Tài liệu Phân lập và tuyển chọn chủng nấm ký sinh côn trùng có khả năng sinh tổng hợp chitinase để kiểm soát rệp muội hại cây trồng​

Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------***------------ VŨ THỊ THANH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE ĐỂ KIỂM SOÁT RỆP MUỘI HẠI CÂY TRỒNG LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2013 Trường đại học khoa học tự nhiên Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------***------------ VŨ THỊ THANH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE ĐỂ KIỂM SOÁT RỆP MUỘI HẠI CÂY TRỒNG Chuyên ngành: Khoa học môi trường Mã số: 60440301 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh Hà Nội - 2013 Trường đại học khoa học tự nhiên Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác. Luận văn này là một phần nghiên cứu trong đề tài: “Nghiên cứu sản xuất và sử dụng chế phẩm từ nấm Lecanicillium spp. để diệt rệp muội (Aphididae) gây hại cây trồng” do TS. Vũ Văn Hạnh làm chủ nhiệm đề tài, được sự hỗ trợ bởi Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2010-2013. Tác giả Vũ Thị Thanh Trường đại học khoa học tự nhiên Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh Lời cảm ơn! Trước hết tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và những kinh nghiệm quý báu trong quá trình học tập và thực hiện luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới toàn thể cán bộ nhân viên Phòng Công nghệ Sinh học Môi trường và Phòng Các chất chức năng Sinh học, đặc biệt là TS. Vũ Văn Hạnh – chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu sản xuất và sử dụng chế phẩm từ nấm Lecanicillium spp. để diệt rệp muội (Aphididae) gây hại trên cây trồng” đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn thí nghiệm, tạo mọi điều kiện về vật tư, hóa chất, thiết bị và chỉ bảo tận tình trong quá trình tôi thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để hoàn thành bản luận văn này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm bộ môn Công nghệ môi trường, các thầy cô Khoa Môi trường, trường đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường. Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó ! Trường đại học khoa học tự nhiên Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3 1.1. Rệp muội hại cây trồng ........................................................................................3 1.1.1. Đặc điểm sinh học của rệp muội hại cây trồng ...........................................3 1.1.2. Tình hình rệp muội hại cây trồng trên thế giới và Việt Nam ......................5 1.2. Thuốc diệt côn trùng có nguồn gốc sinh học .......................................................8 1.2.1. Tình hình sử dụng nấm diệt côn trùng trên thế giới ....................................8 1.2.2. Tình hình sử dụng nấm diệt côn trùng ở Việt Nam ...................................11 1.3. Nấm ký sinh côn trùng .......................................................................................12 1.4. Hệ enzyme chitinase từ nấm sợi ........................................................................14 1.4.1. Định nghĩa .................................................................................................14 1.4.2. Cấu trúc của chitinase ...............................................................................14 1.4.3. Cơ chế hoạt động của chitinase ................................................................16 1.4.4. Cơ chất cảm ứng của chitinase .................................................................18 1.4.5. Các nguồn thu nhận chitinase ...................................................................19 1.4.6. Ứng dụng của chitinase .............................................................................20 1.5. Công nghệ lên men lỏng và lên men xốp ...........................................................20 1.6. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp chitinase....22 1.6.1. Nguồn carbon ............................................................................................22 1.6.2. Nguồn nitơ .................................................................................................22 1.6.3. Độ ẩm cơ chất ............................................................................................23 1.6.4. Nhiệt độ nuôi cấy .......................................................................................23 1.6.5. pH môi trường ...........................................................................................24 1.6.6. Cơ chất.......................................................................................................24 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ...................................................26 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng ..........................................................26 2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................................26 2.1.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ..........................................................26 2.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................28 2.2.1. Phương pháp phân lập nấm ......................................................................28 2.2.2.Sàng lọc chủng nấm ký sinh côn trùng có độc lực diệt rệp hại ngô cao ....29 2.2.3. Chọn lọc chủng nấm ký sinh côn trùng có hoạt tính chitinase cao ...........30 Trường đại học khoa học tự nhiên Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh 2.2.4. Xác định hoạt tính chitinase của chủng nấm ký sinh côn trùng ................31 2.2.5. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng nấm có độc lực diệt rệp hại ngô cao .........................................................................................................32 2.2.6. Phương pháp phân loại nấm sợi dựa vào xác định và so sánh trình tự gen mã hóa 18S rRNA ...............................................................................................33 2.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm được lựa chọn ............................................35 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................38 3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm ký sinh côn trùng có độc lực diệt rệp muội hại ngô cao ...............................................................................................................38 3.2. Tuyển chọn chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao .....................41 3.3. Hình thái khuẩn lạc và hình thái bào tử của chủng nấm NM4...........................42 3.4. Xác định trình tự gene mã hóa 18S rRNA của chủng NM4 ..............................43 3.4.1. Tách chiết DNA tổng số của chủng nấm NM4 ..........................................43 3.4.2. Nhân đoạn gene 18S rRNA của chủng NM4 .............................................44 3.5. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm Penicillium sp. M4..........................................................................................46 3.5.1. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất ...................................................................46 3.5.2. Ảnh hưởng của độ dày cơ chất ..................................................................48 3.5.3. Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất ...................................................................48 3.5.4. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng .................................................49 3.5.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ .............................................................................51 3.5.6. Ảnh hưởng của pH môi trường lên men ....................................................51 3.5.7. Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ vô cơ ...................................................52 3.5.8. Ảnh hưởng của thời gian lên men..............................................................53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................56 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................57 PHỤ LỤC 2. THÔNG TIN CỦA CHỦNG NẤM PENICILLIUM SP. M4 TRÊN NGÂN HÀNG GEN NCBI .........................................................................70 PHỤ LỤC 3: CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN TỚI ................71 LUẬN VĂN ..............................................................................................................71 Trường đại học khoa học tự nhiên Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Danh mục các thiết bị sử dụng trong phòng thí nghiệm...........................38 Bảng 2.2. Các loại môi trường cơ bản ......................................................................38 Bảng 3.1. Các chủng nấm phân lập được trên môi trường PDA ..............................38 Bảng 3.2. Hoạt tính chitinase của hai chủng nấm NM3 và NM4. ............................42 Trường đại học khoa học tự nhiên Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cấu tạo ngoài của rệp ..................................................................................3 Hình 1.2. Rệp ngô Aphis maydis ................................................................................5 Hình 1.3. Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 (A) và Glycohydrolase 19 (B) ..............................................................................................15 Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của enzyme chitinase ...................................................16 Hình 1.5. Cấu tạo hóa học của chitin ........................................................................18 Hình 2.1. Đường chuẩn N-acetyl-β-D-glucosamine .................................................31 Hình 3.1. Kết quả phun bào tử nấm lên rệp ngô .......................................................39 Hình 3.2. Độc lực diệt rệp của 6 chủng nấm .............................................................40 Hình 3.3. Hoạt tính chitinase của hai chủng nấm NM3 và NM4..............................41 Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc (A, B), hình thái bào tử (C) của chủng nấm NM4…42 Hình 3.5. DNA tổng số của chủng nấm NM4 ...........................................................43 Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm nhân đoạn gene mã hóa 18S rRNA của chủng NM4 ...................................................................................................................................44 Hình 3.7. Trình tự đoạn gene 18S rRNA của chủng nấm NM4 ...............................45 Hình 3.8. Cây phát sinh chủng loại của chủng nấm NM4. .......................................45 Hình 3.9. Ảnh hưởng của các nguồn cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm Penicillium sp. M4 ...........................................................................47 Hình 3.10. Khả năng phát triển của chủng nấm Penicillium sp. M4 trên các nguồn cơ chất khác nhau sau 7 ngày lên men rắn ................................................................47 Hình 3.11. Ảnh hưởng của độ dày cơ chất (A), độ ẩm cơ chất (B) đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm Penicillium sp. M4. ...........................................49 Hình 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất chitin đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm Penicillium sp. M4 ............................................................50 Hình 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ (A), pH (B) đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm Penicillium sp. M4. ...........................................................51 Hình 3.14. Ảnh hưởng của các nguồn nitơ vô cơ (A), nồng độ urê (B) đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm Penicillium sp. M4. ....................................53 Hình 3.15. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm Penicillium sp. M4. ..........................................................................54 Trường đại học khoa học tự nhiên Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh BẢNG CHỮ VIẾT TẮT bp : Base pair (cặp bazơ) cm, mm, nm : Centimeters, millimeters, nanometers DNA : Deoxyribonucleic acid dNTPs : Deoxyribonucleic triphotphate DNS : acid 3,5-dinitrosalicylic GlcNAc : N- acetylglucosamine ha : hecta LB : Luria-Bertani M, µmol : Mol, micromol mg, g : milligrams, grams NAG : N-acetyl-β-D-glucosamine OD : Optical Density (mật độ quang học) PDA : Potato dextrose agar PDB : Potato dextrose broth PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) RNA : Ribonucleic acid rRNA : Ribosomal ribonucleic acid SDS : Sodium dodecyl sulfate Taq-DNA polymerase TE : Thermus aquaticus DNA polymerase : Đệm Tris – EDTA (Ethylennediaminetetraacetic) v/v : Volume/volume v/w : Volume/ weight w/v : Weight/volume µl, ml, l : Microliters, milliliters, liters Trường đại học khoa học tự nhiên Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh MỞ ĐẦU Rệp muội là loài côn trùng gây hại lớn đối với cây trồng nói chung và cây lương thực nói riêng. Hàng năm, trên thế giới sản lượng nông nghiệp bị tổn thất do nạn rệp gây ra lên tới hàng tỷ đô la. Đặc biệt, thế giới mỗi năm đã phải chi nhiều tỷ đô la Mỹ để khống chế rệp muội phá hại cây trồng. Trong số, các loài rệp muội gây hại phải kể đến rệp ngô (Aphis maydis) là một loại sâu hại phổ biến trên toàn thế giới, chúng ký sinh trên nhiều loại cây trồng như lúa miến (Sorghum), ngô, mía và lúa mì… với mật độ cao sẽ làm giảm sản lượng hạt và lây truyền virus gây bệnh. Rệp có thể trích hút nhựa, làm tổn thương ở tất cả các bộ phận khác nhau của cây dẫn tới giảm năng suất, chất lượng hạt [29]. Mặt khác chúng còn là môi giới truyền virus gây một số bệnh cho cây bắp như potyvirus, virus màu vàng, bệnh vàng lùn, bệnh khảm lá, bệnh đỏ lá. Do tính chất gây hại của rệp ngô, việc sử dụng các biện pháp phòng trừ rệp ngô là rất cần thiết. Một trong những phương pháp mà nhân dân ta hay sử dụng là dùng thuốc bảo vệ thực vật hóa học để khống chế các nạn dịch bệnh và sâu hại đã tỏ ra có hiệu quả. Tuy nhiên, việc gia tăng và thường xuyên sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong những năm gần đây đã ảnh hưởng không nhỏ đến côn trùng có ích, động vật hoang dã, làm ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người. Nông nghiệp nước ta đang hướng tới một nền nông nghiệp sạch, nông nghiệp sinh thái, trong đó biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp là nòng cốt. Việc sử dụng biện pháp sinh học phòng chống sâu hại cây trồng như nấm ký sinh côn trùng, thiên địch đang mở ra một hướng đi mới trong sản xuất nông nghiệp bởi ưu điểm vượt trội là phát tán rất nhanh và chỉ gây hại trên côn trùng có hại, không gây hại tới nguồn nước môi trường sinh thái và sức khỏe con người, vật nuôi. Nấm ký sinh côn trùng gây bệnh theo con đường chính là bào tử nảy mầm phát triển thành hệ sợi ăn sâu vào khoang bụng, qua đường tiêu hóa, thông qua các khí quản và sợi nấm phủ kín các lỗ khí côn trùng làm chúng chết. Nấm còn gây bệnh cho côn trùng bằng cách tiết độc tố và các enzyme như protease, lipase, Trường đại học khoa học tự nhiên 1 Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh chitinase thủy phân vỏ và mô cơ quan của côn trùng [44]. Hiện nay, trong nhóm enzyme thủy phân, chitinase đang rất được quan tâm vì nó có khả năng thủy phân chitin- nguyên liệu cơ bản cấu thành nên lớp vỏ côn trùng. Trong quá trình ký sinh côn trùng, việc tiết ra chitinase càng mạnh thì tốc độ diệt côn trùng càng nhanh và hiệu quả cao, tiết kiệm thời gian. Dựa vào đặc tính này của nấm, việc nghiên cứu cải biển tăng tổng hợp chitinase nhằm tạo ra một lượng lớn enzyme bổ sung vào chế phẩm sinh học là rất cần thiết. Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài “Phân lập và tuyển chọn chủng nấm ký sinh côn trùng có khả năng sinh tổng hợp chitinase để kiểm soát rệp muội hại cây trồng” đã được thực hiện.  Mục tiêu của đề tài Tuyển chọn được chủng nấm ký sinh côn trùng có khả năng diệt rệp muội hại ngô mạnh và tối ưu các điều kiện môi trường sinh tổng hợp cao sản chitinase bởi chủng nấm chọn lọc.  Nội dung nghiên cứu của đề tài - Phân lập và tuyển chọn chủng nấm ký sinh côn trùng có khả năng diệt rệp muội hại ngô. - Xác định hoạt tính chitinase của chủng nấm ký sinh côn trùng có độc lực diệt rệp hại ngô cao. - Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng nấm có độc lực diệt rệp muội hại ngô cao. - Phân loại, định tên chủng nấm ký sinh côn trùng có độc lực diệt rệp hại ngô cao dựa vào trình tự đoạn gene mã hóa 18S rRNA. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm được chọn. Trường đại học khoa học tự nhiên 2 Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Rệp muội hại cây trồng 1.1.1. Đặc điểm sinh học của rệp muội hại cây trồng Trong các loài sâu hại cây trồng có thể nói rệp là nhóm côn trùng chích hút nhựa cây phổ biến nhất thế giới, phân bố tập trung nhất ở vùng ôn đới [36], rệp cũng phân bố khá phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới với độ đa dạng thấp hơn. Ước tính trên thế giới có khoảng 4000 loài rệp muội đã được phát hiện trong đó vùng Đông Nam Á có hơn 1000 loài. Trong số này có khoảng 250 loài rệp là côn trùng phá hoại nguy hiểm đối với nông, lâm nghiệp cần được kiểm soát [26]. Các loài thuộc họ rệp muội gây hại mạnh trong nông nghiệp phải kể đến như: rệp đào (Myzus persicae) gây hại trên cải, rệp bông (Aphis gossypii) gây hại trên cây bông, rệp muội hại ngô (Aphis maydis) gây hại trên cây ngô… Các loài thuộc họ rệp muội (Aphididae) có thân mềm, màu sắc khác nhau, từ màu xanh lá cây, vàng, nâu, đen, hồng hoặc hầu như không có màu. Rệp muội có kích thước rất nhỏ (từ 1-2 mm), hình quả lê, trần trụi, ở cuối bụng có phiến đuôi và 2 ống bụng ở 2 bên, có ba cặp chân phân đốt, mắt kép và một cặp râu, cơ thể được bao bọc bởi bộ khung kitin. Rệp có lớp biểu bì mềm, có cánh (dạng màng) hoặc không cánh [3] (hình 1.1). Râu Chân Mắt Ống tiết Ngực Đầu Bụng Đuôi Hình 1.1. Cấu tạo ngoài của rệp Phương thức dinh dưỡng của rệp là chích hút nhựa cây bằng miệng. Chúng làm yếu cây bằng cách hút cạn nguồn dinh dưỡng và gây ảnh hưởng nghiêm trọng Trường đại học khoa học tự nhiên 3 Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh cho sự phát triển của cây. Chúng tiết ra chất đường mật không chỉ làm đóng khí khổng của lá mà còn góp phần tăng sự phát triển của mốc đen, làm ngăn cản ánh sáng đến các mô quang hợp, ảnh hưởng nghiêm trọng tới năng suất cây trồng. Thêm vào đó, các loài rệp còn là những phương tiện góp phần lây lan virus từ những cây bệnh sang các cây khỏe mạnh [27]. Rệp sinh sản bằng hai hình thức: đơn tính và hữu tính (là sự kết hợp giữa các cá thể khác nhau tạo ra trứng để tồn tại qua mùa đông). Tại vùng nhiệt đới, chu kỳ sinh trưởng của rệp muội rất ngắn từ 5-7 ngày [3]. Mỗi rệp cái đẻ trung bình 30-50 con, quá trình sinh con lặp đi lặp lại trong suốt mùa hè, sinh ra nhiều thế hệ. Trong điều kiện nhiệt độ 20-30oC một năm có thể tới 20-30 thế hệ. Tuy nhiên, vòng đời của rệp muội tương đối ngắn, phần lớn từ 15-20 ngày, cá biệt là 25-30 ngày. Các loài rệp muội có thể phát triển trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm khá rộng, có một số loài như rệp cải phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ 10-30oC. Rệp muội là những loài côn trùng có sức tàn phá khủng khiếp trên nhiều loại cây trồng khác nhau như ngô, khoai tây, khoai lang, các cây họ dưa (cucurbitaceae) (dưa chuột, dưa tây, dưa hấu, bầu bí), họ cà (solanaceae) (như ớt chuông, cà tím, thuốc lá, cà chua), cam quýt, bông vải, đào, mận, mơ, táo, bắp cải, cải xanh, rau bina, rau diếp, cà rốt và họ cà rốt.... Chúng đã gây thiệt hại hàng tỷ đô la Mỹ mỗi năm do cây cho năng suất kém hoặc mất mùa. Mặt khác, thế giới mỗi năm cũng phải chi nhiều tỷ đô la Mỹ để khống chế rệp muội phá hại cây trồng. Rệp muội gây hại bốn mùa, đặc biệt từ mùa xuân đến mùa thu, nhất là vào thời điểm thời tiết râm mát, độ ẩm không khí cao. Rệp ngô có tên khoa học là Aphis maydis, thuộc họ rệp muội, là một trong những loại sâu hại quan trọng đối với người trồng ngô. Rệp hút nhựa ở trên nõn ngô, bẹ lá, bông cờ, lá bi, làm cho cây ngô mất hết dinh dưỡng, trở nên gầy yếu, bắp bé đi hoặc không hình thành bắp nếu bị hại từ giai đoạn cây còn nhỏ, chất lượng hạt xấu kém. Rệp phá hại làm giảm năng suất và phẩm chất ngô rõ rệt. Ngoài cây ngô chúng còn có nhiều loại cây ký chủ khác như: kê, cao lương, mía, cỏ trồng làm thức Trường đại học khoa học tự nhiên 4 Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh ăn cho gia súc… Mặt khác chúng còn là môi giới truyền virus gây một số bệnh cho cây bắp như potyvirus, virus màu vàng, bệnh vàng lùn, bệnh khảm lá, bệnh đỏ lá… [17]. Trong quần thể rệp thường thấy nhiều loại hình: Rệp cái không cánh, rệp cái có cánh và rệp con. Rệp trưởng thành có hai loại hình, rệp có cánh và rệp không cánh dài 1,5-2,3 mm, màu vàng nhạt hoặc xanh xám, cơ thể hình bầu dục, thân mềm. Chân và tuyến tiết sáp ngắn, màu xanh đen. Rệp cái có cánh có đầu, ngực màu đen và bụng màu xanh. Rệp non màu xanh sáng, chân và tuyến tiết sáp giống như trưởng thành có màu đen (hình 1.2). Rệp non trải qua 7-10 lần lột xác mới thành rệp trưởng thành. Một năm có từ 7-10 lứa. Hình 1.2. Rệp ngô Aphis maydis Rệp ngô sinh sản theo lối đơn tính và đẻ con. Chúng thường đẻ nhiều nhất ở nhiệt độ 30oC và đẻ ít nhất ở nhiệt độ 15oC [25]. Rệp ngô thường phát triển nhiều trong tháng 1 và tháng 2 lúc độ ẩm không khí cao. Từ tháng 4 trở đi số lượng rệp giảm dần. Trong mùa hè chỉ thấy rệp xuất hiện lẻ tẻ. Rệp thường phá hại ở cây ngô từ giai đoạn 8-10 lá cho tới khi ngô chín sáp. Đến cuối vụ khi cây ngô đã già, không còn thức ăn nữa thì các con rệp có cánh di chuyển sang các cây ký chủ, đẻ ra rệp con không có cánh tiếp tục phát triển trên các cây ký chủ này cho tới vụ ngô sau. 1.1.2. Tình hình rệp muội hại cây trồng trên thế giới và Việt Nam  Tình hình rệp muội hại cây trồng trên thế giới Trường đại học khoa học tự nhiên 5 Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh Trên thế giới, rệp đang được coi là kẻ thù nguy hiểm đối với cây trồng. Rệp cây hại tại nhiều quốc gia và không cố định trong một vùng nhất định. Những thiệt hại do rệp gây ra đang ngày càng nghiêm trọng và diễn ra trên diện rộng. Sản lượng nông nghiệp thế giới hàng năm bị thiệt hại khoảng 15% do côn trùng [33], ở Mỹ là 13% [59]. Mặc dù chưa có thống kê chính thức về thiệt hại nông nghiệp do rệp nhưng trong số 300 loài côn trùng gây hại nghiêm trọng [49] thì có đến 250 loài là rệp. Chúng là tác nhân chính gây hại ở nhiều loại cây trồng quan trọng như bông, đậu tương, hướng dương, củ cải đường, khoai tây, ngô, ngũ cốc và rau cải. Theo nghiên cứu của các nhà côn trùng học Úc, ngành du lịch nước này đã thiệt hại 75 triệu USD/năm do nạn rệp hoành hành. Tình trạng nạn rệp lan tràn ở xứ sở này chỉ là một phần của đại dịch toàn cầu với số lượng rệp trên thế giới đã tăng lên gấp đôi mỗi năm. Các nhà côn trùng học cho biết, nguyên nhân là việc thay đổi biện pháp diệt côn trùng (không dùng thuốc xịt mà dùng mồi) và do sự gia tăng đáng kể lượng du khách đến từ các nước đang phát triển, nơi rệp vẫn còn đang hoành hành. Tại châu Á, rệp gây thiệt hại nghiêm trọng một số loại cây trồng, đặc biệt là dưa chuột, hại tiêu và cà chua. Các rệp đào Myzus persicae thường phát triển nhanh trong mùa vụ và phát triển nhanh chóng đến tuổi trưởng thành nên tăng nhanh về số lượng. Ước tính thiệt hại hàng tỷ đô la Mỹ mỗi năm do nạn rệp hoành hành. Tại 3 tỉnh của Thái Lan, trong tháng 7/2009 nạn rầy nâu hại lúa, rệp hại cây trồng đã bùng phát mạnh và gây thiệt hại khoảng 7,5 ngàn ha mỗi vụ. Đậu tương là loại hạt dầu được trồng nhiều nhất trên thế giới, nhưng năng suất bị đe dọa nghiêm trọng bởi Aphis glycines (rệp đậu tương). Sản lượng hạt bị thiệt hại ước tính khoảng 34% [65], theo tính toán của Catangui và cộng sự (2009), con số thiệt hại thậm chí lên đến 48-72%. Nguyên nhân do rệp chích hút có thể làm giảm 50% tốc độ quang hợp của lá cây [30]. Lipaphis erysimi (rệp cải dầu) ký sinh trên một số loài cây nhưng chủ yếu là các loại cải và cải dầu. Ngoài ra nó còn ký sinh trên cà chua và bí xanh. Ở phía Trường đại học khoa học tự nhiên 6 Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh đông của miền Trung Ấn Độ, Lipaphis erysimi cùng với Myzus persicae và Brevicoryne brassicae là ba loại rệp nguy hiểm đối với cây cải dầu (Brassica juncea). Trong đó Lipaphis erysimi phá hoại nhiều nhất, riêng nó gây thiệt hại 35,491,3 % sản lượng [28]. Theo nghiên cứu của Patel và cộng sự (2004), nếu không có biện pháp bảo vệ, Lipaphis erysimi có thể gây thiệt hại 80,6-97,6% sản lượng cải dầu [57]. Trong một nghiên cứu khác, Razaq và cộng sự (2011) đã chỉ ra rằng, Lipaphis erysimi và Brevicoryne brassicae cũng gây thiệt hại 75,1-81,9% sản lượng cải dầu ở Multan, Punjab, Pakistan [64]. Ngoài cải dầu, Brassica brassicae còn phá hoại nhiều cây quan trọng khác như súp lơ, cà rốt và củ cải. Rệp làm giảm năng suất cây trồng không chỉ do phá hoại trực tiếp mà còn do truyền virus gây bệnh rụng lá ở đậu lăng, đậu răng ngựa, đậu gà [54]. Myzus persicae là loại nguy hiểm nhất trong 10 loại rệp truyển bệnh virus gây bệnh rụng lá ở khoai tây. Rệp truyền virus gây bệnh khảm có thể làm thiệt hại 60% năng suất dưa chuột [71]. Không những phá hoại rau và cây công nghiệp, rệp còn là côn trùng nguy hiểm đối với cây lương thực. Diuraphis noxia (rệp lúa mì Nga) chuyên phá hoại lúa mì, lúa mạch đen, lúa mạch trắng, yến mạch. Theo nghiên cứu của Akhtar và cộng sự (2010), năng suất lúa mì có thể bị giảm 7,9-34,2 % do Diuraphis noxia (rệp lúa mì Nga) phá hoại [21]. Như vậy với nguy cơ làm giảm năng suất cây trồng của rệp, yêu cầu phải có biện pháp kiểm soát rệp để bảo vệ mùa màng là cấp thiết. Biện pháp kiếm soát rệp và các loại côn trùng khác được áp dụng chủ yếu trong nhiều thập kỷ qua là sử dụng hóa chất diệt côn trùng tổng hợp. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học đã và đang làm phá hủy môi trường sống xung quanh và ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe của người nông dân.  Tình hình rệp muội hại cây trồng ở Việt Nam Theo số liệu thống kê ở Việt Nam nếu mỗi năm công tác phòng trừ dịch hại không tốt thì bị hao hụt từ 3-10% sản lượng nông sản dự trữ. Trường đại học khoa học tự nhiên 7 Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh Theo nghiên cứu và thống kê của các nhà khoa học, nước ta chịu sự tấn công của hơn 250 loài rệp khác nhau. Tại Ninh Thuận và Bình Thuận có tới 25 loài cây trồng đã bị tấn công bởi rệp muội bông. Rệp muội bông phát sinh, phát triển quanh năm, gây thiệt hại nghiêm trọng cho năng suất bông. Rệp muội bông gây hại phổ biến trên cây mãng cầu xiêm ở Bình Chánh, thành phố Hồ Chí Minh. Trong quá trình điều tra nghiên cứu 2 năm gần đây (2008-2010) đã ghi nhận được rệp muội bông gây hại trên cây bằng lăng nước rất phổ biến. Rệp muội bông gây hại nặng cây bằng lăng nước trong giai đoạn vườn ươm làm cho ngọn non mang lá bị dị dạng, lá bị cong gây tổn thất giá trị kinh tế đáng kể cho nhà vườn, làm ảnh hưởng lớn đến kế hoạch nhân giống cây. Theo thống kê các loài gây hại cho cây trồng ở nước ta trong những năm gần đây, rệp đào đang là mối đe dọa cho ngành nông nghiệp với sự gia tăng nhanh chóng về diện tích và số lượng cây trồng bị hại. Chúng có thể gây hại trên 300 loài cây trồng khác nhau, trong đó thường thấy trên các cây như: các loại rau họ thập tự (cải trắng, cải củ, cải xanh, cải bắp), một số cây ăn quả như đào, hồng, lê, mận. Trong điều kiện nước ta, rệp đào có thể xuất hiện và gây hại quanh năm, trong đó tập trung nhiều khi thời tiết dịu mát, độ ẩm cao vào tháng 4-5 (vụ đông xuân) và tháng 9-10 (vụ thu đông). Vụ đông xuân 2010-2011, huyện Tân Kỳ - Nghệ An gieo trỉa 1500 ha ngô, nhưng đến có tới hơn 80% diện tích ngô của địa phương đã xuất hiện bệnh rệp cờ gây hại. Không chỉ có xã Tân Kỳ mà xã Nghĩa Dũng cũng là một trong những địa phương có diện tích ngô bị nhiễm bệnh rệp cờ khá lớn. Vụ đông xuân năm nay toàn xã gieo trỉa 240 ha ngô, cơ cấu giống chủ yếu là C919, nhưng đã có tới 90 ha xuất hiện bệnh rệp cờ. 1.2. Thuốc diệt côn trùng có nguồn gốc sinh học 1.2.1. Tình hình sử dụng nấm diệt côn trùng trên thế giới Trên trái đất có khoảng 1 triệu loài côn trùng, trong đó có khoảng 5 vạn loại ăn thực vật và chỉ có khoảng 1% (khoảng 500 loài côn trùng) chuyên ăn hoa màu, Trường đại học khoa học tự nhiên 8 Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh cây ăn quả. Tuy số lượng chủng loại không nhiều nhưng chúng rất phàm ăn và ăn rất khoẻ, gây tác hại rất lớn đối với cây lương thực, rau xanh, cây ăn quả. Rệp muội (trong đó có rệp ngô) và bọ cánh trắng là những côn trùng gây hại cây trồng rất nghiêm trọng trong nhà kính trên toàn thế giới. Chúng gây thiệt hại nặng nề trên nhiều loại cây trồng, đặc biệt trên các cây như dưa chuột, rau cải, ngô… Chúng tăng số lượng rất nhanh và truyền virut từ cây bệnh sang cây khỏe mạnh. Để kiểm soát chúng, thuốc trừ sâu hóa học được bà con nông dân sử dụng tràn lan với liều lượng cao làm cho các loài côn trùng gây hại biến đổi nhanh chóng và kháng thuốc. Hiệu quả của việc sử dụng thuốc ngày càng thấp ngược lại với chi phí ngày càng cao [31]. Thuốc trừ sâu hóa học không chỉ tiêu diệt các loài côn trùng gây hại mà còn tiêu diệt cả những loài có ích như động vật ăn côn trùng, các loài ký sinh côn trùng gây hại cây trồng [59]. Mặt khác, phần lớn thuốc diệt côn trùng có thời gian phân hủy lâu, sau khi được phun cho cây trồng sẽ thẩm thấu một phần vào đất và các mạch nước ngầm. Các chất này khi đã ngấm vào đất và nước ngầm sẽ tồn tại lâu dài và ảnh hưởng nghiêm trọng tới môi trường sống, sức khỏe con người, gia súc và các loài sinh vật khác, đặc biệt là các động vật sống trong nước như cá, tôm, cua và các loài thủy sinh khác. Trước thực trạng đó, rất nhiều nước đang cố gắng làm giảm bớt việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học trong nông nghiệp. Hơn nữa, kiểm soát sinh học đang là một phương pháp thay thế hiệu quả, bao gồm việc dùng nấm ký sinh côn trùng (tức sử dụng tác nhân gây bệnh là nấm để tiêu diệt các loài côn trùng) [40]. Việc sử dụng thuốc trừ sâu sinh học có những đặc tính nổi bật sau: Ưu điểm: (a) Không tạo nên tính kháng thuốc của sâu hại cây trồng, nếu dùng liều lượng cao. (b) Không độc hại cho người và gia súc, không gây ô nhiễm môi trường, không ảnh hưởng đến chất lượng nông sản, không tác dụng tiêu cực đến đất trồng. (c) Hiệu quả thuốc vi sinh thường kéo dài vì chúng không chỉ tiêu diệt trực tiếp lứa sâu đang phá hoại mà chúng còn có thể lan truyền cho thế hệ tiếp theo, nên rất tiết kiệm chi phí. (d) Không ảnh hưởng đến tài nguyên vi sinh vật đất, Trường đại học khoa học tự nhiên 9 Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh các loài thiên địch hữu ích. (e) Nếu sử dụng hợp lý, đúng kỹ thuật mang lại hiệu quả kinh tế cao. Nhược điểm: (a) Tác dụng của thuốc trừ sâu vi sinh chậm nên hiệu quả chậm vì thuốc trừ sâu vi sinh thường có quá trình gây bệnh và nhiễm bệnh khi vào cơ thể sâu thì thời gian ủ bệnh phải mất 1-3 ngày. (b) Hiệu quả của thuốc ban đầu không cao, phổ tác dụng của thuốc còn hẹp. (c) Một vài loại thuốc trừ sâu vi sinh bị ảnh hưởng bởi điều kiện thời tiết như độ ẩm không khí, gió, ánh sáng mặt trời. Nếu như phun trừ sâu không đúng kỹ thuật, phun trong điều kiện không thích hợp sẽ khó đạt hiệu quả cao. (d) Giá thành cao và việc bảo quản còn gặp khó khăn. Một số chủng nấm diệt côn trùng mạnh như Beauveria sp., Metarhizium sp., Paecilomyces sp., Nomuraea sp., Verticillium sp., đã được sử dụng làm chất trừ sâu sinh học ở một số nước trên thế giới. Ở các nước như Liên Xô cũ, Mỹ, Anh chi nấm Beauveria dùng để sản xuất chế phẩm có tên Beauverin, ở Việt Nam có tên thương mại là Beauverit từ chủng Beauveria spp.. Bào tử nấm Metarhizium anisopliae đã được phối chế tạo sản phẩm có tên gọi thương mại là “BioBlast” được sử dụng để kiểm soát mối, mọt, côn trùng gây hại [63]. Cho đến nay, kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng một số chủng nấm thuộc hai loài nấm Beauveria sp. và Metarhizium sp. có tiềm năng rất mạnh để gây bệnh, diệt côn trùng, bướm gây hại ở trên đồng ruộng. Tuy nhiên, các nghiên cứu ứng dụng chế phẩm nấm này dùng để diệt côn trùng trên đồng ruộng thì rất ít. Việc sử dụng bào tử nấm ký sinh côn trùng để xử lý đất trồng cây, để kiểm soát côn trùng có cánh gây hại đã được đề cập [35, 74]. Hiện nay, các nghiên cứu về các chủng nấm Lecanicillium spp. được sử dụng để kiểm soát côn trùng gây hại cây trồng cũng đã và đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu bởi khả năng diệt côn trùng của chúng rất cao. Vi nấm Lecanicillium spp. ký sinh trên nhiều loại côn trùng bao gồm bộ cánh đều, bộ cánh cứng, cánh thẳng và bướm [39]. Việc sử dụng bào tử nấm Lecanicillium spp. đã rất được quan tâm để kiểm soát côn trùng và sâu bệnh hại cây trồng. Bên cạnh đó, giun tròn nang gây hại đậu tương, nấm mốc gây hại dưa chuột và các loại nấm gỉ gây hại Trường đại học khoa học tự nhiên 10 Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh cây hoa cúc cũng có thể được kiểm soát bởi loại nấm này [46]. Hơn nữa, Lecanicillium spp. đã được chứng minh có độc tính rất mạnh đối với một số loài rệp muội như rệp đào (Myzus persicae), rệp bông (Aphis gossypii) và Macrosiphum euphorbiae [22], do đó tại Anh, Mỹ và một số nước khác đã nghiên cứu và có chế phẩm thương mại như Vertalec® từ bào tử nấm Lecanicillium longisporum diệt các loài rệp muội, rệp chích hút nhựa cây. Ngoài ra, Lecanicillium đã được chứng minh rằng, nó có các hoạt động chống nấm mốc gây bệnh phấn trắng trên nhiều loại cây trồng [47], diệt các ký sinh trùng khác hại cây trồng như sâu, bọ [37]. 1.2.2. Tình hình sử dụng nấm diệt côn trùng ở Việt Nam Tại Việt Nam quy trình sử dụng vi nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria brassiana đã được nghiên cứu khá thành công và được sản xuất thành một số chế phẩm. Chế phẩm từ hai loại nấm này giúp bảo vệ môi trường và tạo thêm một số mô hình kinh tế mới như trồng lúa kết hợp nuôi tôm. Sử dụng biện pháp sinh học này giúp việc kiểm soát rầy nâu giảm bớt chi phí so với dùng thuốc trừ sâu hóa học. Vi nấm Metarhizium anisopliae cũng có hiệu lực cao đối với rệp sáp giả Dysmicoccus sp. hại na. Phun nấm với nồng độ 9×108 bào tử/ml đã kiểm soát được 82% rệp sáp giả sau 5 ngày xử lý. Tuy nhiên, hiệu quả trừ rệp sáp giả của nấm Metarhizium anisopliae trên cây na ở điều kiện động ruộng ở ngoại ô Thành phố Hồ Chí Minh thấp hơn so với ở phòng thí nghiệm, nhưng cũng đạt 56-78% [14]. Một chế phẩm khác từ Metarhizium diệt trừ được các loại sâu xanh, bướm trắng, sâu khoang ăn lá, bọ hung đen ăn mía, mối đất ăn thông trắng, một số loại côn trùng hại bồ đề, cây điều, cây ăn quả; sâu xanh bướm trắng ăn su hào, bắp cải, sâu khoang hại cà chua cho kết quả diệt sâu bệnh hơn 70%. Chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học 2B có nguồn gốc từ nấm Beauveria brassiana đã được thử nghiệm kiểm soát rầy nâu hại lúa [10]. Các chủng Bacillus thuringiensis được chọn lọc từ tự nhiên ở Việt Nam và nước ngoài cũng đã được nghiên cứu tạo chế phẩm, chế phẩm Bt do viện Công Trường đại học khoa học tự nhiên 11 Lớp cao học môi trường K19