dụng trong nghiên cứu là Azotobacter bejerinski, Azotobacter vinelandii, Bacillus subtilis, Paenibacillus polymyxa. Thử nghiệm trên khoai tây làm tăng năng suất từ 100 – 300% so với đối chứng. Phạm Văn Toản (2003) sử dụng phân bón sinh học giảm được 20% phân bón vô cơ NPK nhưng năng suất khoai tây vẫn tăng so với đối chứng 15 – 50%, cà chua tăng 12 – 34%, lạc tăng 30% và làm giảm đáng kể bệnh héo xanh. Nguyễn Thúy Hương, Nguyễn Thùy Quý Tú (2013) đã nghiên cứu thực hiện được chế phẩm biopolyter – Azotobacter để sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm. Phương pháp lên men bán rắn trên giá thể hạt polyter thu sinh khối Azotobacter, tạo chế phẩm biopolyter – Azotobacter có nhiều ưu thế hơn so với phương pháp lên men truyền thống lên men chìm vì đơn giản, hiệu suất thu sinh khối tăng hơn từ 3,2 đến 4,3 lần. Mật độ Azotobacter của chế phẩm đạt 3,80.109 CFU/g. Hiện nay, trên thị trường Việt Nam đã có những phân bón vi sinh có tác dụng tốt cho cây trồng, giúp cây trồng phát triển cân đối, tăng năng suất cây trồng, tăng độ phì nhiêu cho đất, làm cho đất trở nên tơi xốp và bảo vệ môi trường như: Phân hữu cơ vi sinh Sông Gianh là nguồn phân được sản xuất theo quy trình công nghiệp mang phần lớn chất hữu cơ và một số thành phần quan trọng cho cây trồng và đặc biệt là nguồn vi sinh vật có ích cho đất bao gồm Aspergillus, Azotobacter, Bacillus đều đạt mật độ trên 106 CFU/g. 4 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ___________________________________________________________________ Hình 2 Phân hữu cơ vi sinh Sông Gianh Phân hữu cơ vi sinh đa chức năng số 05 – KC 04 – 04: đây là sản phẩm của đề tài nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước mã số KC 04 – 04. Phân này có nguồn gốc từ rác thải trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội nên rất giàu carbon. Các chủng vi sinh vật bao gồm Azotobacter, Bacillus, Enterobacter để có mật độ trên 109 CFU/g, tạp khuẩn <1% Các nghiên cứu ở Việt Nam và nước ngoài cho thấy, phân bón hữu cơ vi sinh có tác dụng tốt đến sự sinh trưởng, phát triển và năng suất cây trồng, giảm giá thành, nâng cao hiệu quả trồng trọt và cải tạo môi trường đất canh tác 5. Phương pháp nghiên cứu − Phương pháp phân lập − Phương pháp đếm khuẩn lạc − Phương pháp nhuộm Gram − Phương pháp nhuộm bào tử − Phương pháp nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy và hình thái của các chủng vi khuẩn tuyển chọn − Phương pháp so màu với thuốc thử Nessler − Phương pháp xác định hàm lượng IAA − Phương pháp định lượng nitơ bằng phương pháp Kjeldahl 5 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ___________________________________________________________________ − Phương pháp so màu trắc quang. − Phương pháp DNS xác định đường khử − Phương pháp xác định các chỉ tiêu than bùn − Sử dụng phần mềm Statgraphic xử lý số liệu thô, tính giá trị trung bình và so sánh sự khác biệt của các nghiệm thức. 6 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ___________________________________________________________________ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sự chuyển hóa nitơ 1.1.1 Vai trò của nitơ đối với thực vật Đối với thực vật nói chung và cây trồng nói riêng, nitơ có vai trò sinh lý đặc biệt quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất. Nitơ có mặt trong rất nhiều hợp chất hữu cơ quan trọng có vai trò quyết định trong quá trình trao đổi chất và năng lượng, đến hoạt động sinh lý của cây. Nitơ là nguyên tố đặc thù của protein mà protein lại có vai trò cực kỳ quan trọng đối với cây. Protein là thành phần chủ yếu tham gia cấu trúc nên hệ thống chất nguyên sinh trong tế bào, cấu tạo nên hệ thống màng sinh học, các bào quan trong tế bào. Nitơ có trong thành phần của acid nucleic (DNA và RNA). Ngoài chức năng duy trì và truyền thông tin di truyền, acid nucleic đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp protein, sự phân chia và sự sinh trưởng của tế bào… Nitơ là thành phần quan trọng của chlorophyll, là một trong những yếu tố quyết định hoạt động quang hợp của cây, cung cấp chất hữu cơ cho sự sống của các sinh vật trên trái đất. Nitơ là thành phần của một số phytohormone như auxin và cytokinin. Đây là những chất quan trọng trong quá trình phân chia và sinh trưởng của tế bào và của cây. Nitơ tham gia vào thành phần của ADP, ATP, có vai trò quan trọng trong trao đổi năng lượng của cây. Nitơ tham gia vào thành phần của phytochrome có nhiệm vụ điều chỉnh quá trình sinh trưởng, phát triển của cây có liên quan đến ánh sáng như phản ứng quang chu kỳ, sự nảy mầm, tính hướng quang. Hàm lượng nitơ trong thành phần chất khô của thực vật thường dao động từ 1 – 3%. Tuy hàm lượng trong cây thấp, nhưng nitơ có ý nghĩa quan trọng bậc nhất đối với đời sống thực vật cũng như toàn bộ thế giới hữu cơ. Trong môi trường sống của thực vật, nitơ tồn tại dưới 2 dạng: 7 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ___________________________________________________________________ Khí nitơ tự do trong khí quyển (N2) chiếm khoảng 79 % không khí (theo thể tích). Dạng này cây không thể sử dụng được. Dạng các hợp chất nitơ hữu cơ và vô cơ. Nitơ liên kết chủ yếu ở 3 dạng hợp chất: Hợp chất nitơ vô cơ trong các muối ammonium (NH4+), muối nitrate (NO3- ), muối nitrite (NO2-) Nitơ hữu cơ của các protein ở dạng xác bã động vật, thực vật chưa phân giải hoàn toàn, ở dưới dạng mùn protein. Các sản phẩm phân giải của protein như các amino acid, các peptid và các amin. Trong số các dạng nitơ trên thì cây sử dụng nitơ vô cơ là chủ yếu. Trong đất nitơ vô cơ chiếm 1 – 2 % lượng nitơ tổng số có trong đất. Các dạng nitơ nói trên luôn luôn biến đổi nhờ các vi sinh vật đất qua chu trình nitơ trong tự nhiên. Thường các nguồn nitơ vô cơ (NO3-, NH4+) được cây đồng hóa tốt hơn các nguồn nitơ hữu cơ (ngoại trừ urea, asparagin, glutamine dễ phân giải thành NH3). Do đó, trong điều kiện tự nhiên đối với sự dinh dưỡng đạm của thực vật, các vi sinh vật đất có ý nghĩa rất to lớn, chúng khoáng hóa nitơ hữu cơ và cuối cùng chuyển hóa thành NH3. Tất cả các nitrate trong đất, hay trong các nguồn nước như ao, hồ, ruộng...đều được tạo thành do hoạt động sống của vi khuẩn nitrit hóa và vi khuẩn nitrate hóa. Còn các vi khuẩn amon (ammonium) hóa cũng phát triển mạnh, chúng phân giải protein của các xác bã động, thực vật và vi sinh vật, bổ sung lượng dự trữ amon cho đất. Riêng nguồn nitơ phân tử của khí quyển (N2) rất trơ về mặt hóa học không được cây xanh đồng hóa. Chỉ có nhóm vi sinh vật đất mới có khả năng đồng hóa nguồn nitơ này. Quan trọng nhất là các vi khuẩn thuộc giống Azotobacter, Clostridium, vi khuẩn lam (Cyanobacteria) sống tự do và các vi sinh vật cộng sinh trong nốt sần của rễ một số loại cây bộ đậu, phi lao hoặc trong một số loại cây khác. 8 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ___________________________________________________________________ Ngoài ra nhờ các quá trình tổng hợp hóa học khi có sự phóng điện trong các cơn giông mà từ N2 có thể hình thành các dạng NO2-, NO3-, NH4+. Do hoạt động canh tác của con người, đất đã lấy đi một phần nitơ trong sản phẩm thu hoạch mà sự cố định nitơ khí quyển nhờ các vi sinh vật và sự phân giải các xác bã hữu cơ trong đất không bù đắp nổi. Vì vậy hàng năm cần phải trả lại nitơ cho đất sau thu hoạch thông qua các dạng phân bón hữu cơ và vô cơ... Vì cây rất nhạy cảm với nitơ. Nitơ có tác dụng hai mặt đến năng suất cây trồng, nếu cây trồng thừa hay thiếu nitơ đều có hại. Thừa nitơ: khác với các nguyên tố khác, việc thừa nitơ có ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất ở cây trồng. Cây sinh trưởng quá mạnh, thân lá tăng nhanh mà mô cơ giới kém hình thành nên cây rất yếu, giảm năng suất nghiêm trọng và có trường hợp không có thu hoạch. Thiếu nitơ: thiếu nitơ cây sinh trưởng kém, chlorophyll không được tổng hợp đầy đủ, lá vàng, đẻ nhánh và phân cành kém, sút giảm hoạt động quang hợp và tích lũy, giảm năng suất. Tùy theo mức độ thiếu đạm mà năng suất giảm nhiều hay ít. Trong trường hợp có triệu chứng thiếu đạm thì chỉ cần bổ sung phân đạm là cây sinh trưởng và phát triển bình thường. 1.1.2 Sự hấp thụ đạm ở thực vật 1.1.2.1 Sự dùng đạm khoáng bởi thực vật có vài đặc tính đáng chú ý Cây non thích NH4+ (cà chua, bắp, lúa; ngoại lệ: mía, bông vải). NH4+ đối kháng với K+, Ca2+ hay Mg2+. Do đó, việc dùng NH4+ quá liều sẽ gây thiếu K+, Ca2+ hay Mg2+ (lúa mì). Sự bổ sung Ca2+ làm giảm tính độc của NH4+. Ngược lại, NO3- giúp sự thấm cation, nhất là K+. NH4+ cản trở NO3-, nhưng giúp các ion phosphor vào tế bào. Sự hạ thấp pH kích thích sự hấp thu và đồng hóa nitrate, trong khi sự tăng pH kích thích sự hấp thu và đồng hóa amonium. Tuy nhiên, khi pH bên ngoài cao, amonia (base yếu) khuếch tán nhanh vào tế bào chất (acid hơn). Do đó, amonia, thiết yếu ở pH trung tính, trở thành độc trong môi trường kiềm. Spirulina platensis là trường hợp đặc biệt, có thể dùng amonia ở nồng độ cao, như nguồn nitrogen duy 9 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ___________________________________________________________________ nhất, ngay cả ở pH 10 hay cao hơn, do khả năng duy trì pH cao trong tế bào, cản trở amonia vào tế bào. Sự thừa NH4+ thường rất độc so với NO3-, vì gây nhiều xáo trộn trong tính thấm của tế bào. Hàm lượng đường của rễ có vai trò quan trọng trong sự dinh dưỡng đạm, vì các acid cetonic được tổng hợp từ đường giúp sự gia nhập nitơ vào amino acid. Do đó, tính độc của NH4+ sẽ rất mạnh nếu quang hợp yếu, khi ấy sự dùng NH4+ hạ thấp hàm lượng tinh bột. 1.1.2.2 Sự khử nitrate Giai đoạn đầu tiên của sự đồng hóa đạm khoáng là sự khử nitrate, nói chung xảy ra ở rễ, trong tối. Tuy nhiên, ở nhiều loài, nhất là ở các cây dạng cỏ, sự khử được thực hiện đồng thời trong lá, dưới ánh sáng (phân nửa trong rễ, phân nửa trong lá lúa mì; gần như hoàn toàn trong lá cà chua). Sự khử nitrate xảy ra theo hai giai đoạn: khử nitrate (NO3-) thành nitrite (NO2-), và khử nitrite thành amonia: NO3- + 2H+ + 2e-  NO2- + H2O NO2- + 6H+ + 6e-  NH3 + H2O + OHNitrate được khử trong cytosol nhờ nitrate reductase, sau đó nitrite vào diệp lạp của lá hay tiền lạp của rễ để được tiếp tục khử nhờ nitrite reductaz. NH3 có thể ở dạng R-NH2 hay dạng ion hóa NH4+ khi nhận 1 H+. 1.1.2.3 Sự tổng hợp amino acid Các amino acid được tổng hợp từ sự cố định nhóm NH3 (được hấp thu dưới dạng NH4+ hay từ sự khử nitrate) trên các acid -cetonic, theo ba quá trình căn bản sau:  Sự amin hóa khử Phản ứng amin hóa khử được thực hiện trong ti thể từ các acid cetonic của chu trình Krebs, và hầu như chỉ xảy ra ở các nấm, ít phổ biến ở thực vật (như hai quá trình còn lại). Ví dụ, glutamate được tổng hợp từ -cetoglutarate, nhờ glutamate dehydrogenase (GDH). 10 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ___________________________________________________________________ Glutamate: HOOC-CH2-CH2-CH(NH2)-COOH -cetoglutarate: HOOC-CH2-CH2-CO-COOH  Con đường glutamin Glutamin (amid của acid glutamic) là dạng đạm dự trữ của hạt và củ. Sự tổng hợp glutamin từ glutamate cần NH3, ATP và glutamin sythetase (GS): NH3 + HCOO-CH2-CH2-CH(NH2)-COOH CO(NH2)-CH2-CH2-CH(NH2)-COOH + H2O ATP ADP + Pi Glu NH3 ATP GS ATP + Pi -CG Gln [2H+ + 2e-] GOGAT Glu Glu Hình 1.1. Con đường glutamin (sự gia nhập của NH3 và glutamin) Glu: glutamat; Gln: glutamin; -GC: -cetoglutarat; GS: glutamin synthetaz; GOGAT: glutamin synthaz hay glutamin --cetoglutarat aminotransferaz. GDH là enzyme ti thể, GOGAT chỉ có trong các lạp, GS nửa trong cytosol (nơi khử nitrate) và nửa trong các lạp (diệp lạp ở lá hay tiền lạp không sắc tố ở rễ). Diệp lạp là bào quan rất thích hợp cho hoạt động của hệ thống GS + GOGAT vì chứa nhiều chất khử và ATP cần cho hệ thống hoạt động. Hơn nữa, không chỉ giàu nitrite NH3 từ sự khử nitrite, các diệp lạp còn tham gia tái đồng hóa NH3 sinh ra từ sự quang phosphoryl hóa.  Sự chuyển amin Phản ứng này rất phổ biến và cũng nhờ một acid cetonic nhưng nhóm amin (NH2) có nguồn gốc từ một amino acid thay vì NH3: R1-CH(NH2)-COOH + R2-CO-COOH  R1-CO-COOH + R2-CH(NH2)-COOH 11 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ___________________________________________________________________ Các transaminase với nhóm hoạt động pyridoxal phosphate (vitamin B6) xúc tác sự trao đổi này.Glutamate thường là chất cho nhóm –NH2 trong sự chuyển amin, để tạo nhiều amino acid khác: aspartate từ oxaloacetate, glycine từ glyoxylate, alanine từ pyruvate, phenyl alanine từ phenylpyruvate, tyrosine từ hydroxy phenylpyruvate. Amid của aspartate là asparagine, dạng đạm vận chuyển và dự trữ thông thường nhất (khoai tây chứa 1,4 mg asparagine/g mô tươi). Ngoài ba quá trình căn bản, các phản ứng khác cũng tạo amino acid: sự amin hóa một acid không bão hòa, sự khử carboxyl hóa của một diacid amin, sự hóa vòng glutamate. Tóm lại, sự tổng hợp amino acid được thực hiện một phần ở các nơi khử nitrate (rễ hay lá). Sau đó, sự biến đổi tiếp tục, qua sự chuyển amin, trong mọi loại mô thực vật, đặc biệt trong ti thể và diệp lạp, các bào quan sẵn sàng cung cấp các acid cetonic, các chất khử (NADH và NADPH) và ATP. 1.1.2.4 Sinh tổng hợp protein Sinh tổng hợp protein trong tế bào được thực hiện trên các ribosome của tế bào chất, ti thể và diệp lạp. Trình tự amino acid trong protein được xác định nhờ thông tin di truyền được giữ trong các phân tử DNA của nhân, ti thể và diệp lạp. 1.1.2.5 Liên hệ giữ khử nitrate với hô hấp và quang hợp Chất cho e- trong sự khử nitrate thành nitrite là NADH được cung cấp trực tiếp trong tối nhờ hô hấp và gián tiếp dưới ánh sáng nhờ quang hợp (NADPH diệp lạp chuyển thành NADH tế bào chất). Do đó, có sự cạnh tranh giữa nitrate với O2 và CO2: O2 của không khí nhận etừ NADH, nên khi có nitrate hệ số hô hấp CO2/O2 của rễ gia tăng; CO2 của không khí nhận e- từ NADPH, do đó khi có nitrate sự đồng hóa CO2 (quang hợp) giảm ở lá. (Bùi Trang Việt, 2002). 1.1.3 Chu trình nitơ tự nhiên Mặc dù nitơ trong khí quyển Trái Đất là một nguồn phong phú, nhưng cây trồng không hấp thụ trực tiếp được mà phải nhờ các vi sinh vật. Quá trình amon hóa 12