Tài liệu Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống..

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG HOÀNG NGỌC CƯƠNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN ERWINIA SP. GÂY BỆNH THỐI NHŨN TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH CỦA CHITOSAN TỪ MAI MỰC ỐNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT KHÁNH HÒA - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG HOÀNG NGỌC CƯƠNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN ERWINIA SP. GÂY BỆNH THỐI NHŨN TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH CỦA CHITOSAN TỪ MAI MỰC ỐNG NGÀNH ĐÀO TẠO : CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN MÃ SỐ : 62540105 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. TRANG SĨ TRUNG PGS.TS. NGUYỄN ANH TUẤN KHÁNH HÒA - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình do chính tôi thực hiện. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những lời cam đoan của mình. Nha Trang, ngày tháng Tác giả luận án Hoàng Ngọc Cương i năm 2017 LỜI CẢM ƠN Luận án hoàn thành là nhờ có nhà trường, các tổ chức có liên quan tạo điều kiện; thầy cô, bạn bè, gia đình giúp đỡ và hỗ trợ. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: PGS. TS. Trang Sĩ Trung và PGS. TS. Nguyễn Anh Tuấn đã định hướng, chỉ dẫn và động viên trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu luận án này. Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, các Phòng, Ban, Khoa, Viện liên quan đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện luận án. Ban giám hiệu Trường Đại học Bình Dương, Lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện luận án. TS. Nguyễn Văn Hòa, Ths. Nguyễn Công Minh đã tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi trong quá trình thực hiện luận án. TS. Huỳnh Thanh Tùng, PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa, TS. Khổng Trung Thắng đã giúp đỡ, chia sẻ nhiều kinh nghiệm quí báu. Các cán bộ kỹ thuật của Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trung tâm Thí nghiệm Thực hành – Trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ và tạo điều kiện trọng quá trình tiến hành nghiên cứu. Cuối cùng, xin gửi tấm lòng ân tình tới gia đình, những người thân yêu luôn là nguồn động viên và chia sẻ mọi khó khăn để luận án được hoàn thành. Nha Trang, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Hoàng Ngọc Cương ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ ii MỤC LỤC .................................................................................................................... iii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT...................................................................vi DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. viii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... viii ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ........................................................................... xii PHẦN MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................ 6 1.1. TIỀM NĂNG SỬ DỤNG PHẾ LIỆU MAI MỰC ỐNG LOLIGO SP. ĐỂ THU NHẬN -CHITIN........................................................................................................... 6 1.1.1. Giới thiệu về nguyên liệu mực ống Loligo sp. và phế liệu từ mực sau chế biến .. 6 1.1.2. Cấu trúc và thành phần hóa học của nguyên liệu mai mực ống Loligo sp. ..... 7 1.2. TỔNG QUAN VỀ β-CHITIN VÀ CHITOSAN ................................................... 16 1.2.1. Cấu trúc hóa học, nguồn gốc tự nhiên và tính chất của các dạng chitin ........ 16 1.2.2. Cấu trúc hóa học và tính chất của chitosan .................................................... 20 1.2.3. Phương pháp thu nhận chitin và chitosan ...................................................... 23 1.2.4. Đặc tính sinh học kháng nấm, kháng khuẩn của chitosan ............................. 36 1.3. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH THỐI NHŨN TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH...... 39 1.3.1. Giới thiệu chung về nguồn nguyên liệu cà chua sau thu hoạch ..................... 39 1.3.2. Tổng quan về bệnh thối nhũn (soft rot) gây hại cà chua sau thu hoạch ......... 41 1.3.3. Giới thiệu về chủng vi khuẩn Erwinia spp. gây bệnh thối nhũn .................... 42 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 45 2.1. VẬT LIỆU ............................................................................................................. 45 2.1.1. Mai mực ống Loligo sp. ................................................................................. 45 2.1.2. Trái cà chua Lycopersicon esculetum ............................................................ 45 2.1.3. Hóa chất dùng trong nghiên cứu .................................................................... 46 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................... 46 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát............................................................................ 46 2.2.2. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thu nhận β-chitin ................................. 49 iii 2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện deacetyl β-chitin thu nhận chitosan ..... 55 2.2.4. Bố trí thí nghiệm phân lập vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn ........... 62 2.2.5. Bố trí thí nghiệm tổng quát đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch của β-chitosan ở điều kiện in vitro và in vivo ................................................................................................. 64 2.3. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU ............................ 71 2.3.1. Phương pháp xác định các thành phần hóa học cơ bản ................................. 71 2.3.2. Phương pháp xác định thành phần acid amin và thành phần khoáng ............ 71 2.3.3. Phương pháp xác định tính chất của -chitin và chitosan ............................. 71 2.3.4. Phương pháp cắt mạch chitosan ..................................................................... 72 2.3.5. Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn ............. 73 2.3.6. Phương pháp chuẩn bị mẫu dịch vi khuẩn Erwinia carotovora ..................... 74 2.3.7. Phương pháp gây bệnh nhân tạo .................................................................... 75 2.3.8. Phương pháp đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vitro75 2.3.9. Phương pháp đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vivo 75 2.3.10. Phương pháp xác định tổng hàm lượng phenol tổng số trong trái cà chua ......... 76 2.3.11. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................ 76 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................. 77 3.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MAI MỰC LOLIGO SP ...................................... 77 3.1.1. Thành phần hóa học cơ bản............................................................................ 77 3.1.2. Thành phần khoáng ........................................................................................ 79 3.1.3. Thành phần acid amin .................................................................................... 80 3.2. XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT -CHITIN TỪ MAI MỰC LOLIGO SP......................................................................................... 82 3.2.1. Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến quá trình khử protein trong mai mực Loligo sp. .................................................... 82 3.2.2. Đánh giá ảnh hưởng chi tiết các yếu tố nhiệt độ, thời gian và nồng độ NaOH đến hiệu quả khử protein và sự cắt mạch của sản phẩm β-chitin .................... 84 3.2.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả khử protein và khối lượng phân tử của sản phẩm β-chitin ...................................................................................... 85 3.2.2.2. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả khử protein và khối lượng phân tử của sản phẩm β-chitin ...................................................................................... 88 iv 3.2.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hiệu quả khử protein và khối lượng phân tử của sản phẩm β-chitin ......................................................................... 90 3.2.3. Tính chất của sản phẩm β-chitin từ mai mực ống .......................................... 92 3.3. ĐIỀU KIỆN DEACETYL -CHITIN VÀ TÍNH CHẤT CHITOSAN TỪ MAI MỰC LOLIGO SP. .....................................................................................................101 3.3.1. Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của 3 yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến hiệu quả deacetyl -chitin.......................................................................101 3.3.2. Ảnh hưởng chi tiết của các yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan ....................................................104 3.3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan .......................................................................................................................104 3.3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hiệu quả deacetyl β-chitin và sự cắt mạch chitosan ................................................................................................ 107 3.3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan 108 3.3.3. Điều kiện deacetyl lần 2 ...............................................................................110 3.3.4. Hiệu suất thu nhận và tính chất của sản phẩm chitosan ............................... 111 3.3.5. Đề xuất quy trình thu nhận chitin, chitosan từ mai mực ống Loligo sp. ......119 3.4. KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN ..........................................120 3.4.1. Nghiên cứu phân lập, khẳng định chủng Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch..............................................................................120 3.4.2. Khả năng kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vitro .........................127 3.4.3. Khả năng kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vivo ............................... 131 3.4.4. Đề xuất quy trình bảo quản cà chua sau thu hoạch bằng dung dịch chitosan từ mai mực Loligo sp. ................................................................................................ 139 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................141 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ .......................................143 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................144 PHỤ LỤC ...................................................................................................................158 v DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AAS Atomic absorption spectrophotometric Phương pháp phổ hấp thu nguyên tử AOAC Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống ANOVA Analysis of Variance Phân tích phương sai -chitosan Chitosan from β-chitin Chitosan từ β-chitin χcr Degree of crystallinity Độ kết tinh C95 Tomato C95 Giống cà chua C95 CrI Crystalline Index Chỉ số kết tinh DA Degree of acetyl Độ acetyl DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic DD Degree of deacetyl Độ deacetyl DP Deproteinization Quá trình khử protein DM Demineralization Quá trình khử khoáng DC Decolorization Quá trình khử màu Ecc Erwinia carotovora subsp. carotovora Erwinia carotovora subsp. carotovora Eca Erwinia carotovora subsp. atroseptica Erwinia carotovora subsp. atroseptica Echr Erwinia chrysanthemi Erwinia chrysanthemi EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Ethylenediaminetetraacetic axit FTIR Fourier Transform Infrared Quang phổ hấp thụ hồng ngoại GlcN D-glucosamine D-glucosamine GlcNAc N-acetyl glucosamine N-acetyl glucosamine MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MHS Mark-Houwink-Sakurada equation Phương trình Mark-HouwinkSakurada Mw The average molecular weight Khối lượng phân tử trung bình NL/DM Material / solvent Nguyên liệu / dung môi vi Nd Not detected Không phát hiện NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân OD Optical density Độ hấp phụ quang học Pl Pectate lyases Enzyme phân giải pectin Pnl Pectin lyases Enzyme phân giải pectin Pme Pectin methylesterases Enzyme phân giải pectin PA Polyamide Bao nylon PG Potato glucose Môi trường potato glucose PCR Polymerase chain reaction Phương pháp khuếch đại gen PDA Potato dextrose agar Môi trường thạch khoai tây rARN Ribosomal ribonucleic ARN riboxom SEM Scanning Electron Microscope Kính hiển vi điện tử quét Size-exclusion chromatographySEC-MALLS Multi-angle static light scattering Phương pháp sắc ký loại trừ kết hợp với phân tán ánh sáng tĩnh đa góc sp. Species Loài spp. Species pluriel Nhiều loài subsp. Subspecies Phân loài SPSS Statistical Package for the Social Sciences Phần mềm thống kê SS Sum of Squares Tổng bình phương độ lệch TEM Transmission Electron Microscope Kính hiển vi điện tử truyền qua TpHCM Ho Chi Minh City Thành phố Hồ Chí Minh TLTK References Tài liệu tham khảo VASEP Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers Hiệp hội chế biến và xuất khẩu Thuỷ sản Việt Nam VNF Viet Nam Food Công ty Cp Việt Nam Food XRD X-ray powder diffraction Phổ nhiễu xạ tia X wt.% Weight percent Phần trăm theo khối lượng vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học trong nguyên liệu của một số loại phế liệu thủy sản thông dụng để sản xuất chitin ................................................................................. 8 Bảng 1.2. Thành phần hóa học trong một số mai mực .................................................... 9 Bảng 1.3. Thành phần khoáng của nguyên liệu mai mực ............................................... 9 Bảng 1.4. Các dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan ...................................... 21 Bảng 1.5. Tính chất của chitosan ảnh hưởng bởi độ deacetyl ....................................... 22 Bảng 1.6. Thành phần và tính chất của một số loại chitosan thương mại ..................... 22 Bảng 1.7. Điều kiện khử protein trong quá trình sản xuất chitin từ các nguyên liệu khác nhau .............................................................................................................. 30 Bảng 1.8. Nguồn nguyên liệu thủy sản, điều kiện xử lý và loại chitin............................ 32 Bảng 1.9. Điều kiện deacetyl thu nhận chitosan từ các nguồn chitin khác nhau .......... 34 Bảng 1.10. Khối lượng phân tử trung bình (Mw) của chitosan ở các điều kiện deacetyl khác nhau .............................................................................................................. 36 Bảng 1.11. Bảng tổng hợp các chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn (soft rot) .............. 43 Bảng 3.1. Thành phần hóa học cơ bản của mai mực ống Loligo sp .............................. 77 Bảng 3.2. Thành phần khoáng trong mai mực Loligo sp., các loại mực khác và vỏ tôm..... 79 Bảng 3.3. So sánh thành phần acid amin trong mai mực ống Loligo sp. và kết quả tham khảo ....................................................................................................................... 80 Bảng 3.4. Tính chất của mai mực ống và sản phẩm β-chitin ........................................ 94 Bảng 3.5. Thành phần khoáng trong mai mực và sản phẩm β-chitin ............................ 95 Bảng 3.6. Hàm lượng acid amin trong mai mực và sản phẩm β-chitin ......................... 95 Bảng 3.7. Độ dịch chuyển hóa học của các proton trong DCl/D2O ở 25oC của β-chitin .. 100 Bảng 3.8. Hiệu suất thu hồi chitin và chitosan ............................................................ 112 Bảng 3.9. So sánh chất lượng của thương mại chitosan và β-chitosan ....................... 113 Bảng 3.10. Hàm lượng acid amin còn lại trong β-chitin và β-chitosan ...................... 114 Bảng 3.11. Thành phần khoáng và kim loại trong mai mực, β-chitin và β-chitosan .. 115 Bảng 3.12. Độ dịch chuyển hóa học của các proton trong DCl/D2O ở 70oC của β-chitosan.. 118 Bảng 3.13. Mẫu cà chua thu nhận từ các chợ nông sản .............................................. 121 Bảng 3.14. Kết quả đánh giá đặc tính sinh hóa sinh lý của các dòng vi khuẩn .......... 123 Bảng 3.15. Khả năng kháng khuẩn Erwinia carotovora của chitosan với khối lượng phân tử khác nhau và chitosan thương mại (C-120) ........................................... 128 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Thống kê giá trị xuất khẩu mực, bạch tuộc; (a) Mực ống Loligo sp. (b) Mai mực. ........................................................................................................................6 Hình 1.2. Mô hình cấu trúc chitin trong mai mực nguyên liệu . ...................................10 Hình 1.3. Một kiểu mô phỏng những liên kết hóa học có thể tạo ra giữa chitin với astaxanthin và các phân tử khác trong nguyên liệu. .............................................11 Hình 1.4. Mô hình cấu trúc lớp vỏ tôm. ........................................................................11 Hình 1.5. Ảnh quét kính hiển vi điện tử SEM của mai mực ống. .................................12 Hình 1.6. Quy trình thu nhận chitin/chitosan từ các nguồn nguyên liệu khác nhau. ....13 Hình 1.7. Cấu trúc hóa học phân tử chitin. ....................................................................17 Hình 1.8. Sự sắp xếp của chuỗi chitin: (a) α-chitin, (b) β-chitin, (c) γ-chitin. ..............17 Hình 1.9. Cấu trúc phân tử (a) α-chitin (b) β-chitin. .....................................................18 Hình 1.10. Cấu trúc α-chitin và -chitin. .....................................................................19 Hình 1.11. Phổ XRD của α-chitin và β-chitin. ..............................................................19 Hình 1.12. Cấu trúc hóa học của chitosan. ....................................................................20 Hình 1.13. Sơ đồ quá trình sản xuất chitin/chitosan từ phế liệu thủy sản. ....................24 Hình 1.14. Phản ứng deacetyl chitin thu chitosan. ........................................................33 Hình 1.15. Cà chua bị bệnh thối nhũn (soft rot). ...........................................................41 Hình 2.1. Nguyên liệu mai mực ống Loligo sp. ............................................................45 Hình 2.2. Nguyên liệu cà chua Lycopersicon esculentum. ............................................46 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát. .................................................................47 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian đến khả năng khử protein trong mai mực ống nguyên liệu. ..................49 Hình 2.5. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến quá trình khử protein mai mực ống. ............................................................................................51 Hình 2.6. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của thời gian .....................................53 Hình 2.7. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến quá trình khử protein. ..................................................................................................................54 Hình 2.8. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát đánh giá ảnh hưởng các yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến quá trình deacetyl -chitin. .............................................56 Hình 2.9. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến quá trình deacetyl -chitin. ..................................................................................................57 ix Hình 2.10. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nồng độ NaOH đến quá trình deacetyl -chitin. ..........................................................................................59 Hình 2.11. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến quá trình deacetyl -chitin. ..................................................................................................60 Hình 2.12. Sơ đồ thí nghiệm deacetyl lần 2. .................................................................61 Hình 2.13. Sơ đồ phân lập vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch. ..............................................................................................................63 Hình 2.14. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan. .....................................64 Hình 2.15. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. của chitosan ở điều kiện in vitro. ...............................................................................................66 Hình 2.16. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng kháng bệnh thối nhũn của chitosan ở điều kiện in vivo. ...................................................................................................67 Hình 2.17. Sơ đồ thí nghiệm so sánh khả năng kháng bệnh thối nhũn của chitosan từ mai mực ống và chitosan thương mại. ..................................................................69 Hình 3.1. Hàm lượng protein còn lại sau quá trình khử protein dưới tác động của 3 yếu tố (nhiệt độ, nồng độ NaOH, thời gian). ...............................................................83 Hình 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ NaOH đến hiệu quả khử protein và sự cắt mạch β-chitin...........................................................................................86 Hình 3.3. (a) Ảnh của mực ống, (b) mai mực ống và (c) sản phẩm β-chitin. ...............92 Hình 3.4. Hình SEM chụp bề mặt cắt của (a) mai mực ống và (b) sản phẩm β-chitin. .....97 Hình 3.5. Phổ XRD của mai mực ống và sản phẩm β-chitin thu được từ mai mực......98 Hình 3.6. Phổ FTIR của nguyên liệu mai mực ống và sản phẩm β-chitin. ...................99 Hình 3.7. Phổ H1 NMR của β-chitin. ..........................................................................100 Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian đến hiệu quả deacetyl. ..103 Hình 3.9. Ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến DD và Mw của chitosan. .................................................................................................106 Hình 3.10. Ảnh hưởng của quá trình deacetyl lần 2 đến DD và Mw của chitosan. ..........110 Hình 3.11. Sản phẩm -chitin và chitosan từ mai mực Loligo sp. ..............................111 Hình 3.12. Hình SEM của (a) mai mực ống, (b) β-chitin và (c) chitosan. ..................115 Hình 3.13. Phổ XRD của mai mực, β-chitin và β-chitosan. ........................................116 x Hình 3.14. Phổ FTIR sản phẩm chitosan từ (a) β-chitosan, (b) α-chitosan thương mại và (c) β-chitin. .....................................................................................................117 Hình 3.15. Phổ H1-NMR của β-chitosan. ....................................................................117 Hình 3.16. Phổ SEC-MALLS của β-chitosan. ............................................................118 Hình 3.17. Quy trình thu nhận β-chitin và chitosan từ mai mực Loligo sp. ................119 Hình 3.18. Mẫu trái cà chua bệnh thối nhũn thu nhận từ chợ nông sản. .....................121 Hình 3.19. (a) Mẫu khuẩn lạc được chọn; (b) Mẫu vi khuẩn nhuộm Gram. ...............122 Hình 3.20. Trình tự một đoạn gen 16S rRNA chủng vi khuẩn Erwinia carotovora...124 Hình 3.21. Hình SEM chủng vi khuẩn Erwinia carotovora. ......................................125 Hình 3.22. Vết bệnh thối nhũn trên trái cà chua..........................................................125 Hình 3.23. Sơ đồ phát triển bệnh thối nhũn trên cà chua. ...........................................126 Hình 3.24. (a) Khả năng kháng khuẩn của S-655 và (b) của S-138 ở các nồng độ khác nhau. C-120 là chitosan thương mại với Mw là120 kDa. ....................................129 Hình 3.25. Hình TEM của vi khuẩn Erwinia sp. được xử lý trong dung dịch β-chitosan 1% (S-138) trong 60 phút. (a) Vi khuẩn Erwinia carotovora; (b) xử lý sau 15 phút; (c) xư lý sau 30 phút; (d) kết quả sau 60 phút. ..........................................130 Hình 3.26. Khả năng kháng khuẩn của chitosan S-1740 ở điều kiện in vivo. .............132 Hình 3.27. Khả năng kháng khuẩn của chitosan S-655 ở điều kiện in vivo. ...............133 Hình 3.28. Khả năng kháng khuẩn của chitosan S-138 ở điều kiện in vivo. ...............134 Hình 3.29. Kích thước vết bệnh bên trong được xử lý S-138 trong (a) 24 giờ , (b) 36 giờ. ..135 Hình 3.30. So sánh khả năng kháng bệnh thối nhũn ở điều kiện In vivo của S-138 và chitosan thương mại C-120 (a) kích thước vết bệnh bên ngoài và (b) kích thước vết bệnh bên trong...............................................................................................136 Hình 3.31. Kích thước vết bệnh bên trong và bên ngoài khi xử lý chitosan S-138 và chitosan thương mại C-120 sau 36 giờ. ..............................................................137 Hình 3.32. Tổng hàm lượng phenol tổng số trong trái cà chua sau khi được xử lý các loại chitosan có phân tử lượng khác nhau sau thời gian 24 và 72 giờ. ...............138 Hình 3.33. Quy trình bảo quản cà chua sau thu hoạch bằng chitosan. ........................139 xi TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài luận án: Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống. Ngành: Công nghệ chế biến thủy sản Mã số: 62540105 Nghiên cứu sinh: Hoàng Ngọc Cương Khóa: 2011 Người hướng dẫn: PGS.TS. Trang Sĩ Trung PGS.TS. Nguyễn Anh Tuấn Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang Nội dung: 1. Đã xác định được thành phần hóa học của nguồn phế liệu mai mực Loligo sp. thải ra sau quá trình chế biến tại các nhà máy chế biến thủy sản thuộc tỉnh Kiên Giang, làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo. 2. Đã xác định được điều kiện thu nhận sản phẩm -chitin đạt tiêu chuẩn thương mại. Sản phẩm -chitin thu được có khối lượng phân tử trung bình lớn (Mw) và là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất chitosan tinh khiết dùng trong các lĩnh vực kỹ thuật cao. Điều kiện thu nhận có thể ứng dụng sản xuất ở qui mô lớn. 3. Đã xác định được điều kiện deacetyl -chitin thu nhận chitosan đạt tiêu chuẩn thương mại, sản phẩm chitosan có độ deacetyl cao và khối lượng phân tử lớn. Sản phẩm chitosan thu được là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất các oligo chitosan và các chế phẩm từ chitosan có thể ứng dụng trong các lĩnh vực kỹ thuật cao như y dược, y sinh và công nghệ thực phẩm. Điều kiện deacetyl có thể ứng dụng sản xuất ở qui mô lớn. 4. Đã đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch ở điều kiện in vitro và in vivo khi sử dụng chitosan có khối lượng phân tử khác nhau. Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở ứng dụng chitosan trong bảo quản nông sản sau thu hoạch và cơ sở khoa học cho các nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chitosan. NGHIÊN CỨU SINH Hoàng Ngọc Cương xii KEY FINDINGS Thesis title: Preparation and characterization of chitosan from squid pens and its antibacterial activity against Erwinia sp. caused soft rot on tomato fruits. Speciality : Aquatic Products Technology Code : 62540105 Ph.D Student : Hoang Ngoc Cuong Course 2011 : Supervisors : 1. Assoc. Prof. PhD. TRANG SI TRUNG 2. Assoc. Prof. PhD. NGUYEN ANH TUAN Intitution : Nha Trang University Key findings: - The data of chemical composition of the Loligo sp. squid pens in Kien Giang province will be reported that can be used for futher studies and improve seafood processing. - The extraction conditions of -chitin with commercial standard from squid pens will be reported. The obtained -chitin with a high molecular weight can be used to prepare chitosan with a high purity and high molecular weight for various applications. Those extraction conditions can be applied in large scale production. - The deacetylation conditions of -chitin for chitosan with commercial standard (Mw > 6338 kDa, DD >90%) will be reported. The obtained chitosan can be used for biomedicine, biopharmacy, and food technology applications. Those deacetylation conditions can be applied in large scale production. - The antibacterial activity of chitosan against Erwinia carotovora caused soft rot on tomato fruits in vitro and in vivo will be reported. The low moleculer weight of chitosan is used, the high activity is observed. Ph.D Student Hoang Ngoc Cuong 1 PHẦN MỞ ĐẦU Ở Việt Nam, cùng với sự phát triển nhanh chóng của ngành công nghiệp chế biến và xuất khẩu thủy sản, hằng năm đã thải ra hàng chục ngàn tấn phế liệu sau chế biến. Tuy nhiên, hầu hết các phế liệu này chỉ được bán thô hoặc chế biến để tạo ra các sản phẩm có giá trị kinh tế thấp gây lãng phí tài nguyên, trong khi đây là nguồn nguyên liệu có thể sản xuất ra các sản phẩm có giá trị gia tăng và chất lượng cao. Trong đó, hướng nghiên cứu thu nhận và ứng dụng các polyme sinh học tách chiết từ nguồn phế liệu thủy sản đang rất được quan tâm của các nhà quản lý, nhà khoa học và doanh nghiệp. Trong số nhiều sản phẩm có giá trị gia tăng từ phế liệu thủy sản, chitin và chitosan (sản phẩm của quá trình deacetyl chitin) là 2 polyme sinh học được chứng minh có nhiều tính chất đặc biệt như khả năng tương thích sinh học cao, khả năng tạo màng, tạo gel, tính phân giải chậm, tính kháng oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn. Do đó, chitin và chitosan đã và đang được nghiên cứu thu nhận và ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực y dược, y sinh, công nghệ thực phẩm, xử lý môi trường, dệt nhuộm, công nghệ sinh học. Ước tính mỗi năm có khoảng 10.000 tấn chitin và chitosan đã được sản xuất, sử dụng trên toàn thế giới nhưng hầu hết được thu nhận từ vỏ tôm, vỏ cua, vỏ ghẹ. Tuy nhiên, α-chitin/chitosan thường có độ rắn cao, khối lượng phân tử thấp và độ tinh sạch chưa cao vì bản chất của nguồn nguyên liệu thu nhận là vỏ giáp xác có chức năng bảo vệ cơ thể sinh vật bên trong nên được cấu tạo rất phức tạp và rắn chắc. Hơn nữa trong nguyên liệu vỏ giáp xác ngoài thành phần chitin còn chứa nhiều khoáng, protein và chất màu nên quá trình sản xuất cần qua nhiều công đoạn tách chiết, sử dụng nhiều hoá chất gây ô nhiễm. Mai mực ống có chứa hàm lượng khoáng thấp, lượng β-chitin khá cao (> 35%), chitin này có khối lượng phân tử lớn gấp 3 lần α-chitin và hầu như không chứa các kim loại nặng như Pb, Hg, As nên có độ tinh khiết cao [36, 79, 95]. Do đó, đây là nguồn nguyên liệu cần thiết để sản xuất ra loại β-chitin/chitosan có khối lượng phân tử lớn và độ tinh khiết cao để ứng dụng trong lĩnh vực như tạo gel trong mỹ phẩm, màng kháng viêm, màng phân giải thuốc, chỉ khâu cấy ghép trong phẫu thuật, kỹ thuật mô cấy ghép da nhân tạo [54, 89, 151]. Ngoài ra, β-chitin/chitosan đã được chứng minh có độ rắn thấp, độ xốp cao nên dễ dàng deacetyl và được ứng dụng trong nuôi cấy mô, cố định tế bào và enzyme, phân giải thuốc chậm mà các tính chất này vượt trội so với α2 chitin/chitosan. Tại Việt Nam, nguồn phế liệu mai mực thải ra sau quá trình chế biến ước tính đạt khoảng 10-15 tấn/tháng [58, 8]. Tuy nhiên, nguồn phế liệu này chủ yếu là phơi khô, bán thô với giá thành thấp, do đó gây lãnh phí tài nguyên. Trong khi, đây là nguồn nguyên liệu quý để thu nhận chitin/chitosan chất lượng cao. Hơn nữa theo chúng tôi tìm hiểu thì chưa có một nghiên cứu chính thức và có hệ thống đầy đủ nào được công bố tại Việt Nam về quy trình thu nhận, đánh giá tính chất và ứng dụng β-chitin/chitosan tách chiết từ mai mực ống. Xuất khẩu nông sản Việt Nam giai đoạn 2012-2016 ước đạt 15 tỷ USD/năm, góp phần đáng kể phát triển nền kinh tế. Tuy nhiên, công nghệ sau thu hoạch chưa được áp dụng hiệu quả nên chất lượng nông sản còn thấp, hạn chế khả năng xuất khẩu, tỷ lệ thất thoát sau thu hoạch ở mức cao. Trong đó, bệnh thối nhũn trên trái cà chua gây ra bởi vi khuẩn Erwinia sp. đã và đang gây thiệt hại 10-30% tổng sản lượng sau thu hoạch [25, 77, 9]. Các hóa chất thường dùng để kháng bệnh này là thủy ngân clorua, dung dịch formaldehyde, dung dịch natri hypocloric 12%, hydroxymercurinitrophenol 12% và hydromercurichloride phenol 2% [24, 25, 9]. Đây là các hóa chất độc hại đối với người nông dân và người tiêu dùng nếu không được kiểm soát chặt chẽ. Ngoài ra, một số kỹ thuật di truyền để kiểm soát bệnh trước và sau thu hoạch cũng được áp dụng. Tuy nhiên, các kỹ thuật này có giá thành cao và khó triển khai thực tế ở qui mô lớn. Do đó, những phương pháp sử dụng các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên và an toàn như chitosan là rất cần thiết. Thực tế, chitosan điều chế từ α-chitin đã được nghiên cứu và sử dụng để kháng khuẩn và kháng nấm có hiệu quả trong quá trình bảo quản sau thu hoạch trên nhiều đối tượng như bơ, xoài, nho và ớt [25, 9]. Các kết quả nghiên cứu cho thấy chitosan thu được từ β-chitin có tính kháng khuẩn và kháng nấm cao hơn so với thu được từ α-chitin [79, 134]. Do đó, chitosan này được kỳ vọng sẽ có hiệu quả kháng khuẩn cao đối với vi khuẩn Erwinia sp. gây ra bệnh thúi nhũn trên trái cà chua. Từ những vấn đề thực tế được nêu, luận án này tiến hành nội dung “Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống”. Đây là vấn đề cần thiết làm cơ sở khoa học để thu nhận các sản phẩm β-chitin và chitosan có giá trị cao từ mai mực ống ở Việt Nam và nâng cao giá trị kinh tế của nguồn phế liệu mực ống. Đồng thời, chứng minh và bổ sung đầy đủ hơn về khả năng kháng khuẩn của chitosan từ -chitin làm đa dạng hóa các ứng dụng của chitosan trong sản xuất nông nghiệp bền vững. 3 Mục tiêu nghiên cứu: 1. Thu nhận -chitin đạt tiêu chuẩn thương mại từ nguồn phế liệu mai mực Loligo sp. thải ra sau quá trình chế biến mực ống xuất khẩu. 2. Sản xuất chitosan đạt tiêu chuẩn thương mại từ -chitin thu nhận ở trên. 3. Đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của chitosan đối với bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch do vi khuẩn Erwinia sp. gây ra. Đối tượng nghiên cứu: Luận án nghiên cứu trên đối tượng phế liệu mai mực Loligo sp. được thu nhận tại các nhà máy chế biến thủy sản thuộc tỉnh Kiên Giang thải ra sau quá trình chế biến mực ống xuất khẩu ở dạng tươi, có chiều dài từ 12-15 cm, rộng 1,01,5 cm và độ dày trung bình 0,4 - 0,5 mm. Phạm vi và nội dung nghiên cứu: Để đạt được 3 mục tiêu nghiên cứu, luận án tập trung nghiên cứu, đánh giá làm rõ 4 nội dung: 1. Xác định thành phần hóa học cơ bản, các acid amin và kim loại của nguồn phế liệu mai mực Loligo sp. 2. Khảo sát, đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ NaOH, nồng độ HCl, nhiệt độ và thời gian đến quá trình khử protein, khử khoáng để thu nhận sản phẩm chitin đạt tiêu chuẩn thương mại và hạn chế đến mức thấp nhất quá trình cắt mạch chitin trong quá trình thu nhận. 3. Khảo sát, đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian đến quá trình deacetyl -chitin để thu nhận sản phẩm chitosan đạt tiêu chuẩn thương mại và hạn chế đến mức thấp nhất quá trình cắt mạch chitosan trong quá trình deacetyl. 4. Phân lập, định danh chủng vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch tại các chợ đầu mối nông sản. Khảo sát, đánh giá khả năng kháng khuẩn của -chitosan với khối lượng phân tử khác nhau đối với vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua ở điều kiện in vitro và in vivo. 4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài: 1. Luận án đã xác định được thành phần hóa học của nguồn phế liệu mai mực Loligo sp. tại các nhà máy chế biến thủy sản thuộc tỉnh Kiên Giang, làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo. 2. Luận án đã xác định được điều kiện thu nhận sản phẩm -chitin đạt tiêu chuẩn thương mại. Sản phẩm -chitin thu được có khối lượng phân tử lớn và là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất chitosan tinh khiết dùng trong các lĩnh vực kỹ thuật cao. Điều kiện thu nhận có thể ứng dụng sản xuất ở qui mô lớn. 3. Luận án đã xác định được điều kiện deacetyl -chitin thu nhận chitosan đạt tiêu chuẩn thương mại, sản phẩm chitosan có độ deacetyl cao và khối lượng phân tử lớn. Sản phẩm chitosan thu được là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất các oligo chitosan và các chế phẩm từ chitosan có thể ứng dụng trong các lĩnh vực kỹ thuật cao như y dược, y sinh và công nghệ thực phẩm. Điều kiện deacetyl có thể ứng dụng sản xuất ở qui mô lớn. 4. Luận án đã đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch ở điều kiện in vitro và in vivo khi sử dụng -chitosan có khối lượng phân tử khác nhau. Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở ứng dụng chitosan trong bảo quản nông sản sau thu hoạch và cơ sở khoa học cho các nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chitosan. 5 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. TIỀM NĂNG SỬ DỤNG PHẾ LIỆU MAI MỰC ỐNG LOLIGO SP. ĐỂ THU NHẬN -CHITIN 1.1.1. Giới thiệu về nguyên liệu mực ống Loligo sp. và phế liệu từ mực sau chế biến Ở Việt Nam, hiện có khoảng 25 loài mực ống thuộc bộ Teuthida, tập trung nhiều nhất ở vùng nước sâu khoảng 30-50 m. Mùa vụ khai thác từ tháng 6 đến tháng 9 (vụ Nam) và tháng 12 đến tháng 4 năm sau (vụ Bắc), trong đó chủ yếu có 4 loài được đánh bắt với số lượng chiến trên 96% tổng sản lượng, bao gồm: Loligo japonica, Loligo chinensis, Loligo beka và Todarodes pacificus. Mực ống Loligo sp. (Hình 1.1a) được phân loại [58]: Ngành động vật thân mềm Mullusca Lớp chân đầu Cephalopoda Bộ mực ống Teuthida Họ Loliginidae Chi Loligo Hình 1.1. Thống kê giá trị xuất khẩu mực, bạch tuộc; (a) Mực ống Loligo sp. (b) Mai mực. 6