Tài liệu Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng từ ví sinh vật tái tổ hợp nhầm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CNSH TRONG LĨNH VỰC NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT ĐẾN NĂM 2020 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng từ vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi” Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Công nghệ sinh học Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Quyền Đình Thi TS. Đỗ Thị Tuyên 8727 Hà Nội - 2010 BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CNSH TRONG LĨNH VỰC NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT ĐẾN NĂM 2020 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng từ vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi” Chủ nhiệm đề tài TS. Đỗ Thị Tuyên PGS. TS. Quyền Đình Thi Cơ quan chủ trì đề tài Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Hà Nội - 2010 MỤC LỤC 1 TỔNG QUAN ....................................................................................................................1 1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới.............................................................................2 1.1.1 Cải thiện chất lượng và hiệu quả sử dụng enzyme ................................................3 1.1.2 Tìm các nguồn enzyme mới...................................................................................5 1.1.3 Tạo ra các enzyme tái tổ hợp với năng suất cao chất lượng mới...........................6 1.1.4 Chuyển gene mã hóa enzyme vào thực vật............................................................8 1.2 Tình hình sản xuất enzyme bổ sung thức ăn gia súc trên thế giới ...........................10 1.3 Hiệu quả của đa enzyme so với đơn enzyme...........................................................11 1.4 Những khác biệt về trình độ KH&CN trong nước và thế giới.................................12 1.5 Tình hình nghiên cứu trong nước trong thời gian qua .............................................12 1.5.1 Tình hình nghiên cứu các enzyme tái tổ hợp .......................................................15 1.5.2 Tình hình nhập khẩu và liên doanh sản xuất........................................................15 1.5.3 Hiệu quả kinh tế của các enzyme bổ sung và mức độ an toàn.............................16 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ...................................................................................16 2.1 Chủng vi sinh vật .....................................................................................................16 2.2 Nguyên liệu..............................................................................................................17 2.3 Môi trường nuôi cấy ................................................................................................17 2.4 Vector biểu hiện.......................................................................................................17 2.5 Hóa chất ...................................................................................................................18 2.6 Các bộ mồi ...............................................................................................................18 2.7 Xác định hoạt tính....................................................................................................19 2.7.1 Xác định hoạt tính glucanase ...............................................................................19 2.7.2 Xác định hoạt tính mannanase .............................................................................20 2.7.3 Xác định hoạt tính subtilisin ................................................................................21 2.7.4 Xác định hoạt tính xylanase.................................................................................21 2.8 Tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng tự nhiên sinh tổng hợp enzyme ...........................21 2.8.1 Sinh tổng hợp glucanase ......................................................................................21 2.8.2 Sinh tổng hợp mannanase và xylanase ................................................................22 2.8.3 Sinh tổng hợp subtilisin .......................................................................................22 2.8.4 Xác định ảnh hưởng của các yếu tố lên hoạt tính enzyme...................................23 2.9 Các phương pháp sinh học phân tử..........................................................................23 2.9.1 Phản ứng PCR......................................................................................................23 2.9.2 Thao tác cắt, gắn dính DNA và biến nạp hóa học ...............................................23 2.9.3 Biến nạp xung điện ..............................................................................................23 2.9.4 Tách chiết RNA ...................................................................................................23 2.9.5 Đọc trình tự DNA ................................................................................................24 2.9.6 Biểu hiện plasmid tái tổ hợp trong E. coli BL21 .................................................24 2.9.7 Biểu hiện plasmid tái tổ hợp trong Aspergillus ...................................................24 2.9.8 Biểu hiện trong Pichia pastoris ............................................................................24 2.9.9 Biểu hiện Xln tái tổ hợp.......................................................................................24 2.9.10 Tách chiết DNA tổng số từ Pichia pastoris......................................................24 2.9.11 Phương pháp tách DNA từ nấm sợi .................................................................25 2.9.12 PCR dung hợp hai đoạn ...................................................................................26 2.9.13 Biến nạp vào Bacillus subtilis WB800 ............................................................26 2.10 Phương pháp tách chiết protein ...............................................................................26 2.10.1 Tinh sạch protein tái tổ hợp .............................................................................26 2.10.2 Điện di SDS-PAGE..........................................................................................26 2.11 Các phương pháp sản xuất enzyme tái tổ hợp .........................................................27 2.11.1 Lên men sản xuất glucanase ............................................................................27 2.11.2 Lên men sản xuất mannanase ..........................................................................27 2.11.3 Lên men sản xuất subtilisin..............................................................................27 2.11.4 Lên men sản xuất xylanase ..............................................................................27 2.11.5 Tạo chế phẩm enzyme thô ...............................................................................27 2.12 Các phương pháp thử nghiệm chế phẩm..................................................................28 2.12.1 Xác định độ an toàn, độ độc cấp tính và bán trường diễn................................28 2.12.2 Đánh giá hiệu quả chế phẩm đơn enzyme .......................................................29 2.12.3 Đánh giá hiệu quả chế phẩm Vietzyme M.......................................................30 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................................................35 3.1 Nội dung 1. Đánh giá các chủng tự nhiên sinh tổng hợp các enzyme .....................35 3.1.1 Glucanase tự nhiên...............................................................................................35 3.1.2 Manananase tự nhiên ...........................................................................................40 3.1.3 Protease tự nhiên..................................................................................................48 3.1.4 Xylanase tự nhiên ................................................................................................50 3.2 Nội dung 2. Tạo các chủng vi sinh vật tái tổ hợp ....................................................62 3.2.1 Glucanase tái tổ hợp.............................................................................................62 3.2.2 Mannanase tái tổ hợp ...........................................................................................69 3.2.3 Subtilisin tái tổ hợp ..............................................................................................74 3.2.4 Xylanase tái tổ hợp ..............................................................................................80 3.3 Nội dung 3. Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm enzyme ...............................94 3.3.1 Tạo nguyên liệu đầu vào ......................................................................................95 3.3.2 Quy trình công nghệ sản xuất subtilisin tái tổ hợp ..............................................96 3.3.3 Quy trình công nghệ sản xuất glucanase tái tổ hợp .............................................99 3.3.4 Quy trình công nghệ sản xuất mannanase tái tổ hợp .........................................102 3.3.5 Quy trình công nghệ sản xuất xylanase tái tổ hợp .............................................105 3.3.6 Quy trình sản xuất chế phẩm đa enzyme (Vietzyme M) ...................................109 3.4 Nội dung 4. Đánh giá chế phẩm đơn và đa enzyme ..............................................111 3.4.1 Đánh giá độ an toàn, độc tính cấp và bán trường diễn của chế phẩm................111 3.4.2 Hiệu quả của chế phẩm enzyme đơn trên gà Lương Phượng ............................113 3.4.3 Hiệu quả của chế phẩm đơn enzyme xylanase trên lợn con sau cai sữa............114 3.4.4 Hiệu quả của chế phẩm Vietzyme M trên gà Lương Phượng............................115 3.4.5 Thử nghiệm hiệu lực của chế phẩm đa enzyme lên sự sinh trưởng của lợn ở các lứa tuổi 8-50kg ...............................................................................................................117 KẾT LUẬN............................................................................................................................120 LỜI CÁM ƠN ........................................................................................................................121 KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................................121 TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................................121 BÁO CÁO TỔNG HỢP 1 TỔNG QUAN Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 với mục tiêu xây dựng nền chăn nuôi an toàn sinh học, bền vững được đề ra trong bối cảnh ngành còn đối mặt với nhiều khó khăn. Nhiều ý kiến cho rằng, quy mô nhỏ lẻ, bất cập trong khâu giống, phát triển vùng nguyên liệu cho chế biến thức ăn... là “rào cản” khiến mục tiêu trên khó thành hiện thực. Những năm qua, ngành chăn nuôi luôn giữ mức tăng trưởng cao, bình quân giai đoạn 2001-2006 tăng 8,5%/năm. Giá trị sản xuất chăn nuôi năm 2006 tăng trưởng 7,3% so với năm 2005. Tuy nhiên, năm 2007 chỉ đạt 4,6%, tỷ trọng của ngành tăng 24,1% (giảm 1,4% so với năm 2006). Việt Nam là nước nông nghiệp nên các nguồn nguyên liệu từ phụ phế liệu của ngành công nghiệp chế biến nông sản rất lớn, nếu sử dụng được nguồn nguyên liệu này để sản xuất thức ăn chăn nuôi sẽ mang lại hiệu quả kinh tế và lợi thế hơn nhiều so với các nguyên liệu khác. Một trong những hạn chế lớn nhất của sử dụng nguyên liệu từ phụ phế liệu nông nghiệp để sản xuất thức ăn chăn nuôi là những nguyên liệu này có tỷ lệ xơ cao, chính vì nhiều xơ nên chúng có tỷ lệ tiêu hóa và giá trị năng lượng thấp. Thú có dạ dày đơn khó tiêu hóa chất này do không sản xuất đủ lượng enzyme nội sinh cần thiết. Không những thế, chất xơ còn bao bọc các chất dinh dưỡng, hạn chế khả năng tiêu hóa, hấp thu dưỡng chất. Trong môi trường ruột, chất xơ hòa tan gây tăng độ nhớt và giữ nước bao phủ các nhung mao ruột, làm giảm khả năng tiêu hóa và hấp thu dưỡng chất của ruột. Ở Việt Nam nhiều tác giả đã nghiên cứu về các enzyme bổ sung thức ăn gia súc, đặc biệt là enzyme từ các chủng vi sinh vật nhưng các kết quả nghiên cứu này vẫn còn nhiều hạn chế, cho nên việc áp dụng các sản phẩm enzyme trong nước trong ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi vẫn chưa được cơ sở sản xuất thức ăn quan tâm. Nguyên nhân chủ yếu là do năng suất sinh tổng hợp của các enzyme tự nhiên còn thấp, chất lượng các enzyme tự nhiên không được cải biến bằng các kỹ thuật công nghệ sinh học hiện đại và hầu hết các chế phẩm enzyme bổ sung cho thức ăn chăn nuôi đã được các nhóm nghiên cứu đều ở dạng đơn enzyme. Chính vì vậy, mục tiêu của đề tài này là tạo ra các chủng tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp các enzyme trên với năng suất, hoạt lực cao; và cuối cùng là xây dựng được các quy trình sản xuất các enzyme tái tổ hợp và nguyên thủy năng suất cao và cuối cùng là lên men tạo chế phẩm đa enzyme bổ sung thức ăn cho gia súc. Enzyme thức ăn thường được gọi là enzyme ngoại sinh để phân biệt với enzyme nội sinh là những enzyme sinh ra trong cơ thể. Enzyme thức ăn làm tăng tỷ lệ tiêu hóa thức ăn và năng suất động vật theo hai cơ chế: 1. Kết hợp với enzyme nội sinh, phân giải các hợp chất thành những chất có kích thước đủ nhỏ để động vật dễ hấp thu. Như vậy, việc lựa chọn enzyme thức ăn sao cho có tác dụng hỗ trợ enzyme nội sinh trong việc phân giải chất dinh dưỡng của thức ăn là rất cần thiết; 2. Enzyme thức ăn phải giảm được độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hóa thức ăn, vì chính độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hóa cản trở sự hấp thu thức ăn. Một vài hợp chất khi giải phóng khỏi vách tế bào đã hình thành các gel làm tăng độ nhớt trong ruột. Thường các khẩu phần chứa nhiều polysaccharide không phải tinh bột (nonstarch polysaccharide, NSP) gây ra hiện tượng này. Động vật non, đặc biệt là gia cầm rất nhạy cảm với sự biến đổi độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hóa. Để tăng cường hai cơ chế trên, enzyme thức ăn thường được sản xuất dưới dạng những chế phẩm đa enzyme để phân giải đồng thời nhiều hợp chất. Ví dụ: nếu dùng β-glucanase thì chỉ phá vỡ được vách nội nhũ của hạt đại mạch mà không phân giải được protein chứa trong tế bào chất, để phân giải được protein trong lớp tế bào chất này phải cần thêm cả cellulase và pentosanase. Ngoài ra, phải đặc biệt quan tâm tới mối quan hệ tương tác giữa enzyme với các nguyên liệu khác nhau trong khẩu phần. 1 Trong dinh dưỡng động vật dạ dày đơn, việc bổ sung các chế phẩm enzyme trong khẩu phần được ứng dụng khá rộng rãi. Tác dụng chính của chúng là cải thiện khả năng tiêu hóa, ngăn cản các tác hại của các chất kháng dinh dưỡng có trong khẩu phần, đồng thời giảm thiểu các chất dinh dưỡng dư thừa bài thải ra môi trường. Từ đó sẽ góp phần cải thiện năng xuất vật nuôi, nâng cao hiệu qủa kinh tế và giảm ô nhiễm môi trường (Wen, 1992; Thacker, 1993; Thacker and Baas, 1996). Trong các khẩu phần cho động vật dạ dày đơn, ngũ cốc thường chiếm tỷ lệ khá lớn, từ 50-65% mà trong thành phần của chúng chứa các nhóm non-starch polysaccharide (NSP) (ß-glucan; arabino-xylans; pentosans; triticale) là những hợp chất cơ thể động vật không tiêu hóa được. Ngoài ra chúng còn làm giảm khả năng tiêu hóa, hấp thu các chất dinh dưỡng khác do làm tăng độ nhớt của đường tiêu hóa (Campbell and Bedford, 1992; Friesen et al., 1992; Boros et al., 1995). Nhiều nghiên cứu đã chứng minh là bổ sung hỗn hợp các enzyme xylanase; cellulose; alpha-amilase; protease vào trong khẩu phần ngũ cốc có tác dụng đáng kể trong việc cải thiện tăng trọng, giảm chi phí thức ăn, nâng cao tỷ lệ tiêu hóa năng lượng, protein và acid amin trong khẩu phần so với không bổ sung (Gdala et al., 1997; Yin et al., 2000; Barrera et al., 2003). 1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Nghiên cứu trên thế giới về các enzyme sử dụng bổ sung thức ăn chăn nuôi đã tiến được bước dài. Những enzyme sử dụng bổ sung thức ăn chăn nuôi đã được nhiều công ty hàng đầu trên thế giới sản xuất từ hai chục năm nay, đã được ứng dụng thường quy ở những nước công nghiệp phát triển như Mỹ, Tây/Đông Âu, Nhật Bản và Trung Quốc. Tuy nhiên những nghiên cứu về các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi vẫn được tiếp tục theo một số hướng chính sau đây như Marquardt (Dept. of Animal Science, University of Manitoba, Winnpeg, Manitoba R3T 2N2, Canada) và Brufau (IRTA, Department of Animal Nutrition, Centre de Mas Bove, Apartat 41 5 Reus, Spain) nhận định trong bài tổng quan “Future of feed enzymes: Orientation and perspectives” đăng trên “CIHEAM - Options Mediterraneennes”. Sử dụng enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi đã có một tác động mạnh mẽ tới việc sử dụng các nguyên liệu thức ăn trong ngành chăn nuôi động vật, đặc biệt trong gia cầm và đặc biệt với thức ăn ngũ cốc như lúa mạch và lúa mỳ. Nghiên cứu và phát triển trong tương lai sẽ tiếp tục được ngành công nghiệp ủng hộ ở mức độ ngày càng tăng trong một lĩnh vực mở rộng. Theo Marquardt và Brufau, một số lĩnh vực tương lai cần tiếp tục nghiên cứu sẽ là: 1. Cải thiện chất lượng và hiệu quả của các enzyme hiện có trên thị trường theo hướng quan tâm tới giá thành, độ bền nhiệt, chống chịu thủy phân và nâng cao hoạt tính trong các bộ phận đích của bộ máy tiêu hóa ruột – dạ dày. 2. Mở rộng sử dụng enzyme trong thức ăn cho gia cầm, thú nuôi bản địa bao gồm các loại gia cầm khác gà, lợn, cá và thú ngoại như cá sấu, rùa, baba, ếch. 3. Mở rộng ra các loại enzyme khác như lipase, protease, amylase, cũng như được sử dụng bằng công nghiệp công nghệ sinh học. 4. Chọn lọc và thiết kế các nguồn lựa chọn khác về enzyme cải biến di truyền cho cơ chất và động vật đặc thù. Bao gồm các enzyme được sản xuất trong vi sinh vật, hạt thực vật và ngay bản thân trong động vật bằng công nghệ DNA tái tổ hợp. 5. Mở rộng phổ nguyên liệu làm thức ăn có thể được xử lý bằng enzyme. 6. Phát triển và chuẩn hóa các qui trình để đánh giá các chế phẩm enzyme khác nhau. 7. Tiếp tục nghiên cứu cách thức sao cho enzyme tạo ra được những tác dụng có lợi. 8. Phát triển các mô hình để tiên đoán đáp ứng đối với các enzyme trong mọi lớp động vật chăn nuôi và với mọi nguyên liệu làm thức ăn để tạo điều kiện dễ dàng cho các nghiên cứu về giá thành – lợi nhuận. 2 9. Nghiên cứu tác động của enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi làm giảm ô nhiễm môi trường, phân chia dinh dưỡng và thay đổi đáp ứng nội tiết tố và tình trạng sức khỏe của động vật. Rõ ràng nghiên cứu và sản xuất enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi sẽ không ngừng phát đạt, tăng tốc và thu được nhiều lợi nhuận. Lĩnh vực hấp dẫn của nghiên cứu sẽ tập trung vào nghiên cứu và phát triển dinh dưỡng động vật trong tương lai. Các hướng nghiên cứu (1-3) là những hướng nghiên cứu tương đối cổ điển: đánh giá tác dụng của các loại enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi thương mại hoặc các enzyme đang nghiên cứu trong phòng thí nghiệm lên năng suất chăn nuôi lợn, bò sữa, gà vịt, ngan ngỗng, gà tây hoặc lên năng suất thu trứng và vắt sữa và mở rộng sang tất cả các động vật chăn nuôi còn lại như cừu, dê, ngựa, cá, rùa và tất cả các loại động vật chăn nuôi khác. Các nghiên cứu này nhằm đánh giá từng enzyme đơn lẻ một hoặc đánh giá hiệu quả chăn nuôi khi bổ sung cùng một lúc nhiều enzyme khác nhau. Các nguồn lựa chọn khác về enzyme (4) bao gồm: (4.1): Tìm kiếm những các nguồn vi sinh vật mới tổng hợp ra các enzyme này, tối ưu nuôi cấy, lên men, sản xuất, tinh sạch và đánh giá tính chất hóa lý. Hai hướng nghiên cứu tuy có vẻ cổ điển, nhưng họ sử dụng nhiều phương pháp hiện đại hơn để đánh giá chính xác hơn như sử dụng phương pháp phân tử 16S, 18S, 26S hoặc 28S rRNA để phân loại vi sinh vật, sử dụng các loại kít có cột sắc ký hoặc kích thước lỗ để tinh sạch enzyme sử dụng vào việc đánh giá tính chất hóa lý. (4.2): Tạo ra các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi tái tổ hợp từ các enzyme đã biết nhằm mục đích nâng cao năng suất hoặc tạo ra các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi cải biến từ những enzyme đã có nhằm nâng cao hoạt tính thủy phân đặc hiệu. (4.3): Nhắm tới một tương lai xa hơn là chuyển gene mã hóa các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi này vào những cây trồng để tạo ra nguồn sản xuất thức ăn chăn nuôi sau này đã có sẵn các loại enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi, mà không cần phải bổ sung nữa. Đây là một hướng rất mới trong vòng dăm năm lại đây. Các hướng nghiên cứu liên quan tới enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi khác như (5) Mở rộng phổ nguyên liệu làm thức ăn; (6) Chuẩn hóa các qui trình đánh giá enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi; (7) Tìm các ưu điểm khác của enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi; (8) Phát triển mô hình để đáp ứng đối với enzyme bổ sung cũng như (9) Các nghiên cứu về giảm ô nhiễm môi trường sẽ không được đề cập trong phần tổng quan này do chúng ít liên quan hơn tới nội dung thực hiện đề tài. Ngoài ra cũng liên quan tới đề tài là tổng quan tình hình sản xuất các loại enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi của các công ty trên thế giới. Thông thường khi các nghiên cứu ở các hướng trên đã hoàn thiện, các nhà nghiên cứu đăng ký patent và các công ty sản xuất enzyme thức ăn chăn nuôi họ săn lùng, mua bản quyền, sản xuất, tiếp thị và thương mại hóa sản phẩm. Để có thể cạnh tranh tốt hơn, chính bản thân các công ty còn sẵn sàng đầu tư trực tiếp vào các nghiên cứu định hướng ứng dụng trong các trường đại học, các viện nghiên cứu để đón đầu các patent, hoặc họ cũng lập ra các viện nghiên cứu riêng độc lập. Có hàng nghìn công bố trên thế giới về các hướng nghiên cứu này. Tuy nhiên để phân tích, đánh giá tình hình nghiên cứu trên thế giới, chúng tôi chỉ đưa ra những công trình tiêu biểu và cập nhật nhất để thấy rằng các hướng nghiên cứu này vẫn tiếp tục tồn tại song song với nhau. 1.1.1 Cải thiện chất lượng và hiệu quả sử dụng enzyme Trong một nghiên cứu của Barrera et al. (2003) về khả năng tiêu hóa amino acid và chăn nuôi lợn bằng thức ăn bổ sung xylanase đã rút ra kết luận sự bổ sung xylanase vào thức ăn chăn nuôi trong đó lúa mỳ là nguồn cung cấp protein và năng lượng duy nhất đã cải thiện được các chỉ số AID (khả năng tiêu hóa rõ ràng ở ruột hồi, apparent ileal destibility) của 3 amino acid, ADG, và tỷ lệ thức ăn : tăng trọng; tuy nhiên, sự cải thiện này ít hơn khi bổ sung amino acid tổng hợp (Barrera et al., 2003). Omogbenigun et al. (2004) đã bổ sung các chế phẩm đa enzyme vào thức ăn của lợn con và thấy rằng các chế phẩm multienzyme đã cải thiện hiệu quả sử dụng dinh dưỡng và tốc độ sinh trưởng của lợn cai sữa. Đây là công thức thân thiện môi trường và hiệu quả kinh tế cao đối với thức ăn cho lợn con (Omogbenigun et al., 2004). Cowieson và Adeola (2005) đã đánh giá các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi carbohydrase, protease, và phytase. Họ thấy rằng các enzyme này có một tác dụng hỗn hợp trong thức ăn chăn nuôi gà giò khi đồng thời cho bổ sung cùng các enzyme với nhau. Họ kết luận sử dụng phytase và XAP (xylanase, amylase, phytase) đồng thời trong thức ăn cho gà giò sẽ có hiệu quả kinh tế và có thể thu lợi nhuận khi chăn nuôi gia cầm (Cowieson and Adeola, 2005). Sieo et al. (2005) đã đánh giá mức độ ảnh hưởng của các chủng Lactobacillus tái tổ hợp sinh tổng hợp β-glucanase lên các tính chất của hệ tiêu hóa và sự di chuyển thức ăn ở gà giò. Sự bổ sung các chủng Lactobacillus biến nạp vào thức ăn chăn nuôi đã cải thiện được các tính chất của hệ tiêu hóa đồng thời nâng cao tốc độ di chuyển thức ăn trong ruột của gà giò (Sieo et al., 2005). Slominski et al. (2006) đã sử dụng công nghệ enzyme để cải thiện tình trạng sử dụng năng lượng từ các hạt có dầu cho gia cầm. Họ đã đánh giá các công thức bổ sung enzyme riêng lẻ khác nhau và tổ hợp từ các enzyme cellulose, xylanase, glucanase, pectinase, mannanase. Bổ sung carbohydrase đa hoạt tính có thể được sử dụng làm công thức để cải thiện tình trạng sử dụng năng lượng từ hạt lanh nhiều dầu, do đó nâng cao được giá trị dinh dưỡng cho gia cầm (Slominski et al., 2006). Trong một nghiên cứu tương tự trước đó (Meng et al. 2006) nhưng đối với hạt cải dầu, họ kết luận mặc dù tác dụng enzyme lên tiêu hóa mỡ ở hệ tiêu hóa ruột mề ở mức độ rất đáng kể, các chỉ số khác cũng cho thấy cải thiện đáng kể chỉ khi tỷ lệ thể vùi enzyme cao được sử dụng. Số liệu này củng cố sự cần thiết bổ sung enzyme carbohydrase cho thức ăn gia cầm có hạt cải có nhiều dầu. Olukosi et al. (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng liên quan tới thời gian chăn nuôi của dịch chiết xylanase, amylase, và protease hoặc phytase đơn lẻ hoặc kết hợp với nhau trong chăn nuôi gà giò. Nghiên cứu này chỉ ra rằng sự kết hợp XAP (xylanase, amylase, và protease) và phytase đã cải thiện tình hình chăn nuôi. Cả XAP lẫn phytase đều có hiệu quả trong việc cải thiện tiêu hóa phosphorus và duy trì gà giò hấp thụ dinh dưỡng bột ngô – đậu nành. Số liệu này cũng cho thấy gà giò hấp thụ tốt hơn từ bổ sung enzyme ở độ tuổi non hơn và sự đóng góp của enzyme vào việc lưu giữ dinh dưỡng giảm theo độ tuổi của gà giò (Olukosi et al., 2007). Nsereko et al. (2002) đã nghiên cứu chế phẩm enzyme thủy phân xơ (xylanase và glucanase) trong khẩu phần ăn của bò sữa cho thấy bổ sung enzyme thủy phân xơ tăng số lượng vi khuẩn dạ cỏ sử dụng các hemicellulose và sản phẩm thứ cấp của dịch thủy phân cellulose (Nsereko et al., 2002). Balci et al. (2007) đã nghiên cứu tác động của các enzyme phân hủy chất xơ ngoại sinh lên quá trình tích mỡ của bò đực. Các kết quả thu nhận được từ nghiên cứu này cho thấy bò đực được cho ăn thức ăn bổ sung enzyme tăng trọng hàng ngày, tăng trọng tổng thể và tỷ lệ chuyển hóa thức ăn cao hơn (Balci et al., 2007). Mục đích nghiên cứu của Wu et al., 2005 là đánh giá tác dụng của β-mannanase lên gà Leghorns thương mại cho ăn thức ăn hạt đậu tương. Sự chuyển hóa thức ăn trung bình của gà mái được cho ăn thức ăn năng lượng thấp bổ sung β-mannanase tương tự như gà mái cho ăn thức ăn năng lượng cao, và cả hai đều thấp hơn đáng kể so với gà mái cho ăn thức ăn năng lượng thấp không có β-mannanase. Bổ sung β-mannanase tăng đáng kể sản xuất trứng và trọng lượng trứng trung bình của gà mái được cho ăn thức ăn năng lượng thấp. Bổ sung β4 mannanase đã cải thiện sử dụng năng lượng của thức ăn đậu tương ngô bắp và có khả năng giảm giá thành thức ăn cho gà đẻ chứa β-mannan (Wu et al., 2005). Trong một nghiên cứu, Ciftci et al. (2005) đã đánh giá tác dụng của phytase vi khuẩn bổ sung vào thức ăn chăn nuôi lên khối lượng thức ăn lấy vào, số lượng trứng đẻ và hiệu quả thức ăn trong gà mái đẻ trứng. Tuy nhiên, trọng lượng gà trước và sau khi cho ăn rất giống nhau ở mọi lô thí nghiệm. Nhưng bổ sung phytase vi khuẩn đã cải thiện được tỷ lệ đẻ trứng rõ ràng (Ciftci et al., 2005). Rengasayee et al. (2005) đã tối ưu các thông số vận hành để sản xuất xylanase sử dụng chủng tự nhiên Aspergillus bằng lên men mẻ chìm sử dụng thiết bị bán tự động. Đây là thí nghiệm đầu tiên sử dụng chủng nấm sợi để sản xuất enzyme ở Công ty Spic Biotech Ltd. (nhà sản xuất chính các enzyme công nghiệp ở Ấn Độ), mà cho tới nay chỉ được sử dụng nuôi cấy vi khuẩn. Sau khi lên men một số mẻ 200 lít để thu được các thông số về tốc độ khuấy, sục khí, pH, độ nhớt, thể tích, hoạt tính enzyme, nhiệt độ, họ đã nâng lên quy mô lên men 1500 lít rồi 9000 lít để sản xuất enzyme (Rengasayee et al., 2005). 1.1.2 Tìm các nguồn enzyme mới Mặc dù trên thế giới đã có hàng trăm công ty sản xuất các loại enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi và bán trên thị trường, nhưng các phòng thí nghiệm trên thế giới vẫn không ngừng nghiên cứu, tìm tòi các enzyme cùng loại nhưng từ những chủng chưa ai nghiên cứu tới để tìm ra các ưu thế vượt trội hoặc tìm ra các giải pháp thay thế, vướng mắc trong việc mua bán bản quyền, vần đề cạnh tranh giữa các công ty. Boyce và Walsh (2007) đã sản xuất, tinh sạch và đánh giá định hướng ứng dụng βglucanase từ Rhizomucor miehei DSM 1330. Họ sử dụng môi trường cám lúa mỳ cho sinh trưởng và cảm ứng sinh tổng hợp β-glucanase ngoại bào từ R. miehei. Enzyme được tinh sạch đồng nhất. Tính đặc hiệu cơ chất và độ tương đồng protein cho thấy đây là một endo-1,3(4)β-glucanase (EC 3.2.1.6). Enzyme này có tiềm năng ứng dụng cho thức ăn chăn nuôi gia cầm. Nó có hoạt tính đáng kể ở dãy pH pH 2,6-6,5 đặc trưng của bộ máy tiêu hóa loài chim. Enzyme cũng bền nhiệt hơn các loại β-glucanase thương mại đang có, đặc biệt khi hâm nóng ở nồng độ enzyme cao, và giữ được hoạt tính còn lại gấp hai lần so với những enzyme thương mại khi cho tiếp xúc ở các điều kiện của bộ máy tiêu hóa loài chim mô phỏng. Trước đây, chưa có thông báo nào về sản xuất, tinh sạch và đánh giá β-glucanase từ Rhizomucor, và các tính chất hóa lý định hướng ứng dụng tạo cho enzyme này thích hợp để sử dụng trong thức ăn chăn nuôi (Boyce and Walsh, 2007). Singh và Satyanarayana (2006) đã nghiên cứu sinh tổng hợp phytase bởi chủng nấm mốc ưa nhiệt Sporotrichum thermophile trong lên men trạng thái rắn và ứng dụng của nó trong việc khử phytine của bánh dầu vừng. Họ đã tìm ra chủng mốc S. thermophile TLR50 có khả năng sản xuất phytase trong mọi thành phần thức ăn chăn nuôi sử dụng thông thường được khảo sát ở mức độ khác nhau khi ủ men pha rắn. Sản xuất enzyme tăng từ 180 U/g dư lượng mốc khô (dry moldy residue, DMR) trong bánh dầu vừng trong 120 giờ ở 45°C với tỷ lệ cơ chất – độ ẩm ban đầu 1:2,5. Bổ sung glucose và tiếp theo ammonium sulfate vào bánh dầu vừng làm cho phytase tiết ra cao hơn (282 IU/g DMR). Sinh tổng hợp phytase tăng lên 76% khi tối ưu. Mốc tiết ra acid phosphatase, amylase, xylanase, và lipase cùng với phytase. Nhờ hoạt tính của phytase, phosphate vô cơ được giải phóng có hiệu quả, dẫn tới khử phytate bánh dầu vừng (Singh and Satyanarayana, 2006). Li et al. (2006) đã tinh sạch và đánh giá tính chất β-mannanase từ Bacillus subtilis B36. pH và nhiệt độ tối ưu cho MANB36 là 6,4 và 50°C. MANB36 tương đối bền nhiệt ở 60°C và hoạt tính riêng là 928 IU/mg. Các cation kim loại (trừ Hg2+ và Ag+), EDTA và 2mercaptoethanol (2-ME) không có tác dụng đối với hoạt tính enzyme. Enzyme này có tính đặc hiệu cao với locust bean gum (LBG) thay thế galactomannan (Li et al., 2006). 5 1.1.3 Tạo ra các enzyme tái tổ hợp với năng suất cao chất lượng mới Hướng tạo ra các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi tái tổ hợp có ba mục tiêu chính là nâng cao năng suất tổng hợp, hoạt tính riêng và chuyển enzyme sinh tổng hợp từ tế bào chủ gây độc sang tế bào chủ không độc hại đối với động vật chăn nuôi hoặc từ tế bào chủ khó lên men, môi trường đắt tiền sang tế bào chủ dễ lên men, tận dụng được các phế thải nông công nghiệp. Các công trình về nhân dòng và biểu hiện các enzyme cùng loại với các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi trên thế giới thì nhiều vô kể, nhưng các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi cũng được nhiều nhóm nghiên cứu nhân dòng, biểu hiện năng suất cao và đăng ký bản quyền. Sau đây là những ví dụ thật tiêu biểu. Onderci et al. (2006) đã đánh giá hiệu quả của E. coli sinh tổng hợp α-amylase từ Bacillus stearothermophilus sự phát triển, sử dụng thức ăn và hình thái của ruột non của gà giò cho ăn ngô. Gà được uống nước E. coli tái tổ hợp tăng trọng hằng ngày và cải thiện sự chuyển hóa thức ăn. Cuối thí nghiệm, gà được uống nước chứa E. coli ăn nhiều hơn, lớn nhanh hơn và chuyển hóa thức ăn tốt hơn gà đối chứng không cho uống. Sự hiện diện của vi khuẩn cũng cải thiện sự tiêu hóa các hợp chất hữu cơ. Tuy nhiên, không có tác dụng đối với dầu mỡ. Bổ sung E. coli làm giảm trọng lượng tụy tương đối, nhưng không ảnh hưởng trọng lượng gan và độ dài của hệ thống ruột – mề. Độ dài lông nhung và chân lông thì tăng lên đối với bổ sung vi khuẩn. Sự có mặt của gene hemoglobin vi khuẩn không gây sự khác biệt nào đáng kể mà quan sát thấy. Số liệu này cho thấy bổ sung E. coli có khả năng sinh tổng hợp αamylase đã cải thiện khả năng tiêu hóa thức ăn và tốc độ sinh trưởng của gà giò cho ăn ngô (Onderci et al., 2006). Sieo et al. (2005) đã đánh giá sự ảnh hưởng của các chủng tái tổ hợp Lactobacillus sinh β-glucanase lên các tính chất hệ thống tiêu hóa và tốc độ đưa thức ăn ở gà giò. Bổ sung các chủng Lactobacillus biến nạp vào thức ăn gà giò làm giảm đáng kể độ keo nhớt dịch ruột 2146% so với gà cho ăn thức ăn không được bổ sung hoặc bổ sung các chủng Lactobacillus tự nhiên. Trọng lượng tương đối của tụy, gan, hệ thống ruột mề, ruột kết giảm 6-27%, và độ dài tương đối của hệ thống ruột mề giảm 8-15%. Kiểm tra mô học của các mô tiêu hóa ruột mề cho thấy rằng chiều cao lông nhung ruột của gà được cho ăn với các chủng Lactobacillus cao hơn đáng kể so với gà cho ăn kiểu khác. Các chủng Lactobacillus biến nạp giảm thời gian thức ăn đi 2,2 giờ. Bổ sung các chủng Lactobacillus tái tổ hợp vào thức ăn đã cải thiện các tính chất hệ thống tiêu hóa và thời gian đi của thức ăn trong gà giò (Sieo et al., 2005). Liu et al. (2006) đã biểu hiện thành công peptide trưởng thành của xylanase A chủng Aspergillus niger (AnxA) trong Pichia pastoris với năng suất cao dưới sự kiểm soát của AOX1 promoter. AnxA tái tổ hợp (reAnxA) được tiết vào môi trường nuôi cấy. Sau 96 giờ cảm ứng 0,25% methanol, hoạt tính reAnxA trong dịch nuôi cấy đạt đỉnh cao, 175 IU/mg, gấp 1,9 lần so với protein tự nhiên AnxA (92 IU/mg). Nhiệt độ và pH tối ưu của reAnxA lần lượt là 50°C và 5. reAnxA bền ở dãy pH rộng 3-8. Sau khi ủ ở pH 3-8, 25°C trong 1 giờ, hoạt tính còn lại của reAnxA đều trên 80%. Các giá trị Km và kcat đối với reAnxA lần lượt là 4,8 mg/ml và 123,2/s. Phân tích HPLC cho thấy rằng xylotriose là sản phẩm thủy phân chủ yếu của xylan bạch dương và từ cám không tan bởi reAnxA (Liu et al., 2006). Chantasingh et al. (2006) đã nhân dòng và đọc trình tự gene xylanase đầy đủ, mã hóa 326 amino acid thuộc họ glycosyl hydrolase nấm số 10, từ Aspergillus terreus BCC129. 25 amino acid đầu tiên của enzyme này là một peptide tín hiệu. Gene xylanase trưởng thành 906 bp được nhân dòng vào vector pPICZαA biểu hiện ở P. pastoris. Băng 33 kDa xuất hiện trên SDS-PAGE gel sau một ngày cảm ứng methanol. Enzyme biểu hiện được tinh sạch bằng sắc ký lọc gel. Xylanase tái tổ hợp tinh sạch cho hoạt tính tối ưu ở 60°C, pH 5 và Km 4,8±0,07 mg/ml và Vmax 757±14,54 µmol/phút mg, sử dụng xylan bạch dương làm cơ chất. Ngoài ra, enzyme tinh sạch có độ bền pH rộng 4-10 khi ủ ở 40°C trong 4 giờ (Chantasingh et al., 6 2006). Enzyme này giữ được 90% hoạt tính khi ủ ở 50°C, 30 phút. Nó có tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp thức ăn chăn nuôi và bột giấy. α- amylase (EC 3.2.1.1) từ chủng Gram dương Alicyclobacillus acidocaldarius là một enzyme ưa acid nhiệt, với nhiệt độ và pH tối ưu lần lượt là 75°C và 3 (Yuan et al., 2005). Trình tự nucleotide của gene amy được nhân dòng bằng PCR. Gene amy (3901bp) gồm một khung đọc mở mã hóa một polypeptide (1301 aa). Khối lượng tính toán của α-amylase AMY ~140 kDa. Gene amy được biểu hiện ở E. coli BL21 (DE3) và P. pastoris đều có hoạt tính sinh học. Hoạt tính amylase biểu hiện trong P. pastoris được chứng minh bằng nhuộm hoạt tính amylase. α-amylase biểu hiện trong P. pastoris được tinh sạch và đánh giá tính chất. Khối lượng phân tử rõ ràng ~160 kDa trên SDS-PAGE. pH tối ưu của enzyme là pH 3,2 như enzyme tự nhiên; nhưng nhiệt độ tối ưu là 65°C thấp hơn một chút so với enzyme tự nhiên. Khoảng 50% hoạt tính tương đối giữ được sau khi ủ 30 phút ở 70°C. Như vậy enzyme biểu hiện trong P. pastoris cũng là ưa acid nhiệt. Ngoài ra trình tự được nhân dòng bằng PCR, nằm từ +1174 bp đến +3288 bp trên gene amy, mã hóa 705 aa với khối lượng phân tử tính toán 79 kDa. Gene cắt bới đầu amy' được biểu hiện trong E. coli BL21 (DE3), cảm ứng bởi 1 mM IPTG, cũng giữa nguyên hoạt tính α-amylase. Phytase có thể làm tăng giá trị dinh dưỡng của thức ăn khi giải phóng ra phosphate vô cơ từ phytate, dạng dự trữ chính của phosphorus ở thực vật. Phytase (phyC) từ chủng Bacillus subtilis VTT E-68013 được biểu hiện ở Lactobacillus plantarum chủng 755 sử dụng tín hiệu tiết từ Lact. amylovorus (Kerovuo and Tynkkynen, 2000). Trong dịch nuôi cấy qua đêm trong môi trường MRS chứa cellobiose để cảm ứng α-amylase promoter, phytase hoạt động xúc tác được tiết ra như một protein ngoại bào chủ yếu. Tuy nhiên, phân tích lai Western cho thấy phytase được cải biến và không cải biến trong dịch tế bào. Các thí nghiệm xung đuổi chỉ ra rằng phytase tái tổ hợp được tiết ở tốc độ chậm hơn so với các protein tự nhiên của Lact. plantarum 755. Năm 2006, Li et al. đã đọc trình tự, nhân dòng gene và biểu hiện β-mannanase chủng Bacillus subtilis B36 trong E. coli MANB36. Gene mã hóa MANB36, manB36, được nhân dòng bằng PCR và đọc trình tự. manB36 chứa một khung đọc mở (ORF) gồm 1104 bp mã hóa cho một protein dài 367 aa. Khối lượng phân tử dự tính 38,13 kDa, tính theo protein suy diễn của gene manB36 không có peptide tín hiệu, phù hợp với khối lượng phân tử rõ ràng 38 kDa của MANB36 tinh sạch được ước lượng bằng SDS-PAGE. Protein chín MANB36 được biểu hiện trong E. coli BL21 và mannanase biểu hiện có hoạt tính sinh học bình thường (Li et al., 2006). Không chỉ dừng ở mức độ tạo ra các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi tái tổ hợp, các nhóm nghiên cứu trên thế giới còn đi xa hơn một bước nữa là cải biến các enzyme đang có bằng các công nghệ DNA tái tổ hợp và công nghệ protein. Ở đây, chúng tôi đưa ra ví dụ thật tiêu biểu theo hướng này, đó là các công trình của (Teng et al., 2007 ) về cải tạo các codon của gene mã hóa β-1,3-1,4-glucanase tái tổ hợp từ Bacillus licheniformis EGW039 để biểu hiện năng suất cao trong P. pastoris (Teng et al., 2007 ) và công trình thứ hai của (Yang et al., 2006 ) tạo ra xylanase TB dung hợp từ đầu C của Streptomyces olivaceoviridis xylanase XYNB với đầu N của Thermomonospora fusca xylanase TfxA (Yang et al., 2006 ). Beta-1,3-1,4-glucanase (EC3.2.1.73), một enzyme công nghiệp quan trọng được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp lên men và bổ sung thức ăn chăn. Để cải thiện hiệu quả biểu hiện của β-glucanase tái tổ hợp từ B. licheniformis EGW039 (CGMCC 0635) trong P. pastoris GS115 chuyển hóa gốc methyl, trình tự DNA mã hóa β-glucanase được thiết kế và tổng hợp dựa vào hệ thống codon của P. pastoris, các codon mã hóa 96 amino acid được tối ưu, trong đó 102 nucleotide được thay đổi, tỷ lệ G+C được tăng lên đồng thời từ 43,6 lên 45,5% (Teng et al., 2007 ). Ở mức độ bình lắc, hoạt tính β-glucanase lần lượt là 67,9 và 52,3 IUml/1 với 7 beta-glucan lúa mạch và lichenan làm cơ chất. Ở quy mô lên men phòng thí nghiệm, nồng độ protein tiết ra vào khoảng 250 mg/l. Hoạt tính β-glucanase lần lượt là 334 và 257 IU/ml với beta-glucan lúa mạch và lichenan làm cơ chất; tuy nhiên, không hoạt tính enzyme về cellulose được quan sát thấy. So với đối chứng không tối ưu, mức độ biểu hiện của βglucanase tối ưu dựa trên các codon thích hợp trong P. pastoris cao gấp 10 lần. Enzyme được tối ưu codon chiếm khoảng 53,8% protein tiết ra tổng số. Độ acid và nhiệt độ và tối ưu của enzyme tái tổ hợp này lần lượt là pH 6 và 45°C. Xylanase TB lai được thiết kế bằng cách thay thế phân đoạn đầu N của S. olivaceoviridis xylanase XYNB với vùng tương ứng của Thermomonospora fusca xylanase TfxA (Yang et al., 2006 ).Gene lai tb, mã hóa TB, được biểu hiện đúng ở E. coli BL21 và P. pastoris GS115. TB được tinh sạch và đánh giá tính chất. Nhiệt độ và pH tối ưu của TB là 70°C và 6, rõ ràng được cải thiện hơn so với XYNB. Độ bền nhiệt TB cao gấp 6 lần so với XYNB sau khi ủ các dịch enzyme ở 80°C và 90°C trong 3 phút. Độ bền pH của TB thấp hơn 5-9 lần so với của XYNB. Tuy nhiên, TB vẫn có hoạt tính riêng cao như XYNB. Phân tích độ tương đồng trình tự để tìm ra các yếu tố ảnh hưởng tới tính chất và mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của enzyme TB. 1.1.4 Chuyển gene mã hóa enzyme vào thực vật Có thể nói ý tưởng chuyển gene mã hóa enzyme bổ sung trực tiếp vào thực vật, nguồn sản xuất thức ăn chăn nuôi sau này là một ý tưởng hay, đón đầu tương lai. Trong một tương lai gần, ngay bản thân nguồn sản xuất thức ăn chăn nuôi đã chứa rất nhiều enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi rồi, thì người ta không còn phải sản xuất enzyme bổ sung riêng nữa. Hiện nay, trên thế giới người ta đã tiến rất sâu theo hướng nghiên cứu này, tới giai đoạn đánh giá các loại thức ăn đã chuyển gene mã hóa enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi lên năng suất chăn nuôi động vật. Giá trị dinh dưỡng thấp của hạt lúa mạch đối với gia cầm là nguyên nhân của sự vắng mặt của một enzyme ruột để khử polymer hiệu quả (1, 3-1,4)-beta-glucan, một polysaccharide chính trong thành tế bào nội nhũ. Điều này dẫn tới độ nhớt cao trong ruột, hạn chế hấp thụ dinh dưỡng, làm giảm tốc độ sinh trưởng, và phân gia cầm keo dính mất vệ sinh dính vào gia cầm và nền chuồng trại chăn nuôi. Cho nên, 7,5 tỷ gà giò sản xuất hàng năm ở Hoa Kỳ được nuôi chủ yếu bằng thức ăn ngô và đậu nành (von Wettstein et al., 2000). Với lý do trên, họ đã cải thiện thức ăn lúa mạch cho gà giò với mạch nha chuyển gene chứa (1,3-1,4)-β-glucanase bền nhiệt. Họ đã bổ sung vào lúa mạch bình thường 6,2% mạch nha chuyển gene chứa β-glucanase ưa nhiệt (4,28 µg/g protein hòa tan) cung cấp đạt trọng lượng tương đương với thức ăn ngô. Số gà đi phân dính đã giảm hẳn. Ruột và phân của gà cho ăn lúa mạch đối chứng chứa một hàm lượng lớn (1,3-1,4)-β-glucan hòa tan, và lần lượt giảm xuống 75 và 50% khi bổ sung mạch nha chuyển gene vào thức ăn (von Wettstein et al., 2000). Hàm lượng enzyme tái tổ hợp hoạt động trong ruột non tương ứng với sự có mặt trong thức ăn, cao gấp 11 lần trong manh tràng và 7,5 trong phân. Beta-glucanase glycosyl hóa phân lập từ manh tràng có nguồn gốc từ mạch nha chuyển gene. Như vậy có thể đưa các enzyme tái tổ hợp riêng lẻ từ mạch nha chuyển gene vào nhiều bộ phận khác nhau của bộ máy tiêu hóa ruột-mề của gà và đánh giá hiệu quả trao đổi chất của thành phần đã trộn enzyme đích (von Wettstein et al., 2000). Thức ăn là lúa mạch bình thường bổ sung lúa mạch chuyển gene biểu hiện β-glucanase ưa nhiệt cải biến từ Bacillus trong quá trình nảy mầm có thể tăng trọng lượng gà giò so với thức ăn ngô hạt. Nó cũng giảm mạnh số gà đi phân dính, nhưng chưa loại hoàn toàn phân dính. Trong một nghiên cứu tiếp theo von Wettstein et al. (2003) đã xác định xem liệu hàm lượng mạch nha chuyển gene cao hơn có thể giảm tiếp phân dính không. Một mục tiêu khác nhằm nghiên cứu khả năng sử dụng hạt chuyển gene β-glucanase ưa nhiệt trưởng thành bổ sung 8 thức ăn và so sánh thức ăn chứa hạt chuyển gene với thức ăn được bổ sung một hàm lượng βglucanase thương mại nhất định. Bổ sung 75 hoặc 151 g/kg mạch nha chuyển gene chứa 4,7 hoặc 98 mg/kg β-glucanase ưa nhiệt vào 545 hoặc 469 g/kg lúa mạch không chuyển gene làm tăng trọng lượng gà giò Cornish Cross như thức ăn ngô sử dụng hiện nay. Gene mã hóa enzyme được biểu hiện trong hạt aleurone với một promoter của gene α-amylase lúa mạch và enzyme được tổng hợp với peptide tín hiệu để tiết vào nội nhũ của hạt mạch nha (von Wettstein et al., 2003). Trọng lượng cũng đạt tương đương khi cho thức ăn bao gồm 39 g/kg hạt lúa mạch chuyển gene (chứa 66 mg/kg β-glucanase ưa nhiệt) và 581 g/kg lúa mạch không chuyển gene thay cho ngô hạt. Ở đây, gene mã hóa enzyme được biểu hiện với promoter của gene D-hordein (Hor3-1) trong quá trình chín hạt. Enzyme được tổng hợp dưới dạng tiền thân có peptide tín hiệu vaccine đi qua lưới nội chất vào các không bào dự trữ. Enzyme được cất dưới dạng protein dự trữ prolamin của nội nhũ, bảo vệ nó không bị phân hủy trong quá trình tế bào chết theo lập trình của nội nhũ ở giai đoạn cuối của quá trình chín hạt và tạo ra độ bền nhiệt khác thường. Một lượng lớn β-glucanase hoạt tính cao trong hạt chín cho phép giảm thành phần hạt chuyển gene xuống còn 0,2 g/kg thức ăn như các muối khoáng được bổ sung vào thức ăn chuẩn (von Wettstein et al., 2003). Bổ sung hạt chuyển gene (1 g/kg thức ăn) và bổ sung enzyme thương mại Avizyme 1100 (1 g/kg) cho trọng lượng, tiêu hao thức ăn và hiệu quả thức ăn tương đương ở gà giò cho ăn thức ăn hạt lúa mạch. Đặc tính ỉa phân dính ở gà giò được loại bỏ với cả 9 thí nghiệm thức ăn và giảm xuống mức quan sát thấy với thức ăn ngô chuẩn khi bổ sung lúa mạch chuyển gene (von Wettstein et al., 2003). Sự tăng trọng tốt và sống sót bình thường của 400 gà giò kiểm tra trên thức ăn lúa mạch được bổ sung hạt chuyển gene hoặc mạch nha chỉ ra rằng hạt và mạch nha đều không độc hại. Thức ăn hạt lúa mạch với hạt hoặc mạch nha chuyển gene bổ sung có β-glucanase ưa nhiệt là một lựa chọn thân thiện môi trường so với bổ sung enzyme, do nó sử dụng năng lượng quang tổng hợp để sản xuất enzyme trong hạt vì vậy tránh sử dụng năng lượng không phục hồi được để lên men (von Wettstein et al., 2003). Việc cất enzyme trong các thể protein của hạt trên cánh đồng tạo ra các qui trình bọc làm ổn định hoạt tính enzyme. Thức ăn lúa mạch với hàm lượng nhỏ hạt chuyển gene như phụ gia của lúa mạch bình thường tạo ra một lựa chọn cho thức ăn gà giò ở những nơi mà ngô hạt không phát triển được vì các điều kiện khí hậu hoặc do đất đai không phù hợp và vì vậy phải nhập khẩu ngô. Phytate là dạng dự trữ chính của phosphorus trong nhiều hạt thực vật, nhưng phosphate liên kết ở dạng này không có tác dụng cho động vật dạ dày đơn. Phytase, một enzyme thủy phân phosphate từ phytate, có khả năng tăng cao tiêu hóa phosphorus trong thức ăn động vật khi đưa vào hạt gạo như là thức ăn bổ sung (Hong et al., 2004). Hai gene, có nguồn gốc từ vi khuẩn dạ cỏ Selenomonas ruminantium (SrPf6) và Escherichia coli (appA), mã hóa các phytase hoạt tính cao được biểu hiện trong hạt lúa chuyển gene nảy mầm. Biểu hiện phytase được khảo sát bởi một promoter của gene α-amylase (alphaAmy8) cảm ứng nảy mầm, và tiết phytase ngoại bào được định hướng bởi trình tự tín hiệu peptide betaAmy8. Hai phytase được biểu hiện rõ ràng ở hạt lúa chuyển gene nẩy mầm và trong một kiểu được kiểm soát tạm thời và đặc hiệu mô. Không quan sát thấy một tác dụng có hại nào lên sự phát triển thực vật hoặc hình thành hạt (Hong et al., 2004).. Hoạt tính phytase tới 0,6 và 1,4 IU/mg protein tế bào chiết tổng số thu được trong lúa chuyển gene nẩy mầm biểu hiện phytase appA và SrPf6, tương ứng, cao gấp 46-60 lần hoạt tính phytase so với hoạt tính không chuyển gene. Phytase appA và SrPf6 sinh tổng hợp trong hạt lúa chuyển gene nẩy mầm có hoạt tính cao trong dãy pH 3,0-5,5 và 2,0-6,0, tương ứng. Mức độ phytase và di truyền trong lúa chuyển gene chỉ trong những cây biểu hiện cao là ổn định qua bốn thế hệ. Các hạt lúa chuyển gene nẩy mầm, sinh tổng hợp một phytase tái tổ hợp hoạt tính cao rất giàu các enzyme thủy phân, dinh dưỡng 9 và muối khoáng, có thể là thức ăn bổ sung lý tưởng để cải thiện tiêu hóa phytate-phosphorus trong động vật dạ dày đơn. Yang et al. (2007) đã biểu hiện xylanase với hoạt tính riêng cao từ Streptomyces olivaceoviridis A1 trong cây khoai tây chuyển gene (Solanum tuberosum L.). Protein tái tổ hợp XYNB đạt tới 5% protein lá hòa tan tổng số trong tế bào chất. Trong dịch chiết thân và lá, hoạt tính xylanase đạt tới 87 µM/min/g lá tươi (9,7 µM/min/mg protein hòa tan tổng số). Xylanase bền ở 60°C và 70°C trong đệm pH 5,2 tới 5 phút. Hơn nữa, hoạt tính xylanase giữ nguyên không thay đổi qua nhiều thế hệ khoai tây. Những kết quả này chứng minh rằng khoai tây chuyển gene có thể được sử dụng để sản xuất ra xylanase với hoạt tính enzyme riêng cao và có thể là một giải pháp khác đối với cách bổ sung xylanase ngày nay vào thức ăn chăn nuôi (Yang et al., 2007). 1.2 Tình hình sản xuất enzyme bổ sung thức ăn gia súc trên thế giới Novozymes A/S có thể nói là một trong những công ty hàng đầu trên thế giới sản xuất các loại enzyme công nghiệp trong đó có công nghiệp bột giặt, công nghiệp dệt, công nghiệp thuộc da, công nghiệp chế biến thực phẩm và công nghiệp sản xuất enzyme bổ sung thức ăn gia súc. Trong dòng enzyme bổ sung thức ăn gia súc phải kể đến các loại Ronozyme® mà hãng sản xuất chứa một trong các enzyme xylanase, protease, glucanase, phytase, pectinase, amylase, cellulose (www.novozymes.com). Theo danh mục hàng hóa nhập khẩu vào Việt Nam của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (90/2006/QĐ-BNN ngày 02/10/2006), các sản phẩm này được phép nhập về Việt Nam. Công ty hóa chất lớn của Đức BASF cũng sản xuất rất nhiều chế phẩm enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi như các loại Natuphos® và Natugrain® chứa phytase và xylanase tương ứng (www.nutrition.basf.com). Các sản phẩm thương mại được đóng gói dưới dạng khô hoặc dịch lỏng. Công ty sản xuất enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi lớn khác trên thế giới là Danisco Animal Nutrition (Đan Mạch, Anh Quốc, www.danisco.com) với các dòng sản phẩm Avizyme, Grandazym, Porzyme chứa enzyme đơn hoặc các tổ hợp enzyme khác nhau bao gồm xylanase, glucanase, subtilisin, amylase, pectinase. Vào năm 1975, một công ty của Mỹ US Kcmlri Co. khởi động với enzyme thức ăn gia súc thương mại. Kể từ khi một công ty của Phần Lan tên là Finnfeed International of Cultor Group Finland (ngày nay Danisco Animal Nutrition) lần đầu tiên ứng dụng β-glucanase enzyme trong thức ăn gia cầm vào giữa những năm 1980, các enzyme thức ăn gia súc đã được sử dụng ngày càng tăng lên bởi công nghiệp thức ăn gia súc toàn cầu (Mo, 1997) và ngày nay đã trở thành một lớp phụ gia thức ăn gia súc quan trọng. Vào năm 1998, giá trị enzyme hàng 150 triệu dollar Mỹ đã được bổ sung vào khoảng 10% thức ăn gia súc dạ dày đơn toàn cầu. Enzyme thức ăn gia súc được đưa vào Trung Quốc vào năm 1989, và sau những năm phát triển thị trường, nó đã được chấp nhận rộng rãi vào năm 2000 bởi rất nhiều công ty trong công nghiệp chăn nuôi gia súc và đạt tốc độ phát triển nhanh trong năm 2003. Tuy nhiên tốc độ phát triển các enzyme thành phần bắt đầu ứ lại vào năm 2004, trong khi phytase bắt đầu trải qua phát triển bùng nổ, trở thành enzyme được tìm kiếm nhiều nhất sau phụ gia thức ăn gia súc trong ba năm liền. Nhu cầu tiêu thụ hàng năm của các enzyme thức ăn gia súc vào năm 2006 đạt 20,100 tấn. 12,800 tấn enzyme thành phần được sử dụng (giảm nhẹ 1,5% so với 2005) chế biến 14,44 triệu tấn thức ăn gia súc, thâm nhập thị trường 14,7% (như năm 2005). 10 Đối với các enzyme đơn vị riêng lẻ, 1.700 tấn đã được sử dụng (tăng cao 79%) trong khi hàm lượng phytase được sử dụng là 5.600 tấn (có tốc độ sinh trưởng là 24,4%). 33,54 triệu tấn thức ăn gia súc được chế biến, một sự gia tăng thị trường 34,1% (giảm nhẹ so với 2005). Giá trị thị trường của enzyme thức ăn gia súc Trung Quốc đạt 464 triệu nhân dân tệ (928 tỷ VNĐ) vào năm 2006, trong đó enzyme thành phần đạt giá trị 262 tỷ Nhân dân tệ (tăng 2,34% so với 2005). Phytase mà đã tăng lên khủng khiếp chỉ có một giá trị thị trường 143 triệu Nhân dân tệ (giảm 18,8% so với 2005). 1.3 Hiệu quả của đa enzyme so với đơn enzyme Sau hơn hai mươi năm sản xuất và ứng dụng enzyme thức ăn chăn nuôi trong chăn nuôi gia súc và gia cầm, người ta đã nghiên cứu, sản xuất và đánh giá hiệu quả của các chế phẩm đa enzyme cao hơn so với các chế phẩm đơn enzyme. Omogbenigun et al. (2004) đã bổ sung các chế phẩm đa enzyme vào thức ăn của lợn con và thấy rằng các chế phẩm multienzyme đã cải thiện hiệu quả sử dụng dinh dưỡng và tốc độ sinh trưởng của lợn cai sữa. Đây là công thức thân thiện môi trường và hiệu quả kinh tế cao đối với thức ăn cho lợn con (Omogbenigun et al., 2004). Cowieson và Adeola (2005) đã đánh giá các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi carbohydrase, protease và phytase. Họ thấy rằng đa enzyme này có một tác dụng hỗn hợp trong thức ăn chăn nuôi gà giò khi đồng thời cho bổ sung cùng các enzyme với nhau. Họ kết luận sử dụng phytase và XAP (xylanase, amylase, phytase) đồng thời trong thức ăn cho gà giò sẽ có hiệu quả kinh tế và có thể thu lợi nhuận khi chăn nuôi gia cầm (Cowieson and Adeola, 2005). Slominski et al. (2006) đã sử dụng công nghệ enzyme để cải thiện tình trạng sử dụng năng lượng từ các hạt có dầu cho gia cầm. Họ đã đánh giá các công thức bổ sung enzyme riêng lẻ khác nhau và tổ hợp từ các enzyme cellulase, xylanase, glucanase, pectinase, mannanase. Kết quả nghiên cứu này cho thấy rằng bổ sung carbohydrase đa hoạt tính có thể được sử dụng làm công thức để cải thiện tình trạng sử dụng năng lượng từ hạt lanh nhiều dầu, do đó nâng cao được giá trị dinh dưỡng cho gia cầm (Slominski et al., 2006). Trong một nghiên cứu tương tự trước đó (Meng et al., 2006) nhưng đối với hạt cải dầu, họ kết luận mặc dù tác dụng enzyme lên tiêu hóa mỡ ở hệ tiêu hóa ruột mề ở mức độ rất đáng kể, các chỉ số khác cũng cho thấy cải thiện đáng kể chỉ khi tỷ lệ thể vùi enzyme cao được sử dụng. Số liệu này củng cố sự cần thiết bổ sung carbohydrase cho thức ăn gia cầm có hạt cải có nhiều dầu. Olukosi et al. (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng liên quan tới thời gian chăn nuôi của dịch chiết xylanase, amylase, và protease hoặc phytase đơn lẻ hoặc kết hợp với nhau trong chăn nuôi gà giò. Nghiên cứu này chỉ ra rằng sự kết hợp XAP (xylanase, amylase, và protease) và phytase đã cải thiện tình hình chăn nuôi. Cả XAP lẫn phytase đều có hiệu quả trong việc cải thiện tiêu hóa phosphorus và duy trì gà giò hấp thụ dinh dưỡng bột ngô – đậu nành. Số liệu này cũng cho thấy gà giò hấp thụ tốt hơn từ bổ sung enzyme ở độ tuổi non hơn và sự đóng góp của enzyme vào việc lưu giữ dinh dưỡng giảm theo độ tuổi của gà giò (Olukosi et al., 2007). Với những ưu thế của các chế phẩm đa enzyme so với các chế phẩm đơn enzyme, cho nên các công ty sản xuất enzyme thức ăn chăn nuôi đã sản xuất và tung ra thị trường các dòng sản phẩm đa enzyme (gồm cellulase, amylase, phytase, β-glucanase, pectinase, protease) như Nutri-Zym™ Dry, Nutri-Zym™ S Dry (Nutri-AD International NV., Bỉ); Ferm MOS, Nutragen-P (Nutribios Corporation, Canada); Natuphos® Combi L, Natugrain® Blend (BASF, Đức); Allzyme™ DDG (Alltech Inc; Mỹ); Enzite, Laczyme, XYLAN 500 (International Nutrition; Mỹ); Luctazyme Pro-Pig (Lucta S.A., Tây Ban Nha); ComplexEnzyme For Forage (Makata) (Haofa Bioengineering Exploitation Co. Ltd., Trung Quốc); 11 Hing efficiemcy Compound Enzymes (Nanning Dazhihuang Fovage Products Co., Ltd., TQ) (90/2006/QĐ-BNN ngày 02/10/2006). 1.4 Những khác biệt về trình độ KH&CN trong nước và thế giới Trong 9 hướng nghiên cứu về enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi trên thế giới hiện nay và trong tương lai gần thì Việt Nam có một khoảng cách rất xa so với họ. Có một số hướng Việt Nam đã thực hiện trong một thời gian tương đối dài là phân lập các chủng vi sinh vật tự nhiên, nuôi cấy, sinh tổng hợp enzyme rồi đánh giá tác dụng của những enzyme này tới năng suất chăn nuôi khi bổ sung vào thức ăn. Tuy nhiên các phương pháp chuẩn, sử dụng thiết bị hiện đại và hóa chất tinh khiết để đánh giá hoạt tính cũng như tác dụng của chúng lên năng suất và chất lượng vật nuôi ở Việt Nam thường chưa được áp dụng. Do đó, ngay trong hướng đi này, chúng ta vẫn còn cách xa. Cụ thể là các công trình trong nước không đủ khả năng để công bố trên các tạp chí quốc tế vì hàm lượng khoa học thấp. Thứ hai là kết quả của các công trình chưa đăng ký bản quyền và ít được các công ty sản xuất thức ăn chăn nuôi quan tâm tới. Các hướng tìm ra các nguồn vi sinh vật mới (đối với Việt Nam) để sinh tổng hợp các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi cũng thường không được chú trọng phát triển tiếp. Các hướng tạo ra các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi tái tổ hợp hoặc cải biến di truyền, hoặc tạo ra các nguyên liệu làm thức ăn có sẵn các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam đang ở thời kỳ manh nha. Hiện nay đã có một số nhóm nghiên cứu ở Việt Nam đã và đang tạo ra các enzyme tái tổ hợp sử dụng làm thức ăn chăn nuôi như Quyền Đình Thi et al. về các enzyme cellulase (Trịnh Đình Khá et al., 2007c; Trịnh Đình Khá et al., 2007d), protease (Nguyễn Thị Thảo and Quyền Đình Thi, 2004; Quyền Đình Thi and Trần Thị Quỳnh Anh, 2007b) và mannanase (Nguyễn Sỹ Lê Thanh et al., 2006); Đỗ Thị Ngọc Huyền (nhóm Nguyễn Thị Thùy Châu, Viện Sau thu hoạch) về phytase phân lập từ chủng Bacillus (Đỗ Thị Ngọc Huyền et al, 2005; Đỗ Thị Ngọc Huyền, 2007). Đương nhiên hướng cải biến các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi có sẵn càng chưa có điều kiện để phát triển ở Việt Nam cũng như tạo nguyên liệu làm thức ăn có sẵn enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi. Các nhóm chuyển gene vào thực vật ở Việt Nam hiện nay mới quan tâm đến các gene kháng sâu bệnh (rầy nâu, khô văn) và các gene chống chịu các điều kiện ngoại cảnh bất lợi như khô hạn, úng ngập, mặn, phèn chua. Các hướng khác như chuẩn hóa phương pháp đánh giá tác dụng của enzyme thức ăn chăn nuôi, đánh giá đáp ứng đối với enzyme thức ăn chăn nuôi của động vật được cho ăn, xây dựng mô hình hay đánh giá quan tâm tới giảm thiểu ô nhiêm môi trường hầu như là con số zero ở Việt Nam. Rất ít các công trình nghiên cứu cơ bản về những hướng đi này. Tóm lại khác biệt về trình độ khoa học và công nghệ trong nước và thế giới trong lĩnh vực enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi cả bề sâu lẫn bề rộng. 1.5 Tình hình nghiên cứu trong nước trong thời gian qua Để phát triển chăn nuôi lợn, gà hàng hóa thì vấn đề giảm giá thành sản xuất, giải quyết hiệu quả nguồn nguyên liệu thức ăn có lợi thế trong nước nhằm đảm bảo một nền chăn nuôi ổn định là vấn đề cần thiết hiện nay. Việt Nam là nước nông nghiệp với cây trồng chính là lúa nên sản phẩm cám gạo phục vụ thức ăn chăn nuôi có rất nhiều triển vọng và lợi thế so với các nguyên liệu khác. Theo báo cáo tổng kết chăn nuôi thời kỳ 1990-2002 (Cục Khuyến nông và Khuyến lâm, 2003), sản lượng cám gạo sản xuất năm 2002 đạt khoảng 3 triệu tấn. Tận dụng có hiệu quả nguồn nguyên liệu này không những tạo ra một lượng lớn thịt, sữa, trứng giúp giải quyết nhu cầu xã hội về lượng đạm/đầu người vốn rất thấp hiện nay mà còn tiết kiệm được ngoại tệ từ nhập khẩu nguyên liệu thức ăn chăn nuôi. Thế nhưng, một trong những hạn chế lớn nhất của cám gạo là nó có tỷ lệ xơ cao. Chính vì nhiều xơ nên cám gạo có tỷ lệ tiêu hóa thấp, giá trị năng lượng thấp. Thành phần xơ chủ yếu 12 là chất đường không phải tinh bột. Cám gạo có các thành phần xơ chủ yếu như arabinoxylan, cellulose và lignin. Thú có dạ dày đơn khó tiêu hóa chất này do không sản xuất đủ lượng enzyme nội sinh cần thiết. Không những thế, chất xơ còn bao bọc các chất dinh dưỡng, hạn chế khả năng tiêu hóa, hấp thu dưỡng chất. Trong môi trường ruột, chất xơ hòa tan gây tăng độ nhớt và giữ nước bao phủ các nhung mao ruột, làm giảm khả năng tiêu hóa và hấp thu dưỡng chất của ruột. Thông thường, khẩu phần nhiều xơ sẽ rất khó cân đối về mặt dinh dưỡng. Khi nhu cầu dinh dưỡng không được thỏa mãn đầy đủ sẽ kích thích heo ăn nhiều và thải ra nhiều phân hơn, do đó làm tăng ô nhiễm môi trường. Mặc khác, do khả năng giữ nước của chất xơ khá cao nên lượng phân thải ra thường rất ẩm ướt, gây khó khăn cho việc dọn rửa, vận chuyển và xử lý chất thải. Vì những hạn chế do chất xơ gây ra nên việc sử dụng cám gạo trong khẩu phần heo không thể đạt được kết quả như mong đợi. Trên thế giới, để nâng cao tỷ lệ tiêu hóa các nguyên liệu nhiều xơ như cám mì, cám lúa mạch, người ta bổ sung thêm men vào khẩu phần. Trước đây, enzyme được thu nhận, chiết xuất từ động thực vật (protease từ nhựa đu đủ, dạ dày; amylase từ hạt nảy mầm). Tuy nhiên, việc chiết xuất này tỏ ra không kinh tế, trong khi đó vi sinh vật chứa rất nhiều loại enzyme và các enzyme vi sinh vật này có hoạt lực khá cao. Thêm vào đó, chúng sinh sản khá nhanh, dễ nuôi cấy và môi trường lên men lại là các phụ phẩm nông nghiệp rẻ tiền, sẵn có ở nước ta như: cám gạo, trấu, bã mía, bã khoai mỳ (sắn). Ở Việt Nam, nhiều tác giả đã nghiên cứu về các enzyme bổ sung thức ăn gia súc, đặc biệt từ các chủng vi sinh vật nhưng các kết quả nghiên cứu này vẫn còn nhiều hạn chế, cho nên việc áp dụng các sản phẩm enzyme trong nước trong ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi vẫn chưa được cơ sở sản xuất thức ăn quan tâm. Nguyên nhân chủ yếu là do năng suất sinh tổng hợp của các enzyme tự nhiên còn thấp, chất lượng các enzyme tự nhiên không được cải biến bằng các kỹ thuật công nghệ sinh học hiện đại và hầu hết các chế phẩm enzyme bổ sung cho thức ăn chăn nuôi đã được các nhóm nghiên cứu đều ở dạng đơn enzyme. Do đó các chế phẩm này chưa cạnh tranh được với các chế phẩm ngoại nhập là các chế phẩm đa enzyme và đã có cải biến về di truyền, sử dụng các chủng vi sinh vật tái tổ hợp. Chính vì vậy, mục tiêu của đề tài là chọn lọc các chủng vi sinh vật tự nhiên có khả năng tổng hợp các các enzyme như lactase, xylanase, glucanase, phytase, subtilisin, lipase và amylase), kế đến là tạo ra các chủng tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp các enzyme trên với năng suất, hoạt lực cao; bước kế đến là xây dựng được các quy trình sản xuất các enzyme tái tổ hợp và nguyên thủy năng suất cao và cuối cùng là lên men tạo chế phẩm đa enzyme bổ sung thức ăn cho gia súc. Trong một thời gian tương đối dài, ở Việt Nam đã có nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau thực hiện các công trình nghiên cứu liên quan tới enzyme bổ sung thức ăn gia súc. Thành tựu bước đầu đạt được rất đáng kể. Hầu hết các nhóm nghiên cứu đều tập trung vào khâu tuyển chọn các chủng vi sinh vật tự nhiên trong các mẫu đất, phân, nước thải, có hoạt tính thủy phân chất xơ, tinh bột, protein. Sau đó họ chọn các chủng có hoạt tính cao nhất rồi nuôi cấy phòng thí nghiệm và đánh giá một số tính chất hóa lý, và thực hiện các thí nghiệm phối trộn với thức ăn gia súc và đánh giá hiệu quả của các chế phẩm enzyme này. Đoàn Văn Thược và Mai Thị Hằng đã thực hiện đề tài “Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh amylase trên bã sắn phế thải để sản xuất enzyme cho chăn nuôi gia súc” (Trung tâm Thông tin và Khoa học Quốc gia, www.vista.gov.vn). Kết quả thu được từ bã sắn phế thải đã tuyển chọn được 3 chủng vi sinh vật có khả năng sinh amylase: Aspergillus oryzae NM1, Aspergillus niger BS1 và Bacillus subtilis V37. Trong 3 chủng nêu trên, có 2 chủng có khả năng sinh α-amylase là A. oryzae NM1 và B. subtilis V37, và một chủng A. niger BS1 có khả năng sinh glucoamylase. Các chủng có thể phối hợp với nhau tạo thành hệ amylase hoàn thiện, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi lợn. Amylase của 3 chủng tuyển 13 chọn đều bền và hoạt động tốt ở pH thấp, khá bền nhiệt và hoạt động tốt ở nhiệt độ gần với nhiệt độ cơ thể, có thể sử dụng làm enzyme cho chăn nuôi gia súc. Trong báo cáo 2005 của dự án hợp tác với Thụy Điển Sida/SAREC Ref. VS-BT-05 “Study on using agriculture by-products for producing microbial enzyme-fed used for poultry and pig husbandry in Vietnam” Mai Thị Hằng và cộng sự đã thông báo các kết quả đánh giá nhiệt độ và pH tối ưu của amylase (Aspergillus oryzae NM1, Aspergillus niger BS1 và Bacillus subtilis V37) xylanase (Aspergillus NM1 và GM56, Bacillus THB14 và 55Lm6), phytase (Bacillus BT17, Vk37, THB17), cellulase (Aspergillus BS1 và BS2). Tác giả và cộng sự cũng thông báo cải thiện tổng hợp enzyme của các chủng này bằng các phương pháp cổ điển (nhiệt độ, pH, nguồn carbon, nitơ, muối khoáng) và gây đột biến bằng UV và hóa chất. Nhưng không kèm theo các kết quả cụ thể nào. Các thí nghiệm cho lợn ăn bổ sung các chế phẩm thương mại khác được tiến hành, nhưng chế phẩm enzyme này không có thông báo kèm theo (Chương trình hợp tác nghiên cứu Việt Nam – Thụy Điển, http://www.sarec.gov.vn/homepage.asp). Ở các tỉnh phía nam, một số đề tài nghiên cứu về enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi cũng đã được tiến hành (Trung tâm Thông tin Khoa học và Công nghệ, Sở Khoa học và Công nghệ TP.HCM). Đinh Văn Cải (1999, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam) đã thực hiện đề tài "Nghiên cứu sản xuất và sử dụng chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ men vi sinh trong khẩu phần của bò sữa và bê". Cũng trong năm, Viện Sinh học Nhiệt đới thông báo đã sản xuất được các chế phẩm enzyme bằng phương pháp vi sinh vật: α-Amylase từ Aspergillus oryzae và Bacillus subtilis; hoạt tính 15 đơn vị/g; sử dụng vào thức ăn gia súc với nhiệt độ và pH thích hợp lần lượt là 60°C, pH 6 và 80°C, pH 6-6.5; phân giải tính bột thành các dextrin và đường. Chế phẩm cellulose từ Aspergillus oryzae và Trichoderma viride; bổ sung vào thức ăn gia súc; phân giải cellulose thành các dextrin, đường; nhiệt độ và pH thích hợp 40°C, pH 5-6. Các chế phẩm này ứng dụng vào thức ăn gia súc nhằm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn, tăng sản lượng thịt, sữa, đạt hiệu quả kinh tế cao với chi phí thấp. Năm 2002, Võ Thị Hạnh (Viện Sinh học Nhiệt đới) chủ nhiệm đề tài "Nghiên cứu để sản xuất chế phẩm hỗn hợp vi sinh vật sống và enzyme dùng trong chăn nuôi (heo) và thủy sản (tôm)". Năm 2004 ở Thành phố Hồ Chí Minh, một số đề tài liên quan tới việc sản xuất các enzyme bổ sung cho thức ăn gia súc cũng đã được tiến hành. Trần Thạnh Phong (Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ) đã “Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase từ Trichoderma reesei và Aspergillus niger trên môi trường lên men bán rắn”. Chế phẩm sinh học từ bã mía dùng bảo quản cỏ xanh làm thức ăn cho gia súc: Hướng nghiên cứu này vừa được Trần Thạnh Phong, Viện Sinh học Nhiệt đới TP.HCM, thực hiện thành công. Trần Thạnh Phong và nhóm cộng sự đã tận dụng nguồn phế liệu bã mía kết hợp với cám mì, dùng phương pháp công nghệ sinh học (lên men bán rắn) để tổng hợp thành chế phẩm sinh học, mang tên là chế phẩm enzyme xylanase. Chế phẩm này kết hợp với chế phẩm VEM (chứa nhóm vi khuẩn lactic và nấm men) dùng vào việc ủ cỏ xanh (hoặc các phế phẩm nông nghiệp khác như bắp, đậu) có tác dụng duy trì được một thời gian dài giá trị dinh dưỡng của cỏ như là lúc mới thu hoạch. Giải pháp này đã thiết thực đáp ứng cho vấn đề bảo quản dự trữ nguồn thức ăn cho gia súc. Đinh Minh Hiệp (Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ) đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp enzyme phytase từ vi sinh vật và ứng dụng bổ sung thức ăn gia súc, gia cầm”. Năm 2004, Đồng Thị Thanh Thu đã thông báo hướng dẫn một số học viên cao học khóa 12 (Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, Đại học TPCMH) thực hiện một số đề tài tốt nghiệp liên quan đến việc đánh giá hoạt tính của một số enzyme như protease (Trần Thị Ngọc Mai: Nghiên cứu đặc tính và ứng dụng của protease dạng hòa tan và dạng cố định từ nấm mốc A. oryzae); hydrolase (Lê Thị Hồng Nga: Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng một số enzyme hydrolase từ vi sinh vật bởi cơ chất tương ứng của enzyme), phytase (Lê Quốc Phong: 14 Nghiên cứu một số đặc tính và thử nghiệm ứng dụng của phytase chiết tách từ môi trường nuôi cấy Bacillus spp.), amylase (Nguyễn Quyết, Nghiên cứu các đặc tính và ứng dụng của – amylase dạng dạng hòa tan và cố định thu nhận từ vi khuẩn Bacillus subtilis) (www.biology.hcmuns.edu.vn/store/thesis/detai-CH-K12.htm). Hoàng Quốc Khánh (Viện sinh học nhiệt đới) cũng hướng dẫn học viên cao học Phạm Huỳnh Ngọc Quyên thực hiện đề tài: Sản xuất xylanase từ Trichoderma harzianum bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt trên vỏ cà phê (www.biology.hcmuns.edu.vn/store/thesis/detai-CH-K12.htm). Theo Trần Thị Dân và Nguyễn Ngọc Tuấn (2006), các chủng Bacillus, đặc biệt Bacillus subtilis, là những chủng được nghiên cứu nhiều nhất ở Việt Nam để khai thác sinh khối (Tô Minh Châu et al., 2005) làm probiotic, và để sử dụng các enzyme của chúng tăng cường tiêu hóa trong động vật và con người. Protease là một enzyme công nghiệp quan trọng, chiếm tới 60% thị phần enzyme tổng số; do đó, protease Bacillus subtilis được sản xuất và tinh sạch (Đỗ Thị Bích Thủy and Trần Thị Xô, 2004). Trình tự nucleotide của gene 16S rRNA từ Bacillus HA401 sản xuất α-amylase kiềm đã được xác định (Tang Thi Chinh, 2006). Một enzyme khác là phytase, nâng cao thủy phân phosphorus, cũng được sản xuất từ chủng Aspergillus niger (Trần Thị Tuyết et al., 2004). Enzyme góp phần cải thiện tỷ lệ chuyển hóa thức ăn và làm giảm ô nhiễm môi trường vì phosphorus. 1.5.1 Tình hình nghiên cứu các enzyme tái tổ hợp Phòng CNSH Enzyme (Viện CNSH) đã và đang triển khai các đề tài nghiên cứu theo hướng tạo ra các chủng vi sinh vật tái tổ hợp sinh tổng hợp các enzyme sử dụng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi như protease (Quyền Đình Thi et al., 2006; Quyền Đình Thi and Trần Thị Quỳnh Anh, 2007a), mannanase (Nguyễn Sỹ Lê Thanh et al., 2006), cellulase (Trịnh Đình Khá et al., 2007b; Trịnh Đình Khá et al., 2007a), lactase (ĐTCS: Nghiên cứu nhân dòng, biểu hiện enzyme lactase từ một chủng vi sinh vật và định hướng ứng dụng bổ sung vào sữa và các sản phẩm từ sữa), lipase (Quyền Đình Thi et al., 2006; Quyền Đình Thi and Trần Thị Quỳnh Anh, 2007a; Quyen et al., 2007). Có enzyme đã được biểu hiện năng suất cao trong E. coli, đánh giá tính chất hóa lý và sẽ được biểu hiện trong nấm men và Bacillus như protease, mannanase và lipase. Trong luận văn nghiên cứu sinh của Đỗ Thị Ngọc Huyền, tác giả cũng nhân dòng, đọc trình tự, phân tích và đăng ký GenBank một gene mã hóa phytase từ Bacillus subtilis. Sau đó tác giả đã biểu hiện thành công ở E. coli và đánh giá tính chất hóa lý (Đỗ Thị Ngọc Huyền, 2007). Tuy nhiên để sử dụng các chủng vi sinh vật tái tổ hợp sản xuất các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi tái tổ hợp thì bắt buộc phải chuyển các gene trên vào các chủng sản xuất như Bacillus subtilis, Lactobacillus, Aspergillus niger và Trichoderma. Hiện nay Phòng CNSH Enzyme đang tiếp cận các phương pháp xây dựng vector chuyên biểu hiện ở các hệ thống tế bào chủ Bacillus và nấm sợi và các phương pháp biến nạp vector vào các hệ thống tế bào chủ này. Đây sẽ là khâu khó khăn nhất, vì hầu hết các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học ở Việt Nam đều chỉ sử dụng các loại vector biểu hiện ở E. coli hoặc nấm Pichia pastoris, mang tính nghiên cứu nhiều hơn. Hơn nữa E. coli không thể sử dụng cho lợn ăn được. 1.5.2 Tình hình nhập khẩu và liên doanh sản xuất Hiện nay trên thị trường Việt Nam đã bán các sản phẩm enzyme sử dụng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi cho các đối tượng bò, lợn, gà, vịt. Những sản phẩm này đều được sản xuất ở nước ngoài. Nếu các cơ sở sản xuất trong nước có khả năng sản xuất được các chế phẩm enzyme tương tự, thì sẽ tạo công ăn việc làm cho nhiều người lao động. Đặc biệt nếu các chế phẩm enzyme được sản xuất tận dụng các phế thải nông nghiệp và công nghiệp chế biến thực phẩm thì giá thành sẽ rẻ hơn, có sức cạnh tranh hơn. Theo Quyết định số 01/2006-QĐ-BNN ra ngày 06/01/2006 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, trên thị trường Việt Nam được phép buôn bán các chế phẩm chứa các loại 15 enzyme tiêu hóa do các công ty lớn trên thế giới sản xuất như Novozymes A/S (Đan Mạch, chế phẩm Ronozyme® các loại chứa glucanase, xylanase, protease, phytase), Finnfeeds International Ltd; Danisco Animal Nutrition Finland hoặc England (các chế phẩm Avizyme, Phyzyme, Porzyme), Chem Tech (Hàn Quốc). Ngoài các công ty lớn ra còn một số công ty khác trên thế giới cũng đã và đang chào bán các chế phẩm chứa enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi trên thị trường Việt Nam, họ đến từ Đức, Hà Lan, Bỉ, Canada, Pháp, Spain, Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Singapore, Malaysia, Philippine. Chế phẩm của Trung Quốc chưa có thương hiệu nhưng lại có nhiều công ty tham gia thị trường. Mặc dù trên thị trường đã có nhiều sản phẩm thương mại của các công ty ngoại quốc, nhưng chúng ta vẫn nên tự sản xuất nhằm tạo thêm công ăn việc làm cho người lao động, chủ động cung cấp. Điều này cũng giống như là câu chuyện về máy tính trước đây. Thế giới có rất nhiều hãng lớn sản xuất và láp ráp máy tính, và bày bán la liệt trên thị trường Việt Nam trước khi các công ty của Việt Nam thực hiện sản xuất và láp ráp. 1.5.3 Hiệu quả kinh tế của các enzyme bổ sung và mức độ an toàn Các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi (xylanase, amylase, protease, glucanase, phytase, pectinase, cellulase, mannanase) đều có hiệu quả kinh tế cao: làm tăng trọng trung bình của động vật lên 5-10%, giảm thức ăn trên một kilogram trọng lượng, tăng năng suất đẻ trứng, tăng năng suất tiết sữa, tăng khả năng hấp thụ phosphor và giảm ô nhiễm môi trường. Hiệu quả kinh tế cao đã được chứng minh qua hàng trăm công trình nghiên cứu đã được công bố trên các tạp chí quốc tế (Nsereko et al., 2002; Omogbenigun et al., 2004; Ciftci et al., 2005; Cowieson and Adeola, 2005; Wu et al., 2005; Slominski et al., 2006; Balci et al., 2007; Olukosi et al., 2007). Chính vì hiệu quả kinh tế cao cho nên hàng chục công ty lớn trên thế giới đã và đang sản xuất các chế phẩm enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi như Novozymes A/C (Đan mạch), BASF (Đức), Danisco Animal Nutrition (Đan Mạch, Anh Quốc), Alltech Inc. (Mỹ) từ hơn chục năm nay. Trong đề tài chúng tôi đề xuất sẽ sử dụng các chủng vi sinh vật như Aspergillus niger và Bacillus subtilis để sản xuất các loại enzyme như trên. Các chủng vi sinh vật này hoàn toàn là những chủng vi sinh vật an toàn đối với người và động vật. Bacillus subtilis là chủng vi sinh vật được sử dụng bổ sung vào hệ thống vi sinh vật tiêu hóa ở người, động vật, tôm cá từ lâu. Theo các tiêu chuẩn của FDA (Mỹ) và các tiêu chuẩn của Châu Âu, các chủng này hoàn toàn an toàn đối với động vật. Trong số các chủng Aspergillus, Aspergillus oryzae và Aspergillus niger được công nhận là chủng an toàn “the Generally Recognized as Safe (GRAS)” trong danh sách của Tổ chức Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration (FDA) ở Hoa Kỳ. Tất cả các công trình nghiên cứu ở Việt Nam về các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi đều đã sử dụng các chủng Bacillus subtilis và Aspergillus niger để sản xuất enzyme và bổ sung trực tiếp vào thức ăn mà không có vấn đề gì về độc hại. Trong đề tài này, các chủng E. coli tái tổ hợp được sử dụng để nghiên cứu các tính chất hóa lý của enzyme tái tổ hợp, chứ không được sử dụng trực tiếp để sản xuất enzyme tái tổ hợp dùng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Do vậy vấn đề an toàn của các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi ở đề tài này hoàn toàn tuân thủ theo các quy định chung của quốc tế lẫn Việt Nam. 2 2.1 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Chủng vi sinh vật Các chủng vi sinh vật dùng để khảo sát hoạt tính enzyme do phòng CNSH Enzyme (Viện CNSH) sưu tập và phân lập: 137 chủng Aspergillus (Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học), 2 chủng Aspergillus (Trung tâm Sưu tầm Vi sinh vật Đức DSM), B. subtilis G1 (Phòng 16