Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật vùng ven biển cần giờ, sóc trăng và vịnh hạ long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN VĂN TUẤN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT VÙNG VEN BIỂN CẦN GIỜ, SÓC TRĂNG VÀ VỊNH HẠ LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -------------------------------- NGUYỄN VĂN TUẤN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT VÙNG VEN BIỂN CẦN GIỜ, SÓC TRĂNG VÀ VỊNH HẠ LONG Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 62.44.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS.TS. Nguyễn Thị Hoàng Anh 2. TS. Trần Thị Phương Thảo HÀ NỘI – 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của hai nhà khoa học PGS.TS. Nguyễn Thị Hoàng Anh và TS. Trần Thị Phương Thảo. Các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận án là trung thực, được đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Tác giả Nguyễn Văn Tuấn LỜI CẢM ƠN Luận án được hoàn thành tại phòng Hợp chất thiên nhiên và phòng Tổng hợp hữu cơ – Viện Hóa học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến hai nhà khoa học PGS.TS Nguyễn Thị Hoàng Anh và TS. Trần Thị Phương Thảo đã từng bước hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến tất cả các cô chú, anh chị phòng Nghiên cứu các Hợp chất Thiên nhiên và phòng Tổng hợp Hữu cơ – Viện Hóa học đã hết lòng chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong thời gian tôi tiến hành thực nghiệm tại Viện Hóa học. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa học và Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Cao đẳng Asean đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với sự động viên, giúp đỡ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này. Xin trân trọng cảm ơn! Tác giả Nguyễn Văn Tuấn MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1 H-NMR 13 C-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectrocopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 Resonance Spectrocopy DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Phổ DEPT HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence Phổ tương tác dị nhân đa liên kết HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Phổ tương tác dị nhân đơn liên kết COSY Correlation Spectrocopy Phổ tương quan proton-proton ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Spectrocopy Phổ khối ion hóa bằng phun mù điện tử HR-ESI-MS High Resolution Electron Spray Ionization- Mass Spectrocopy Phổ khối phân giải cao ion hóa bằng phun mù điện tử NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectrocopy Hiệu ứng NOE IR Infrared Spectrocopy Phổ hồng ngoại IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% tế bào thử nghiệm KB Human epidermic carcinoma Ung thư biểu mô ở người HepG2 Human hepatocellular carcinoma Ung thư gan ở người Lu Human lung carcinoma Ung thư phổi ở người MCF-7 Human breast carcinoma Ung thư vú ở người MKN7 Human gastric cancer Ung thư dạ dày ở người NIH/3T3 Nguyên bào sợi của gốc phôi chuột LNCaP Human prostate edenocarcinoma Ung thư tuyến tiền liệt ở người HL-60 Human promyeloccytic leukemia Ung thư máu cấp tính ở người SK-Mel2 Human malignant melanoma Ung thư da ở người SW626 Human ovarian adenocarcinoma Ung thư buồng trứng ở người SW480 Human colon adenocarcinoma Ung thư đại tràng ở người RD Human rhabdomyosarcoma Ung thư cơ vân ở người PBS Dung dịch muối đệm phosphat IL-6 Interleukin 6 Pleiotropic cytokine TNF-α Tumor necrosis factor alpha Yếu tố hoại tử khối u HEPES Acid 4-(2-hydroxyethyl)-1piperazineethanesulfonic MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl LPS Lipopolysaccharides L-NMMA NG-methyl-L-arginine acetate ATCC American Type Culture Collection SRB Sulforhodamine B TBUT Bảo tàng giống chuẩn Hoa Kỳ Tế bào ung thư s Singlet br s Broad singlet d Doublet t Triplet m Multiplet dd Doublet of doublet J Coupling constant δ Hằng số tương tác (Hz) Độ dịch chuyển hóa học, thang δ (ppm) DCM Dichloromethane EtOAc Ethyl acetate MeOH Methanol DMSO Dimethyl Sulfoxide DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH 1 MỞ ĐẦU Hệ thực vật vùng ngập mặn và ven biển Việt Nam đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế tác hại của thiên tai, điều hòa khí hậu, hạn chế xói lở, giữ phù sa, duy trì đa dạng sinh học và là vùng đệm an toàn giữa biển và đất liền. Sự đa dạng của thảm thực vật vùng ngập mặn ven biển không chỉ mang lại lợi ích kinh tế mà còn có giá trị to lớn trong việc khai thác nguồn dược phẩm quý báu này. Trong điều kiện khí hậu khắc nghiệt và rất đặc hữu ở vùng ven biển, các loài thực vật ở đây tạo ra các hợp chất thứ cấp rất phong phú, đóng vai trò quan trọng tạo nên các hoạt tính sinh học thú vị. Rất nhiều loài cây vùng ngập mặn và ven biển đã được sử dụng trong dân gian để phòng và chữa nhiều loại bệnh. Tuy nhiên, chúng đang dần biến mất hoặc bị xóa sổ hoàn toàn do một số yếu tố tác động như nước biển dâng, hoạt động khai thác du lịch, phá rừng ngập mặn để phát triển đô thị, bến cảng, làm đầm nuôi tôm, đổ chất phế thải, sử dụng hóa chất, vv… Vịnh Hạ Long là nơi chứa đựng đầy đủ các giá trị về địa chất, địa mạo và đa dạng sinh học. Ở đó, một số quần xã các loài thực vật khác nhau được tìm thấy như loài ngập mặn, các loài thực vật ở bờ cát ven đảo, các loài mọc trên sườn núi, vách đá vôi, đỉnh núi hoặc ở cửa hang. Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện 19 loài thực vật đặc hữu của Vịnh Hạ Long. Trong đó có một số loài như Hedyotis lecomtei, Allophylus leviscens, Chirita gemella,... Đại đa số các loài thực vật này chưa được nghiên cứu về hóa học và dược lý học. Rừng ngập mặn ven biển Cần Giờ và Sóc Trăng là quần thể các loài động, thực vật trên cạn và thủy sinh được hình thành trên vùng châu thổ rộng lớn của các cửa sông Đồng Nai, Sài Gòn, Vàm Cỏ Đông, Vàm Cỏ Tây. UNESCO đã công nhận đây là khu dự trữ sinh quyển thế giới với hệ động thực vật đa dạng độc đáo và điển hình của vùng ngập mặn với trên 150 loài thực vật. Đây là địa điểm lí tưởng cho công tác nghiên cứu khoa học. Để đóng góp vào việc tìm hiểu, nghiên cứu, đánh giá một cách có hệ thống các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các loài thực vật vùng ven biển và ngập mặn, đồng thời đề xuất hướng khai thác và bảo tồn nguồn gen quý hiếm của các loài thực vật này ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật vùng ven biển Cần Giờ, Sóc Trăng và Vịnh Hạ Long”. 2 Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu thành phần hoá học của hai loài Chirita drakei ở vịnh Hạ Long và Dolichandrone spathacea ở Sóc Trăng nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo. Nội dung luận án bao gồm: 1. Phân lập các hợp chất từ lá và thân cành hai loài Chirita drakei thu hái tại vịnh Hạ Long và Dolichandrone spathacea thu hái tại vùng ngập mặn tỉnh Sóc Trăng bằng phương pháp sắc ký cột. 2. Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp phổ IR, MS, 1D-NMR, 2D-NMR. 3. Đánh giá hoạt tính độc tế bào, hoạt tính kháng viêm, hoạt tính hạ đường huyết, hoạt tính chống oxi hóa và hoạt tính kháng vi sinh vật của các dịch chiết và các hợp chất phân lập được. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung về thực vật vùng Hạ Long 1.1.1. Sơ lược về thực vật Vịnh Hạ Long nổi tiếng với phong cảnh tuyệt đẹp, đã được công nhận là di sản thế giới từ năm 1994. Hạ Long bao gồm hàng nghìn đảo, hầu hết là đảo đá vôi với hình thù kỳ thú nhô lên trên mặt biển. Những đảo đá vôi được bao phủ bởi màu xanh của hệ thực vật càng tô điểm và làm tăng giá trị của di sản thiên nhiên thế giới. Thực vật của Hạ Long rất độc đáo và đa dạng, thảm thực vật trên các đảo ở vịnh Hạ Long được tạo thành từ những quần xã thực vật chủ yếu sau đây: Thảm thực vật ngập mặn, thảm cây bụi trên các sườn và vách đá ở các đảo và thảm thực vật rừng trong các thung lũng núi đá. Cho đến nay hệ thực vật Vịnh Hạ Long được ghi nhận có ít nhất 508 loài, 347 chi thuộc 113 họ thực vật bậc cao có mạch. Trong đó lớp Mộc lan (Magnoliopsida) có 86 họ, 295 chi, 431 loài; lớp Hành (Liliopsida) có 15 họ, 44 chi, 55 loài [1]. Hệ thực vật Hạ Long được ghi nhận có 19 loài thực vật đặc hữu của Việt Nam; trong đó có 15 loài được ghi nhận là các loài đặc hữu hẹp, mới chỉ được tìm thấy trên các đảo Cát Bà, Hạ Long; 4 loài là các loài đặc hữu của vùng Đông Bắc Việt Nam. Tại Hạ Long, ghi nhận có 25 loài thực vật quý hiếm. Ở mức độ quốc gia, có 21 loài thực vật phân bố ở Hạ Long có tên trong Sách Đỏ Việt Nam (2007), trong đó có 1 loài ở cấp độ rất nguy cấp (CR), 7 loài ở cấp độ nguy cấp (EN), 13 loài ở cấp độ sẽ nguy cấp (VU); 6 loài có tên trong Phụ lục của Nghị định số 32 2006-NĐCP, trong đó 1 loài thuộc nhóm I (nghiêm cấm mọi hình thức khai thác buôn bán với mục đích thương mại), 5 loài thuộc nhóm II (hạn chế khai thác buôn bán với mục đích thương mại). Ở cấp độ quốc tế, có 1 loài xếp ở mức nguy cấp (EN) và 1 loài ở mức gần bị đe dọa (NT) [1]. Các nhà khoa học trong nước đã và đang tích cực tìm hiểu, nghiên cứu, đánh giá, góp phần bảo vệ, duy trì, khai thác nguồn gen quí hiếm của các loài thực vật đặc hữu ở vùng Vịnh Hạ long. Tuy nhiên, đại đa số các loài thực vật này chưa được nghiên cứu về hóa học và dược lý học 4 Bảng 1.1. Các loài thực vật đặc hữu được phân bố trên các đảo ở vịnh Hạ long [1] STT 1 Tên khoa học Schefflera alongensis R. Vig. Livistona halongensis Kiew & T. H. Nguyen Impatiens halongensis Kiew & T. H. Nguyen Cycas tropophylla K. D. Hill & P. K. Lôc Chirita drakei Burtt. Tên Việt Nam Ngũ gia bì hạ long Họ thực vật Araliaceae Cọ hạ long Arecaceae Bóng nước hạ long Balsaminaceae Tuế hạ long Cycadaceae Cày rita drake Gesneriaceae Cầy ri một cặp Gesneriaceae Cầy ri hạ long Gesneriaceae Cầy ri hiệp Gesneriaceae Cầy ri ôn hoà Gesneriaceae Song bế hạ long Gesneriaceae Nô hạ long Lauraceae Mun rô cuống dài Meliaceae Sung hạ long Moraceae 14 Chirita gemella D. Wood. Chirita halongensis Kiew & T. H. Nguyen Chirita hiepii Kiew & T. H. Nguyen Chirita modesta Kiew & T. H. Nguyen Paraboea halongensis Kiew & T. H. Nguyen Neolitsea alonngensis Lecomte Munronia petiolata N. T. Cuong, D. T. Hoan & Mabb. Ficus superba var. alongensis Ardisia pedalis Cơm nguội chân Myrsinaceae 15 Jasminum alongensis Nhài hạ long Oleaceae 16 Hedyotis lecomtei An điền hạ long Rubiaceae 17 Allophylus leviscens Ngoại mộc tai Sapindaceae 18 Pilea alongensis Nan ông hạ long Urticaceae 19 Alpinia calcicola Riềng núi đá Zingiberaceae 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Ghi chú Đặc hữu của Cát Bà, Hạ Long Đặc hữu của Cát Bà, Hạ Long Đặc hữu của Cát Bà, Hạ Long Đặc hữu của Cát Bà, Hạ Long Đặc hữu vùng Đông Bắc Đặc hữu của Cát Bà, Hạ Long Đặc hữu của Cát Bà, Hạ Long Đặc hữu của Cát Bà, Hạ Long Đặc hữu của Cát Bà, Hạ Long Đặc hữu của Cát Bà, Hạ Long Đặc hữu của Cát Bà, Hạ Long Đặc hữu của Cát Bà, Hạ Long Đặc hữu của Cát Bà, Hạ Long Đặc hữu vùng Đông Bắc Đặc hữu của Cát Bà, Hạ Long Đặc hữu vùng Đông Bắc Đặc hữu vùng Đông Bắc Đặc hữu của Cát Bà, Hạ Long Đặc hữu của Cát Bà, Hạ Long 1.1.2. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật đặc hữu ở vịnh Hạ Long 1.1.2.1. Thành phần hóa học 5 Cho đến nay mới chỉ có một số tài liệu của nhóm tác giả Phạm Đức Thắng và Khiếu Thị Tâm công bố về thành phần hóa học của loài cọ Hạ Long Livistona halongensis [2] và loài Ngoại Mộc Tái Allophylus leviscens [3]. Kết quả cho thấy có rất nhiều hợp chất có cấu trúc lý thú thuộc các lớp chất như sterol, flavan và các hợp chất khác.  Các hợp chất triterpenoid khung sterol: Các steroid cyclomusalenon (1), cycloleucadenon (2), 3β-cyclomusalenol (3) có nhóm thế methyl ở vị trí C-4, C-13, C-14, một vòng cyclopropan ở vị trí C-9 và C-10 và nhóm thế 2,3-dimethylhept-1en-7-yl đã được phân lập. Cùng với các phytosterol, stigmast-4-en-3-on (4), stigmasterol (5), β-sitosterol (6), daucosterol (7) cũng được tìm thấy ở loài Livistona halongensis [2].  Các hợp chất flavonoid khung flavan: 2S,3S-3,5,7,3’-tetrahydroxy-5’methoxyflavan (8), 2R,3R-3,7,3’-trihydroxy-5’-methoxyflavan glucopyranoside (9) [2] và catechin (10) [3]. 5-O-- 6  Các hợp chất khác: 6-O-acetyl-2R,8-dimethyl-2-(4R,8R,11-trimethyl tridecence-12)chroman (11) [3], 3,5,3’,5’-tetrahydroxy-4-methoxystilben (12), sacharose octaacetate (13), 1,6,10,14-phytatetraen-3-ol (14) [2]. 1.1.2.2. Hoạt tính sinh học Kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học một số loài thực vật đặc hữu vùng vịnh Hạ Long cho thấy dịch chiết dichloromethane từ rễ cây Cọ Hạ Long có hoạt tính ức chế sự phát triển của 3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm là KB (ung thư biểu mô), LU (ung thư phổi) và HepG2 (ung thư gan) với các giá trị IC50 trong khoảng từ 24,15-96,48 μg/ml. Đồng thời dịch chiết này cũng thể hiện khả năng kháng các chủng vi khuẩn Gram (+) là Lactobacillus fermentum, Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus với giá trị IC50 lần lượt là 12,57; 155,83 và 56,68 μg/ml. Trong số các chất phân lập được thử hoạt tính, chất 8 thể hiện hoạt tính gây độc với bốn dòng tế bào ung thư thử nghiệm ở người gồm: ung thư biểu mô (KB), ung thư phổi (LU), ung thư vú (MCF7), ung thư gan (HepG2) ở mức độ trung bình với các giá trị IC50 tương ứng 53,0; 68,37; 85; 72,29 g/ml [2]. Chất 9 thể hiện khả năng kháng chủng vi khuẩn Gram (+) Staphylococcus aureus với giá trị IC50 27,76 μg/ml [2]. Theo tra cứu tài liệu, hoạt tính sinh học của các loài thực vật đặc hữu khác ở vịnh Hạ Long cho đến nay chưa được nghiên cứu. 1.1.3. Tổng quan về chi Chirita, họ Rau tai voi (Gesneriaceae) Họ Gesneriaceae gồm có 150 chi và 3000 loài phân bố ở các vùng nhiệt đới trên thế giới. Các loài thuộc họ này chủ yếu là các loài thảo mộc, dây leo hoặc cây bụi, một số loài được sử dụng làm cây cảnh và một số loài được sử dụng trong y học cổ truyền chủ yếu chống lại sốt, ho, cảm lạnh, rắn cắn, đau nhức, các bệnh truyền nhiễm và viêm. Mặc dù, Gesneriaceae là một họ lớn nhưng vài thập kỉ qua 7 chỉ có vài loài được nghiên cứu về thành phần hóa học. Tổng cộng có 300 hợp chất đã được báo cáo ở các loài thuộc họ Gesneriaceae bao gồm các nhóm chất flavonoid, terpenoid, steroid, phenol glucoside, phenol đơn giản, quinone, lignan, xanthone và hợp chất với bộ khung khác [4]. 1.1.3.1. Chi Chirita trên thế giới Chi Chirita thuộc họ Rau tai voi (Gesneriaceae) có nguồn gốc từ Indonesia, Malaysia và miền nam Trung Quốc. Theo các tài liệu đã công bố, đến nay các nhà khoa học đã phát hiện được trên 180 loài và khoảng 100 loài trong số đó là cây đặc hữu của Trung Quốc (bảng 1.2) [5]. Các loài thảo mộc thuộc chi Chirita được tìm thấy ở Ấn Độ, các nước Đông Nam Á và được trồng để làm cảnh. Cây cao từ 40–50 cm, thân mềm, dễ gãy, có lông mịn, lá hình trái tim, hoa năm cánh không đều, đa số có màu xanh tím sẫm, ngoài ra còn có những màu khác [6]. Bảng 1.2. Danh sách các loài thực vật thuộc chi Chirita [5] STT Tên khoa học STT Tên khoa học 1 C. adenonema Hilliard 94 C. longii Z.Y. Li 2 C. anachoreta Hance 95 C. longipedicellata B.L. Burtt 3 C. angusta (C.B. Clarke) Theob. & Grupe 96 C. lunglinensis W.T. Wang 4 C. annamensis Pellegr 97 C. lungzhouensis W.T. Wang 5 C. aratriformis D. Wood 98 C. lutea Y. Liu & Y.G. Wei 6 C. asperifolia (Blume) B.L. Burtt 99 C. luzhaiensis Yan Liu, Y.S. Huang & W.B. Xu 7 C. atroglandulosa W.T. Wang 100 C. macrodonta D. Fang & D.H. Qin 8 C. atropurpurea W.T. Wang 101 C. macrophylla Wall. 9 C. auriculata J.M. Li & S.X. Zhu 102 C. macrorhiza D. Fang & D.H. Qin 10 C. baishouensis Y.G. Wei, H.Q. Wen & S.H. Zhong 103 C. maguanensis Z.Y. Li, H. Jiang & H. Xu 11 C. balansae Drake 104 C. marcanii Craib 12 C. bicolor W.T. Wang 105 C. medica D. Fang ex W.T. Wang 13 C. bifolia D. Don 106 C. micromusa B.L. Burtt 14 C. bimaculata D. Wood 107 C. minutihamata D. Wood 15 C. bogneriana B.L. Burtt 108 C. minutimaculata D. Fang & W.T. Wan 16 C. brachystigma W.T. Wang 109 C. mishmiensis Debbarman ex Biswas 17 C. brachytricha W.T. Wang & D.Y. Chen 110 C. modesta R. Kiew & T.H. Nguyen 18 C. brassicoides W.T. Wang 111 C. mollifolia D. Fang, Y.G. Wei & J. Murata 19 C. briggsioides W.T. Wang 112 C. mollis Miq.