Tài liệu Nghiên cứu thành phần hoá học của một số cây thuộc họ na (annonaceae) và khảo sát hoạt tính độc tế bào, hoạt tính chống sốt rét của một số chất phân lập được

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Tr­êng §¹i häc Vinh --------o0o-------- TRẦN ĐĂNG THẠCH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA MỘT SỐ CÂY THUỘC HỌ NA (ANNONACEAE) VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ĐỘC TẾ BÀO, HOẠT TÍNH CHỐNG SỐT RÉT CỦA MỘT SỐ CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC Chuyên ngành: Hoá Hữu cơ Mã số: 60.44.27.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC Vinh - 2012 Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Vinh Người hướng dẫn khoa học: 1, PGS.TS. Nguyễn Văn Hùng 2, PGS.TS. Lê Văn Hạc Phản biện 1: PGS.TS. Nguyễn Quyết Chiến Phản biện 2: PGS.TS. Nguyễn Hải Nam Phản biện 3: PGS.TS. Phan Minh Giang Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp trường họp tại Trường Đại học Vinh vào hồi ...... giờ ....... ngày ........ tháng........ năm ...... Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia - Trung tâm thông tin Nguyễn Thúc Hào – Trường Đại học Vinh 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1. Lý do chọn đề tài Hiện nay môi trường sống bị ô nhiễm nghiêm trọng, ngày càng có nhiều bệnh nguy hiểm như bệnh ung thư, HIV... Nhiều bệnh có thể gây nên đại dịch cho nhân loại như dịch cúm H5N1, H1N1... Ngoài ra, vấn đề kháng thuốc của các loại virus cũng đang là một thách thức lớn với con người. Để phòng ngừa và chữa trị các loại bệnh nguy hiểm này, loài người luôn cần những biệt dược mới có khản năng điều trị hiệu quả và tránh được sự kháng thuốc. Hiện nay có khoảng 60% các loại thuốc có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên. Vì vậy, hóa học các hợp chất thiên nhiên nói chung và đặc biệt là hóa học các hợp chất có hoạt tính sinh học nói riêng được sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học. Tiếp tục theo đuổi hướng nghiên cứu trên, trong khuôn khổ dự án hợp tác quốc tế Pháp-Việt: "Nghiên cứu hoá thực vật của thảm thực vật Việt Nam", chúng tôi đã thử hoạt tính sinh học dịch chiết của một số loài họ Na. Kết quả cho thấy, dịch chiết EtOAc của lá cây Giác đế miên (Goniothalamus tamirensis Pierre), ức chế 67,5 % dòng tế bào ung thư KB ở nồng độ 1 g/ml. Dịch chiết EtOAc của quả cây Lãnh công lông mượt (Fissistigma villosissimum Merr) thể hiện hoạt tính chống sốt rét trên ký sinh trùng Plasmodium facilparum (ức chế 58,3 % ở nồng độ 5 g/ml). Vì vậy chúng tôi chọn đề tài: ''Nghiên cứu thành phần hoá học của một số cây thuộc họ Na (Annonaceae) và khảo sát hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính chống sốt rét của một số chất phân lập được'' 2 2. Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu lá cây Giác đế miên (Goniothalamus tamirensis Pierre) và quả cây Lãnh công lông mượt (Fissistigma villossimum Merr). 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Thu mẫu cây, xử lý, bảo quản và định danh đối tượng nghiên cứu. - Ngâm, chiết các mẫu thực vật để thu được các cao tương ứng. - Phân lập được các chất sạch từ các cao thu được. - Xác định công thức hoá học các hợp chất tách được. - Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết, một số chất phân lập được. 4. Phương pháp nghiên cứu - Các phương pháp chiết với các dung môi hữu cơ để thu được các cao. - Các phương pháp sắc ký, kết tinh,... để tách được các chất sạch. - Các phương pháp phổ chứng minh công thức cấu tạo của các hợp chất sạch tách được từ các đối tượng nghiên cứu. - Các phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào, chống sốt rét. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn, đóng góp mới của luận án Luận án đã phân lập và xác định được 44 hợp chất có trong hai đối tượng nghiên cứu, trong đó có 5 chất mới và một chất lần đầu tiên phân lập được trong tự nhiên. - Đây là lần đầu tiên lá cây Giác đế miên (Goniothalamus tamirensis Pierre) ở Quỳ châu - Nghệ An được nghiên cứu thành phần hoá học và phân lập được 29 hợp chất, bao gồm 12 ancaloit, 1 amino axit, 6 hợp chất styryllacton và 10 hợp chất khác. 3 - Trong số 29 hợp chất đã phân lập được từ lá cây Giác đế miên có một ancaloit là hợp chất mới có tên là 7β,11-dihydroxy-1,2,10-trimetoxynoraporphin, một amino axit mới là: axit 3-amino-4,5-dihydroxy-7phenyl-6-heptenoic và một chất lần đầu phân lập được trong tự nhiên 3,5demetoxypiperolide. - Đây là lần đầu tiên quả cây Lãnh công lông mượt (Fissistigma villossimum Merr) ở Quỳ châu -Nghệ An được nghiên cứu thành phần hoá học và phân lập được 15 hợp chất. - Trong số 15 hợp chất đã phân lập được từ quả cây Lãnh công lông mượt có 3 hợp chất mới có tên là: 1-oxo-4α,7α,11-eudesmanetriol; 1β,4α,7α,11-eudesmanetetraol và 4-O-(1,3-dihydroxyprop 2-yl)-2-metyl1,2,3,4- tetrahydroxybutan. - Đã thử hoạt tính sinh học dịch chiết và một số chất được cho thấy hợp chất N-nornuciferine và chất goniothalamin có hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào KB. 6. Bố cục luận án Luận án gồm 138 trang trong đó có 8 bảng, 77 hình, 7 sơ đồ. Luận án bao gồm các phần sau: Đặt vấn đề (4 trang). Chương 1: Tổng quan (24 trang). Chương 2: Phương pháp nghiên cứu (4 trang). Chương 3: Thực nghiệm (31 trang). Chương 4: Kết quả và thảo luận (57 trang). Kết luận: (2 trang). Danh mục các công trình liên quan luận án (1trang). Tài liệu tham khảo, đã sử dụng 108 tài liệu liên quan (14 trang). 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Phần thứ nhất Trình bày về thực vật họ Na, chi Giác đế và chi Lãnh công, cây Giác đế miên (Goniothalamus tamirensis Pierre), cây Lãnh công lông mượt (Fissistigma villosissimum Merr) và ứng dụng của chúng trong Y học. Cây Giác đế miên Cây Lãnh công lông mượt 1.2. Phần thứ hai Trình bày các nghiên cứu về hoá thực vật chi Giác đế và chi Lãnh công. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Phần thứ nhất: Trình bày các phương pháp phân lập các hợp chất từ các đối tượng nghiên cứu. 2.2. Phần thứ hai: Trình bày các phương pháp xách định công thức phân tử của các chất như phương pháp phổ khác nhau như: Phương pháp phổ hồng ngoại (FT-IR), Khối phổ va chạm (EI-MS), các phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều, hai chiều, Khối phổ phân giải cao (HRMS) và các phương pháp thử hoạt tính sinh học các chất phân lập được. Phép thử gây độc tế bào được tiến hành trên dòng ung thư biểu mô KB. Hoạt tính chống sốt rét được thử với dòng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum. 5 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1. Phần thứ nhất: Quy trình tách các cao và tách các chất sạch Mẫu lá cây Giác đế miên được xử lý theo sơ đồ sau: Mau (10 kg) Etylaxetat/4% dd NH3 (3x50l) 2,5 l (GDM) 1. 2 l HCl 5% 2. Etylaxetat (3x5l) Cao EtOAc KH: GDM1 DD H2O 1. Na2CO3 10% 2. Etylaxetat (3x5l) (GDM1; 54 g) Cao EtOAc KH: GDM2 DD H2O CH2Cl2(3x5l) Cao CH2Cl2 KH: GDM3 (GDM2; 43 g) (GDM3; 4,3 g) Sơ đồ 3.1: Chiết tách lá cây Giác đế miên trong các dung môi GDM3 (4,3 g) CC 100% CH2Cl2 -> 100% MeOH + 4% dd NH3 F1 (0,1 g) F2 (0,23 g) F3 (0,33 g) F5 F6 F7 F4 (0,342 g) (0,51 g) (0,53 g) (0,32 g) F9 F8 (1,02 g) (0,22 g) sephadex sephadex F7.1 F7.2 F7.3 F7.4 F7.5 F7.6 F7.7 F7.8 F7.9 F7.10 (16 mg)(10 mg) (54 mg)(20 mg) (67 mg) (6 mg) (12 mg) (8 mg) (13 mg) (19 mg) BM GT5 GT4 (4,5 mg) (4,2 mg) BM GT12 (6,2 mg) CC GT1 (4,5 mg) F8.1 F8.4 F8.5 F8.2 F8.3 (210 mg)(150 mg) (17 mg) (200 mg) (350 mg) BM GT7 (10 mg) CC GT13 (7 mg) Sơ đồ 3.2: Phân lập cặn GDM3 của lá cây Giác đế miên 6 GDM2 (43 g) 100% CH2Cl2 -> 100% MeOH + 4% dd NH3 F8 F1 F5 F6 F7 F3 F4 F2 F9 F10 F11 (13,25 g) (1,07 g) (1,02 g) (1,14 g) (0,39 g) (1,02 g) (9,02 g) (1,15 g) (3,08 g) (1,05 g) (3,1 g) kt CC CC kt GT15 GT18 GT16 (25 mg) (11 mg) (3 g) GT20 (8,1 mg) CC F6.1 F6.2 F6.3 F6.4 F6.5 F6.6 F6.7 F6.8 (0,02 g) (0,17 g) (0,04 g) (0,09 g) (0,375 g) (0,02 g) (0,15 g) (0,25 g) kt CC GT17 (4,2 mg) sephadex CC CC F11.1 F11.2 F11.3 F11.4 F11.5 (345 mg)(475 mg) (923 mg)(830 mg) (275 mg) GT6 GT14 GT10 (6,2 mg) (4 mg) (5,7 mg) CC F7.1 F7.2 F7.3 F7.4 F7.5 F7.6 F7.7 F7.8 (0,01 g)(0,045 g)(0,05 g) (0,08 g) (0,275 g) (0,2 g) (0,15 g) (0,35 g) F11.3.1 F11.3.2 F11.3.3 F11.3.4 (250 mg) (47 mg) (273 mg) (330 mg) sephadex GT2 (4 mg) sephadex GT8 (5.6 mg) F9.1 F9.2 F9.3 F9.4 F9.5 F9.6 F9.7 F9.8 F9.9 F9.10 F9.11 (0,15 g) (0,1g) (0,12 g) (0,3 g) (0,5 g) (0,1 g) (0,15 g) (0,832 g) (0,22 g) (0,5 g) (0,2 g) sephadex F9.8.1 F9.8.2 F9.8.3 F9.8.4 F9.8.5 F9.8.6 F9.8.7 F9.8.8 F9.8.9 F9.8.10 (60 mg) (40 mg) (89 mg) (35 mg) (67 mg) (78 mg) (56 mg) (83 mg) (35 mg) (70 mg) CC sephadex GT11 (6 mg) sephadex GT9 (6 mg) Sơ đồ 3.3: Phân lập cặn GDM2 của lá cây Giác đế miên 7 GDM1 (54 g) 1. 100% n-hexan ->100% EtOAc 2. 100% EtOAc -> 100% MeOH F1 (25 g) F2 (5,4 g) F3 (1,52 g) CC CC F4 (2,3 g) F4.2 (67 mg) F7 (1,8 g) sephadex CC GT26 GT24 GT27 (9,5 mg) (5 mg) (3 mg) sephadex CC GT19 GT25 GT23 (18 mg) (4 mg) (11 mg) CC GT3 (6 mg) GT28 (3 mg) Sơ đồ 3.4: phân lập cặn GDM1 của lá cây Giác đế miên. Mẫu quả cây Lãnh công lông mượt được xử lý theo sơ đồ sau: MAU (150g) 5 (l) CH2Cl2 Cao CH2Cl2 Mau1 4 (l) MeOH FV (10,5 g) CC F4.4 F5.5 F5.1 F5.2 F5.3 F5.4 (43 mg) (87 mg) (240 mg) (20 mg) (98 mg) (260 mg) F4.3 (806 mg) CC F6 (1,63 g) CC sephadex GT29 GT21 GT22 (1,3 mg) (5,1 mg) (3,3 mg) F4.1 (25 mg) F5 (0,783 g) Cao MeOH MFV (4,6 g) Sơ đồ 3.5. Chiết quả Lãnh công lông mượt trong các dung môi 8 (FV; 10,5 g) CC 100% n-hexan -> 100% EtOAC F1 F4 F3 F5 F6 F2 F7 F8 F10 F11 F9 F12 (0,229 g) (0,069 g) (0,043 g) (0,1g) (0,019 g) (0,49 g) (1,15 g) (0,94 g) (1,94 g) (0,75g) (1,53 g) (0,967 g) CC sephadex CC CC F6.1 F6.3 F6.4 F6.2 (89 mg) (170 mg) (30 mg) (90 mg) FV4 (5,7 mg) CC F10.1 F10.2 F10.3 F10.4 F10.5 (90 mg)(87 mg) (75 mg)(85 mg)(167 mg) FV7 (4,5 mg) sephadex FV8 (2,5 mg) F8.8 F8.1 F8.7 F8.4 F8.5 F8.2 F8.3 F8.6 (98 mg) (76 mg) (68 mg) (94 mg) (75 mg) (90 mg) (80 mg) (87 mg) sephadex CC FV5 FV6 (9,2 mg) (10,8 mg) FV9 (8,5 mg) Sơ đồ 3.6. Phân lập cặn CH2Cl2 quả cây Lãnh công lông mượt (MFV;4,6 g) CC 100% CH2Cl2 -> 100% MeOH F1 F4 F5 F2 F3 F6 F7 F8 F9 F10 F11 (0,8 g) (0,1 g) (0,86 g) (0,17 g) (0,41 g) (0,11 g) (0,12 g) (0,46 g) (0,38 g) (0,1 g) (0,12 g) sephadex CC FV12 (3,3 mg) FV1 FV11 (5,6 mg) (7,6 mg) CC CC FV14 FV10 (15 mg) (14 mg) sephadex sephadex FV13 (8,2 mg) F5.1 F5.4 F5.2 F5.3 (95 mg) (73 mg) (87 mg) (96 mg) CC FV15 (20 mg) CC FV2 FV3 (13 mg) ( 15 mg) Sơ đồ 3.7. Phân lập cặn MeOH quả cây Lãnh công lông mượt 3.2. Phần thứ hai: Nêu các số liệu về phổ của các chất tách được. 9 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Các hợp chất phân lập được từ lá cây Giác đế miên Từ lá cây Giác đế miên đã phân lập được 29 hợp chất. Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng các phương pháp phổ như sau: Hợp chất GT1: có phổ hồng ngoại có đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm chức hydroxyl, max 3458 cm-1. Phổ khối HR-ESI-MS cho pic ion phân tử proton hoá ở m/z 344,14979 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử của GT1 là C19H21NO5. Trên phổ 1H-NMR ở vùng trường thấp, có tín hiệu của 3 proton vòng thơm, trong đó có tín hiệu của 1 singlet ở H 6,95 (1H, s, H-3), 2 tín hiệu doublet ở H 7,08 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-9) và 7,24 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-8), đồng thời có 3 nhóm metoxy ở H 3,70 (3H, s, OCH3), 3,90 (3H, s, OCH3) và 3,92 (3H, s, OCH3). Phổ 13C-NMR và DEPT cho tín hiệu của 19 nguyên tử cacbon tương ứng với 3 nhóm metoxy, 2 nhóm metylen, 3 nhóm metin sp2, 1 nhóm metin sp3, 1 nhóm hydroxymetin và 9 cacbon bậc 4. Phổ tương tác 2 chiều đồng hạt nhân 1H-1H COSY cho thấy tương tác giữa các proton thuộc nhóm CH2-4 (H 2,90 và 3,19) với CH2-5 (H 3,06 và 3,49), tương tác giữa H-7 (H 4,42) với H-6a (H 3,67) và tương tác của proton H-8 (H 7,24) với H-9 (H 7,08). Từ các dữ liệu thu được từ phổ NMR cho phép giả thiết hợp chất GT1 có chứa 2 vòng benzen thế (vòng A và D). Trên phổ HMBC, cho thấy tương tác giữa H-3 (H 6,95) với cacbon C-4 (C 28,2) và CH2-4 (H 2,90 và 3,19) với C-3a (C 131,1), chứng tỏ CH2-4 liên kết với vòng A. Độ chuyển dịch hóa học của CH2-5 và CH-6a cho phép kết luận các nhóm này liên kết với nguyên tử nitơ. Ngoài ra, tương tác HMBC của H-6a (H 3,67) với C-5 (C 42,4) và C-1b (C 124,3) cho thấy liên kết giữa CH-6a với vòng A tại vị trí C-1b và với nhóm 10 CH2-5 thông qua nguyên tử nitơ tạo thành vòng B. Tương tự, nhóm CH-7 có độ chuyển dịch hóa học đặc trưng của nhóm metin gắn kết với nguyên tử oxy được xác định liên kết với vòng D nhờ sự xuất hiện tương tác giữa H-7 (H 4,42) và C-7a (C 133,7) trên phổ HMBC. Mặt khác, hai nhóm metoxy cộng hưởng ở H (3,70 và 3,93) được xác định liên kết tương ứng với C-1 và C-2 của vòng A thông qua tương tác giữa chúng trên phổ HMBC và tương tác giữa nhóm metoxy ở H 3,93 với H-3 (H 6,95) trên phổ NOESY. Đồng thời, tương tác HMBC giữa C-10 (C 150,9) với nhóm metoxy ở H 3,91 cho thấy nhóm metoxy này liên kết với vòng D tại vị trí C-10. Điều này cũng được khẳng định nhờ sự xuất hiện tương tác không gian giữa H-9 (H 7,08) và nhóm metoxy ở H 3,91. Phân tích chi tiết phổ 2D-NMR và đối chiếu với công thức phân tử cho phép xác định công thức phẳng của hợp chất GT1. Cấu hình tương đối của hợp chất GT1 được xác định nhờ phân tích hằng số tương tác proton và phổ NOESY. Trên phổ 1H-NMR, proton H-7 xuất hiện dưới dạng doublet với hằng số tương tác anti J = 11,5 Hz, cho thấy mối tương quan trans-diaxial giữa H-7 và H-6a. Một số tài liệu đã công bố về các hợp chất aporphines có nhóm hydroxyl ở vị trí C-7, phù hợp với chất GT1. Ngoài ra, trên phổ NOESY cũng thấy sự tương tác của H-6a với Hax5, điều này cho thấy H-6a chiếm vị trí axial trên cả hai vòng B và C. Cấu hình tuyệt đối của hợp chất GT1 được xác định bằng phương pháp Mosher. Áp dụng theo mô hình đã được công bố cho phép xác định cấu hình R cho cacbon bất đối C-6a. Dựa vào cấu hình tương đối đã xác định trên đây, cấu hình S được gắn cho C-7. Như vậy hợp chất GT1 là 7 β,11-dihydroxy1,2,10-trimetoxy-noraporphin. Đây là hợp chất ancaloit mới và được đặt tên là gonitamine. 11 4 3 MeO 2 3a A 5 B 1 MeO HO 6a C 11a 7 11 D MeO NH 1b 1a 7a OH 8 10 9 Hình 4.1. Cấu trúc của hợp chất GT1 Hợp chất GT2: thu được dưới dạng tinh thể hình kim, màu nâu, điểm nóng chảy 215-216 oC và có độ quay cực []D28 +0,91 (c, 0,22, CHCl3). Phổ hồng ngoại có đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm chức cacbonyl ở max 1655 cm-1. Phổ khối negative HR-ESI-MS cho pic ion phân tử proton hoá ở m/z 250,10789 [M-H]-, cho phép xác định công thức phân tử C13H17NO4 cho hợp chất GT2. Trên phổ 1H-NMR tại vùng trường thấp, có sự xuất hiện các tín hiệu của năm proton vòng thơm ở H 7,26 (H-4), 7,34 (H-3 + H-5) và 7,46 (H2 + H-6). Ngoài ra, tín hiệu của hai proton olefin ở H 6,42 (H-6’) và 6,74 (H-7’) dưới dạng doublet cũng được ghi nhận. Mặt khác ở vùng aliphatic, tín hiệu của năm proton được quan sát thấy. Phổ 13 C-NMR và DEPT của chất GT2 cho tín hiệu của 13 nguyên tử cacbon, trong đó có 1 cacbonyl ở (C 177,6, C-1’), 1 nhóm metylen ở (C 37,2, C-2’), 1 cacbon sp2 bậc 4 ở (C 138,0, C-1), 5 nhóm metin vòng thơm, 2 nguyên tử cacbon olefin và 3 nhóm metin sp3. Phân tích phổ COSY của hợp chất GT2 cho thấy sự có mặt của nhóm phenyl được xác định nhờ chuỗi tương tác lần lượt của các proton H-2 + H-6 (H 7,46), H-3 + H-5 (H 7,34) và H-4 (H 7,26). Đồng thời chuỗi tương tác xuất phát từ CH2-2’ (H 2,56 và 2,63) đến H-7’ (H 6,74), thông qua các proton H-3’ (H 3,66), H-4’ (H 3,73), H-5’ (H 4,44) và H-6’ (H 6,42) cũng được ghi nhận. Phổ HMBC cho thấy tương tác của H-7’ với C-2 (C 127,6) và C-6 (C 127,6), H-6’ với C-1 (C 138,0). Điều này cho thấy nhóm phenyl liên kết với C-7’. Hơn nữa, tương tác 12 HMBC của nhóm cacbonyl C-1’ (C 177,6) với proton H-3’ (H 7,46) cho phép xác định nhóm cacboxylic ở vị trí cuối mạch. Độ chuyển dịch hóa học của CH-4’ và CH-5’ cho thấy chúng liên kết với nguyên tử oxy trong khi độ chuyển dịch hóa của nhóm CH-3’ đặc trưng cho nhóm liên kết với nguyên tử Nitơ. Ngoài ra, hằng số tương tác giữa H-6’ và H-7’ (J = 16,0 Hz) xác định cấu hình trans giữa C-6’ và C-7’. Kết hợp với công thức phân tử thu được từ phổ HR-ESI-MS, hợp chất GT2 được xác định là axit 3-amino-4,5dihydroxy-7-phenyl-6-heptenoic. Hợp chất này được phân lập lần đầu tiên và được đặt tên là axit gonitamic. 3 OH 2 4 5 1 7' 6' 5' 4' 3' 6 OH 2' 1' COOH NH2 Hình 4.2. Cấu trúc của hợp chất GT2 Hợp chất GT3: được phân lập dưới dạng bột, có màu vàng, điểm nóng chảy 123 oC, có độ quay cực []D20 +105,4 (c, 0,5, CHCl3). Phổ hồng ngoại có đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm chức cacbonyl νmax 1746, 1630 cm-1. Phổ khối HR-ESI-MS cho pic ion phân tử proton hoá ở m/z 197,06021 [M+H]+, tương ứng với công thức phân tử C13H10O2. Từ công thức phân tử này, bảy nối đôi tương đương đã được xác định cho hợp chất GT3. Tại vùng trường thấp trên phổ 1H-NMR, tín hiệu của mười proton được quan sát thấy, trong đó có 5 proton vòng thơm ở H 7,32 (t, J = 7,5 Hz, H-4’), 7,49 (d, J = 7,5 Hz, H-2’ + H-6’), 7,36 (t, J = 7,5 Hz, H-3’ + H-5’) và 5 proton olefinic ở H 6,00 (d, J = 11,5 Hz, H-6), 6,19 (d, J = 5,5 Hz, H-3), 6,82 (d, J = 16,0 Hz, H-8), 7,30 dd (J = 11,5 và 16,0 Hz, H-7), và 7,41 (d, J = 5,5 Hz, H-4). Phổ 13CNMR và DEPT của chất GT3 cho tín hiệu của 13 nguyên tử cacbon, trong đó có 1 cacbonyl ở (C 169,5, C-2), 2 cacbon sp2 bậc 4 và 10 nhóm metin sp2. Trên phổ COSY, sự có mặt của 3 chuỗi tương tác được xác định bao gồm: H- 13 3-H-4, H-6-H-7-H-8 và H2’ + H-6’-H-3’ + H-5’-H4’. Các dữ kiện phân tích này cho thấy sự có mặt của một nhóm phenyl, ba nối đôi và một nhóm cacboxylic. Phổ HMBC cho thấy tương tác xa giữa H-8 (H 6,82) với C-2’ và C-6’ (C 127,2), chứng tỏ nhóm phenyl được liên kết với C-8 tại vị trí C-1’. Đồng thời, cacbon bậc 4 C-5 (C 149,0) cho tương tác với H-7 (H 7,30). Điều này cho phép khẳng định liên kết giữa C-5 và C-6. Độ chuyển dịch hóa học 13C của C-5 cho thấy cacbon này được liên kết với nguyên tử oxy. Mặt khác, H-4 (H 7,41) cho tương tác HMBC với C-6 (C 115,1) và cacbon cacboxylic C-2 (C 169,5). Dữ liệu này cho thấy C-5 liên kết với C-4 và nhóm cacboxylic liên kết với C-3. Đối chiếu với bảy nối đôi tương đương thu được trên đây cho phép xác định sự có mặt của vòng lacton. Cấu hình trans giữa C-7 và C-8 được xác định từ hằng số tương tác mạnh giữa chúng (J = 16,0 Hz). Phân tích chi tiết phổ 2D-NMR cho phép xác định hợp chất GT3 là 3,5-demetoxypiperolide. Hợp chất này đã được tổng hợp trước đây và đây là lần đầu tiên hợp chất này được phân lập từ tự nhiên. 3' 3 2' 4' 5' 1' 6' 4 8 7 5 6 2 O O Hình 4.3. Cấu trúc của hợp chất GT3 4.2. Các hợp chất phân lập được từ quả cây Lãnh công lông mượt Từ quả cây Lãnh công lông mượt đã phân lập được 15 hợp chất. Cấu trúc của các hợp chất phân lập được xác định bằng các phương pháp phổ như trình bày sau: Hợp chất FV1: được phân lập dưới dạng chất vô định hình, tan tốt trong dung môi CHCl3 và có độ quay cực [α]28D -53,2 (c, 1,0, CHCl3). Trên phổ 1H-NMR cho thấy sự có mặt của 4 nhóm metyl singlet ở H 1,27 (H-13), 1,25 (CH3-12), 1,31 (CH3-15) và 1,08 (CH3-14). Phổ 13C-NMR và DEPT cho 14 tín hiệu của 15 nguyên tử cacbon trong đó có 1 cacbon lai hoá sp2 và 14 cacbon lai hoá sp3 tương ứng với 4 nhóm metyl, 5 nhóm metylen, 1 nhóm metin và 5 cacbon bậc bốn trong đó có 1 cacbon của nhóm cacbonyl. Độ chuyển dịch hóa học của cacbon C-4 (C 70,8), C-7 (C 75,4) và C-11 (C 75,6), đặc trưng cho nguyên tử cacbon liên kết với oxy. Từ các quan sát này cho phép giả thiết FV1 là một sesquiterpen. Trên phổ 1H-1H COSY cho thấy sự có mặt của 3 chuỗi tương tác: CH2-2 (H 2,42, 2,60) và CH2-3 (H 1,89, 2,05), giữa H-5 (H 2,19) và CH2-6 (H 1,69, 1,89) và tương tác của CH2-8 (H 1,59 và 1,89) với CH2-9 (H 1,68 và 1,74). Phân tích phổ HMBC cho phép gắn kết các mảnh phân tử của FV1. Theo đó, cacbon bậc bốn C-7 (C 75,4) cho tương tác HMBC với CH2-6 và CH2-8 cho thấy liên kết giữa C-7 với cả 2 cacbon C-6 và C-8. Mặt khác C-10 (C 45,9) tương tác với H-5, CH26 và CH2-8. Ngoài ra, proton của CH3-14 (H 1,08) cho tương tác với C-5 (C 46,9), C-9 (C 30,9) và C-10. Phân tích này cho thấy C-10 liên kết trực tiếp với C-5 và C-9 hình thành vòng A, đồng thời nhóm metyl CH3-14 liên kết với C-10. Trên phổ HMBC, tương tác của C-4 (C 70,8) với H-5, CH2-3 và CH3-15 cũng được ghi nhận, cho thấy liên kết trực tiếp giữa C-4 với C-3 và C-15. Tương tác HMBC của nhóm keton C-1 (C 215,2) với proton của CH22, CH2-3 và CH3-14 cho phép xác định C-1 được kết nối với C-2 và với C-10 của vòng A. Các phân tích trên đây cho thấy sự có mặt của hệ vòng bicyclic trong phân tử FV1. Cuối cùng, tương tác HMBC của các proton của 2 nhóm metyl CH3-12 (H 1,25) và CH3-13 (H 1,27) với 2 cacbon bậc 4 C-7 và C-11 cho phép xác định liên kết của C-11 với C-7 của vòng A. Kết hợp với số khối phân tử, công thức phẳng của FV1 được xác định. Cấu hình tương đối của FV1 được xác định nhờ phân tích hằng số tương tác proton và phổ NOESY. Proton H-5 xuất hiện dưới dạng 2 doublet trên phổ 1H-NMR với 2 hằng số tương tác, một hằng số tương tác gauche (J = 2,5 Hz) và một hằng số tương 15 tác anti (J = 12,5 Hz), chứng tỏ H-5 ở vị trí axial trên vòng A. Trên phổ NOESY CH3-14 ở H 1,08 cho tương tác với CH3-15 ở H 1,31. Điều này cho thấy CH3-14 và CH3-15 đều ở vị trí axial trên vòng B. Phân tích chi tiết phổ 2D-NMR cho phép xác định hợp chất FV1 là 1-oxo-4α,7α,11eudesmanetriol. Đây là một sesquiterpenoit mới và được đặt tên là fissistinone. HO OH H OH O Hình 4.4. Cấu trúc của hợp chất FV1 Hợp chất FV2: được phân lập dưới dạng vô định hình màu trắng. Các tín hiệu từ phổ 1D-NMR của FV2 cho thấy hợp chất này có cùng khung với FV1. Trong đó, điểm khác biệt giữa 2 hợp chất này trên phổ 13C-NMR là sự xuất hiện của nhóm hydroxymetin ở (C 80,2) thay vì nhóm keton trong FV1. Phân tích phổ 1H-1H-COSY cho thấy có 3 chuỗi tương tác: CH2-8 (H 1,51 và 1,81) với CH2-9 (H 1,45 và 1,73), H-5 (H 1,68) với CH2-6 (H 1,68 và 1,68) và chuỗi tương tác từ H-1 (H 3,30,) đến CH2-3 (H 1,58 và 1,81) thông qua CH2-2 (H 1,61 và 1,68). Độ chuyển dịch hóa học của CH-1 cho thấy C-1 liên kết với nguyên tử oxy. Từ các phân tích trên đây cho phép sơ bộ kết luận nhóm keton của hợp chất FV1 đã được khử về nhóm hydroxyl trong phân tử FV2, được khẳng định nhờ phổ HMBC. Proton của nhóm CH3-14 (H 0,88) cho tương tác HMBC với cacbon C-1 (C 80,2), C-5 (C 47,8), C-9 (C 37,3) và C-10 (C 39,9), khẳng định nhóm hydroxyl ở C-1 và nhóm metyl CH3-14 liên kết với C-10. Sự gắn kết của CH3-15 với C-4 của vòng B cũng được khẳng định nhờ tương tác của proton CH3-15 (H 1,11) với C-3 (C 42,2), C-4 (C 72,3) và C-5 (C 47,8). Đồng thời liên kết của nhóm isopropanol với C-7 16 của vòng A cũng được xác định từ tương tác HMBC của proton ở H 1,21 (CH3-12 và CH3-13) với C-11 (C 76,2) và C-7 (C 76,9). Phân tích chi tiết phổ 2D-NMR xác định cấu trúc phẳng của FV2 giống với FV1, chỉ khác nhóm thế hydroxyl ở C-1 thay vì nhóm keton của FV1. Phân tích hằng số tương tác và phổ NOESY cho phép xác định cấu hình tương đối của FV2. Theo đó, H-1 cho 2 hằng số tương tác, bao gồm 1 hằng số tương tác anti (J = 10 Hz) và 1 hằng số tương tác gauche (J = 4,5 Hz). Như vậy, H-1 chiếm giữ vị trí axial. Ngoài ra, trên phổ NOESY còn có tương tác giữa CH3-15 (H 1,11) với CH3-14 (H 0,88), như vậy 2 nhóm metyl này cùng chiếm giữ vị trí axial trên vòng B. Cuối cùng, nhóm isopropanol chiếm giữ vị trí equatorial được xác định thông qua tương tác NOESY của CH3-12 và CH3-13 (H 1,21) với cả 4 proton của 2 nhóm metylen CH2-6 (H 1,68 và 1,68) và CH2-8 (H 1,53, 1,81). Cấu trúc hóa học của FV2 được xác định là 1β,4α,7α,11 eudesmanetetraol. Hợp chất này là một sesquiterpenoit mới và được đặt tên là fissistinol. HO OH H OH OH Hình 4.5. Cấu trúc của hợp chất FV2 Hợp chất FV3: được phân lập dưới dạng dịch dầu màu vàng nhạt, tan tốt trong dung môi MeOH và có độ quay cực [α]28D +7 (c, 1,0, CHCl3). Trên phổ 1H-NMR có tín hiệu của một nhóm metyl ở H 1,14 (s, CH3-5). Ngoài ra còn xuất hiện tín hiệu của 10 proton cộng hưởng trong khoảng từ 3,0 đến 4,0 ppm. Phổ 13 C-NMR và DEPT cho biết tín hiệu của 8 nguyên tử cacbon lai hoá sp3 tương ứng với 1 nhóm metyl, 4 nhóm metylen, 2 nhóm metin và 1 cacbon bậc bốn. Ngoại trừ nhóm metyl, độ chuyển dịch hóa học của các nguyên tử cacbon còn lại đều nằm trong khoảng 63,8 đến 76,2 ppm. Từ các 17 dữ liệu trên đây cho thấy hợp chất FV3 là một cacbonhydrat. Trên phổ COSY cho thấy tương tác giữa H-1’ (H 3,68) với 2 metylen trùng nhau CH22’(H 3,55, 3,61) và CH2-3’ (H 3,55, 3,61). Điều này cho phép giả thiết sự có mặt của glycerol. Ngoài ra, còn xuất hiện tương tác của H-3 (H 3,63) với CH2-4 (H 3,62 và 3,82). Phân tích phổ HMBC cho thấy cacbon bậc 4 C-2 (C 74,9) cho tương tác với CH2-1 (H 3,47, 3,54), H-3 (H 3,63) và CH3-3 (H 1,14). Điều này cho thấy, C-2 liên kết với C-1 và C-3. Đồng thời, tương tác của C-4 (C 63,8) với H-1’ xác định liên kết giữa C-4 và C-1’ thông qua nguyên tử oxy. Hợp chất FV3 được xác định là 4-O-(1,3-dihydroxyprop-2yl)-2-metyl-1,2,3,4-tetrahydroxybutan được phân lập lần đầu tiên. OH 2' HO 1 O 1' 3' 3 OH 2 4 HO 5 HO Hình 4.6. Phổ HMBC của hợp chất FV3 18 4.3. Công thức các hợp chất phân lập được H3CO H3CO H H3CO HO H3CO OH NH OH OH NH H3CO O O O NH2 OH NH H3CO HO H3CO H3CO GT2 GT1 H3CO OH N H3CO HO OCH3 H3CO NH NH H3 CO O O O H3 CO H3CO GT5 GT4 GT3 NH O N O N O H3CO OH GT7 GT6 HO GT8 H3CO N H3CO HO H3CO N O O O O O O O O O HO O OH GT13 GT12 O O H3CO OH GT11 O O O N H3CO GT10 GT9 GT16 GT15 GT14 GT17 O OH O OH H3CO 4''' 5''' 3''' OH 6''' 5' HO 7 8a O 2 1' O 6 5 5a 4 3 8'' O CHO 7'' HO 5'' 6'' COOH OH OH O GT19 H3CO GT20 CHO GT24 H3CO HO COOH OH GT26 OCH3 OH OCH3 HO GT25 H3 CO G22 CHO OH OH GT23 3'' 8''a 4'' 5''a 2' O OH O 3' GT21 2'' 1'' 4' 6' 1 8 H3CO 2''' 1''' GT18 COOH COOH GT27 OCH3 H3 CO 36 HO 1 GT28 2 GT29 Hình 4.7: Các hợp chất phân lập được từ lá cây Giác đế miên