Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây máu chó trái dày (knema pachycarpa) và cây máu chó đá (knema saxatilis)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẦN HỮU GIÁP NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY MÁU CHÓ TRÁI DÀY (KNEMA PACHYCARPA) VÀ CÂY MÁU CHÓ ĐÁ (KNEMA SAXATILIS) Chuyên ngành: Hoá học hữu cơ Mã số: 9.44.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC 1. TS. Lê Nguyễn Thành 2. GS. TS. Nguyễn Văn Hùng HÀ NỘI - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của GS. TS. Nguyễn Văn Hùng và TS. Lê Nguyễn Thành. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Trần Hữu Giáp i LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, sự cảm phục và kính trọng nhất tới GS. TS. Nguyễn Văn Hùng và TS. Lê Nguyễn Thành - những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển cùng tập thể cán bộ của Viện đã quan tâm giúp đỡ và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ cùng tập thể cán bộ của Học viện đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ Trung tâm Nghiên cứu và phát triển thuốcViện Hóa sinh biển về sự ủng hộ to lớn, những lời khuyên bổ ích và những góp ý quý báu trong việc thực hiện và hoàn thiện luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn! Tác giả Trần Hữu Giáp ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................3 1.1. Giới thiệu về chi Máu Chó (Knema) ....................................................................3 1.1.1. Đặc điểm thực vật của chi Máu chó (Knema) ...................................................3 1.1.2. Một số loài máu chó đã đƣợc sử dụng trong y học cổ truyền các nƣớc Đông Nam Á. ........................................................................................................................4 1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Knema .......................................5 1.2.1. Nghiên cứu trong nƣớc .....................................................................................5 1.2.2. Nghiên cứu trên thế giới....................................................................................5 1.2.2.1. Các hợp chất resorcinol ..................................................................................5 1.2.2.2. Các hợp chất anacardic acid ...........................................................................8 1.2.2.3. Các hợp chất cardanol ....................................................................................9 1.2.2.4. Các hợp chất acetophenone ..........................................................................11 1.2.2.5. Các hợp flavonoid ........................................................................................11 1.2.2.6. Các hợp lignan .............................................................................................13 1.2.2.7. Các hợp chất khác ........................................................................................15 1.3. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Knema .......................................18 1.3.1. Hoạt tính chống ung thƣ ..................................................................................19 1.3.2. Hoạt tính liên quan đến hệ thần kinh ..............................................................21 1.3.3. Độc tính trên ký sinh trùng .............................................................................21 1.3.4. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm .............................................................21 1.3.5. Hoạt tính chống oxy hóa .................................................................................22 1.3.6. Hoạt tính kháng lao .........................................................................................22 1.3.7. Hoạt tính chống sốt rét ....................................................................................22 1.3.8. Hoạt tính liên quan đến giảm glucose máu .....................................................22 1.3.9. Hoạt tính chống viêm ......................................................................................22 1.4. Tác dụng ức enzyme acetylcholinesterase (AChE) ...........................................23 1.4.1. Sơ lƣợc về chứng rối loạn nhận thức ..............................................................23 1.4.2. Mối liên hệ giữa chứng sa sút trí tuệ và enzyme acetylcholinesterase ...........23 iii 1.4.3. Các hợp chất thiên nhiên có tác dụng ức chế AChE .......................................24 1.5. Giới thiệu về loài máu chó trái dày và máu chó đá ............................................28 1.5.1. Đặc điểm thực vật loài máu chó trái dày ........................................................28 1.5.2. Đặc điểm thực vật loài máu chó đá .................................................................28 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................30 2.1. MẪU THỰC VẬT .............................................................................................30 2.1.1. Cây máu chó trái dày ......................................................................................30 2.1.2. Cây máu chó đá ...............................................................................................30 2.2. PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT .............................................30 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ..................................................................................30 2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế ...............................................................................30 2.2.3. Sắc ký cột (CC) ...............................................................................................31 2.3. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC ...................................31 2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp) .....................................................................................31 2.3.2. Độ quay cực ([α]D) ..........................................................................................31 2.3.3. Phổ hồng ngoại (IR) ........................................................................................31 2.3.4. Phổ khối lƣợng (MS).......................................................................................31 2.3.5. Phổ cộng hƣởng từ nhân (NMR).....................................................................31 2.3.6. Sắc ký khí khối phổ (GC/MS).........................................................................32 2.4. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC.................................32 2.4.1. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào .............................................32 2.4.2. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme Acetylcholinesterase ..........34 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM ................................................................................36 3.1. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ LOÀI MÁU CHÓ TRÁI DÀY .................36 3.1.1. Phân lập các hợp chất từ quả ...........................................................................36 3.1.2. Phân lập các hợp chất từ thân cành .................................................................39 3.1.3. Phân lập các hợp chất từ lá..............................................................................41 3.2. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ LOÀI MÁU CHÓ ĐÁ ..............................45 3.2.1. Phân lập các hợp chất từ thân cành cây ..........................................................45 3.2.2. Phân lập các hợp chất từ lá cây .......................................................................47 iv 3.3. HẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC .......................................................................................................................49 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................56 4.1. Kết quả phân tích GC/MS cặn chiết n-hexan quả cây máu chó trái dày ...........56 4.2. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ cây máu chó trái dày .....................58 4.2.1. Hợp chất MC1: Knepachycarpic acid A (hợp chất mới) ................................58 4.2.2. Hợp chất MC2: Knepachycarpic acid B (hợp chất mới) ................................65 4.2.3. Hợp chất MC3: Knepachycarpanol A (hợp chất mới) ....................................70 4.2.4. Hợp chất MC4: Knepachycarpanol B (hợp chất mới) ....................................76 4.2.5. Hợp chất MC5: Knepachycarpasinol (hợp chất mới) .....................................81 4.2.6. Hợp chất MC6: (+)-Pinoresinol ......................................................................87 4.2.7. Hợp chất MC7: (+)-epi-Pinoresinol ...............................................................89 4.2.8. Hợp chất MC8: Piperitol .................................................................................91 4.2.9. Hợp chất MC9: Knepachycarpanone A (hợp chất mới) .................................92 4.2.10. Hợp chất MC10: Knepachycarpanone B (hợp chất mới) .............................97 4.2.11. Hợp chất MC11: Knepachycarpanol C (hợp chất mới) ..............................102 4.2.12. Hợp chất MC12: Globulol ..........................................................................106 4.2.13. Hợp chất MC13: β-Caryolanol....................................................................108 4.2.14. Hợp chất MC14: Biochanin A ....................................................................109 4.2.15. Hợp chất MC15: 5,7,3’-Trihydroxy-5’-methoxyl-isoflavone.....................110 4.2.16. Hợp chất MC16: Luteolin ...........................................................................112 4.2.17. Hợp chất MC17: Chrysoeriol ......................................................................113 4.2.18. Hợp chất MC18: Naringenin .......................................................................114 4.2.19. Hợp chất MC19: (+) - Catechin ..................................................................116 4.2.20. Hợp chất MC20: Kaempferol-3-glucoside (Astragalin) .............................117 4.2.21. Hợp chất MC21: Kaempferol-3-O-rutinoside (Nicotiflorine) ....................119 4.2.22. Hợp chất MC22: (7''R, 8''R) Hydnocarpin D ..............................................121 4.2.23. Hợp chất MC23: (7''R, 8''R) Hydnocarpin ..................................................123 4.3. Các hợp chất phân lập từ cây máu chó đá ........................................................129 4.3.1. Hợp chất MC24: Eriodictyol .........................................................................129 v 4.3.2. Hợp chất MC25: Sulfuretin ...........................................................................130 4.3.3. Hợp chất MC26: (+)-Taxifolin......................................................................131 4.3.4. Hợp chất MC27: Procyanidin A1 .................................................................133 4.3.5. Hợp chất MC28: Clovan-2β,9α-diol .............................................................135 4.3.6. Hợp chất MC29: (+)-Isolariciresinol ............................................................136 4.4. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC ....................................................139 4.4.1. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất phân lập từ cây máu chó trái dày....139 4.4.1.1. Hoạt tính ức chế AChE ..............................................................................139 4.4.1.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ loài máu chó trái dày ..............................................................................................................141 4.4.2. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất phân lập từ loài máu chó đá............143 4.4.2.1. Hoạt tính gây độc tế bào ............................................................................143 4.4.2.2. Hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase ..........................................144 KẾT LUẬN .............................................................................................................145 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................146 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ..................147 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................148 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh của một số loài thuộc chi Knema ............................................................ 4 Hình 1.2. Cấu trúc các hợp chất resorcinol từ chi Knema....................................................... 7 Hình 1.3. Cấu trúc các hợp chất anacardic acid từ chi Knema ............................................... 9 Hình 1.4. Cấu trúc các hợp chất cardanol từ chi Knema ....................................................... 11 Hình 1.5. Cấu trúc các hợp chất acetophenone từ chi Knema .............................................. 11 Hình 1.6. Cấu trúc các hợp chất flavonoid từ chi Knema ..................................................... 13 Hình 1.7. Cấu trúc các hợp chất lignan từ chi Knema ........................................................... 15 Hình 1.8. Cấu trúc một số hợp chất khác từ chi Knema........................................................ 17 Hình 1.9. Các ion đặc trƣng cho các nhóm chất phenylalkylphenol .................................... 17 Hình 1.10. Quá trình phân mảnh của dẫn xuất di-trimethylsilyl hợp chất 25 ...................... 18 Hình 1.11. Cấu trúc các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase ................................................................................................................. 27 Hình 1.12. Loài máu chó trái dày (Knema pachycarpa W.J.de Wilde.) [1] ........................ 28 Hình 1.13. Loài máu chó đá (Knema saxatilis W.J.de Wilde) [1]........................................ 29 Hình 3.1. Sơ đồ chiết các phân đoạn mẫu quả máu chó trái dày (K.pachycarpa)............... 38 Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết n-hexan và ethyl acetate quả máu chó trái dày ...................................................................................................................................... 38 Hình 3.3. Sơ đồ chiết các phân đoạn thân cành máu chó trái dày (K. pachycarpa)............ 40 Hình 3.4. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết ethyl acetate thân cành máu chó trái dày ................................................................................................................................................... 40 Hình 3.5. Sơ đồ chiết các phân đoạn lá máu chó trái dày (K. pachycarpa) ......................... 43 Hình 3.6. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết n-hexane lá máu chó trái dày.............. 44 Hình 3.7. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết ethyl acetate lá máu chó trái dày ........ 44 Hình 3.8. Sơ đồ chiết các phân đoạn thân cành máu chó đá (K. saxatilis)........................... 46 Hình 3.9. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết n-butanol thân cành máu chó đá ........ 46 Hình 3.10. Sơ đồ chiết các phân đoạn lá máu chó đá (K. saxatilis)...................................... 48 Hình 3.11. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết EtOAc lá máu chó đá........................ 48 Hình 4.1. Sắc ký đồ GC/MS cặn n-hexan quả cây máu chó trái dày ................................... 57 vii Hình 4.3. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất MC1 ..................................................................... 58 Hình 4.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC1 ........................................................................... 60 Hình 4.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC1 .......................................................................... 60 Hình 4.6. Phổ HSQC của hợp chất MC1 ............................................................................... 61 Hình 4.7. Phổ HMBC của hợp chất MC1 .............................................................................. 62 Hình 4.8. Các tƣơng tác HMBC quan trọng của hợp chất MC1 .......................................... 62 Hình 4.9. Phổ khối phân mảnh của dẫn xuất trimethylsilyl MC1 ........................................ 63 Hình 4.10. Cơ chế phân mảnh của dẫn xuất MC1 di-trimethylsilyl..................................... 63 Hình 4.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất MC2.................................................................... 65 Hình 4.12. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất MC2 ................................................................... 65 Hình 4.13. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC2 ......................................................................... 66 Hình 4.14. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC2........................................................................ 66 Hình 4.15. Phổ HSQC của hợp chất MC2 ............................................................................. 67 Hình 4.16. Phổ HMBC của hợp chất MC2............................................................................ 68 Hình 4.17. Các tƣơng tác HMBC quan trọng của hợp chất MC2 ........................................ 68 Hình 4.18. Phổ khối phân mảnh của dẫn xuất trimethylsilyl MC2 ...................................... 69 Hình 4.19. Cơ chế phân mảnh của dẫn xuất MC2-di-trimethylsilyl .................................... 69 Hình 4.20. Cấu trúc hóa học của hợp chất MC3.................................................................... 70 Hình 4.21. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất MC3 ................................................................... 71 Hình 4.22. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC3 ......................................................................... 72 Hình 4.23. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC3........................................................................ 72 Hình 4.24. Phổ HSQC của hợp chất MC3 ............................................................................. 73 Hình 4.25. Phổ HMBC của hợp chất MC3............................................................................ 74 Hình 4.26. Các tƣơng tác HMBC quan trọng của hợp chất MC3 ........................................ 74 Hình 4.27. Phổ khối phân mảnh của dẫn xuất trimethylsilyl MC3 ...................................... 75 Hình 4.28. Cơ chế phân mảnh của dẫn xuất trimethylsilyl MC3 ......................................... 75 Hình 4.29. Cấu trúc hóa học của hợp chất MC4.................................................................... 76 Hình 4.30. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất MC4 ................................................................... 76 Hình 4.31. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC4 ......................................................................... 77 Hình 4.32. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC4........................................................................ 78 viii Hình 4.33. Phổ HSQC của hợp chất MC4 ............................................................................. 78 Hình 4.34. Phổ HMBC của hợp chất MC4............................................................................ 79 Hình 4.35. Các tƣơng tác HMBC quan trọng của hợp chất MC4 ........................................ 79 Hình 4.36. Phổ khối phân mảnh của dẫn xuất trimethylsilyl MC4 ...................................... 80 Hình 4.37. Cơ chế phân mảnh của dẫn xuất trimethylsilyl MC4 ......................................... 80 Hình 4.38. Cấu trúc hóa học của hợp chất MC5.................................................................... 81 Hình 4.39. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất MC5 ................................................................... 82 Hình 4.40. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC5 ......................................................................... 83 Hình 4.41. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC5........................................................................ 83 Hình 4.42. Phổ HSQC của hợp chất MC5 ............................................................................. 84 Hình 4.43. Phổ HMBC của hợp chất MC5............................................................................ 84 Hình 4.44. Các tƣơng tác HMBC quan trọng của hợp chất MC5 ........................................ 85 Hình 4.45. Phổ khối phân mảnh của dẫn xuất trimethylsilyl MC5 ...................................... 85 Hình 4.46. Cơ chế phân mảnh của dẫn xuất trimethylsilyl MC5 ......................................... 85 Hình 4.47. Cấu trúc hóa học của hợp chất MC6.................................................................... 87 Hình 4.48. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác COSY, HMBC của hợp chất MC7................... 89 Hình 4.49. Cấu trúc hóa học của hợp chất MC8.................................................................... 91 Hình 4.50. Cấu trúc hóa học của hợp chất MC9.................................................................... 92 Hình 4.51. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất MC9 ................................................................... 93 Hình 4.52. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC9......................................................................... 94 Hình 4. 53. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC9....................................................................... 95 Hình 4.54. Phổ HSQC của hợp chất MC9 ............................................................................. 95 Hình 4.55. Phổ HMBC của hợp chất MC9............................................................................ 96 Hình 4.56. Các tƣơng tác HMBC quan trọng của hợp chất MC9 ........................................ 96 Hình 4.57. Cấu trúc hóa học của hợp chất MC10.................................................................. 97 Hình 4.58. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất MC10 ................................................................. 98 Hình 4.59. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC10....................................................................... 99 Hình 4.60. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC10...................................................................... 99 Hình 4.61. Phổ HSQC của hợp chất MC10 ......................................................................... 100 Hình 4.62. Phổ HMBC của hợp chất MC10........................................................................ 100 ix Hình 4.63. Các tƣơng tác HMBC quan trọng của hợp chất MC10 .................................... 101 Hình 4.64. Cấu trúc hóa học của hợp chất MC11................................................................ 102 Hình 4.65. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất MC11 ............................................................... 102 Hình 4.66. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC11..................................................................... 103 Hình 4.67. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC11.................................................................... 104 Hình 4.68. Phổ HSQC của hợp chất MC11 ......................................................................... 104 Hình 4.69. Phổ HMBC của hợp chất MC11........................................................................ 105 Hình 4.70. Các tƣơng tác HMBC quan trọng của hợp chất MC11 .................................... 105 Hình 4.71. Cấu trúc hóa học của hợp chất MC12................................................................ 106 Hình 4.72. Cấu trúc hóa học và của hợp chất MC13........................................................... 108 Hình 4.73. Cấu trúc hóa học và của hợp chất MC14........................................................... 109 Hình 4.74. Cấu trúc hóa học của hợp chất MC15................................................................ 110 Hình 4.75. Cấu trúc hóa học chất MC16.............................................................................. 112 Hình 4.76. Cấu trúc hóa học của hợp chất MC17................................................................ 113 Hình 4.77.Cấu trúc hóa học của hợp chất MC18................................................................. 114 Hình 4.78. Cấu trúc hóa học của hợp chất MC19................................................................ 116 Hình 4.79. Cấu trúc hóa học của hợp chất MC20................................................................ 117 Hình 4.80. Cấu trúc hóa học của hợp chất MC21................................................................ 119 Hình 4.81. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HMBC của hợp chất MC22 ............................ 121 Hình 4.82. Cấu trúc hóa học của hợp chất MC23................................................................ 123 Hình 4.83. Các hợp chất phân lập đƣợc từ loài máuchó trái dày........................................ 127 Hình 4.84.Cấu trúc hóa học và của hợp chất MC24............................................................ 129 Hình 4.85. Cấu trúc hóa học và của hợp chất MC25........................................................... 130 Hình 4.86. Cấu trúc hóa học và của hợp chất MC26........................................................... 131 Hình 4.87. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HMBC của hợp chất MC27 ............................ 133 Hình 4.88. Cấu trúc hóa học của hợp chất MC28................................................................ 135 Hình 4.89. Cấu trúc hóa học và của hợp chất MC29........................................................... 136 Hình 4.90. Các hợp chất phân lập đƣợc từ loài máu chó đá ............................................... 138 x DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các hợp chất resorcinol từ chi Knema..................................................................... 6 Bảng 1.2. Các hợp chất anacardic acid từ chi Knema ............................................................. 8 Bảng 1.3. Các hợp chất cardanol từ chi Knema..................................................................... 10 Bảng 1.4. Các hợp chất acetophenone từ chi Knema ............................................................ 11 Bảng 1.5. Các hợp chất flavonoid từ chi Knema ................................................................... 12 Bảng 1.6. Các hợp chất lignan từ chi Knema......................................................................... 14 Bảng 1.7. Các hợp chất khác từ chi Knema ........................................................................... 16 Bảng 1.8. Một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase.. 25 Bảng 4.1. Thành phần hóa học cặn hexane quả cây máu chó trái dày ................................. 57 Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC1 và hợp chất tham khảo............................. 64 Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC2.................................................................... 69 Bảng 4.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC3.................................................................... 75 Bảng 4.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC4.................................................................... 80 Bảng 4.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC5.................................................................... 86 Bảng 4.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC6 và hợp chất tham khảo............................. 88 Bảng 4.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC7 và hợp chất tham khảo............................. 90 Bảng 4.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC8 và hợp chất tham khảo............................. 91 Bảng 4.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC9.................................................................. 96 Bảng 4.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC10.............................................................. 101 Bảng 4.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC11.............................................................. 105 Bảng 4.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC12 và hợp chất tham khảo....................... 107 Bảng 4.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC13 và hợp chất tham khảo....................... 108 Bảng 4.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC14 và hợp chất tham khảo....................... 110 Bảng 4.16. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC15 và hợp chất tham khảo...................... 111 Bảng 4. 17. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC16 và hợp chất tham khảo...................... 112 Bảng 4.18. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC17 và hợp chất tham khảo....................... 114 Bảng 4.19. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC18 và hợp chất tham khảo....................... 115 Bảng 4.20. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC19 và hợp chất tham khảo....................... 116 Bảng 4.21. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC20 và hợp chất tham khảo....................... 118 xi Bảng 4.22. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC21 và hợp chất tham khảo....................... 120 Bảng 4.23. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC22 và tài liệu tham khảo.......................... 122 Bảng 4.24. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC23 và tài liệu tham khảo.......................... 125 Bảng 4.25. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC24 và hợp chất tham khảo....................... 129 Bảng 4.26. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC25 và hợp chất tham khảo....................... 131 Bảng 4.27. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC26 và hợp chất tham khảo....................... 132 Bảng 4.28. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC27 và hợp chất tham khảo....................... 134 Bảng 4.29. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC28 và hợp chất tham khảo....................... 136 Bảng 4.30. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC29 và hợp chất tham khảo....................... 137 Bảng 4.31. Kết quả thử hoạt tính ức chế AChE................................................................... 139 Bảng 4.32. Kết quả thử độc tế bào của các hợp chất phenylalkylphenol .......................... 142 Bảng 4.33. Kết quả thử độc tế bào hợp chất phân lập cây máu chó đá .............................. 143 xii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải 13 Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Resonance Spectroscopy cacbon 13 Proton Nuclear Magnetic Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Resonance Spectroscopy proton AChE Acetylcholinesterase enzyme Enzyme acetylcholinesterase A-549 Human lung carcinoma Tế bào ung thƣ phổi ngƣời COSY 1 Phổ COSY DEPT Distortionless Enhancement by 1 C-NMR H-NMR H-1H- Correlation Spectroscopy Phổ DEPT Polarisation Transfer DMSO Dimethyl sulfoxide (CH3)2SO ESI-MS Electrospray Ionization Mass Phổ khối ion hóa phun mù điện Spectra tử HeLa HeLa cell Tế bào ung thƣ cổ tử cung Hep G2 Hepatocellular carcinoma Tế bào ung thƣ biểu mô gan HL-60 Human promyelocytic leukemia Tế bào ung thƣ máu HMBC Heteronuclear Mutiple Bond Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua Connectivity nhiều liên kết HR-ESI-MS High Resolution Electrospray Phổ khối lƣợng phân giải cao Ionization Mass Spectrum phun mù điện tử Heteronuclear Single-Quantum Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua 1 Coherence liên kết HT-29 Human colon adenocarcinoma Tế bào ung thƣ ruột kết ngƣời IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tƣợng HSQC thử nghiệm KB Human epidemoid carcinoma K Knema LU-1 Human lung carcinoma Tế bào ung thƣ biểu mô ngƣời Tế bào ung thƣ phổi ngƣời xiii MCF-7 Human breast carcinoma Tế bào ung thƣ vú ngƣời NOESY Nuclear Overhauser Enhancement Phổ NOESY Spectroscopy TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng VERO Monkey epithelial renal Tế bào thƣợng thận khỉ xiv MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với công cuộc phát triển kinh tế thì việc chăm sóc sức khoẻ ban đầu và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng trở nên cấp thiết đối với mọi quốc gia trên thế giới. Do đó, nhu cầu về sử dụng thuốc để phòng ngừa và chữa trị những căn bệnh nan y ngày càng cao. Một trong những hƣớng nghiên cứu để giải quyết vấn đề này là tìm kiếm các hoạt chất có nguồn gốc từ thiên nhiên. Trên thế giới, các nhà khoa học đã tìm ra nhiều loại thuốc mới từ thực vật có hoạt tính mạnh và đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc điều trị bệnh. Việc nghiên cứu thành phần hoá học và khảo sát hoạt tính sinh học không những giúp sử dụng các cây thuốc một cách hiệu quả, mà trên cơ sở đó chúng ta có thể tiến hành tổng hợp hoặc bán tổng hợp các hoạt chất mới có hoạt tính cao hơn và ít tác dụng phụ hơn trong điều trị. Trong những năm gần đây, rất nhiều công trình nghiên cứu về cây thuốc của hệ thực vật Việt Nam đã có những đóng góp quan trọng vào việc chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng. Mô hình nghiên cứu tách chiết và phân lập hoạt chất định hƣớng bằng các phép thử sinh học nhằm tìm kiếm những chất có hoạt tính là mô hình nghiên cứu tiên tiến, có tính định hƣớng cao, nhằm làm sáng tỏ bản chất khoa học của nguồn tài nguyên thiên nhiên và góp phần đƣa nhanh các kết quả nghiên cứu vào áp dụng thực tiễn. Chi Máu chó (Knema) thƣờng đƣợc tìm thấy ở các nƣớc nhiệt đới nhƣ châu Á, châu Phi và Châu Úc. Một số loài thuộc chi Knema đã đƣợc sử dụng trong y học, hạt đƣợc sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị bệnh liên quan đến da hoặc miệng và đau họng [5]. Chi Knema có đặc trƣng là nhựa đỏ nhƣ máu nên đƣợc gọi tên là chi Máu chó. Các nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, chi Knema chứa các lớp chất nhƣ: acetophenone, stilbene, lignan, flavonoid, resorcinol và dẫn xuất phenylalkylphenol. Các loài thuộc chi này thể hiện nhiều hoạt tính đáng quan tâm nhƣ: kháng khuẩn, chống ung thƣ, độc tính tế bào, và ức chế enzyme acetylcholinesterase [5]. Tuy nhiên nghiên cứu về các loài thuộc chi này vẫn còn nhiều hạn chế. Ở Việt Nam, hầu hết các loài thuộc chi Máu chó chƣa đƣợc nghiên cứu, ví dụ nhƣ loài: Máu chó trái dày (Knema pachycarpa), Máu chó đá (Knema 1 saxatilis).Trong quá trình sàng lọc hoạt tính các loài thực vật ở Việt Nam để tìm kiếm các hoạt chất sinh học, chúng tôi phát hiện một số loài thuộc chi Knema thể hiện hoạt tính gây độc tế bào và ức chế enzyme acetylcholinesterase cụ thể nhƣ sau: Dịch chiết ethyl acetate quả loài Máu chó trái dày (Knema pachycarpa) thể hiện khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase 100% ở nồng độ 10 μg/ml và ức chế 44% tế bào ung thƣ biểu mô (KB) ở nồng độ 1 μg/ml. Dịch chiết ethyl acetate từ lá, thân cành và quả loài Máu chó đá (Knema saxatilis) có tác dụng ức chế 100% sự phát triển của dòng tế bào ung thƣ tuyến thƣợng thận (SW13) ở nồng độ 5 µg/ml [1]. Nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Knema ở Việt Nam, chúng tôi lựa chọn đề tài: ―Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây máu chó trái dày (Knema pachycarpa) và cây máu chó đá (Knema saxatilis)‖. Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu để làm rõ thành phần hoá học chủ yếu của cây máu chó trái dày (Knema pachycarpa) và cây máu chó đá (Knema saxatilis). Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase và hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập đƣợc để tìm kiếm một số chất có hoạt tính, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo. Nội dung luận án bao gồm: 1. Phân lập các hợp chất từ 2 loài: Máu chó trái dày (Knema pachycarpa), Máu chó đá (Knema saxatilis) bằng các phƣơng pháp sắc ký. 2. Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập đƣợc bằng các phƣơng pháp vật lý và hóa học. 3. Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của các hợp chất phân lập đƣợc 4. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập đƣợc. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về chi Máu chó (Knema) 1.1.1. Đặc điểm thực vật của chi Máu chó (Knema) Chi Knema (Máu chó) là chi lớn thuộc họ Myristicaceae. Chi này đƣợc phân bố khắp nơi trên thế giới và nhiều nhất tại Ấn Độ, Malaysia, Trung Quốc, Việt Nam. Chi Knema có khoảng hơn 60 loài ở Đông Nam Á [5], Ở Việt Nam chi Knema gồm 14 loài [2, 3]: Knema erratica Sincl. (Máu chó lƣu linh) Knema globularia Warb. (Máu chó cầu) Knema elegans Warb. (Máu chó thanh) Knema lenta Warb. (Máu chó thấu kính) Knema mixta de Wilde. (Máu chó trộn) Knema pachycarpa de Wilde. (Máu chó trái dày) Knema petelotii Merr. (Máu chó Petelot) Knema pierrei Warb. (Máu chó Pierre) Knema poilanei de Wilde. (Máu chó Poilane) Knema saxatilis de Wilde. (Máu chó đá) Knema sessiliflora de Wilde. (Máu chó hoa không cọng) Knema squamulosa de Wilde. (Máu chó vảy nhỏ) Knema tonkinensis de Wilde. (Máu chó Bắc bộ). Knema corticosa Lour. (Máu chó) Mô tả thực vật: Cây to cao có thể tới hơn 10 m. Cành non có lông tơ màu hung đỏ. Lá mọc so le, có cuống, mặt trên bóng. Hoa khác gốc, có lông mịn màu nâu nhạt. Quả hình trứng hay hình cầu, khi chín thì nhẵn, vỏ quả mỏng. Hạt có vỏ mỏng và nhẵn. Phân bố, thu hái và chế biến: Cây máu chó mọc hoang ở khắp miền rừng núi các tỉnh miền Bắc, miền Trung và miền Nam. Vào tháng 9-10 ngƣời ta thu hoạch hạt. Quả máu chó khi còn non có màu xanh, lúc già có màu vàng, để lâu vỏ nứt làm 3 2 mảnh, phía trong có hạt. Ngƣời ta dùng nguyên cả hạt máu chó hay ép lấy dầu dùng [3]. Knema poilanei Knema mixta de wilde Hình 1.1. Hình ảnh của một số loài thuộc chi Knema [1] 1.1.2. Một số loài máu chó đã đƣợc sử dụng trong y học cổ truyền các nƣớc Đông Nam Á. Ở Việt Nam: Hạt máu chó (K. corticosa Lour.) đƣợc nhân dân ta dùng làm chữa ghẻ. Trƣớc đây làng Tiên Hội (Bắc Ninh) sản xuất một loại thuốc ghẻ nổi tiếng gọi là thuốc ghẻ Tiên Hội [3]. Hạt máu chó lá nhỏ (Knema globularia Warb.) thƣờng dùng để chữa ghẻ, ngứa, hắc lào. Dầu hạt máu chó lƣu linh (Knema erratica Sincl.) đƣợc dùng để ăn [4]. Tại Thái Lan: Vỏ thân cây K. furfuraceae đƣợc sử dụng để điều trị viêm loét, mụn nhọt và bệnh ung thƣ. Vỏ thân cây K. globularia đƣợc dùng làm thuốc bổ máu, dầu hạt dùng để chữa bệnh ngoài da [5]. Ở Indonesia, Malaysia, Singapore: Lá loài K. hookeriana Warb. đƣợc sử dụng trong điều trị bệnh dạ dày [5]. Ngoài ra ở Malaysia: Loài K. laurina Warb, đƣợc sử dụng để điều trị bệnh tiêu hóa và sử dụng với công dụng kháng viêm [5]. 4 1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Knema 1.2.1. Nghiên cứu trong nƣớc Trong cuốn ―Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam‖, Giáo sƣ Đỗ Tất Lợi có đề cập sơ lƣợc về thành phần hóa học của loài K. corticosa Lour.: Trong hạt máu chó (K. corticosa Lour.) có 7-10% độ ẩm, 1,5-2% chất vô cơ, 24-28% chất béo, 8% prôtit, 4-5% chất đƣờng, 22-26% tinh bột, ngoài ra còn xenluloza và một số chất khác. Dầu máu chó có màu đỏ sẫm, mùi hắc, rất nhầy, tỷ trọng ở 26oC là 0,94, chỉ số khúc xạ ở 26oC là 1,483, chỉ số axít là 90,2, chỉ số xà phòng là 196,1, chỉ số Iốt 59,55, phần không xà phòng hóa đƣợc là 1,14%, Trong phần không xà phòng hóa đƣợc có phytosterol và lecxitin [3]. Ngoài ra hầu nhƣ chƣa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học về chi Knema đƣợc báo cáo. 1.2.2. Nghiên cứu trên thế giới Các nghiên cứu từ năm 1978 cho đến nay cho thấy có 12 loài thuộc chi Knema đã đƣợc nghiên cứu về thành phần hóa học, bao gồm: K. attenuate, K. austrosiamensis, K. elegans, K. furfuraceae, K. glauca, K. globularia, K. glomerata, K. hookeriana, K. laurina, K. patentinervia, K. stellata subsp. cryptocaryoides. và K. tenuinervia. Các lớp chất đƣợc tìm thấy trong chi này bao gồm resorcinol, anacardic acid, cardanol, acetophenone, stilbene, lignan, flavonoid, và một số hợp chất khác [5]. 1.2.2.1. Các hợp chất resorcinol Các hợp chất resorcinol đƣợc tìm thấy ở các loài: K. austrosiamensis de Wilde., K. furfuraceae Warb., K. glauca Warb., K. elegans Warb., K. glomerata Merr.,và K. laurina Warb. Nghiên cứu đầu tiên đƣợc tiến hành từ năm 1980, khi các nhà khoa học Mỹ xác định thành phần hóa học từ dầu hạt loài K. elegans Warb. Qua nghiên cứu các nhà khoa học đã xác định đƣợc 10 hợp chất thuộc nhóm alkyl resorcinol (15-24) [6]. Những năm tiếp theo nhóm acyl resorcinol đƣợc tìm thấy ở các loài: thân loài K. austrosiamensis de Wilde ở Thái Lan năm 1996 [7], lá loài K. furfuraceae Warb ở Malaysia năm 1993 [8]; quả, thân và lá loài K. glauca Warb ở Thái Lan năm 2009 [9]. Lớp chất resorcinol là một trong những lớp chất chính của 5