Tài liệu Nghiên cứu tác dụng và cơ chế hạ glucose máu của dịch ép thân cây chuối tiêu (musa x paradisiacal l.) trên thực nghiệm.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THNGUYNGUYÊNNỄN THỊ ĐÔNGỊ ĐÔNG NGUYỄN THỊ ĐÔNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG VÀ CƠ CHẾ HẠ GLUCOSE MÁU CỦA DỊCH ÉP THÂN CÂY CHUỐI TIÊU (MUSA X PARADISIACA L.) TRÊN THỰC NGHIỆM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƯỢC MÃ SỐ: 62720408 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Phùng Thanh Hương GS.TS. Nguyễn Hải Nam HÀ NỘI, NĂM 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Tác giả luận án Nguyễn Thị Đông LỜI CẢM ƠN Trong suố t quá trì nh học tập và hoà n thà nh luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giú p đỡ quý bá u củ a cá c nhà Khoa học, các thầ y cô giáo, cá c anh chi ̣, cá c em, cá c bạn bè đồng nghiệp và gia đình. Vớ i lò ng kí nh trọng và biế t ơn sâu sắ c nhất tôi xin được bà y tỏ lòng biết ơn chân thành tớ i PGS. TS. Phùng Thanh Hương, GS.TS. Nguyễn Hải Nam, hai người Thầy tâm huyết, tận tình luôn sát cánh bên tôi quan tâm giúp đỡ cũng như động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hòan thành luận án này. Lời cảm ơn tiếp theo, tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giá m hiê ̣u trường Trường Đại học Dược Hà Nội, Trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương, đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thày giáo, cô giáo, anh chị em kỹ thuật viên Bộ môn Hóa sinh, Bộ môn Dược lực, Phòng Sau đại học Trường Đại Học Dược Hà Nội, Bộ môn Hóa dược Trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương, đã tạo mọi điề u kiê ̣n thuận lợi giú p đỡ tôi trong quá trì nh học tập và hoà n thà nh luận án. Trong quá trình làm thực nghiệm tại Khoa Sinh hóa và Huyết học, Khoa Giải phẫu bệnh- Bệnh viện Đa khoa tỉnh Hải Dương. Viện Hóa sinh biển- Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, Khoa Hóa sinh và Vi sinh, Đại học Hóa học và Công nghệ Praha, Cộng hòa Czech. Tôi đã nhận được sự giúp đỡ về điều kiện về trang thiết bị, hóa chất và kỹ thuật giúp tôi hoàn thành luận án. Xin được bày tỏ lòng biết ơn tới các chuyên gia,các Bác sĩ, Dược sĩ, các anh chị em kỹ thuật viên tại các cơ quan trên. Xin gử i lời cả m ơn tới bạn bè , cá c em sinh viên Trường Đại học Dược Hà Nội, các anh chi ̣ em đồng nghiệp Trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương, luôn động viên và giú p đỡ tôi trong thời gian qua. Lời cảm ơn cuối cùng tôi muốn giành tặng cho những người thân trong gia đình đã luôn ở bên cạnh động viên, giú p đỡ và giành mọi thời gian để tôi học tập là m viê ̣c và hoà n thà nh luận án này. NCS. Nguyễn Thị Đông NCS. Nguyễn Thị Đông MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG ............................................. 3 1.1.1. Định nghĩa, dịch tễ, phân loại đái tháo đường ................................................... 3 1.1.1.1. Định nghĩa .......................................................................................... 3 1.1.1.2. Dịch tễ................................................................................................. 3 1.1.1.3. Phân loại đái tháo đường .................................................................... 3 1.1.1.4. Tiêu chuẩ n chẩ n đoán ......................................................................... 4 1.1.2. Cơ chế bệnh sinh ..................................................................................................... 5 1.1.2.1. Bệnh sinh của đái tháo đường typ 1 ................................................... 5 1.1.2.2. Bệnh sinh của đái tháo đường typ 2 ................................................... 7 1.2. CÁC CƠ CHẾ GÂY HẠ GLUCOSE MÁU .................................................. 10 1.2.1. Tăng cường số lượng insulin nội sinh ............................................................... 10 1.2.1.1. Tăng cường số lượng insulin thông qua ức chế kênh KATP, tăng nồng độ calci nội bào ................................................................................................ 10 1.2.1.2. Tăng cường số lượng insulin thông qua các incretin ....................... 12 1.2.1.3. Tăng cường số lượng insulin thông qua ức chế DPP-4 .................... 12 1.2.2. Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin ................................................ 14 1.2.2.1. Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua hoạt hóa AMPK ....................................................................................................................... 14 1.2.2.2. Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua receptor PPAR ....................................................................................................................... 15 1.2.2.3. Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua quá trình truyền tín hiệu của insulin ................................................................................ 16 1.2.3. Tác dụng điều hòa, chuyển hóa tương tự như insulin .................................... 17 1.2.3.1. Tác dụng tương tự insulin thông qua các enzym.............................. 18 1.2.3.2. Tác dụng tương tự insulin thông qua hoạt hóa GLUT4 ................... 19 1.2.4. Ức chế tiêu hóa carbohydrat ................................................................................ 19 1.2.5. Các cơ chế khác gây hạ glucose máu ................................................................. 20 1.3. CÁC MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM TRONG NGHIÊN CỨU THUỐC ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG ........................................................................... 21 1.3.1. Các mô hình thực nghiệm in vivo ....................................................................... 21 1.3.1.1. Mô hình gây bệnh ĐTĐ typ 1........................................................... 21 1.3.1.2. Mô hình gây bệnh ĐTĐ typ 2........................................................... 22 1.3.2. Các mô hình thực nghiệm in vitro ...................................................................... 24 1.3.2.1. Đánh giá tác động lên hoạt tính của các enzym tiêu hóa và chuyển hóa glucid.................................................................................................................. 24 1.3.2.2. Đánh giá khả năng bài tiết insulin của tế bào β đảo tụy ................... 25 1.3.2.3. Đánh giá mức độ nhạy cảm của mô đích với insulin ....................... 25 1.4. CÂY CHUỐI TIÊU ......................................................................................... 26 1.4.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật .................................................................. 26 1.4.1.1. Vị trí phân loại .................................................................................. 26 1.4.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố .......................................................... 27 1.4.2. Bộ phận dùng ......................................................................................................... 27 1.4.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây chuối tiêu (Musa x paradisiaca L.) ................................................................................ 27 1.4.3.1. Nghiên cứu về thành phần hoá học .................................................. 28 1.4.3.2. Nghiên cứu về tác dụng dược lý ....................................................... 29 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................... 32 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU......................................................................... 32 2.1.1. Dược liệu nghiên cứu ........................................................................................... 32 2.1.2. Động vật thí nghiệm .............................................................................................. 32 2.1.3. Các dòng tế bào cho nghiên cứu in vitro............................................................ 33 2.2. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU ...................................................... 33 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ .................................................................................................... 33 2.2.2. Thuốc và hóa chất nghiên cứu ............................................................................ 34 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 35 2.3.1. Phương pháp điều chế mẫu nghiên cứu ............................................................ 38 2.3.1.1. Điều chế cắn toàn phần..................................................................... 38 2.3.1.2. Điều chế cắn phân đoạn .................................................................... 38 2.3.1.3. Phương pháp pha mẫu thử ................................................................ 38 2.3.2. Phương pháp đánh giá tác dụng hạ glucose máu thực nghiệm trên chuột . 39 2.3.2.1.Trên chuột nhắt trắng tăng glucose máu thực nghiệm bởi STZ liều 150 mg/kg ................................................................................................................. 39 2.3.2.2. Trên chuột cống trắng ĐTĐ typ 2 thực nghiệm ............................... 40 2.3.2.3. Trên khả năng dung nạp glucose của chuột cống trắng ĐTĐ typ 2 thực nghiệm .............................................................................................................. 43 2.3.3. Các kỹ thuật định lượng hóa sinh trong thực nghiệm in vivo ........................ 44 2.3.3.1. Định lượng glucose máu ................................................................... 44 2.3.3.2. Định lượng insulin huyết thanh ........................................................ 45 2.3.3.3. Định lượng cholesterol toàn phần huyết thanh ................................. 46 2.3.3.4. Định lượng triglycerid huyết thanh .................................................. 47 2.3.4. Kỹ thuật xét nghiệm mô bệnh học....................................................................... 47 2.3.5. Phương pháp xác định hoạt độ enzym G6Pase gan (EC 3.1.3.9) .................. 48 2.3.6. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế các enzym in vitro .......................... 49 2.3.6.1. Đánh giá khả năng ức chế enzym α-amylase (EC 3.2.1.1) .............. 49 2.3.6.2. Đánh giá khả năng ức chế enzym α-glucosidase (EC 3.2.1.20) ....... 51 2.3.6.3. Đánh giá khả năng ức chế protein tyrosin phosphatase 1B (PTP1B - EC 3.1.3.48) .............................................................................................. 52 2.3.7. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng trên sự phosphoryl hóa AMPK và IRS-1 .................................................................................................................................. 53 2.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sự biệt hóa của tế bào mô mỡ 3T3-L1 ................................................................................................................................ 56 2.3.9. Các phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu ........................................................................................................... 57 2.3.9.1. Định tính các nhóm chất hóa học ..................................................... 57 2.3.9.2. Phân lập chất ..................................................................................... 57 2.3.9.3. Xác định cấu trúc .............................................................................. 57 2.3.10. Xử lý số liệu .......................................................................................................... 58 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 59 3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE MÁU TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM .............................................................................. 59 3.1.1. Kết quả tác dụng hạ glucose máu của cắn toàn phần ..................................... 59 3.1.1.1. Tác dụng của cắn toàn phần trên glucose máu của chuột tiêm STZ liều 150mg/kg ........................................................................................................... 59 3.1.1.2. Tác dụng của cắn toàn phần trên glucose máu của chuột ĐTĐ typ 2 ................................................................................................................................ 60 3.1.1.3. Tác dụng của cắn toàn phần trên khả năng dung nạp glucose của chuột ĐTĐ typ 2 ....................................................................................................... 62 3.1.2. Kết quả tác dụng của cắn phân đoạn ................................................................. 64 3.1.2.1. Tác dụng của cắn phân đoạn trên glucose máu của chuột tiêm STZ liều 150mg/kg ................................................................................................... 64 3.1.2.2. Tác dụng của cắn phân đoạn trên chuột ĐTĐ typ 2 ......................... 66 3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CẮN TOÀN PHẦN THÂN CÂY CHUỐI TIÊU ............................................................... 68 3.2.1. Kết quả định tính các nhóm chất ........................................................................ 68 3.2.2. Kết quả phân lập các hợp chất trong phân đoạn ethylacetat .......................... 69 3.2.2.1. Nhận dạng hợp chất 1 (FE1C) .......................................................... 69 3.2.2.2. Nhận dạng hợp chất 2 (FE6B) .......................................................... 71 3.2.2.3. Nhận dạng hợp chất 3 (FE10A) ........................................................ 72 3.2.2.4. Nhận dạng các chất 4 (FE12A) ........................................................ 73 3.2.3. Kết quả phân lập các hợp chất trong phân đoạn n-butanol............................ 75 3.2.3.1. Nhận dạng hợp chất 5 (FB2A) ......................................................... 76 3.3.3.2. Nhận dạng hợp chất 6 (FB2B) .......................................................... 78 3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ HẠ GLUCOSE MÁU CỦA CẮN TOÀN PHẦN THÂN CÂY CHUỐI TIÊU ........................................................... 79 3.3.1. Kết quả trên các mô hình thực nghiệm in vivo ................................................. 79 3.3.1.1. Nồng độ insulin huyết thanh............................................................. 79 3.3.1.2. Tình trạng mô tụy nội tiết và tế bào β của chuột ĐTĐ typ 2 ........... 84 3.3.1.3. Nồng độ lipid huyết thanh ................................................................ 85 3.3.1.4. Kết quả trên hoạt độ enzym G6Pase gan ......................................... 86 3.3.2. Kết quả trên các mô hình thực nghiệm in vitro ................................... 89 3.3.2.1. Tác dụng ức chế enzym α-amylase .................................................. 89 3.3.2.2. Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase ............................................. 90 3.3.2.3. Tác dụng ức chế enzym PTP1B ....................................................... 92 3.3.2.4. Tác dụng ức chế sự phosphoryl hóa IRS-1(Ser 307) trên dòng tế bào cơ vân chuột nhắt C2C12 ..................................................................................... 93 3.3.2.5. Tác dụng hoạt hoá AMPK trên dòng tế bào cơ vân nguyên phát chuột nhắt C2C12 ....................................................................................................... 95 3.3.2.6. Tác dụng trên sự biệt hóa tế bào 3T3-L1 ......................................... 98 CHƯƠNG IV. BÀN LUẬN .................................................................................... 99 4.1.1. Lựa chọn liều thử nghiệm .................................................................................... 99 4.1.2. Tác dụng của cắn toàn phần.............................................................................. 100 4.1.2.2.Trên chuột tiêm STZ liều 150 mg/kg .............................................. 100 4.1.2.2. Trên chuột cống ĐTĐ typ 2............................................................ 102 4.1.2.3. Trên khả năng dung nạp glucose của chuột cống ĐTĐ typ 2 ........ 104 4.1.3. Tác dụng của cắn phân đoạn............................................................................. 105 4.2. VỀ VIỆC PHÂN LẬP CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN CÓ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE MÁU CHIẾM ƯU THẾ............................................................ 106 4.3. VỀ CƠ CHẾ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE MÁU CỦA THÂN CÂY CHUỐI TIÊU ........................................................................................................ 111 4.3.1. Cơ chế hạ glucose máu ở mức độ cơ thể.......................................................... 112 4.3.1.1. Về tác dụng trên nồng độ insulin huyết thanh ................................ 112 4.3.1.2. Về tác dụng tăng dung nạp glucose trong test dung nạp glucose bằng đường uống .................................................................................................... 114 4.3.1.3. Về tác dụng trên nồng độ lipid huyết thanh ................................... 114 4.3.2. Cơ chế hạ glucose máu ở mức độ tế bào, phân tử .......................................... 116 4.3.2.1. Về tác dụng trên mô tụy nội tiết và tế bào β của chuột ĐTĐ typ 2 116 4.3.2.2. Về tác dụng trên sự biệt hóa tế bào mỡ 3T3-L1 ............................. 118 4.3.2.3. Về khả năng ức chế enzym tiêu hóa glucid .................................... 119 4.3.2.4. Về tác dụng ức chế PTP1B ............................................................. 122 4.3.2.5. Về tác dụng ức phosphoryl hóa IRS-1(Ser 307) ............................ 124 4.3.2.6. Về tác dụng hoạt hóa AMPK.......................................................... 126 4.2.2.7. Về tác dụng ức chế G6Pase gan ..................................................... 127 4.4. BÀN LUẬN CHUNG ..................................................................................... 129 KẾT LUẬN............................................................................................................ 135 1. Tác dụng hạ glucose máu của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu .................. 135 2. Cơ chế hạ glucose máu của thân cây chuối tiêu .................................................. 135 2.1. Trên chuyển hoá..................................................................................................... 135 2.2. Trên sự nhạy cảm của mô đích với insulin ....................................................... 136 2.3. Trên chuyển hoá và tăng nhạy cảm của tế bào mô đích với insulin ............ 136 ĐỀ XUẤT .............................................................................................................. 136 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT ACC Ac-CoA ADA AICAR Akt AMPK ARB Cho TP CXCL DAG Db/db DMEM DMSO DPP-4 ĐTĐ ECLIA F1,6BPase FBS FDA FFA G6Pase GDH GIP GK GLP-1 GLP-1 GLUT GOAT GOD GP GPR TÊN ĐẦY ĐỦ Acetyl-coA carboxylase Acetyl-CoA Hiệp hội đái tháo đường Mỹ (American Diabetes Association) Aminoimidazol-4-carboxamid Ribosid The serine/threonine kinase Adenosine monophosphate activated protein kinase Angiotensin receptor blocker Cholesterol toàn phần Chemokine ligand Diacylglycerol Diabetes Môi trường nuôi cấy tế bào (Dulbecco’s modified eagle medium) Dimethyl sulfoxid Dipeptidyl peptidase-4 Đái tháo đường Electro chemiluminessance Immuno Assay Fructose-1,6-biphosphatase Huyết thanh bào thai bê (Fetal bovine serum) Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and drug administration) Acid béo tự do (Free fatty acid) Glucose6phosphatase Glucose dehydrogenase Glucose-dependent insulinotropic polypeptid Glucokinase Glucagon-like peptide 1 Glucagonlike pepdid-1 Hệ vận chuyển glucose (Glucose-transporter) Ghrelin o-acyltransferase Glucose oxidase Glycogen phosphorylase G protein-coupled receptors VIẾT TẮT GSH GSK-3 HbA1C HDACs HEPES HLA HMGB1 HOMA HS IC50 IKK IL IRS JNK LC-CoA LDL NaCMC NF-κB NOD NPPH OB/OB p-AMPK PĐ PI3 PI3K PPAR PTP1B SGLT STZ SUR TG TP WHO TÊN ĐẦY ĐỦ Glutathione Glycogen synthase kinase-3 Hemoglobin A1C Histone deacetylase 4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethane sulfonic acid Kháng nguyên liên kết tế bào lympho (Human Leukocyte Antigen) High-mobility-group 1 Homeostasis model assessment Huyết thanh ngựa (Horse Serum) Nồng độ ức chế 50% Inhibitory κB kinase Interleukin Insulin receptor substrate Jun N-terminal kinase Long chair-CoA Low densyti lipoprotein Sodium carboxy methyl cellulose Nuclear factor κB nonobese diabetic 2,2-diphenyl -1-picrylhydrazyl Obese Adenosine monophosphate activated protein kinase trong đó phân tử threonin172 đã được phosphoryl hóa Phân đoạn Phosphatidylinositol 3 Phosphatidylinositol 3-kinase Peroxisome proliferator-activated receptors protein-tyrosine phosphatase 1B Na+/glucose cotransporter Streptozocin Sulfunylurea receptor Triglycerid Toàn phần Tổ chức y tế thế giới (World Heath Organization) DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU TT NỘI DUNG TRANG 1 Bả ng 1.1. Tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ và tiền ĐTĐ của WHO và ADA Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng trong khẩu phần ăn của chuột thí nghiệm Bảng 2.2 Thành phần phản ứng đánh giá tác dụng ức chế enzym α-amylase Bảng 2.3. Thành phần phản ứng đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase Bảng 2.4. Thành phần phản ứng đánh giá tác dụng ức chế PTP1B Bảng 3.1. Nồng độ glucose máu chuột tăng glucose máu thực nghiệm bằng STZ (150 mg/kg) sau 15 ngày uống mẫu thử Bảng 3.2. Nồng độ glucose máu của chuột cống ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử Bảng 3.3. Nồng độ glucose máu của các lô chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm sau khi uống dung dịch glucose Bảng 3.4. Nồng độ glucose máu của các lô chuột tăng glucose máu bằng STZ (150mg/kg) sau 15 ngày uống các hỗn dịch cắn phân đoạn Bảng 3.5. Nồng độ glucose máu của chuột cống ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống hỗn dịch cắn phân đoạn Bảng 3.6. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất FE1C và chất tham khảo Bảng 3.7. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất FE6B và chất tham khảo Bảng 3.8. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất FE10A và chất tham khảo Bảng 3.9. Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất FB12A và chất tham khảo Bảng 3.10. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất FB2A và tài liệu tham khảo Bảng 3.11. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất FB2B và tài liệu tham khảo Bảng 3.12. Nồng độ insulin huyết thanh của các lô chuột tiêm STZ 150 mg/kg sau 15 ngày uống mẫu thử Bảng 3.13. Ảnh hưởng của chế độ ăn giàu chất béo kết hợp STZ 4 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 11 18 41 49 51 53 59 61 62 65 67 70 71 72 74 77 78 80 81 TT 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 NỘI DUNG (50 mg/kg) trên một số chỉ số sinh học của chuột cống trắng Bảng 3.14. Chức năng tế bào β và chỉ số kháng insulin của các lô chuột cống béo phì tiêm STZ liều 50 mg/kg Bảng 3.15. Nồng độ insulin huyết thanh của chuột cống ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử Bảng 3.16. Nồng độ triglycerid và cholesterol toàn phần huyết thanh của chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử Bảng 3.17. Hoạt độ G6Pase gan của các lô chuột tiêm STZ 150 mg/kg sau 15 ngày uống mẫu thử Bảng 3.18. Hoạt độ enzym G6Pase gan của chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống hỗn dịch cắn toàn phần Bảng 3.19. Kết quả tác dụng ức chế enzym α- amylase in vitro của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu Bảng 3.20. Khả năng ức chế enzym α-amylase của các chất phân lập từ thân cây chuối tiêu Bảng 3.21. IC50 của các chất có tác dụng ức chế α-amylase Bảng 3.22. Kết quả tác dụng ức chế enzym α- glucosidase in vitro của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu Bảng 3.23. Khả năng ức chế enzym α-glucosidase của các chất phân lập từ thân cây chuối tiêu Bảng 3.24. IC50 của các chất có tác dụng ức chế αglucosidase Bảng 3.25. Kết quả tác dụng ức chế PTP1B in vitro của cắn toàn phần Bảng 3.26. Khả năng ức chế PTP1B của của các chất phân lập từ thân cây chuối tiêu Bảng 3.27. IC50 của các chất có tác dụng ức chế PTP1B TRANG 82 83 85 87 88 89 90 90 91 91 92 92 93 93 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ TT NỘI DUNG 1 Hình 1.1. Sự phá hủy của tế bào β trong cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 2 Hình 1.2. Con đường truyền tín hiệu của insulin trong chuyển hóa glucose 3 Hình 1.3. Acid béo tự do với sự kháng insulin 4 Hình 1.4. Cơ chế tác dụng của các thuốc nhóm sulfunylure 5 Hình 1.5. Cơ chế tác dụng của các thuốc ức chế DPP4 6 Hì nh 1.6. Cơ chế tác dụng giảm kháng insulin thông qua hoạt hoá AMPK 7 Hì nh 1.7. Cơ chế truyề n tí n hiê ̣u củ a PPAR 8 Hình 1.8. Liên quan giữa insulin và GLUT4 9 Hình 1.9. Cây chuối tiêu chụp ở xã Giang Sơn, huyện Gia Bình, tỉnh Bắc Ninh (Musa x paradisiaca L.)* 10 Hình 2.1. Thân cây chuối tiêu thu hoạch tại xã Giang Sơn, huyện Gia Bình, tỉnh Bắc Ninh* 11 Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 12 Hình 2.3. Sơ đồ chiết các phân đoạn dịch chiết từ thân cây chuối tiêu 13 Hình 2.4. Sơ đồ quy trình định lượng insulin huyết thanh 14 Hình 2.5. Sơ đồ quy trình thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của mẫu thử trên sự phosphoryl hoá của IRS-1 và AMPK 15 Hình 3.1. So sánh mức hạ glucose máu của các lô chuột thí nghiệm tiêm STZ (150 mg/kg) sau 15 ngày uống mẫu thử 16 Hình 3.2. Mức hạ glucose máu của các lô chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 TRANG 6 7 9 11 13 14 15 19 27 32 37 38 46 54 60 61 ngày uống mẫu thử 17 Hình 3.3. Sự thay đổi nồng độ glucose máu của chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm trong test dung nạp glucose 63 18 Hình 3.4. Sự tồn lưu glucose trong máu của chuột cống ĐTĐ typ 2 thực nghiệm trong test dung nạp glucose đường uống sau 120 phút 64 19 Hình 3.5. Mức hạ glucose máu của các lô chuột tiêm STZ 150 mg/kg sau 15 ngày uống hỗn dịch cắn các phân đoạn Hình 3.6. Mức hạ glucose máu của các lô chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống hỗn dịch cắn phân đoạn Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của hợp chất FE1C 66 20 21 68 71 TT 22 23 24 25 26 27 NỘI DUNG Hình 3.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất FE6B Hình 3.9. Cấu trúc hóa học của hợp chất FE10A Hình 3.10. Cấu trúc hóa học của hợp chất FE12A Hình 3.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất FB2A Hình 3.12. Cấu trúc hóa học của hợp chất FB2B Hình 3.13. Mô bệnh học tụy của các lô chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử (nhuộm HE x 400 lần) TRANG 72 73 75 78 79 84 28 Hình 3.14. Phần trăm hạ cholesterol và triglyceride của các lô chuột thí nghiệm trước và sau khi uống mẫu thử 86 29 Hình 3.15. Phần trăm ức chế hoạt độ enzym G6Pase của các lô chuột tăng glucose máu bởi STZ liều 150mg /kgsau 15 ngày uống mẫu thử 87 30 Hình 3.16. Phần trăm ức chế hoạt độ enzym G6Pase của các lô chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử 89 31 Hình 3.17. Tác dụng của cắn toàn phần ở các nồng độ khác nhau trên lượng IRS-1 phosphoryl hóa ở Ser307 Hình 3.18. So sánh lượng p-IRS-1 (Ser307) giữa các lô ủ với cắn toàn phần ở các nồng độ khác nhau Hình 3.19. Ảnh hưởng của cycloeucalenon (H1) và daucosterol (H2) ở các nồng độ khác nhau trên lượng IRS-1 phosphoryl hóa ở Ser307 Hình 3.20. So sánh lượng p-IRS-1 (Ser307) giữa các lô ủ với cycloeucalenon (H1) và daucosterol (H2) ở các nồng độ khác nhau 94 Hình 3.21. Tác dụng của cắn toàn phần ở các nồng độ khác nhau trên lượng AMPKα phosphoryl hóa ở Thr172 Hình 3.22. So sánh lượng p-AMPKα (Thr172) giữa các lô ủ với cắn toàn phần ở các nồng độ khác nhau Hình 3.23. Tác dụng của cycloeucalenon (H1) và daucosterol (H2) trên lượng AMPK phosphoryl hóa ở Thr172 Hình 3.24: So sánh lượng p-AMPKα (Thr172) giữa các lô ủ với cycloeucalenon (H1) và daucosterol (H2) ở các nồng độ khác nhau Hình 3.25. So sánh mức độ tổng hợp triglycerid của tế bào mô mỡ 3T3-L1 Hình 4.1. Các cơ chế tác dụng hạ glucose máu đã được phát hiện của thân cây chuối tiêu 96 32 33 34 35 36 37 38 39 40 94 95 95 96 97 97 98 131 ĐẶT VẤN ĐỀ Đái tháo đường (ĐTĐ) là một bệnh nội tiết đặc trưng bởi tình trạng tăng glucose máu kèm theo nhiều biểu hiện rối loạn chuyển hóa. Hậu quả của sự tăng glucose máu là những biến chứng nghiêm trọng, có thể đe dọa đến tính mạng của người bệnh. Theo nghiên cứu của Hiệp hội Đái tháo đường quốc tế, năm 2015 số lượng bệnh nhân mắc bệnh là 415 triệu người, chiếm 8,8% dân số thế giới và vẫn tiếp tục gia tăng mạnh, ước tính đến năm 2040 sẽ có khoảng 642 triệu người mắc bệnh ĐTĐ [67]. Sự gia tăng đột biến về tỷ lệ người mắc bệnh ĐTĐ hiện nay đang là một gánh nặng cho ngành y tế. Chi phí để quản lý, chăm sóc và điều trị bệnh rất tốn kém. Theo công bố của tổ chức Y tế thế giới (WHO), chi phí trực tiếp mỗi năm cho bệnh nhân ĐTĐ ước tính khoảng 673 tỷ đô la Mỹ, chiếm khoảng 16,2% ngân sách chăm sóc sức khoẻ của toàn thế giới [181]. Trong những năm qua, số các nghiên cứ u về đái thá o đường đã tăng lên nhanh chó ng. Kết quả là sự ra đời củ a cá c thuố c mớ i và các ứng du ̣ng trong điề u tri,̣ cho phé p thầ y thuố c cũ ng như bê ̣nh nhân có nhiề u sự lựa cho ̣n hơn. Các thuố c điề u tri ̣ ĐTĐ đang đươ ̣c sử du ̣ng cho thấ y nhữ ng hiê ̣u quả nhấ t đinh [19], ̣ [181]. Tuy nhiên, hiê ̣u quả lâu dà i trong viê ̣c ngăn ngừa cá c biế n chứ ng củ a ĐTĐ thông qua kiể m soá t glucose máu vẫn còn hạn chế, đồ ng thờ i nhữ ng phả n ứng bấ t lơ ̣i khi sử du ̣ng thuố c vẫn là một vấn đề đáng lưu ý [110]. Do đó, mô ̣t trong nhữ ng mố i quan tâm hà ng đầ u củ a cá c nhà khoa ho ̣c hiê ̣n nay là viê ̣c tìm ra nhữ ng thuố c mớ i điề u tri ̣ ĐTĐ dựa trên sự khá m phá cá c đich tá c du ̣ng mớ i, ́ nhằ m nâng cao hiê ̣u quả điề u tri ̣ đái thá o đường, đồ ng thờ i giả m đươ ̣c nhữ ng phả n ứng bấ t lơ ̣i. Kế thừa nền y học cổ truyền của dân tộc để từ đó nghiên cứu, sản xuất ra các loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược thiên nhiên hiệu quả và an toàn đang là hướng lựa chọn hợp lý để giải quyết vấn đề này. Từ hướng nghiên cứu đó, đã có nhiều loại thảo dược được nghiên cứu và chứng minh tác dụng hạ glucose máu như: Dây đau xương, Chè xanh, Thổ phục linh... [7], [8],[13]. Cây Chuối tiêu (Musa x paradisiaca L.) được biết đến như một loại thực phẩm và cũng là một vị thuốc. Theo y học cổ truyền, quả chuối tiêu xanh chữa tiêu chảy, kiết lỵ. Chuối tiêu chín có tác dụng nhuận tràng, chữa táo bón, vỏ quả 1 chuối tiêu chữa lỵ, nhựa quả chuối tiêu xanh chữa hắc lào, lá chuối tiêu non giã nát cầm máu vết thương, làm dịu vết bỏng...[3]. Nhiều bộ phận dùng của cây chuối tiêu như quả, lá rễ...đã được nghiên cứu và chứng minh tác dụng hạ glucose máu [89], [150], [151]. Theo kinh nghiệm dân gian của đồng bào dân tộc thiểu số phía bắc Việt Nam và một số quốc gia trên thế giới, phần thân chuối ép lấy nước uống để điều trị ĐTĐ có hiệu quả làm hạ glucose máu [103], [153]. Tuy nhiên, cho đến thời điểm này chưa có tài liệu khoa học nào của Việt Nam nghiên cứu về tác dụng sinh học của thân cây chuối tiêu. Hiện nay, trên thế giới có một vài nghiên cứu về tác dụng hạ glucose máu của thân cây chuối tiêu [89],[163]. Các nghiên cứu chỉ mới ở mức độ sàng lọc, kết quả chưa thống nhất, chưa có một nghiên cứu có hệ thống nào đánh giá được tác dụng và cơ chế tác dụng hạ glucose máu của dược liệu này. Để có những bằng chứng khoa học về tác dụng và cơ chế tác dụng của thân cây chuối tiêu hướng tới ứng dụng trong điều trị ĐTĐ, luận án tiến hành đề tài “Nghiên cứu tác dụng và cơ chế hạ glucose máu của dịch ép thân cây chuối tiêu (Musa x paradisiacal L.) trên thực nghiệm” với 2 mục tiêu: 1. Đánh giá tác dụng hạ glucose máu của cắn toàn phần từ dịch ép thân cây chuối tiêu trên chuột thực nghiệm. 2. Nghiên cứu cơ chế hạ glucose máu của cắn toàn phần và một số chất phân lập từ dịch ép thân cây chuối tiêu. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG 1.1.1. Định nghĩa, dịch tễ, phân loại đái tháo đường 1.1.1.1. Định nghĩa Theo Hiê ̣p hô ̣i Đái thá o đường Hoa Kỳ , bê ̣nh đái thá o đường là mô ̣t tâ ̣p hơ ̣p nhữ ng rố i loa ̣n chuyể n hó a ma ̣n tính đă ̣c trưng bởi sự tăng glucose máu do suy giả m sả n xuấ t insulin và / hoă ̣c do giảm đáp ứng vớ i insulin ta ̣i cá c mô. Sự tăng glucose máu ma ̣n tính trong bê ̣nh đái thá o đường có liên quan mâ ̣t thiế t vớ i nhữ ng tổ n thương lâu dài, rố i loa ̣n và suy giả m chứ c năng của nhiề u cơ quan khá c nhau, đă ̣c biê ̣t là mắ t, thâ ̣n, thầ n kinh, tim và ma ̣ch má u [19]. 1.1.1.2. Dịch tễ Đái thá o đường là bê ̣nh thường gă ̣p nhấ t trong cá c bê ̣nh nô ̣i tiế t, là mô ̣t trong 3 bê ̣nh có tố c đô ̣ phá t triể n nhanh nhấ t trên thế giớ i (ung thư, tim ma ̣ch và ĐTĐ). Trong nhữ ng năm cuố i thế kỷ 20, đầ u thế kỷ 21, ĐTĐ là bê ̣nh không lây phá t triể n nhanh nhấ t [19]. Theo thống kê của Hiệp hội Đái tháo đường quốc tế, năm 2015 số người mắc bệnh ĐTĐ ở các khu vực điển hình như sau: Bắc Mỹ 44,3 triệu người, Châu Âu 58,9 triệu người, Đông Bắc Phi 35,4 triệu người, Nam Mỹ 29,6 triệu người, Đông Nam Á 78,3 triệu người và phía Tây Thái Bình Dương 153 triệu người. Dự tính đến năm 2040, số người mắc bệnh ĐTĐ tại các vùng này càng gia tăng nhanh chóng với số lượng ước tính: Bắc Mỹ 60,5 triệu người, Châu Âu 71,1 triệu người, Đông Bắc Phi 72,1 triệu người, Nam Mỹ 48,8 triệu người, Đông Nam Á 140,2 triệu người và phía Tây Thái Bình Dương 214,8 triệu người [67]. Mă ̣c dù có sự gia tăng cả về ĐTĐ typ 1 và typ 2 nhưng tố c đô ̣ phá t triể n củ a ĐTĐ typ 2 tăng ma ̣nh do sự gia tăng tỷ lê ̣ bé o phì và lố i số ng ít hoa ̣t đô ̣ng thể lực ở cá c nước phá t triể n, cứ 10 người mắ c ĐTĐ thì có 9 người mắ c ĐTĐ typ 2. ̉ Ơ Viê ̣t Nam, năm 2015, số người trong đô ̣ tuổ i từ 20 đế n 79 tuổi mắ c ĐTĐ và o khoả ng 3,5 triệu, chiế m 6,0 % dân số trong đô ̣ tuổ i nà y [67]. Đặc biệt tỷ lệ mắ c ĐTĐ ở nhó m đố i tươ ̣ng có yế u tố nguy cơ, tuổ i từ 30 đế n 64 chiế m tỷ lê ̣ là cao nhất. Tầ n suấ t cá c yế u tố nguy cơ như BMI (Body mass index) cao, vòng eo rô ̣ng, it vâ ̣n đô ̣ng thể lực, gia đinh có người thuô ̣c cá c thế hê ̣ câ ̣n kề mắ c ĐTĐ ́ ̀ cao rõ rê ̣t ở khu vực đồ ng bằ ng, đô thi ̣so vớ i miề n nú i và trung du [1]. 1.1.1.3. Phân loại đái tháo đường Theo phân loa ̣i củ a Hiê ̣p hô ̣i Đái thá o đường Hoa Kỳ (ADA) năm 2017, ĐTĐ đươ ̣c chia thà nh ĐTĐ typ 1, ĐTĐ typ 2, ĐTĐ thứ phá t, ĐTĐ thai kỳ [19]. 3 - Đái thá o đường typ 1: Chiế m 5-10% trong số nhữ ng người mắ c ĐTĐ với đặc điểm tế bà o β đảo tu ̣y bi ̣ phá hủ y gây thiế u hu ̣t insulin tuyê ̣t đố i. Nguyên nhân củ a sự phá hủ y nà y có thể là do tự miễn dich. ̣ - Đái thá o đường typ 2: ĐTĐ typ 2 chiế m khoả ng 90% số người mắ c ĐTĐ. Đó là mô ̣t tâ ̣p hơ ̣p nhữ ng rố i loa ̣n chuyể n hó a do nhiề u nguyên nhân khá c nhau, nhưng đề u có chung đă ̣c điể m: có sự đề khá ng insulin ở mô đich và tiế p theo là ́ sự suy giả m tiế t insulin ở tuyế n tu ̣y. - Đái thá o đường thư phá t: ĐTĐ có thể là hê ̣ quả củ a nhữ ng bê ̣nh lý khá c ́ như: các khuyế t tâ ̣t di truyề n củ a tế bà o β, giả m hoa ̣t tinh củ a insulin do khiế m ́ khuyế t gen, cá c bê ̣nh lý tu ̣y ngoa ̣i tiế t (u tu ̣y, chấ n thương, cắ t bỏ tu ̣y…), cá c bê ̣nh nô ̣i tiế t khá c (u tủ y thươ ̣ng thâ ̣n, u tiế t glucagon, u tiế t somatostatin, hô ̣i chứ ng Cushing…), do dù ng thuố c hoă ̣c hó a chấ t, do nhiễm trù ng và mô ̣t số hô ̣i chứ ng về gen khá c… - Đái thá o đường thai kỳ : Đái tháo đường ở phu ̣ nữ mang thai thường khở i phá t từ tuầ n lễ thứ 24 củ a thai kỳ , đôi khi sớm hơn. Nguyên nhân là sự tăng nhu cầ u insulin khi thai phá t triể n do nhu cầ u cung cấ p năng lươ ̣ng củ a người me ̣. Đồ ng thờ i trong quá trinh mang thai, sự thay đổ i nồ ng đô ̣ estrogen và ̀ progesteron là m thay đổ i chứ c năng tế bà o đảo tu ̣y, gây hiê ̣n tươ ̣ng rố i loa ̣n dung na ̣p glucose tiề m tà ng. Hơn nữa, trong giai đoa ̣n nà y, cơ thể người me ̣ cũ ng sả n xuấ t ra cá c nô ̣i tiế t tố khá c như các lactogen ở nhau thai có tá c du ̣ng khá ng insulin và tăng thoái hóa lipid. 1.1.1.4. Tiêu chuẩ n chẩ n đoán Hiê ̣p hô ̣i Đái thá o đường Hoa Kỳ (ADA) và Tổ chứ c Y tế thế giớ i (WHO) đã đưa ra các tiêu chuẩ n chẩ n đoán ĐTĐ đươ ̣c áp du ̣ng rô ̣ng rai. Tiêu chuẩ n ̃ chẩ n đoán ĐTĐ của 2 tổ chứ c nà y đươ ̣c tó m tắ t trong bả ng 1.1 [19],[181]. Bả ng 1.1. Tiêu chuẩ n chẩ n đoán ĐTĐ và tiền ĐTĐ củ a WHO và ADA Chẩ n đoán WHO (2016) HbA1c FPG G2h (%) (mmol/L) (mmol/L) ADA (2017) HbA1c FPG G2h (%) (mmol/L) (mmol/L) Đái thá o ≥ 7,0 ≥ 11,1 ≥ 7,0 ≥ 11,1 đường ≥ 6,5 ≥ 6,5 Rố i loa ̣n dung na ̣p ≥ 7,8 và ≥ 5,6 và ≥ 7,8 và < 7,0 glucose < 11,1 <7 < 11,1 Rối loạn glucose lú c 6,1 - 6,9 < 7,8 5,6 - 6,9 < 7,8 đói FPG: fasting plasma glucose – glucose huyết tương lú c đói G2h: Glucose huyết tương 2h sau khi uố ng 75g glucose (test dung nạp glucose) 4