Tài liệu Nghiên cứu tăng cường tích lũy một số alkaloid có hoạt tính sinh học từ sinh khối rễ tơ cây bá bệnh (eurycoma longifolia jack) nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 20 lít)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- TRẦN THU TRANG NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG TÍCH LUỸ MỘT SỐ ALKALOID CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ SINH KHỐI RỄ TƠ CÂY BÁ BỆNH (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) NUÔI CẤY TRÊN HỆ THỐNG BIOREACTOR 20 LÍT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội-2020 1 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Trần Thu Trang NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG TÍCH LUỸ MỘT SỐ ALKALOID CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ SINH KHỐI RỄ TƠ CÂY BÁ BỆNH (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) NUÔI CẤY TRÊN HỆ THỐNG BIOREACTOR 20 LÍT Chuyên ngành: Hoá sinh học Mã sỗ: 9 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Chu Nhật Huy 2. PGS.TS. Phạm Bích Ngọc Hà Nội, 2020 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án “Nghiên cứu tăng cường tích luỹ một số alkaloid có hoạt tính sinh học từ sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 20 lít” là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được tác giả công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Tôi xin chịu trách nhiệm về tính chính xác và trung thực của luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả NCS. Trần Thu Trang i LỜI CẢM ƠN Trong biển kiến thức bao la, tôi đã thực sự tìm được con thuyền lớn để theo đuổi đam mê nghiên cứu khoa học. Với vai trò đầu tàu, Thầy, TS. Chu Nhật Huy và Cô, PGS.TS. Phạm Bích Ngọc đã chèo lái, hướng dẫn và giúp đỡ biết bao nhiêu thế hệ sinh viên tiến đến với ước mơ và gặt hái thành công trong cuộc sống và trên con đường nghiên cứu khoa học phục vụ cho sự phát triển của nước nhà. Cảm ơn Thầy, Cô luôn tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm qu ý báu, cũng như không ngừng giúp đỡ để tôi, chỉ dẫn những hướng mới cho nghiên cứu, cũng như đã luôn nhắc nhở để tôi hoàn thành tốt chương trình học và luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy PGS.TS. Chu Hoàng Hà đã gợi ý, chỉ dẫn, giúp đỡ tôi trong những năm học vừa qua. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Công nghệ Tế bào Thực Vật, Phòng Công nghệ Lên men, Phòng Thử nghiệm sinh học, Phòng Dược liệu biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cơ sở đào tạo, Khoa Công nghệ sinh học-Học viện khoa học và công nghệ,Viện Công nghệ sinh học đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cảm ơn GS. T.Kishimoto, trường Đại học Osaka, Nhật Bản đã giúp đỡ tôi thực hiện một phần công trình nghiên cứu của luận án này. Đặc biêt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới các thành viên trong đại gia đình thân yêu của tôi. Nhờ những động viên, khích lệ, đồng hành và chia sẻ khó khăn của những người thân trong gia đình mà tôi luôn có sự quyết tâm và nghị lực cao trong quá trình nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả NCS. Trần Thu Trang ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN...................................................................................................................................i LỜI CẢM ƠN.........................................................................................................................................ii MỤC LỤC...............................................................................................................................................iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT...........................................................................................vi DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................................................vii DANH MỤC CÁC HÌNH...............................................................................................................ix MỞ ĐẦU....................................................................................................................................................1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................................5 1.1. Giới thiệu chung về cây Bá bệnh.................................................................................5 1.1.1. Đặc điểm sinh học và phân bố.........................................................................................5 1.1.2. Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học các alkaloid của cây Bá bệnh...6 1.1.3 Tác dụng dược lý của cây Bá bệnh.................................................................................9 1.2. Ứng dụng của cây Bá bệnh trong Y học cổ truyền.........................................13 1.3. Nuôi cấy sinh khối rễ tơ.................................................................................................14 1.3.1. Giới thiệu về nuôi cấy sinh khối rễ tơ.........................................................................14 1.3.2. Nuôi cấy rễ tơ trên quy mô Bioreactor để thu nhận hợp chất thứ cấp.........18 1.3.3. Ảnh hưởng của elicitor đến tích luỹ các HCTC trong quá trình nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh.......................................................................................................................20 1.3.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về nuôi cấy sinh khối rễ tơ thu nhận các HCTC....................................................................................................................23 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................27 2.1. Vật liệu nghiên cứu...........................................................................................................27 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................................28 2.1.2 . Thiết bị và hoá chất nghiên cứu.....................................................................................28 2.2. Phương pháp nghiên cứu..............................................................................................30 2.2.1. Phương pháp định tính bằng sắc ký lớp mỏng........................................................30 2.2.2. Thực nghiệm chiết cao alkaloid và tách chất sạch...............................................31 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học....................................................................33 iii 2.2.4. Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các alkaloid phân lập được từ rễ tơ cây Bá 2.2.5. bệnh ........................................................................................................ 33 Thực nghiệm và phương pháp định lượng các alkaloid thông qua phương pháp HPLC-DAD.................................................................................... 36 2.2.6. Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tăng trưởng và tích luỹ các alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh trên bình tam giác 500 ml ........................ 37 2.2.7. Xây dựng quy trình nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh trên hệ thống Bioreactor 20 lít ............................................................................ 41 2.3 Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................... 42 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 43 3.1. Xác định cấu trúc hoá học của các chất phân lập được từ cao chiết alkaloid .................................................................................................... 43 3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của các chất phân lập được từ cao chiết alkaloid cảu rễ tơ cây Bá bệnh ....................................................... 47 3.2.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các chất thử (1), (2), (3) ................................................................................................................ 3.2.2. 47 Thử khả năng ức chế sự sản xuất của IL-6 và TNF-α trên tế bào đại thực bào chuột và người kích thích bởi LPS của chất (1), (2), (3) .................... 49 3.3. Xây dựng đường chuẩn định lượng các alkaloid trong các mẫu Bá bệnh bằng phương pháp HPLC-DAD .............................................................. 54 3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tăng trưởng và tích luỹ các chất (1), (2), (3) của rễ tơ trên bình tam giác 500 ml .................................................... 57 3.4.1. Ảnh hưởng trạng thái môi trường đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ cây Bá bệnh .................................................................................................. 57 3.4.2. Ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ Bá bệnh ................................................................................................................ 3.4.3. 58 Ảnh hưởng chiều dài rễ ban đầu đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ cây Bá bệnh ................................................................................................... 59 3.4.4. Ảnh hưởng khối lượng rễ cấy chuyển đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ câyBá bệnh ......................................................................................... 61 iv 3.4.5. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng sinh trưởng và tích luỹ hợp chất (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one trong quá trình nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh.............................................................................62 3.4.6. Ảnh hưởng của jasmonic acid (JA) lên sự tăng sinh và tích luỹ chất (1) 7MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one trong quá trình nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh......................................................................................69 3.4.7. Ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên sự tăng sinh và tích luỹ chất (1) 7MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one trong quá trình nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh......................................................................................72 3.4.8. Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men (YE) lên sự tăng sinh và tích luỹ chất (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one trong quá trình nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh......................................................................................76 3.5. Xây dựng quy trình nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ tơ Bá bệnh trên hệ thống bioreactor 20 lít.......................................................................................................82 3.5.1. Thiết lập hệ thống nuôi cấy.................................................................................................82 3.5.2. Đánh giá sự tích luỹ các alkaloid (1), (2), (3) trong quá trình nuôi cấy rễ tơ trên hệ thống bioreactor 20 lít so với rễ tự nhiên.....................................................87 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................................................90 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ...................................................................92 TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................................93 MỤC LỤC............................................................................................................................................103 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 13C-NMR : Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon) 1H-1H-COSY : 1H-1H Correlated Spectroscopy (Phổ tương tác proton-proton) 1H-NMR : Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) 7-MCPA : 7-methoxy-(9H-b-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid ATCC Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ CĐHST : Chất điều hòa sinh trưởng thực vật Chất (1) : 7-MCPA Chất (2) : 9-methoxycanthin-6-one Chất (3) : 9-hydroxycanthin-6-one d : Dublet dd : Dublet của dublet DEPT : Distortionless Enhancement By polarization Transfer (Phổ DEPT) ĐK-Bb : Xây dựng phương pháp phân tích mẫu Bá bệnh bằng HPLC DMSO : Dimethyl sulfoxyde dq : Dublet của quartet dt : Dublet của triplet HepG2 : Dòng tế bào ung thư gan HPLC : High performance liquid chromatography (sắc ký lỏng hiệu năng cao) HSQC : Heteronuclear Spectroscopy Quantum Coherence (Phổ tương tác dị hạt nhân) IC50 : Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của cá thể nghiên cứu J(Hz) : Hằng số tương tác tính bằng Hz JA : Jasmonic acid KB : Dòng tế bào ung thư biểu mô vi KLK : Khối lượng khô KLT : Khối lượng tươi LPS : Escherichia coli 055:B5 LPS : Lipopolysaccharide LU-1 : Dòng tế bào ung thư phổi m : Multiplet MCF-7 : Dòng tế bào ung thư vú MS : Môi trường Murashige và Skoog – 1962 MS : Murashige & Skoog, 1962 MTT : (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl bromide) NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân PBS : Huyết thanh bò (fetal bovine serum) q Rễ TN : Quartet : Rễ tự nhiên S : singulet SA : Salicylic acid SH : Môi trường Schenk và Hildebrandt - 1972 SH : Schenk and Hidebrandt, 1972 t : Triplet TCA : Acid tricloacetic TLC : Thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng) Trypsin EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid WPM : Môi trường McCown’s Woody Plant - 1981 WPM : McCown’s Woody Plant, 1981 YE : Yeast extract (dịch chiết nấm men) δ (ppm) : Độ chuyển dịch hóa học tính bằng ppm vii tetrazolium Bảng 1.1. DANH MỤC CÁC BẢNG Các thành phần hoá học được phân lập từ cây Bá bệnh và tác dụng dược lý của chúng. .......................................................... Bảng 1.2 Sản xuất hợp chất thứ cấp bằng kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ từ một số loài cây thuốc....................................................................... Bảng 3.1. 25 Kết quả thử hoạt tính độc tế bào ung thư của các chất thử (1), (2), (3)...................................................................................... Bảng 3.2. 10 47 Kết quả xác định nồng độ ức chế sản xuất 50 % IL-6 và TNF-α của tế bào ................................................................................. 51 Bảng 3.3. Kết quả xây dựng đường chuẩn ba alkaloid (1), (2), (3)............ 55 Bảng 3.4. Sự phát triển của rễ tơ Bá bệnh trên môi trường lỏng và thạch. 57 Bảng 3.5 Sự phát triển của rễ tơ ở điều kiện tối và sáng .......................... 59 Bảng 3.6. Ảnh hưởng chiều dài rễ cấy chuyển đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ .................................................................................. 60 Bảng 3.7. Sự phát triển của rễ tơ trên 100 ml môi trường ......................... 62 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến sinh trưởng và phát triển Bảng 3.9. của rễ tơ ................................................................................... 63 Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến tích luỹ chất 7MCPA .. 65 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến tích luỹ 9 - methoxycanthin-6-one .............................................................. 65 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến tích luỹ chất 9 hdroxycanthin-6-one ............................................................... 66 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của JA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh ............................................................... 70 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của SA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh ............................................................... 73 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của YE lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh ............................................................... Bảng 3.15. Hiệu quả tác động của các elicitor lên tích luỹ các alkaloid ...... viii 76 80 Bảng 3.16. Kết quả sau 30 ngày nuôi cấy rễ tơ trên hệ thống bioreactor tự tạo 20 lít 86 Bảng 3.17. Hàm lượng alkaloid có trong rễ tơ và rễ tự nhiên..................................87 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái cây Bá bệnh.........................................................................................5 Hình 1.2 Minh hoạ một số sản phẩm được sản xuất từ cây Bá bênh.................14 Hình 1.3 Hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu............................................................18 Hình 1.4 Cơ chế tác động lên tế bào của elicitor........................................................21 Hình 1.5 Sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh 90 g....................................................................28 Hình 2.1 Rễ tơ nuôi cấy trên môi trường WPM..........................................................27 Hình 2.2 Rễ tơ cây Bá bệnh nuôi cấy trên môi trường WPM...............................27 Hình 2.3 Quy trình chiết cao alkaloid từ sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh..............31 Hình 2.4 Sơ đồ phân lập các chất từ cao chiết alkaloid...........................................32 Hình 2.5 Mô phỏng các bộ phận của hệ thống bioreactor 20 lít sủi bọt 42 dạng cầu tự tạo ......................................................................... Hình 3.1 Sắc ký cột và sắc ký bản mỏng một số phân đoạn cao chiết 43 alkaloid..................................................................................... Hình 3.2 Sắc ký bản mỏng của chất (1), (2), (3) phân lập được từ cao chiết 47 methanol của rễ tơ cây Bá bệnh ................................................ Hình 3.4 Ảnh hưởng của chất 7-MCPA trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7. 49 Hình 3.5 Ảnh hưởng của chất 9-methoxycanthin-6-one trên dòng tế bào 49 ung thư vú MCF-7 .................................................................... Hình 3.5 Kết quả ảnh hưởng của chất (1), (2), (3) lên sự sống của tế bào đại thực bào chuột và người..............................................................................50 Hình 3.6 Chất 7-MCPA ức chế sản xuất IL-6 và TNF-α trên tế bào đại thực vào chuột và người được kích hoạt bởi LPS Hình 3.7 Chất 9-methoxycanthin-6-one ức chế sản xuất IL-6 và TNF-α trên tế bào đại thực vào chuột và người được kích hoạt bởi LPS. Hình 3.8 52 Chất 9-hydroxycanthin-6-one ức chế sản xuất IL -6 và TNF-α trên tế bào đại thực bào chuột và người được kích hoạt bởi LPS Hình 3.9 52 53 Sắc ký đồ của các chất chuẩn (1), (2), (3),...................................................54 Hình 3.10 Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic với nồng độ chất chuẩn 56 x Hình 3.11 Sự phát triển của rễ tơ trên môi trường lỏng và thạch...........................57 Hình 3.12 Sự phát triển của rễ tơ ở điều kiện tối và sáng...........................................59 Hình 3.13 Quá trình mọc đầu sinh trưởng của các đoạn rễ tơ được cắt với kích thước khác nhau 60 Hình 3.14 Ảnh hưởng chiều dài rễ cấy chuyển đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ 60 Hình 3.15 Sự phát triển của rễ tơ trên 100 ml môi trường với lượng rễ ban đầu khác nhau. 62 Hình 3.16 Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ 64 Hình 3.17 Sắc ký HPLC của rễ tơ được nuôi cấy trên môi trường WP..............68 Hình 3.18 Ảnh hưởng của JA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid của rễ tơ Bá bệnh 71 Hình 3.19 Sắc ký HPLC thể hiện hàm lượng alkaloid trong có trong rễ tơ nuôi cấy trên môi trường WPM bổ sung 8 mg/l JA 72 Hình 3.20 Ảnh hưởng của SA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid của rễ tơ Bá bệnh 75 Hình 3.21 Sắc ký HPLC thể hiện hàm lượng các alkaloid có trong rễ tơ nuôi cấy trên môi trường WPM bổ sung 5 mg/l SA 75 Hình 3.22 Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh. 77 Hình 3.23 Sắc ký HPLC thể hiện hàm lượng alkaloid của mẫu rễ tơ nuôi cấy trên môi trường WPM bổ sung 40 mg/l YE 79 Hình 3.24 Nguồn mẫu ban đầu…..........................................................................................82 Hình 3.25 Chuẩn bị bình nuôi cấy bioreactor 20 lít......................................................82 Hình 3.26 Bình thuỷ tinh 20 lít chứa 9,8 lít môi trường..............................................83 Hình 3.27 Chuyển môi trường vào bình bioreactor 20 lít...........................................83 Hình 3.28 Quy trình nuôi cấy rễ tơ trên hệ thống Bioreactor 20 lít.......................85 Hình 3.29 Nuôi cấy rễ tơ trên hệ thống bioreactor 20 lít.............................................86 Hình 3.30 Hàm lượng các alkaloid tích luỹ trong rễ tơ và ở rễ tự nhiên.............87 xi Hình 3.31 Sắc ký bản mỏng các alkaloid, cao chiết tổng MeOH của rễ tơ 88 và rễ TN cây Bá bệnh. .............................................................. Hình 3.32 (A) và (B) Sắc ký HPLC của mẫu rễ tơ được nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 20 lít và rễ tự nhiên cây Bá bệnh xii 89 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) là cây thuốc phổ biến ở nước ta, phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền Trung, Kon tum, Đồng Nai, Phú Quốc và Vườn quốc gia Bái Tử Long. Cây Bá bệnh được dùng bồi bổ sức khoẻ, tăng lượng testosterone ở nam giới, có hoạt tính kháng viêm mạnh, chống ung thư tốt và một số tác dụng khác như chữa sốt rét, chống loãng xương, trị tiểu đường...Các công trình nghiên cứu về cây Bá bệnh cho thấy cây có chứa nhiều hoạt chất alkaloid có giá trị trong kháng sốt rét, chống viêm, gây độc tế bào ung thư và tăng cường sinh lực… Hiện nay, cây Bá bệnh đang bị khai thác quá mức ngoài tự nhiên do nhu cầu sử dụng thảo dược ngày càng tăng. Hơn nữa, Bá bệnh khó nuôi trồng và nhân rộng, với thời gian thu hoạch được rễ có chất lượng phải cần ít nhất 5-6 năm dẫn tới nguồn nguyên liệu cung cấp cho sản xuất dược phẩm còn gặp nhiều khó khăn. Đến nay, nuôi cấy rễ được xem là một giải pháp thay thế đầy tiềm năng để thu nhận ổn định được một lượng lớn sinh khối sạch trong thời gian ngắn từ 3040 ngày, làm nguồn nguyên liệu cho sản xuất dược liệu. Công nghệ nuôi cấy mô sẹo hay nuôi cấy huyền phù tế bào cần phải bổ sung chất điều hoà sinh trưởng (CĐHST). Tuy nhiên, sự tồn dư CĐHST ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ người sử dụng. Vấn đề này có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối rễ tơ do rễ tơ có thể sinh trưởng và phát triển liên tục không cần bổ sung CĐHST. Hơn thế, rễ tơ có nhiều ưu điểm khác như có thể sản xuất một lượng lớn các hợp chất thứ cấp và có sự di truyền ổn định hơn nuôi cấy tế bào huyền phù và mô sẹo . Trong nuôi cấy in vitro, việc gây kích kháng hay bổ sung các elicitor giúp tăng đáng kể khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp trong quá trình nhân nhanh sinh khối rễ. Nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh in vitro, dù môi trường giàu dinh dưỡng giúp rễ phát triển nhanh, nhưng hàm lượng alkaloid phân tích được rất thấp. Hơn nữa, quá trình tích lũy một số chất không diễn ra do thiếu một số yếu tố kích kháng, dẫn đến hàm lượng alkaloid nội sinh thấp hơn so với rễ thu ngoài tự nhiên. Kể từ khi các stress do sự thay đổi về ánh sáng, nhiệt độ hay tác động từ các tác nhâ n gây hại cây trồng được phát hiện làm kích thích tích lũy các hợp chất thứ cấp thông qua con đường truyền tín hiệu của các elicitor như jasmonic acid (JA), salicylic 1 acid (SA), yeast extract (YE)… lần lượt kích hoạt biểu hiện các gen phòng vệ, đồng thời sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp . Các elicitor đã được ứng dụng rộng rãi vào nuôi cấy để gia tăng hoạt chất saponin trong nuôi cấy nhiều loài cây dược liệu quý. Việc nghiên cứu bổ sung các elicitor trong việc tăng cường khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy in vitro vẫn chưa có. Kỹ thuật nuôi cấy mô ra đời đã mở ra một cuộc cách mạng trong nhân giống thực vật. Nhưng với phương pháp truyền thống nuôi cấy trên môi trường thạch thì khó đáp ứng được nhu cầu giống cây trồng cung cấp trên thị tr ường, giá thành lại cao; do việc phải cấy chuyền, tách mẫu bên trong tủ cấy hầu như đều thực hiện bằng tay, tốn nhiều lao động lại d ễ bị nhiễm. Chính vì vậy cần phải có một hệ thống nuôi cấy mới làm sao có thể tự động hóa giúp giảm thiểu nhân công, thời gian và số lượng cây nhiều. Trong nuôi cấy lỏng người ta chia ra ba loại là nuôi cấy lỏng tĩnh, nuôi cấy lỏng lắc và nuôi cấy Bioreactor, tất cả đều được dùng để nuôi cấy huyền phù tế bào, phát sinh cơ quan. Hiện nay đang có xu hướng dùng Bioreactor để nhân sinh khối rễ tơ nhằm thu nhận hoạt chất thứ cấp. Xuất phát từ các cơ sở khoa học và luận cứ trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài nhằm tìm kiếm những alkaloid có hoạt tính sinh học đồng thời nghiên cứu những hoạt tính mới từ những alkaloid từ đó nghiên cứu nuôi cấy tăng tích luỹ hàm lượng các alkaloid bằng cách bổ sung các elicitor. Sau đó, rễ tơ được nghiên cứu nhân sinh khối lớn phục vụ định hướng làm dược liệu bằng cách tối ưu hoá hệ thống bioreactor 20 lít "Nghiên cứu tăng cường tích luỹ một số alkaloid có hoạt tính sinh học từ sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 20 lít”. Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát hoạt tính sinh học của các alkaloid phân lập từ rễ tơ cây Bá bệnh để tìm ra những hoạt tính mới. Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu để rễ tơ cây Bá bệnh sinh trưởng và phát triển. Xác định nồng độ của ba elicitor (Salicylic acid, Jasmonic acid và Yeat extract lên quá trình sản xuất và tích luỹ các alkaloid phân lập được từ rễ tơ cây 2 Bá bệnh in vitro Xây dựng được thống bioreactor 20 lít để nhân sinh khối rễ tơ. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cao chiết alkaloid trong sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh Nội dung 2: Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sinh trưởng rễ tơ và tích luỹ các alkaloid (1) 7-methoxy-(9H-β-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid) (7-MCPA), (2) 9-methoxycanthin-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one trong rễ tơ cây Bá bệnh. Nội dung 3: Xây dựng kỹ thuật nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh trên hệ thống bioreactor 20 lít. Đánh giá hàm lượng của các alkaloid (1) 7MCPA, (2) 9-methoxycanthin-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one có trong sinh khối thu được nuôi cấy ở hệ thống bioreactor 20 lít so với rễ tự nhiên. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Ý nghĩa thực tiễn Luận án xác định được môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và hệ thống nuôi cấy tối ưu cho rễ tơ cây Bá bệnh tăng sinh khối. Đồng thời, luận án giúp nâng cao chất lượng rễ thông qua việc sử dụng các elicitor để tăng hàm lượng các alkaloid như 7-MCPA, 9-methoxycanthin-one và 9-hydroxycanthin-6one. Làm chủ được công nghệ nuôi cấy sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh trên hệ thống bioreactor 20 lít. Kết quả của luận án có thể ứng dụng vào sản xuất sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh trên quy mô lớn nhằm giải quyết vấn đề khan hiếm nguồn nguyên liệu cho sản xuất dược phẩm. Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp các dẫn liệu khoa học mới có giá trị về các nghiên cứu hoạt tính sinh học và tăng cường tích lũy các hợp chất alkaloid trong rễ tơ cây Bá bệnh. Luận án thiết lập được những phương pháp nghiên cứu tăng sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh. Đồng thời luận án cũng là tài liệu tham khảo hữu ích cho việc nghiên cứu và giảng dạy về lĩnh vực hoá sinh, sinh lý thực vật và nuôi cấy mô tế bào thực vật. Những đóng góp mới của luận án 3 Đã phân lập và xác định cấu trúc hoá học được một chất mới (7-MCPA ) từ cao chiết alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh. Đánh giá được hoạt tính mới của ba alkaloid (1) 7-MCPA, (2) 9methoxycanthin-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one như hoạt tính kháng viêm trên dòng tế bào chuột RAW264.7, đại thực bào của chuột và dòng tế bào người THP1 có giá trị IC50 từ 0,95–16,0 µM; hoạt tính gây độc của chất (1), (2) trên các dòng tế bào ung thư KB, MCF-7, Hep-G2, LU-1 và chất (3) trên dòng LU-1. Lần đầu tiên tìm được điều kiện nuôi cấy thích hợp cho rễ tơ cây Bá bệnh tăng trưởng để thu sinh khối và tăng tích luỹ ba hoạt chất 7-MCPA , 9methoxycanthin-6-one và 9-hydroxycanthin-6-one. Xây dựng được h ệ thống bioreactor sục khí dạng cầu 20 lít sử dụng cho nhân sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh với các điều kiện tối ưu. 4 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây Bá bệnh 1.1.1. Đặc điểm sinh học và phân bố Bá bệnh, còn gọi là mật nhân, bách bệnh, mật nhơn, bá bịnh có tên khoa học là Eurycoma longifolia Jack, thuộc họ Simaroubaceae. Phân bố phổ biến nhất ở Miền Trung, cây mọc ở ven rừng còi Kon tum, từ Đồng Nai đến Phú Quốc, cây cũng được tìm thấy tại Vườn quốc gia Bái Tử Long, mọc tự nhiên ở hầu hết các diện tích đ ất rừng tại đây [1]. Ngoài ra, cây còn có ở một số nước Đông Nam Á như Indonesia, Malaysia, Lào, Campuchia và Philippines và vùng ranh giới Ấn Độ - Trung Quốc. Phân loại Giới: Plantae Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Lớp:Magnoliopsida Bộ: Sapindales Họ: Simaroubaceae Chi: Eurycoma Chi: Eurycoma Loài: Longifoloa A Loài: Longifolia B C D Hình 1.1. Hình thái của cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) A-Cây; B-Hoa; C-Quả; D-Rễ Về đặc điểm hình thái thực vật, Bá bệnh là loại cây gỗ nhỏ, thân nhỏ, cao 2-8 m ít phân cành, lúc nhỏ ít khi có nhánh, vỏ và rễ rất đắng. Lá dài, gồm hơn 10 cặp lá chét, mọc đối, hình bầu dục, cuống lá rất ngắn, gốc lá thuôn, đầu nhọn, mặt trên bóng, mặt dưới có lông màu xám. Hoa chùm kép mọc ở thân hoặc đầu cành, hoa màu vàng, ra hoa vào tháng 3-11, 5 cánh hoa, đài hoa có 5-6 lá đài hình tam giác, 5 tiểu nhuỵ. Quả hình trứng dài 1-2 cm, rộng 0,5- 1cm, vỏ nhẵn có rãnh dọc, khi chín quả màu đỏ 5 sẫm chứa 1 hạt. Toàn cây (trừ quả chín) có vị đắng [1]. Cây Bá bệnh non cần nhiều ánh sáng để sinh trưởng. Cây có dạng rễ chùm, lan rộng bám chặt vào đất. Cây thường mọc ở vùng đồi núi có sườn dốc cao hơn mực nước biển chừng 700 m, vùng đất cát có tính axít, nghèo chất dinh dưỡng mọc dưới tán cây, thích hợp ở những nơi có nhiệt độ trung bình 25 0C và độ ẩm khoảng 86% mọc trong các khu rừng ven bờ biển hoặc rừng nguyên sinh, rừng tái sinh và các khu rừng hỗn tạp, rừng thưa, cây ưa axít và đất cát ở độ cao khoảng 700 m so với mực nước biển [1]. 1.1.2 Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học các alkaloid của cây Bá bệnh Với việc được sử dụng khá phổ biến và hiệu quả trong y học cổ truyền, cây Bá bệnh đã sớm được các nhà khoa học trên thế giới để ý. Từ cây này, rất nhiều các hợp chất sinh học thứ cấp đã được tách chiết, tinh sạch, sàng lọc hoạt tính và nhiều trong số chúng có hoạt tính tốt, hứa hẹn khả năng được áp dụng vào thực tiễn. Các hoạt tính thường được thăm dò là: hoạt tính gây độc với các tế bào ung thư, hoạt tính kháng viêm, khả năng chống các gốc oxy hóa… Ngoài ra, tùy theo những tác dụng của loài trong y học dân gian, tùy theo tính chất của các chất, người ta có thể thăm dò các hoạt tính khác như: tính tăng cường sinh lực cho nam giới, ức chế phóng xạ, chống tiểu đường… Dưới đây, chúng tôi xin giới thiệu về những hoạt tính sinh học của các hợp chất alkaloid đã được tách từ loài cây Bá bệnh này. Năm 2004, Kuo và cs đã tách được một số hợp chất từ rễ cây Bá bệnh E. longifolia. Trong đó, có alkaloid 9-methoxycanthin-6-one (1) và canthin-6-one (2) đã chứng minh độc tính mạnh đối với A-549 và các dòng tế bào MCF-7 [2]. (1) (2) Từ loài E. longifolia, Tran Thi Van Anh và cs đã tách được một chất mới eurycomalide C cùng với 27 hợp chất đã biết bao gồm 11 quassinoids, 6 alkaloids, 2 coumarins, 1 squalene derivative, 1 triterpenoid, and 6 phenolic. Các hợp chất 6