Tài liệu Nghiên cứu thiết lập quy trình định lượng hbv rna huyết tương ở bệnh nhân viêm gan b mạn tính​

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- TRIỆU THỊ NGUYỆT NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HBV-RNA HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Triệu Thị Nguyệt NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HBV-RNA HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Hồ Hữu Thọ - Viện nghiên cứu Y Dược Học Quân sự - HVQY TS. Mai Thị Đàm Linh – Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội – Năm 2019 LỜI CẢM ƠN Lời cảm ơn đầu tiên tôi xin trân trọng gửi tới TS. Hồ Hữu Thọ - Viện nghiên cứu Y Dược học quân sự - Học viện Quân Y, người thầy đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Mai Thị Đàm Linh- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, người thầy đã hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và anh chị trong Phòng Công nghệ gen và Di truyền tế bào - Viện nghiên cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân Y vì các thầy cô và anh chị đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài tại phòng. Tôi đặc biệt cảm ơn CN. Vũ Nguyễn Quỳnh Anh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, các cô giáo trong bộ môn Vi sinh vật học cùng các thầy cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã hết lòng giảng dạy kiến thức khoa học cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Hà Nội, 10 tháng 01 năm 2020 Học viên Triệu Thị Nguyệt MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT...................................................................................7 DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................8 DANH MỤC BẢNG .................................................................................................10 Chương 1 - TỔNG QUAN ..........................................................................................3 1.1. Tổng quan về HBV ........................................................................................3 1.1.1. Đặc điểm phân loại HBV.....................................................................3 1.1.2. Đặc điểm hình thái HBV .....................................................................4 1.1.3. Cấu trúc hệ gen HBV...........................................................................5 1.1.4. Các protein HBV .................................................................................7 1.1.5. Lựa chọn vùng gen cho thiết kế mồi, probe ......................................10 1.1.6. Chu trình nhân lên của HBV .............................................................12 1.1.7. Con đường lây nhiễm của virus HBV ................................................14 1.2. Tổng quan về viêm gan B mạn tính.............................................................15 1.2.1. HBV và viêm gan B ...........................................................................15 1.2.2. Tình hình nhiễm HBV trên thế giới ...................................................16 1.3. Tình hình nghiên cứu HBV .........................................................................18 1.3.1. Trên thế giới ............................................................................................18 1.3.2. Trong nước ........................................................................................21 1.4. Tính mới và tính sáng tạo của đề tài ............................................................23 Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................26 2.1. Đối tượng, vật liệu, hóa chất nghiên cứu .......................................................26 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................26 2.1.2. Vật liệu, hóa chất ....................................................................................27 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................28 2.2.1 . Thiết kế nghiên cứu ................................................................................28 2.2.2. Thu thập, bảo quản mẫu .........................................................................29 2.2.3. Tách chiết acid nucleic ...........................................................................29 2.2.4. Xây dựng quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương .....29 2.2.5. Tối ưu quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA ..............................32 Tối ưu nhiệt độ bước phiên mã ngược: .............................................................34 Tối ưu thời gian của bước phiên mã ngược ......................................................35 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi ....................................................................................36 Tối ưu thời gian luân nhiệt ................................................................................36 Tối ưu nồng độ mồi ...........................................................................................37 Tối ưu nồng độ probe ........................................................................................37 Các chất phụ gia trong phản ứng RT-qPCR .....................................................38 2.2.6. Đánh giá quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA..........................38 2.2.7. Phân tích, xử lý số liệu ............................................................................39 Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................................................41 3.1. Thiết kế phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB. ....................................................................................................41 3.1.1. Nghiên cứu thiết lập chứng dương pgRNA được tổng hợp in-vitro, chứng âm được tách chiết từ huyết tương người khỏe mạnh. ...........................41 3.1.2. Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn định lượng sử dụng RNA được tổng hợp in-vitro với dãy nồng độ xác định. Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu chuẩn trước khi hoàn thiện. .........................................................................................41 3.1.3. Thiết kế trình tự mồi và probe cho phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB.......................................................42 3.1.4. Nghiên cứu thiết lập bộ panel độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng RTqPCR đo tải lượng HBV pgRNA. ......................................................................44 3.2. Tối ưu quy trình realtime RT- PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB. ..........................................................................................47 3.2.1. Tối ưu điều kiện phản ứng bao gồm: nhiệt độ gắn mồi, thời gian các bước và tốc dộ thay đổi nhiệt độ của phản ứng của phản ứng RT-qPCR. .......47 3.2.2. Tối ưu các thành phần phản ứng RT-PCR, gồm có buffer, các enzyme DNA polymerase, nồng độ mồi và probe. Thành phần phản ứng bao gồm cả dUTP và AmpErase uracil N-glycosylase để chống ngoại nhiễm. ...................54 3.2.3. Quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA .........................................56 3.3. Đánh giá chất lượng quy trình RT-qPCR. .....................................................57 3.3.1. Xác định ngưỡng phát hiện, ngưỡng định lượng trong mỗi lần xét nghiệm. Xác định độ chính xác, độ lặp lại giữa các lần xét nghiệm của quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB. .57 3.3.2. Xác định tính ổn định của bộ mẫu chuẩn trên quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB. ..................................61 3.4 Đánh giá quy trình RT-qPCR trên mẫu bệnh nhân CHB. ...............................64 KẾT LUẬN ...............................................................................................................67 KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................67 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………85 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT 1 Nghĩa Từ viết tắt cccDNA Covalently closed circular DNA – DNA kép, mạch vòng 2 CHB Chronic Hepatitis B – Viêm gan B mạn tính 3 Ct Crossing threshold 4 CV Coefficient of Variation - Hệ số biến thiên 5 ER Endoplasmic Reticulum – Mạng lưới nội chất 6 HBeAg Hepatitis B envelope Antigen – Kháng nguyên e của HBV 7 HBcAg Hepatitis B core antigen – Kháng nguyên lõi của HBV 8 HCC Hepatocellular Carcinoma – Ung thư biểu mô tế bào gan 9 HBV Hepatis B Virus – Virus viêm gan B 10 HBsAg Hepatitis B surface Antigen – Kháng nguyên vỏ của HBV 11 ME Meaning – Độ lệch phép đo 12 ORF Open Reading Frame – Khung đọc mở 13 NAs Nucleos(t)ide Analogues 14 RT-qPCR Reverse Transcription Realtime - quantitative Polymerase Chain Reaction 15 rcDNA Relaxed circular DNA – DNA dạng vòng không kín 16 SD Standard Deviation – Độ lệch chuẩn 17 pgRNA Pre-genomic RNA 18 UNG Uracil Deoxyribonucleic Acid Glycosylase DANH MỤC HÌNH Hình 1: Ba loại tiểu thể của virus HBV [99]..............................................................5 Hình 2: Cấu trúc hệ gen HBV .....................................................................................7 Hình 3: Chu trình nhân lên của virus HBV [47]. ......................................................14 Hình 4: Mô hình nhân lên của hệ gen virus [47]. .....................................................14 Hình 5: Đánh giá tính đa hình, đột biến vùng gen S .................................................30 Hình 6: Kết quả phản ứng RT-qPCR đánh giá mồi/probe. .......................................43 Hình 7: Bản đồ trình tự mồi/probe cho quy trình RT-qPCR ....................................44 Hình 8: Panel độ nhạy ...............................................................................................45 Hình 9: Kết quả thiết lập bộ panel độ nhạy...............................................................46 Hình 10: Kết quả dựng đường chuẩn từ panel độ nhạy. ...........................................46 Hình 11: Kết quả bộ panel độ đặc hiệu .....................................................................47 Hình 12: Kết quả của phản ứng RT-qPCR trên phần mềm RotorGene với nhiệt độ 45°C...........................................................................................................................48 Hình 13: Kết quả của phản ứng RT-qPCR trên phần mềm RotorGene với nhiệt độ 50°C...........................................................................................................................49 Hình 14: Thời gian phiên mã ngược 20 phút. ...........................................................50 Hình 15: Thời gian phiên mã ngược 40 phút. ...........................................................51 Hình 16: Nhiệt độ gắn mồi 63°C. .............................................................................52 Hình 17: Nhiệt độ gắn mồi 57°C. .............................................................................52 Hình 18: Kết quả ở thời gian gắn mồi 15 giây. .........................................................53 Hình 19: Kết quả ở thời gian gắn mồi 30 giây. .........................................................53 Hình 20: Kết quả tối ưu nồng độ mồi. ......................................................................54 Hình 21: Kết quả đánh giá ở nồng độ probe 0,2 µM ................................................55 Hình 22: Kết quả đánh giá ở nồng độ probe 0,1 µM ................................................55 Hình 23: Kết quả chạy đánh giá quy trình dựa trên bộ mẫu chuẩn...........................59 Hình 24: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau hai tuần. ............................................61 Hình 25: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau một tháng. ........................................62 Hình 26: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau hai tháng. ..........................................62 Hình 27: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau ba tháng. ...........................................63 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Máy móc, trang thiết bị................................................................................27 Bảng 2: Hóa chất nghiên cứu ....................................................................................27 Bảng 3: Thành phần phản ứng RT-qPCR .................................................................31 Bảng 4: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-qPCR .....................................................32 Bảng 5: Thành phần phản ứng RT-qPCR .................................................................34 Bảng 6: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-qPCR với hai nhiệt độ khác nhau ở bước phiên mã ngược .........................................................................................................35 Bảng 7: Thành phần tối ưu của một phản ứng RT-qPCR .........................................56 Bảng 8: Chu trình luân nhiệt tối ưu của phản ứng RT-qPCR ...................................56 Bảng 9: Kết quả đánh giá quy trình định lượng trên dải nồng độ 104 – 1,25 copy/phản ứng trong 10 lần chạy ..............................................................................57 Bảng 10: Kết quả chạy đánh giá quy trình dựa trên bộ mẫu chuẩn ..........................59 Bảng 11: Xử lý thống kê thông qua các chỉ số SD, CV, độ lệch phép đo (ME)..60 Bảng 12: Kết quả đánh giá độ ổn định của quy trình RT-PCR.................................63 Bảng 12: Kết quả đánh giá độ ổn định của quy trình RT-PCR.................................63 Bảng 13: Nồng độ HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân viêm gan B mạn tính ở nhóm HBeAg dương tính và âm tính. ....................................................................64 MỞ ĐẦU Nhiễm Hepatitis B virus (HBV) là một vấn đề y tế toàn cầu. Mặc dù đã có sự phát triển các vaccine ngăn chặn bệnh hiệu quả cao từ những năm 1980 và việc bổ sung chương trình tiêm chủng vaccine mở rộng tại hơn 168 quốc gia, bệnh gan do nhiễm mạn tính HBV vẫn là gánh nặng khổng lồ đối với toàn xã hội. Tính đến thời điểm hiện nay, trên thế giới, nhiễm HBV là nguyên nhân của 30% bệnh nhân xơ gan và 53% trong số họ tiến triển thành HCC, với khoảng hơn 200,000 và 300,000 người mang HBsAg chết mỗi năm tương ứng do xơ gan và ung thư gan. Các thuốc điều trị viêm gan B mạn tính hiện nay được cấp phép là Peg-IFN α2a và các thuốc ức chế enzym phiên mã ngược đường uống đồng đẳng của nucleoside (nucleos(t)ide analogues, NAs) như Lamivudine, Telbivudine, Adefovir, Entecavir, Tenofovir. Peg-IFN vừa có tác dụng điều hòa miễn dịch vừa có tác dụng kháng virus trực tiếp, nhờ đó có thể duy trì sự ức chế HBV DNA sau khi ngừng điều trị ở một nhóm bệnh nhân. Ngược lại, việc sử dụng NAs làm giảm mạnh HBV DNA và các biến chứng ở hầu hết các bệnh nhân. Tuy nhiên NAs sẽ không ảnh hưởng tới sự tổng hợp RNA tiền bộ gen (pgRNA) của HBV ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính hay tổng hợp protein virus như HBsAg vì cccDNA không bị ảnh hưởng và vẫn giữ nguyên hoạt tính phiên mã. Hệ quả là, ngừng điều trị NAs thường dẫn tới bệnh tái phát và hầu hết các bệnh nhân cần điều trị cả đời. Không may là việc điều trị bằng thuốc NAs (như lamivudine) trong một khoảng thời gian dài có thể dẫn đến các đột biến kháng thuốc và một số nguy cơ nghiêm trọng khác liên quan tới gan. Chính vì vậy, việc đánh giá được nồng độ của cccDNA ở các bệnh nhân điều trị NAs là vô cùng quan trọng giúp xác định thời điểm và hiệu quả của các loại thuốc kháng virus. Tuy nhiên, việc đánh giá cccDNA lại yêu cầu phải sử dụng các mẫu mô sinh thiết, gây khó khăn trong quá trình đánh giá lâm sàng. Chức năng cơ bản của cccDNA đó là khuôn cho quá trình phiên mã cho tất cả các RNA của virus bao gồm pregenomic RNA (pgRNA), từ đó tiếp tục tổng hợp tạo ra các DNA của virion. Do đó, nồng độ của cccDNA lại được phản ánh bởi 1 RNA. Được phát hiện vào những năm 1996 trong huyết thanh của bệnh nhân nhiễm viêm gan B, HBV pgRNA gần đây đã được báo cáo là một dấu ấn sinh học mới đầy hứa hẹn trong tiên lượng và đánh giá đáp ứng điều trị ở bệnh nhân CHB. Việt Nam nằm trong khu vực có tỉ lệ lưu hành HBV trong cộng đồng vào loại cao nhất trên thế giới, nhiễm HBV mạn tính là một vấn đề y tế nặng nề tại nước ta. Sự cấp thiết trong việc tìm ra hay thiết lập các công cụ theo dõi, kiểm soát điều trị cũng như quản lý sự lây nhiễm trong cộng đồng là rất rõ ràng trong bối cảnh phổ biến của nhiễm HBV mạn tính. Hiện nay, chưa có một nghiên cứu nào trong nước đề cập đến dấu ấn tiềm năng HBV pgRNA huyết tương ở bệnh nhân CHB. Chính vì vậy, nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu: Xây dựng và tối ưu quy trình RTqPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương với độ nhạy cao trên đối tượng là các bệnh nhân viêm gan B mạn tính đang điều trị bằng các đồng đẳng nucleoside ở Việt Nam. 2 Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về HBV 1.1.1. Đặc điểm phân loại HBV Hepatitis B virus (HBV) là một thành viên của họ Hepadnaviridae [130]. Sở dĩ họ virus này có tên như vậy là bởi vì những virus này là nguyên nhân gây ra các bệnh về viêm gan (hepatitis) và genome là DNA. Một số virus thuộc họ này có khả năng lây nhiễm ở các động vật có vú và chim; ví dụ bao gồm woodchuck HBV và heron HBV. HBV được biết đến nhiều nhất là virus có khả năng lây nhiễm ở người, và là một trong những nguyên nhân gây bệnh gan ở người [46]. Các virus thuộc họ Hepadnaviridae đều có những đặc điểm chung như sau [121]: - Hệ gen là DNA sợi đôi không hoàn chỉnh bao gồm 2 sợi: sợi âm đầy đủ và sợi dương không đầy đủ. - Enzyme DNA polymerase - Nhân lên thông qua mạch khuôn là pre-genomic RNA (pgRNA) - Có mức độ đặc trưng về mô và loài cao Việc nghiên cứu về các HBV từ lâu đã được quan tâm vì hai lý do. Thứ nhất, các virus này có bộ gen rất nhỏ, tuy nhiên chúng vẫn có khả năng mã hóa các protein của virus và kiểm soát sự biểu hiện gen của virus. Thứ hai, bộ gen DNA của các virus được nhân lên thông qua trung gian RNA. Nói cách khác, sự nhân lên của virus bao gồm quá trình phiên mã ngược, vì vậy các virus thuộc nhóm này khác biệt rất lớn với các virus có bộ gen là DNA có khả năng nhân lên một cách trực tiếp. DNA của virus được nhân lên thông qua trung gian RNA còn được tìm thấy ở các loài thực vật. Những virus này, cùng với HBV còn được gọi là Pararetrovirus [46]. Các nghiên cứu về giải trình tự nucleotide của HBV được phân lập ở người trên khắp thế giới đã được thiết lập, 8 tuýp của virus HBV đã được xác định (A-H) dựa trên sự khác biệt về trình tự lớn hơn 8% và không vượt quá 17% [61, 102]. Các tuýp này có sự phân bố khác nhau, như tuýp A và D thường xuất hiện ở Châu Phi, Châu Âu và Ấn Độ; tuýp B và C thường phân bố ở Châu Á; tuýp E được tìm thấy ở 3 Tây Phi, và tuýp F xuất hiện ở cả Trung và Nam Mỹ. Sự phân bố của tuýp G và tuýp H vẫn chưa rõ ràng, nhưng đã có những báo cáo cho rằng hai tuýp này đã xuất hiện ở Trung Mĩ và Nam Âu [54]. Bên cạnh đó, có một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng có sự xuất hiện của các tuýp virus mới, như tuýp I là tuýp có độ tương đồng lớn với tuýp C là tuýp được phát hiện ở một số nước Đông Nam Á như Việt Nam, Lào và Đông Ấn [106]; và tuýp J được phát hiện ở một người Nhật Bản sống ở Borneo, là dạng tái tổ hợp giữa tuýp C và HBV ở vượn [102]. Các tuýp A, B, C, D, F, I có thể được phân ra thành các nhóm nhỏ hơn dựa trên sự khác biệt khoảng 4% nucleotide. Có 44 nhóm các tuýp phụ: A1–6, B1–9, C1–16, D1–7, F1–4 và I1–2 [54, 84]. Thêm vào đó, còn có một số dạng tái tổ hợp của các tuýp như đã kể trên, nhưng phần lớn là các dạng tái tổ hợp B/C và C/D, trong khi các tái tổ hợp giữa các tuýp khác xảy ra ít hơn các trường hợp kể trên [8]. 1.1.2. Đặc điểm hình thái HBV Dưới kính hiển vi điện tử quan sát thấy HBV tồn tại dưới 3 loại tiểu thể khác nhau (Hình 1): tiểu thể hình cầu nhỏ (small particle) có đường kính 22 nm, tiểu thể hình ống (tubµLar particle) kích thước 22nm có chiều dài 40 - 400nm và tiểu thể hình cầu lớn (large particle) có kích thước 42 - 45 nm. Tiểu thể hình cầu nhỏ và hình ống là thành phần vỏ của HBV mà trong quá trình nhân lên tổng hợp dư thừa. Đây chính là kháng nguyên bề mặt (HBsAg). Các tiểu thể này có thể đứng riêng rẽ hay đứng hợp với nhau thành từng đám, chúng không có khả năng lây truyền bệnh [48]. Tiểu thể hình cầu lớn (large particle) có kích thước 42 - 45 nm. Đây chính là hạt virus hoàn chỉnh (Tiểu thể Dane) có cấu tạo gồm 2 lớp: - Bao ngoài: Lớp bao ngoài có bản chất là Lipoprotein. Lớp này có các kháng nguyên bề mặt (HBsAg) [28]. - Lớp lõi: Capsid đối xứng hình hộp có chứa các kháng nguyên lõi HBcAg. Bên trong lõi có chứa bộ gen HBV gồm 2 sợi DNA đóng vòng không kín, enzyme phiên mã ngược polymerase và protein kinase [28, 34]. 4 Hình 1: Ba loại tiểu thể của virus HBV [100]. (A) Tiểu thể hình cầu lớn (tiểu thể Dane); (B) Tiểu thể hình cầu nhỏ; (C) Tiểu thể hình ống. 1.1.3. Cấu trúc hệ gen HBV Cấu trúc nucleocapsid HBV chứa bộ gen với chiều dài khoảng 3,2 kilobase (kb) và là phân tử DNA sợi đôi không hoàn chỉnh dạng vòng không kín hoàn toàn (relaxed circular DNA - rcDNA) [11, 17]. Nucleocapsid là một cấu trúc nhị thập diện đều được hình thành bởi 240 phân tử protein capsid của virus với đường kính khoảng 27 nm, và mỗi một nucleocapsid chứa một bản sao DNA của virus và enzyme polymerase liên kết cộng hóa trị với đầu 5’ của sợi âm [17, 58]. Một vài protein của tế bào bao gồm protein kinase cũng được đóng gói vào trong cấu trúc nucleocapsid [17]. Một trong những đặc điểm độc đáo của hệ gen HBV đó chính là cấu trúc bất đối xứng giữa hai sợi. Sợi âm được tổng hợp đầy đủ và có chiều dài bằng kích thước hệ gen, còn sợi dương bổ sung với sợi âm lại có sự khác biệt về 5 chiều dài, chiều dài của sợi dương cho đến nay vẫn chưa được nghiên cứu chính xác, thay đổi theo từng tuýp, từng dòng [30]. Ngoài ra, cả sợi âm và sợi dương đều có chung một điểm đặc biệt đó là cả 2 sợi đều là DNA dạng thẳng nhưng nhờ sự bổ sung giữa 2 sợi mà hình thành cấu trúc vòng rcDNA. Hệ gen của virus có chứa các khung đọc mở (open reading frame - ORF) xếp chồng lên nhau kí hiệu là S, C, P và X mã hóa cho bốn protein khác nhau [58]. Cấu trúc xếp chồng lên nhau của các vùng mã hóa khiến cho virus có thể sử dụng hệ gen với hiệu suất 150% (Hình 2) [124]. - Gen PreS1/PreS2 và S (mã hóa cho 3 protein vỏ L-, M- và S) - Gen precore/core (mã hóa cho protein nucleocapsid; HBcAg và các protein không cấu trúc; HBeAg) - Gen polymerase (enzyme reverse transcriptase, RNase H) - Gen X (mã hóa cho protein điều hòa X) Các gen S và C nằm ở các ORF riêng có các bộ ba mã mở đầu khác nhau, tổng hợp các sản phẩm gen có chức năng khác nhau [30, 58]. Các ORF S và C lần lượt kéo dài đến preS1 (preS1 và preS2) và vùng preC ở đầu 5’. Ở các vùng ORF xếp chồng lên nhau có sự xuất hiện của các gen điều hòa là 4 vùng khởi động (preC/C, preS1/S và X) và 2 trình tự tăng cường, các gen này cho phép sự biểu hiện của 7 protein khác nhau được phiên mã từ các bộ ba mã mở đầu khác nhau bởi ít nhất 5 mRNA khác nhau với đuôi tự do. Sản phẩm phiên mã đầu tiên có chiều dài 0,7 kb mã hóa cho protein HBx; các sản phẩm phiên mã có chiều dài 2,1 kb và 2,4 kb lần lượt mã hóa cho M- và S-HBsAg, L-HBsAg [30]. Sản phẩm phiên mã mã hóa cho cả protein core và polymerase là pregenomic RNA (pgRNA). Pregenomic RNA là mạch khuôn cho quá trình tổng hợp virus HBV và được phiên mã ngược để hình thành nên hệ gen DNA của HBV. Như chúng ta đã biết, hệ gen của virus có chiều dài 3,2 kb, và chiều dài của pgRNA là 3,5 kb, tức là dài hơn hệ gen của virus, đó chính là bản sao “dự phòng” của hệ gen virus [75, 95]. Hai vùng gen với 11 nu lặp lại được gọi là DR1 và DR2 nằm ở đầu 5’ ở cả sợi âm và sợi dương và hai gen 6 này có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của DNA virus [33, 58]. Hai trình tự tăng cường (enhancer) kí hiệu là Enh1 và Enh2, giúp tăng biểu hiện của các sản phẩm gen virus đặc hiệu với tế bào gan [58]. Vùng ORF S mã hóa cho các protein bề mặt của virus, HBsAg có cấu trúc được phân chia và phân hóa tại các vùng preS1, preS1 và S với 3 bộ ba mã mở đầu AUG khác nhau [92]. Trong khi L HBsAg có vai trò chính trong liên kết với các thụ thể được dịch mã từ mRNA preS1 có chứa các domain preS1, preS2 và S; protein M và S HBsAg được dịch mã từ mRNA preS2/S và mRNA S [30, 33, 107]. Hình 2: Cấu trúc hệ gen HBV 1.1.4. Các protein HBV Hệ gen HBV mã hóa cho 7 protein: HBx, core, polymerase, L-, M- và SHBsAg. Trong số các protein này, HBx là protein điều hòa không tham gia vào hình thành cấu trúc của virus, HBeAg không tham gia vào cấu trúc của virion và protein này được giải phóng một cách riêng biệt khỏi tế bào, polymerase chịu trách nhiệm cho quá trình nhân lên của cả hệ gen, và protein core và HBsAg có chức năng hình thành cấu trúc của virion. Chức năng của từng protein của virus HBV sẽ được nhắc đến chi tiết hơn ở phần dưới đây. Kháng nguyên E HBeAg là sản phẩm cuối cùng của quá trình sau dịch mã ORF precore. Là một trong những protein được mã hóa bởi sản phẩm phiên mã từ bộ gen của virus, 7 sự biểu hiện của protein này phụ thuộc vào vùng khởi động của bộ gen virus. ORF HBeAg mã hóa cho một trình tự với đích là lưới nội chất (endoplasmic reticulum ER) và đồng thời cũng dịch mã ra các peptide hướng ngoài ER, nơi mà protein sau khi hoàn thiện tồn tại ở dạng 15kD HBeAg - chính là các kháng nguyên được tiết ra từ các tế bào nhiễm HBV [113]. Kháng nguyên bề mặt HBsAg là protein vỏ của virion HBV. Như sự tồn tại của HBsAg ở các virion trưởng thành, người lành mang HBV có chứa một lượng dư các tiểu thể hình cầu nhỏ và các tiểu thể hình ống HBsAg không có khả năng gây nhiễm cũng tồn tại trong huyết thanh của họ. Những tiểu thể này được tiết ra nhiều hơn (100 -100,000 lần) khi so với số lượng các virus trưởng thành được tiết ra [107]. Có một số báo cáo đã chỉ ra rằng lý do các tiểu thể hình cầu nhỏ và các tiểu thể hình ống HBsAg được tổng hợp với số lượng gấp hàng nghìn lần so với tiểu thể Dane có thể là cái bẫy dành cho hệ miễn dịch, từ đó, sự nhiễm mạn tính có thể được hình thành [30, 35]. HBsAg không chỉ được tạo ra bởi quá trình dịch mã của mRNA mà còn từ các DNA tích hợp với bộ gen của người. Điều kiện này có thể giúp chúng ta biết được trạng thái nhiễm của bệnh nhân một cách toàn diện hơn [107]. Chức năng chính của các kháng nguyên bề mặt đó là hình thành nên lớp vỏ của virus. Ba dạng khác nhau của hạt virus được giải phóng từ tế bào nhiễm HBV là kết quả của quá trình biểu hiện không đồng đều của ba kháng nguyên bề mặt này. SHBsAg là protein có mức biểu hiện cao nhất trong các kháng nguyên bề mặt của virus HBV và protein này chính là thành phần chính cấu thành nên vỏ virus [25]. Protein lõi (protein core) Protein core (protein lõi) (21 kD) hay còn gọi là HBcAg, là protein có vai trò định hình cho virion. Khi được biểu hiện trong tế bào, protein này thường tồn tại ở dạng nhị hợp, hoặc ở dạng capsid nhị thập diện đều T = 3 hoặc T = 4. Khoảng 95% các nucleocapsid được phân lập từ tiểu thể Dane có chứa capsid T = 4 tạo nên khoảng 120 lõi nhị hợp, với 5% còn lại là các capsid T = 3 với 90 nhị hợp. 8 Protein lõi được dịch mã từ pgRNA và 149 axit amin đầu tiên hình thành nên vùng lắp ráp, có chức năng cho sự hình thành in vitro của capsid, capsid này sẽ có sự khác biệt với capsid được phân lập từ tiểu thể Dane [16]. Khoảng 34 - 36 axit amin còn lại sẽ tạo nên vùng C-terminal giàu Arginine (CTD); quá trình phosphoryl hóa của một số axit amin trong vùng CTD có chức năng điều hòa một số giai đoạn trong chu trình sống của virus [57, 65, 73, 81]. Polymerase/Reverse transcriptase (RTase) Không lâu sau khi xác định được dạng virus giống HBV ở vịt [69], mô hình DHBV đã được sử dụng để xác định bộ gen của DHBV có trải qua trung gian RNA, cho thấy HBV nhân đôi thông qua quá trình phiên mã ngược (RT) [99]. Trong khi quá trình phiên mã ngược là một cơ chế đã được nhiều virus sử dụng, HBV trải qua quá trình sao chép bộ gen với nhiều đặc điểm độc đáo. Protein polymerase (reverse transcriptase/RTase/Pol/P) là protein 90kD và có khoảng 838 axit amin được tạo thành từ 3 vùng chức năng và một vùng đệm thay đổi. Ở vùng N-terminal là vùng TP (terminal protein), là vùng có vai trò quan trọng trong việc khởi động quá trình sao chép bộ gen virus. Mặc dù vùng này có vai trò quan trọng giúp polymerase bám vào pgRNA, đóng gói RNA, liên kết các protein [9, 119, 129], vùng TP là một domain độc đáo không có ở các virus RT không thuộc nhóm HBV. Một vùng đệm thay đổi có khả năng phân chia TP domain từ RT domain, và đã có một số nghiên cứu cho thấy gần như tất cả axit amin thuộc vùng đệm này có thể bị đột biến mà không làm thay đổi chức năng của P [86]. Thực tế là, chỉ có 3 phân tử cysteine nằm trong vùng C-terminal của vùng đệm, cùng với một phần tư của đầu N-terminal của RT domain là quan trọng đối với chức năng của enzyme RTase/polymerase [53]. RT domain có vai trò trong quá trình nhân lên của bộ gen virus bằng cách phiên mã ngược pgRNA để hình thành sợi âm trong DNA của bộ gen virus và sau đó sợi âm này được sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợp sợi dương của DNA. Domain này có độ tương đồng cao đối với các loại retrovirus khác [122]. Hiện nay domain RT là liệu pháp đích duy nhất chống lại HBV [91], dựa trên hiệu quả của các loại thuốc NAs có khả năng ức chế khả năng của enzyme RTase của virus HIV. Thực tế 9