Tài liệu Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn bacillus thuringiensis phục vụ tạo chế phẩm diệt côn trùng bộ hai cánh (diptera).

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ----***---- Phạm Thùy Dương NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS PHỤC VỤ TẠO CHẾ PHẨM DIỆT CÔN TRÙNG BỘ HAI CÁNH (DIPTERA) CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội, tháng 3 năm 2019 DỰ THẢO LUẬN ÁN TIẾN SĨ BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ----***---- Phạm Thùy Dương NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSISPHỤC VỤ TẠO CHẾ PHẨM DIỆT CÔN TRÙNG BỘ HAI CÁNH (DIPTERA) CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 9.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS.TS. Ngô Đình Bính 2. TS. Lê Đức Khánh Hà Nội, tháng 3 năm 2019 DỰ THẢO LUẬN ÁN TIẾN SĨ LỜI CẢM ƠN TrTrƣớc tiên, cho phép tôi đƣợc bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Ngô Đình Bính giáo viên hƣớng dẫn khoa học, ngƣời đã tạo điều kiện và cấp kinh phí cho tôi thực hiện luận án, đồng thời luôn ở bên truyền dạy kiến thức kinh nghiệm và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cám ơn TS Lê Đức Khánh, ngƣời hƣớng dẫn khoa học, đã giúp tôi hiểu sâu sắc hơn về lĩnh vực khoa học thực hiện trong luận án và cấp kinh phí cho tôi thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi thực hiện phần lớn các thí nghiệm trong phạm vi luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Tăng Thị Chính và tập thể cán bộ phòng Vi sinh môi trƣờng-Viện Công nghệ Môi trƣờng đã tạo điều kiện cho tôi đƣợc sử dụng một số thiết bị và tận tình giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trƣờng Đại học dân lập Phƣơng Đông, Khoa Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng đã luôn động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè trong và ngoài trƣờng Đại học Phƣơng Đông,Viện Công nghệ sinh học đã luôn quan tâm, động viên và chỉ dẫn cho tôi để tôi hoàn thành luận án. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai bên gia đình nội ngoại đã luôn là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn chồng và các con của tôi đã cho tôi thêm sức mạnh, động lực để tôi vƣợt qua mọi khó khăn. i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện và một số kết quả cùng cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên các tạp chí chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của tác giả. Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Hà Nội, ngày thángnăm 2018 Tác giả ii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................ii MỤC LỤC ............................................................................................................... iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................. vi DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... viii DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... x MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu.............................................................................................. 2 2.1. Mục tiêu chung ................................................................................................. 2 2.2. Mục tiêu cụ thể ................................................................................................. 2 3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................. 3 4. Những đóng góp mới của luận án ........................................................................ 3 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................ 4 5.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................................. 4 5.2. Ý nghĩa thực tiễn .............................................................................................. 4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 5 1.1. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis ........................................................................ 5 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis ........................ 5 1.1.2. Vị trí, đặc điểm hình thái và sinh thái học Bacillus thuringiensis ................ 7 1.1.3. Đặc điểm phân loại........................................................................................ 9 1.1.4. Hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis ................................................ 10 1.1.5. Đặc điểm protein độc tố diệt côn trùng ....................................................... 11 1.1.6. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp độc tố của vi khuẩn B. thuringiensis ........................................................................................... 21 1.1.7. Nhu cầu dinh dƣỡng của Bacillus thuringiensis ........................................ 23 1.1.8. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn B. thuringiensis ở Việt Nam 26 1.2. Gen cry2 ............................................................................................................. 28 1.3. Hệ biểu hiện Escherichia coli .......................................................................... 29 1.4. Côn trùng thử nghiệm ..................................................................................... 31 iii 1.4.1. Ruồi nhà ...................................................................................................... 31 1.4.2. Muỗi ........................................................................................................ 34 1.5. Thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis ............................................... 35 1.5.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất thuốc trừ sâu sinh học BT ..................... 35 1.5.2. Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học B. thuringiensis ...................... 38 1.5.3. Ảnh hƣởng của thuốc trừ sâu sinh học BT đến môi trƣờng và con ngƣời40 1.5.4. Tồn dƣ của thuốc trừ sâu BT ....................................................................... 42 1.6. Bã malt bia ........................................................................................................ 44 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 46 2.1. Vật liệu .............................................................................................................. 46 2.1.1.Vật liệu, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ...................................................... 46 2.1.2. Chủng vi sinh vật ....................................................................................... 46 2.1.3. Cặp mồi khuếch đại gen cry2A và hệ vector ............................................... 46 2.1.4. Hóa chất ...................................................................................................... 47 2.1.5. Thiết bị ........................................................................................................ 47 2.1.6. Môi trƣờng nuôi cấy .................................................................................... 48 2.1.7. Dung dịch .................................................................................................... 48 2.2. Địa điểm và thời gian thực hiện thí nghiệm................................................... 49 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................. 49 2.3.1. Phƣơng pháp vi sinh .................................................................................... 49 2.3.2. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học............................................................ 50 2.3.3. Phƣơng pháp sinh học phân tử .................................................................... 53 2.3.4. Tối ƣu hóa môi trƣờng lên men theo phƣơng pháp đáp ứng bề mặt ........... 60 2.4. Sơ đồ nghiên cứu .............................................................................................. 64 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 66 3.1. Phân lập và lựa chọn chủng hiệu lực kháng côn trùng bộ hai cánh từ các chủng Bacillus thuringiensis ................................................................................... 66 3.1.1. Phân lập các chủng Bacillus ........................................................................ 66 3.1.2. Nghiên cứu protein tinh thể......................................................................... 69 3.1.3. Phân loại dƣới loài các chủng Bacillus thuringiensis phân lập………….. 3.1.4. Đánh giá khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh của các chủng phân lập ..... 73 iv 3.2. Khẳng định sự có mặt của cry2A liên quan tới tính trạng diệt côn trùng bộ hai cánh ở các chủng phân lập ............................................................................... 74 3.2.1. Phát hiện gen cry2A từ các chủng Bacillus thuringiensis đã phân loại huyết thanh bằng phƣơng pháp PCR .............................................................................. 74 3.2.2. Tách dòng và đọc trình tự gen cry2A .............................................................. 76 3.2.3. Biểu hiện gen............................................................................................... 84 3.2.4. Nghiên cứu tối ƣu điều kiện biểu hiện gen ................................................. 88 3.2.5. Tinh chế protein tái tổ hợp bằng cột sắc kí ái lực Probond Nikel Resin .... 91 3.2.6. Hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh của rCry2A và chủng MSS8.4.......... 92 3.3. Lựa chọn môi trƣờng và tối ƣu lên men làm tăng khả năng hình thành protein tinh thể của chủng vi khuẩn MSS8.4từ bã bia ........................................ 94 3.3.1. Xử lý bã bia làm nguyên liệu nuôi cấy vi khuẩn MSS8.4 .......................... 94 3.3.2. Đánh giá tác động độc lập của các yếu tố dinh dƣỡng bổ sung vào dịch thủy phân bã bia đến sinh trƣởng và sinh tinh thể độc của vi khuẩn MSS8.4. ... 100 3.3.3. Tối ƣu hóa môi trƣờng lên men cho vi khuẩn MSS8.4 từ nguồn bã bia ... 107 3.4. Nghiên cứu tạo chế phẩm .............................................................................. 114 3.4.1. Ảnh hƣởng của điều kiện lên men đến sinh trƣởng,hình thành bào tử và sinh tinh thể độc của chủng MSS8.4 ................................................................... 114 3.4.2. Kết quả thử nghiệm chế phẩm BT với ấu trùng ruồi nhà.......................... 119 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................. 126 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐƢỢC CÔNG BỐ ................................................. 128 LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ............................................................................... 128 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 129 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết đầy đủ 1 Chữ viết tắt Bp Base pair 2 BSA Bovine serum albumin-albumin huyết thanh bò 3 Bt Bacillus thuringiensis 4 BT Chế phẩm Bacillus thuringiensis 5 Btk Bacillus thuringiensis serova kurstaki 6 CFU Colony Forming Unit 7 dH2O Deionized water 8 DNA Deoxyribonucleotide acid 9 dNTPs Deoxynucleotide triphosphates 10 ĐC Đối chứng 11 E. coli Escherichiacoli 12 EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid 13 EtBr Ethidium Bromide 14 kDa Kilo Dalton 15 Kb Kilo base 16 LB Luria-Bertani- Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn 17 SDS Sodium dodecyl sulphate SDS- Điện di trên gel polyacrylamide có chứa sodium PAGE doecyl sunfat 19 Sol Solution- Dung dịch 20 IPTG Isopropyl- β-D-thiogalactoside- Chất cảm ứng 21 TE Tris EDTA 22 X-gal 5- bromo- 4 Cloro- 3 indolyl β- d galactoside 23 MTCS Môi trƣờng cơ sở 24 OD Optical density-Mật độ quang học 25 TCC Tổng tế bào đếm đƣợc (gồm tế bào và bào tử sống) 18 vi 26 SC Số bào tử đếm đƣợc 27 TS Tổng chất rắn 28 DTPBB Dịch thủy phân bã bia vii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Phân tích trình tự của độc tố cry đại diện với cấu trúc đƣợc nghiên cứu bằng tinh thể tia X ..................................................................................................... 14 Bảng 1.2. Thành phần một số môi trƣờng lên men sản xuất chế phẩm BT .............. 23 Bảng 1.3. Thành phần bã malt (%) ........................................................................... 44 Bảng 1.4. Thành phần trung bình của tro .................................................................. 45 Bảng 2.1. Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy ....................................................... 48 Bảng 2.2. Thành phần và nồng độ các loại dung dịch .............................................. 48 Bảng 2.1. Các thí nghiệm đƣợc thiết kế bởi phần mềm design expert 10.1 ............. 63 Bảng 3.1. Kết quả phân loại dƣới loài các chủng B. thuringiensis bằng phƣơng pháp huyết thanh ................................................................................................................ 72 Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính diệt ấu trùng bộ 2 cánh của các chủng B. thuringiensis .............................................................................................................. 73 Bảng 3.3. Thử hoạt tính sinh học của rcry2a và protein tinh thể từ B. thuringiensis với ấu trùng M. domestica ......................................................................................... 88 Bảng 3.4. Hoạt tính diệt côn trùng của protein tinh thể từ chủng MSS8.4 và protein tái tổ hợp RCry2A ..................................................................................................... 93 Bảng 3.5.Ảnh Hƣởng Của Phƣơng Pháp Xử Lý Đến Khả Năng Sinh Trƣởngvà Sinh Tổng Hợp Protein Tinh Thể Của MSS8.4 ................................................................ 94 Bảng 3.6.Thành Phần Hóa Học Của Dịch Thủy Phân Bã Bia .................................. 96 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của tỷ lệ bã bia đến sinh trƣởng, sinh protein tinh thể của chủng vi khuẩn MSS8.4. ........................................................................................... 98 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣỡng hữu cơ bổ sung vào dịch thủy phân bã bia đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein tinh thể ............................................ 100 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của nguồn khoáng bổ sung vào dịch thủy phân bã bia đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein tinh thể ................................................................. 101 viii Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng bổ sung vào dịch thủy phân bã bia đến sinh trƣởng của MSS8.4 ............................................................................. 106 Bảng 3.11. Kết quả phân tích hồi quy nồng độ protein tinh thể ............................. 108 Bảng 3.12. Hàm lƣợng protein tinh thể tính theo mô hình và thực nghiệm ........... 111 Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của ph ban đầu đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp delta endotoxin của vi khuẩn MSS 8.4 ............................................................................ 114 Bảng 3.14. Giá trị ph ban đầu và sau 48 giờ lên men ............................................. 115 Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn MSS8.4 ........................................................................................ 116 Bảng 3.16. Kết quả thử hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà Musca domestica của chế phẩm ........................................................................................................................ 119 Bảng 3.17. Hoạt tính diệt ấu trùng ruồi của chế phẩm BT qui mô pilot ................. 121 Bảng 3.18. Các công thức chế phẩm bt diệt ruồi cho thử nghiệm ngoài thực địa ......... 123 Bảng 3.19. Hiệu quả diệt dòi của chế phẩm bt dạng bột thấm ƣớt. ........................ 124 ix DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Hình ảnh bào tử và tinh thể của vi khuẩn B. thuringiensis ........................ 8 Hình 1.2. Cấu trúc tinh thể của Cry1Aa, cry2aa (. .................................................... 15 Hình 1.3. Cấu trúc tinh thể của colicin N.................................................................. 15 Hình 1.4. Tóm tắt phổ hoạt tính của B. thuringiensisδ-endotoxins .......................... 18 Hình 1.5. Cơ chế tác động của protein tinh thể độc lên côn trùng ............................ 20 Hình 1.6. Ruồi nhà .................................................................................................... 31 Hình 1.7. Vòng đời của ruồi nhà (musca domestica) ................................................ 32 Hình 1.8. Trứng của ruồi nhà (musca domestica) ..................................................... 33 Hình 1.9. Các giai đoạn phát triển của muỗi ............................................................. 34 Hình 1.10. Quy trình sản xuất chế phẩm bt bằng phƣơng pháp lên men chìm ......... 40 Hình 3.1. Sự phân bố của các chủng B. thuringiensis phân lập tại 7 vùng địa lý của Việt Nam ................................................................................................................... 66 Hình 3.2. Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn B. thuringiensis trên môi trƣờng MPA sau 72 giờ nuôi cấy ở 300C .............................................................................................. 67 Hình 3.3. Kết quả phân lập của B. thuringiensis trong các mẫu đất, lá thuộc 7 vùng của Việt Nam............................................................................................................. 68 Hình 3.4. Hình ảnh tinh thể của các chủng B. thuringiensis phân lập tại Việt Nam chụp bằng kính hiển vi đối pha, độ phóng đại 10000 lần. ........................................ 69 Hình 3.5. Kết quả phân loại hình thái tinh thể của B. thuringiensis trong các mẫu đất, lá thuộc 7 vùng của Việt Nam ............................................................................ 70 Hình 3.6. Hình ảnh ngƣng kết của chủng MSS8.4 phân lập với typ huyết thanh dƣới kính hiển vi quang học. ............................................................................................. 72 Hình 3.7. Kết quả PCR sàng lọc các 7 chủng B. thuringiensis bằng cặp mồi khuếch đại gen cry2A ............................................................................................................. 76 Hình 3.8. Kết quả sàng lọc bằng kỹ thuật pcr khuẩn lạc, các dòng biến nạp gen cry2A từ 2 chủng LNT7.12 và MSS8.4..................................................................... 76 x Hình 3.9. Kết quả cắt các dòng biến nạp mang gen cry2A từ 2 chủng LNT7.12 và MSS8.44 bằng 2 enzyme BamHI,XhoI ..................................................................... 77 Hình. 3.10. Phân nhóm quan hệ của trình tự DNA phân lập từ chủng MSS8.4 với các trình tự gen cry. ................................................................................................... 79 Hình 3.11. So sánh trình tự gen của chủng MSS8.4 với với các gen cry2A từ ngân hàng gen quốc tế........................................................................................................ 81 Hình 3.12. So sánh trình tự a.a suy diễn của chủng MSS8.4 với các trình tự protein độc tố cry2A từ ngân hàng gen quốc tế..................................................................... 82 Hình 3.13. Cấu trúc 3D mô phỏng của cry2Aa từ chủng MSS 8.4 ......................... 83 Hình 3.14. Kết quả sàng lọc bằng kỹ thuật PCR khuẩn lạc, các dòng biến nạp gen cry2A với cặp mồi đặc hiệu. ..................................................................................... 84 Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm cắt vector tái tổ hợp mang gen cry2A với BamHI ,XhoI ............................................................................................................ 85 Hình 3.16. Kiểm tra sự biểu hiện của gen cry2A trên gel polyacryamide 12,6%. .... 86 Hình 3.17. Phân tích sự biểu hiện của protein cry2A bằng kỹ thuật Western blot. ...... 87 Hình 3.18. Sản phẩm protein của chủng E. Coli tái tổ hợp mang gen cry2Atheo nhiệt độ trên gel 12,6 % polyacrylamide. .......................................................................... 89 Hình 3.19. Sản phẩm protein của chủng E. Coli tái tổ hợp mang gen cry2A theo nồng độ chất cảm ứng (IPTG) trên gel 12,6 % polyacrylamide. .............................. 90 Hình 3.20. Sản phẩm protein của chủng E. Coli tái tổ hợp mang gen cry2Atheo thời gian trên gel 12,6 % polyacrylamide. ....................................................................... 91 Hình 3.21. Điện di protein sau khi tinh sạch trên gel 12,6 % polyacrylamide. ........ 92 Hình 3.22. Tỷ lệ chuyển hóa thành bào tử sau 48 giờ lên men ............................... 100 Hình 3.23. Ảnh hƣởng của nồng độ MgSO4 đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein tinh thể của chủng MSS8.4 ............................................................................ 104 Hình 3.24. Ảnh hƣởng của nồng độ MnSO4 đến khả năng tổng hợp protein tinh thể của chủng vi khuẩn MSS 8.4................................................................................... 105 Hình 3.25. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng bổ sung vào dịch thủy phân bã bia đến nồng độ protein tinh thể thu đƣợc sau 48 giờ lên men ............................... 107 xi Hình 3.26. Bề mặt đáp ứng của từng cặp yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp độc tố protein tinh thể của chủng vi khuẩn B.thuringiensis ............................................... 111 Hình 3.27.Thiết bị lên men chế phẩm ..................................................................... 118 Hình 3.28. Sinh khối thu đƣợc đặt trong tủ âm ....................................................... 118 Hình 3.29. Chế phẩm BT sau khi đông khô ........................................................... 119 Hình 3.30. Thử hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà của chế phẩm BT quy mô phòng thí nghiệm ..................................................................................................................... 120 Hình 3.31. Thử nghiệm hoạt tính diệt ruồi nhà Musca dometisca .......................... 122 Hình 3.32. Một số hình ảnh thử nghiệm chế phẩm diệt dòi ngoài hiện trƣờng ...... 125 xii MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Bacillus thuringiensis là vi khuẩn có khả năng sinh sản ra các protein tinh thể độc có khả năng diệt côn trùng thuộc các bộ khác nhau mà không gây độc hại cho con ngƣời và môi trƣờng sinh thái và sinh vật có ích. Trong nhiều năm qua, thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng để diệt trừ côn trùng có hại đối với cây trồng cũng nhƣ bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Càng ngày thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis càng đƣợc sử dụng một cách rộng rãi bởi nhu cầu sử dụng các sản phẩm nông nghiệp sạch ngày càng cao. Không những thế thuốc trừ sâu sinh học BT còn có những ƣu điểm rất vƣợt trội từ việc khắc phục đƣợc tính kháng thuốc của côn trùng và chỉ diệt các loài côn trùng có hại, không ảnh hƣởng tới môi trƣờng sinh thái cũng nhƣ sức khỏe con ngƣời. Côn trùng bộ hai cánh là một trong những bộ lớn trong lớp côn trùng với số lƣợng và thành phần đa dạng. Côn trùng thuộc bộ hai cánh rất đa dạng về mặt sinh thái học và chủ yếu là các tác nhân gây hại trong nông nghiệp (ruồi đục quả) hay cho con ngƣời nhƣ ruồi, muỗi. Chúng là tác nhân trung gian chủ yếu truyền bệnh giữa ngƣời với ngƣời hay giữa động vật và ngƣời. Các bệnh do muỗi truyền có thể gây tử vong cao nhƣ Anopheles gambiae là trung gian truyền bệnh sốt rét cho ngƣời. Aedes aegypti truyền bệnh sốt xuất huyết. Culex tritaeniorhynchus truyền bệnh viêm não Nhật Bảncòn ruồi là tác nhân truyền khoảng 100 bệnh nhƣng chủ yếu là các bệnh nguy hiểm nhƣ: bại liệt, bệnh đau mắt hột, viêm gan (A, E), sốt hồi qui do Rickettsiae,lỵ, tả, thƣơng hàn, liên cầu khuẩn (Streptococcus) và tụ cầu vàng (Staphyloccocus). Ngày nay, có nhiều phƣơng pháp diệt côn trùng bộ hai cánh khác nhau mà con ngƣời áp dụng. Biện pháp diệt đƣợc sử dụng phổ biến nhất là dùng các loại thuốc diệt ruồi, muỗi. Tuy nhiên, những loại thuốc này hiện nay thƣờng có giá thành cao, chủ yếu có nguồn gốc từ hóa chất nên dễ gây ô nhiễm môi trƣờng và ảnh hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời, động vật, không diệt trừ tận gốc mầm bệnh. Việc nghiên cứu hoạt tính diệt ấu trùng một số côn trùng bộ hai cánh của các 1 chủng Bacillus thuringiensisphân lập ở Việt Nam là rất cần thiết nhằm tìm ra những chủng mang gen tự nhiên có hoạt tính mạnh phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học diệt ấu trùng một số côn trùng bộ hai cánh. Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Bacillusthuringiensis phục vụ tạo chế phẩm diệt côn trùng bộ hai cánh (Diptera)” 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Mục tiêu chung Tuyển chọn đƣợc chủng Bacillus thuringiensis bản địa có khả năng sinh protein tinh thể độc diệt côn trùng thuộc bộ hai cánh (Diptera) cao. Biểu hiện, tinh sạch đƣợc protein mã hóa tinh thể độc diệt côn trùng bộ hai cánh trong vi khuẩn E.coli phục vụ nghiên cứu chuyên sâu và sản xuất đƣợc chế phẩm sinh học Bacillus thuringiensis có hoạt lực diệt ấu trùng ruồi nhà (Musca domestica) từ bã thải nhà máy bia . 2.2. Mục tiêu cụ thể - Thu thập và sàng lọc đƣợc chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ các mẫu đất, lá tại một số tỉnh của Việt nam có khả năng sinh gen cry2A mã hóa protein tinh thể độc diệt côn trùng bộ hai cánh và xác định đƣợc trình tự nucleotide của gen cry2A này. - Biểu hiện và tinh sạch đƣợc protein tái tổ hợp (rCry2A) trong E.coli BL 21 (DE3). - Tìm ra đƣợc phƣơng pháp xử lý bã malt bia làm môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn B. thuringiensis và nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn B. thuringiensis khi sử dụng bã malt bia làm môi trƣờng nuôi cấy ở quy mô phòng thí nghiệm. Đồng thời đánh giá đƣợc sơ bộ hiệu quả diệt côn trùng bộ hai cánh của chế phẩm BT từ vi khuẩn B. thuringiensis 2 3. Nội dung nghiên cứu - Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus thuringiensis (B. thuringiensis) có hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh. - Nghiên cứu tách dòng và đọc trình tự đƣợc gen cry2 của các chủng Bt phân lập từ đất, lá có hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánhcủa chủng vi khuẩn B. thuringiensis tuyển chọn. - Nghiên biểu hiện gen mã hóa protein Cry2 diệt côn trùng bộ hai cánh của chủng vi khuẩn B. thuringiensis tuyển chọn. - Nghiên cứu các phƣơng pháp xử lý bã malt bia làm môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn B. thuringiensis. Hoàn thiện môi trƣờng lên men vi khuẩn B. thuringiensis từ bã malt bia. - Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn B. thuringiensis tuyển chọn khi sử dụng bã malt bia làm môi trƣờng nuôi cấy ở quy mô phòng thí nghiệm. - Lên men sản xuất chế phẩm sinh học diệt côn trùng bộ hai cánh từ vi khuẩn B. thuringiensis tuyển chọn và đánh giá sơ bộ hiệu quả diệt côn trùng bộ hai cánh của chế phẩm trong phòng thí nghiệm và ngoài thực địa. 4. Những đóng góp mới của luận án - Phân lập và tuyển chọn đƣợc 7 chủng vi khuẩn B. thuringiensis mang gen cry2A có hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh cao. - Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống về gen cry2A từ chủng vi khuẩn B. Thuringiensis serovar kurstaki MSS 8.4 của Việt Nam có khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh phục vụ cho việc phát triển thuốc trừ sâu sinh học. - Bổ sung cơ sở dữ liệu nguồn gen cry2A của các chủng B. thuringiensis Việt Nam phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng về sau. 3 - Sử dụng bã malt bia là một chất thải của ngành sản xuất đồ uống làm nguồn nguyên liệu cung cấp các chất dinh dƣỡng (các bon, nitơ, chất khoáng…) cho sự sinh trƣởng của vi khuẩn B. thuringiensis và đƣợc sử dụng nhƣ một nguyên liệu thay thế cho các hợp chất hữu cơ tổng hợp đắt tiền để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học BT. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 5.1. Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu một cách hệ thống và đầy đủ về gen cry2A là cơ sở khoa học đáng tin cậy cho những nghiên cứu tiếp theo về vi khuẩn Bacillus thuringiensis nói chung và gen cryA nói riêng. Trên cơ sở đánh giá đƣợc tác động của gen cryA mã hóa protein tinh thể có khả năng diệt đƣợc một số côn trùng bộ hai cánh nhƣ ruồi nhà là một bƣớc đi mới để mở ra khả năng tạo ra đƣợc các chế phẩm sinh học diệt các côn trùng này. Kết quả của luận án còn góp phần phát triển công nghệ lên men chế phẩm BT từ nguồn nguyên liệu thay thế rẻ tiền là phế thải của ngành sản xuất bia. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của luận án góp phần khai thác có hiệu quả nguồn gen của vi sinh vật nói chung và gen cry2A của vi khuẩn B. thuringiensis nói riêng để góp phần tạo ra các chế phẩm sinh học diệt một số côn trùng bộ hai cánh.Mặt khác sử dụng bã malt bia - một loại chất thải của ngành sản xuất công nghiệp đƣợc xử lý thành nguồn nguyên liệu cho quá trình sản xuất khác chế phẩm BT là rất cần thiết. Đây là một hƣớng nghiên cứu nhằm nâng cao giá trị của bã malt bia, tạo ra sản phẩm thân thiện môi trƣờng phục vụ sản xuất nông nghiệp bền vững. 4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis Năm 1870, Louis Pasteur phát hiện một loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho tằm và ông đặt tên loại vi khuẩn này là Bacillus bombyces. Năm 1901, Bacillus soto đƣợc nhà khoa học Nhật Bản Sigetane Ishiwata phát hiện và đặt tên khi ông nghiên cứu về bệnh ở tằm dâu. Đến mƣời năm sau (1911), loài vi khuẩn này đƣợc nhà khoa học ngƣời Đức là Berliner phân lập đƣợc từ xác ấu trùng bƣớm Địa Trung Hải (Anagasta kuhniella) và ông đã có những mô tả đầu tiên về loài vi khuẩn đất này, đó là vi khuẩn đất có tế bào hình que, có khả năng sinh bào tử. Đến năm 1915, vi khuẩn này chính thức mang tên Bacillus thuringiensisdo phân lập từ nhà máy bột vùng Thuringen của Đức. Từ đó, chế phẩm sử dụng B. thuringiensis để diệt sâu đục thân có hại Angasta kuhniella ở châu Âu đƣợc ra đời năm 1930 tên là chế phẩm BT. Chế phẩm thƣơng mại đầu tiên đƣợc sản xuất để diệt sâu hại lúa mỳ tại Pháp năm 1938. Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể có bản chất protein. Năm 1956, Angus đã chứng minh đƣợc hoạt tính diệt sâu của B. thuringiensislà do tinh thể độc này đƣợc sinh ra từ tế bào và bào tử vi khuẩn. Trong suốt những năm 1960, nhiều chế phẩm thƣơng mại của B. thuringiensis đã đƣợc sản xuất ở nhiều quy mô khác nhau tại Mỹ, Pháp, Đức. Sau đó, Howard Dulmage và Clayton Beesle của viện nghiên cứu Nông Nghiệp USDA đã thu thập đƣợc bộ sƣu tầm đầu tiên về các chủng B. thuringiensis. Năm 1962, De Barjac và Bonnefoi đã đƣa ra phƣơng pháp phân loại mới cho các chủng B. thuringiensis và B. sphaericus (Bs) bằng phƣơng pháp huyết thanh. Năm 1970, Dulmage đã phân lập đƣợc chủng HD-1 và cho đến nay nó vẫn đƣợc sử dụng cho nhiều nghiên cứu và trong chế phẩm B. thuringiensis. Trong những năm 1970 và 1980, rất nhiều nghiên cứu về B. Thuringiensis 5 đƣợc thực hiện nhằm tìm ra phổ côn trùng đích của B. thuringiensis. Năm 1977, Goldberg và Margarit đã phát hiện ra B. thuringiensis subsp. isralensis diệt đƣợc cả ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh. Đặc biệt, gen mã hóa protein tinh thể diệt sâu đầu tiên đƣợc tách dòng và đọc trình tự năm 1981. Từ đó trở đi, rất nhiều gen của vi khuẩn B. thuringiensis đã đƣợc tách dòng và nghiên cứu đặc tính diệt côn trùng. Năm 1983, Krieg và cộng sự đã phát hiện dƣới loài Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis diệt bọ cánh cứng hại lá khoai tây vùng Colorado, Hoa Kỳ từ sâu Tenebrio molitar. Sau đó không lâu thì công ty Mycogen phát hiện chủng tƣơng tự B. thuringiensis subsp. morrisoni đặt tên là B. thuringiensis subsp. sandiego và đã tổng hợp đƣợc chuỗi gen độc tố của chúng. Đặc biệt, vi khuẩn này còn đƣợc phát hiện ra hoạt tính đối với giun tròn thực vật, diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda và diệt kiến thuộc bộ Hymenoptera. Đáng chú ý, đây cũng là giai đoạn diễn ra những nghiên cứu đầu tiên về chuyển gen B. thuringiensis vào cây trồng (1985). Giai đoạn từnăm 1990 đến nay, các phƣơng pháp truyền thống nhằm tuyển chọn và đánh giá hoạt tính của các chủng B. thuringiensis thông qua các thử nghiệm hoạt tính sinh học và kiểm tra đặc tính sinh hóa dần dần đƣợc thay thế bởi PCR đặc hiệu cho các gen mã hóa độc tố. Phổ côn trùng đích không chỉ thu đƣợc nhờ việc phát hiện ra các độc tố mới mà còn nhờ việc tạo ra các chủng B. thuringiensis mới không chỉ mang những gen mã hóa độc tố sẵn có mà còn mang những gen mới đƣợc chuyển vào bằng chuyển nạp hoặc biến nạp trực tiếp (Osman và cộng sự, 2015). Đáng chú ý là năm 1995, cây chuyển gen thƣơng phẩm đầu tiên đƣợc đƣa vào sản xuất, từ đó một chƣơng trình mới về ứng dụng B. thuringiensis vào cây trồng - thực vật chuyển gen (Genetically Modified Organisms - GMOs). Cho đến năm 2009 (Sanahuja và cộng sự, 2011), tổng diện tích toàn cầu dành cho cây trồng chuyển gen kháng côn trùng từ B. thuringiensis trong năm 2009 là> 50 triệu ha (36% tổng số cây trồng biến đổi gen) (James, 2010). Một loạt các cây trồng chuyển gen cry1A, cry1Ab và cry1Actừ B. Thuringiensis đƣợc thử nghiệm ở quy mô lớn vào năm 2007 (Huang và cộng sự, 2007) và đã đƣợc thƣơng mại hóa vào tháng 11 năm 2009. 6