Tài liệu Phân tích cấu trúc một số hợp chất phân lập từ cây muồng lá hẹp (cassia angustifolia) bằng các phương pháp phổ hiện đại​

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC --------------------------------------- Ngô Văn Huy PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY MUỒNG LÁ HẸP (CASSIA ANGUSTIFOLIA) BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP PHỔ HIỆN ĐẠI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Thái Nguyên – 5/2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC --------------------------------------Ngô Văn Huy PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY MUỒNG LÁ HẸP (CASSIA ANGUSTIFOLIA) BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP PHỔ HIỆN ĐẠI Chuyên ngành : Hóa phân tích Mã số: 8440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Lê Đăng Quang Thái Nguyên – 2018 LỜI CẢM ƠN Luận văn được hoàn thành tại Phòng thí nghiệm hóa học – Viện Hóa học Công nghiệp Việt Nam. Để hoàn thành luận văn này, tôi xin được chân thành cảm ơn sâu sắc nhất đến: TS. Lê Đăng Quang – Giám đốc trung tâm nghiên cứu Triển khai các Hoạt chất sinh học – Viện Hóa học Công nghiệp Việt Nam đã tận tình chu đáo tạo điều kiện cơ sở vật chất thuận lợi, truyền đạt kiến thức và kỹ năng trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận văn. TS. Nguyễn Hữu Tùng – giảng viên bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn này. Các cán bộ, nhân viên trung tâm Nghiên cứu Triển khai các Hoạt chất Sinh học, Viện Hóa học Công nghiệp Việt Nam, đặc biệt là CN. Nguyễn Thị Duyên đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành thực nghiệm và hoàn thiện luận văn. Mặc dù đã rất cố gắng thực hiện luận văn khoa học một cách hoàn chỉnh nhất, song do mới làm quen với công tác nghiên cứu khoa học cũng như hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên luận văn khoa học của tôi không tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy, cô giáo góp ý để luận văn của tôi được hoàn chỉnh hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2018 Tác giả luận văn Ngô Văn Huy MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................... a DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... b DANH MỤC CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ .............................................................................c DANH MỤC PHỤ LỤC .............................................................................................. d MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ....................................................................................... 4 1.1. Tổng quan về cây Muồng ............................................................ 4 1.2. Tổng quan về cây Muồng lá hẹp ................................................. 4 1.2.1. Đặc điểm cây Muồng lá hẹp...............................................................4 1.2.2. Thu hái, chế biến ................................................................................5 1.2.3. Công năng và dược tính .....................................................................6 1.2.4. Các thành phần đã được tìm thấy trong cây Muồng lá hẹp................6 1.3. Các phương pháp hiện đại nghiên cứu cấu trúc: ...................... 9 1.3.1. Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS)......................................9 1.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)...............................................12 1.3.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):.................................................13 CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM .............................................................................. 17 2.1. Đối tượng nghiên cứu: .............................................................. 17 2.2. Phương pháp phân lập chất: ..................................................... 17 2.1.1. Phương pháp chiết:...........................................................................17 2.1.2. Sắc kí cột (CC): ................................................................................17 2.1.3. Sắc kí lớp mỏng (TLC) ....................................................................19 2.1.4. Thuốc thử hiện bản mỏng.................................................................20 2.3. Thực nghiệm: ............................................................................. 21 2.3.1. Hóa chất và thiết bị: .........................................................................21 2.3.2. Xử lý và phân lập chất: ....................................................................22 2.3.3. Tách chiết và phân lập chất ..............................................................24 2.3.4. Tiến hành chiết phân bố dung môi ...................................................25 2.3.5. Tiến hành phân lập chất: ..................................................................26 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 29 3.1. Phân lập các chất: ...................................................................... 29 3.1.1. Phân lập CA1, CA3 từ EA ...............................................................29 3.1.2. Phân lập CA2 từ cặn chiết phân đoạn BuOH ...................................29 3.1.3. Phân lập CA4 từ phân đoạn B5 ........................................................29 3.2. Xác định cấu trúc phân tử của các hợp chất... ......................... 30 3.2.1. Hợp chất CA1: .................................................................................30 3.2.2. Hợp chất CA2: .................................................................................37 3.2.3. Hợp chất CA3: .................................................................................43 3.2.4. Hợp chất CA4: .................................................................................49 3.3. Xác định độ tinh khiết các chất bằng HPLC ............................ 55 3.3.1. Đo điểm chảy: ..................................................................................55 3.3.2. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ...................................................................56 3.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ............................56 3.4. Thảo luận.................................................................................... 58 3.4.1. Về chiết tách và phân lập các chất: ..................................................58 3.4.2. Về xác định cấu trúc của các hợp chất .............................................59 3.4.3. Về phân tích HPLC...........................................................................60 KẾT LUẬN ................................................................................................................ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 63 PHỤ LỤC ............................................................................................................... 1-PL DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13 1 C-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 H-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton MS: Phổ khối lượng ESI-MS: Phổ khối lượng phun mù điện tử HPLC: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao BuOH: Butanol CC: Cột sắc kí D: Đường kính Dc: Dịch chiết Dm: Dung môi DMSO: Dimethyl sulphoxide W: Nước EtOH: Etanol EA: Etyl axetat H: chiều cao cột Hex: Hexan g: gam MeOH: Metanol TMS: Tetrametyl silan TLC: Sắc kí lớp mỏng Pđ: phân đoạn a DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cấu trúc của các 1,8-dihydroxylanthraquinone và naphthone.........................2 Hình 1.1: Lá cây Muồng lá hẹp đã được phơi khô........................................................5 Hình 2.1: Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng..........................................13 Hình 3.1: Phổ 1H-NMR của CA1................................................................................31 Hình 3.2: Phổ 13C-NMR của CA1...............................................................................32 Hình 3.3: Phổ HMBC của CA1...................................................................................33 Hình 3.4: Phổ ESI – MS của hợp chất CA1................................................................36 Hình 3.5: Công thức cấu tạo của rhein........................................................................37 Hình 3.6: Phổ (-) ESI-MS của CA2............................................................................38 Hình 3.7: Phổ 1H-NMR của CA2................................................................................39 Hình 3.8: Phổ 13C-NMR của CA2...............................................................................40 Hình 3.9: Công thức cấu tạo của aloe – emodin..........................................................43 Hình 3.10: Phổ 1H – NMR của CA3............................................................................44 Hình 3.11: Phổ 13C – NMR của CA3...........................................................................45 Hình 3.12: Phổ ESI – MS của CA3.............................................................................47 Hình 3.13: Công thức cấu tạo của emodin...................................................................49 Hình 3.14: Phổ 1H – NMR của CA4............................................................................50 Hình 3.15: Phổ 13C – NMR của CA4...........................................................................51 Hình 3.16: Phổ ESI – MS của CA4..............................................................................52 Hình 3.17: Cấu tạo của aloe emodin glucoside............................................................55 Hình 3.18: Sắc kí đồ của hợp chất CA1.......................................................................56 Hình 3.19: Sắc kí đồ của hợp chất CA2.......................................................................56 Hình 3.20: Sắc kí đồ của hợp chất CA3.......................................................................57 Hình 3.21: Sắc kí đồ của hợp chất CA4........................................................................57 b DANH MỤC CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ Bảng 1.1: Vị trí và phân loại khoa học của Muồng lá hẹp...............................................5 Sơ đồ 2.1: Xử lí và phân lập chất..................................................................................23 Sơ đồ 2.2: Sơ đồ ngâm và chiết phân bố trong các hệ dung môi....................................25 Sơ đồ 2.3: Phân lập các chất trong cặn chiết phân đoạn EA........................................26 Sơ đồ 2.4: Phân lập các chất trong cặn chiết phân đoạn BuOH..................................27 Sơ đồ 2.5: Phân lập từ dịch chiết phân đoạn B5............................................................28 Bảng 3.1: So sánh số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và tương tác HMBC của CA1 với rhein.............................................................................................................................34 Bảng 3.2: So sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của CA2 với aloe emodin.........42 Bảng 3.3: So sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của CA3 với emodin...............48 Bảng 3.4: So sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13 C-NMR của CA4 với aloe emodin glucoside......................................................................................................................54 Bảng 3.5: Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của cryptotanshinon tinh chế được............55 Bảng 3.6: Kết quả phân tích độ tinh khiết của các chất tinh chế được...........................57 c DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của CA1.............................................................................1-PL Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR của CA1............................................................................2-PL Phụ lục 3: Phổ HMBC của CA1...............................................................................3-PL Phụ lục 4: Phổ ESI – MS của hợp chất CA1...........................................................4-PL Phụ lục 5: Phổ 1H-NMR của CA2...........................................................................5-PL Phụ lục 6: Phổ 13C-NMR của CA2............................................................................6-PL Phụ lục 7: Phổ (-) ESI-MS của CA2.........................................................................7-PL Phụ lục 8: Phổ 1H – NMR của CA3.........................................................................8-PL Phụ lục 9: Phổ 13C – NMR của CA3.........................................................................9-PL Phụ lục 10: Phổ (-) ESI - MS của hợp chất CA3....................................................10-PL Phụ lục 11: Phổ 1H – NMR của CA4......................................................................11-PL Phụ lục 12: Phổ 13C – NMR của CA4.....................................................................12-PL Phụ lục 13: Phổ ESI – MS của CA4........................................................................13-PL Phụ lục 14: Sắc kí đồ của hợp chất CA1.................................................................14-PL Phụ lục 15: Sắc kí đồ của hợp chất CA2................................................................14-PL Phụ lục 16: Sắc kí đồ của hợp chất CA3................................................................14-PL Phụ lục 17: Sắc kí đồ của hợp chất CA4.................................................................14-PL Phụ lục 18: Độ dịch chuyển hóa học của rhein theo ChemOffice..........................15-PL Phụ lục 19: Độ dịch chuyển hóa học của aloe-emodin theo ChemOffice..............16-PL Phụ lục 20: Độ dịch chuyển hóa học của emodin theo ChemOffice.......................17-PL d MỞ ĐẦU Việt Nam là một nước nông nghiệp nên nhu cầu sử dụng thuốc bảo vệ thực vật rất cao. Tuy nhiên trên thị trường hiện nay thuốc bảo vệ thực vật chủ yếu có nguồn gốc hóa học ít thân thiện với môi trường, làm mất cân bằng hệ sinh thái, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của con người. Chính vì vậy mà việc tạo ra các loại thuốc kháng nấm và vi khuẩn hại cây trồng với quy trình công nghệ đơn giản, thân thiện với môi trường, không độc hại, có nguồn gốc từ các nguyên liệu thảo mộc hoặc sàng lọc hoạt tính trong điều kiện nghiên cứu hóa học, sinh học hiện tại là hết sức cần thiết. Cây Muồng lá hẹp (Cassia angustifolia) thuộc phân họ Vang (Caesalpinioideae) được biết đến là một loại dược liệu có giá trị trong y học cổ truyền vùng Đông Nam Á và trong y học hiện đại có tác dụng trị chứng táo bón, giảm kích ứng da, giảm sưng, điều trị chứng chảy nước mũi do cảm lạnh. Tra cứu tiếp từ nguồn tài liệu về cây cỏ làm thuốc, nguyên liệu lá Muồng còn được biết có hiệu quả ức chế khối u, kháng viêm và đặc biệt có nhiều hoạt tính ức chế vi sinh vật gây bệnh đường ruột đối với người. Các thành phần hoạt chất sinh học từ họ Muồng được nghiên cứu trước đây cho thấy sự xuất hiện của các lớp chất flavonoid và anthraquinone. Trong lá, quả và rễ của cây Muồng lá hẹp đều có chứa các dẫn chất anthraquinone. Trong lá có các chất anthraquinone như chrysophanol, aloe emodin, rhein, emodin. Một số dẫn chất anthranoid dimer do 2 phân tử ở dạng anthron bị oxy hoá rồi trùng hợp với nhau tạo thành dianthron [1,2]. Nghiên cứu về hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn của các anthraquinone đã được tiến hành bởi các nghiên cứu trước đây [1-4]. Các hoạt chất được tách ra từ cây Cassia tora (Senna tora) thuộc họ Muồng gồm có emodin, physcion và chrysophanol bằng phương pháp phân lập định hướng sinh học có hoạt tính kháng nấm in vivo đối với các nấm Magnaporthe grisea, Corticium sasaki,Botrytis cinerea, Phytophthora infestans, Puccinia recondita và Blumeria graminis f.sp. hordei [1,3]. 1 Hình 1: Cấu trúc của các 1,8-dihydroxylanthraquinone và naphthone Để kiểm tra và khảo sát thành phần nguyên liệu lá cây Muồng lá hẹp ở Việt Nam có đặc điểm về hóa học cũng như hàm lượng hoạt chất trong lá đáp ứng đặc điểm hóa thực vật và hoạt tính sinh học hay không, tôi đã chọn đề tài: “Phân tích cấu trúc một số hợp chất phân lập từ cây Muồng lá hẹp (Cassia angustifolia) bằng các phương pháp phổ hiện đại”, tiến hành chế tạo cao chiết từ lá Muồng; xác định độ tinh khiết của một số hợp chất phân lập, tạo tiền đề hướng tới việc xác định hàm lượng các chất có trong cao chiết tổng và cao chiết phân đoạn, kiểm tra hiệu quả ức chế của cao chiết này với một số vi nấm, vi khuẩn gây hại cho cây trồng trong phòng thí nghiệm và tạo ra một chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật có hiệu quả, thân thiện với môi trường và sức khỏe con người [3,5-10]. Mục tiêu của luận văn: - Chiết tách các chất từ các phân đoạn của cao chiết lá của cây Muồng lá hẹp. - Phân lập các chất từ các phân đoạn của cao chiết lá của cây Muồng lá hẹp mang hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn hại cây trồng. - Nghiên cứu phân tích cấu trúc các chất tách được bằng phương pháp phân tích phổ hiện đại như NMR và ESI-MS và định lượng HPLC. Nội dung: 2 Luận văn gồm 3 chương. Chương 1 trình bày tổng quan về cây Muồng lá hẹp (Cassia angustifolia), một số phương pháp phổ hiện đại như phổ khối (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều 1D-NMR (1H-NMR, 13C-NMR) và hai chiều 2DNMR (HMBC) dùng để phân tích cấu trúc các chất và phương pháp định lượng HPLC. Chương 2 là phần thực nghiệm bao gồm các các quy trình xử lý và phân lập chất; một số phương pháp sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng. Chương 3 là phần kết quả tổng hợp phân tích cấu trúc một số chất phân lập từ lá cây Muồng lá hẹp bằng các phương pháp phổ hiện đại và xác định độ tinh khiết của các hợp chất đã phân lập được từ cây Muồng lá hẹp. 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây Muồng Cây Muồng là một trong các chi thuộc phân họ Vang. Phân họ Vang có danh pháp khoa học là Caesalpiniaceae, là một tên gọi ở cấp độ phân họ, thuộc họ Đậu (Leguminosae hay Fabaceae). Phân họ Vang chủ yếu là cây thân gỗ, ngoài ra còn bao gồm cây, cây bụi và một số loại thảo mộc được tìm thấy trong các vùng nhiệt đới. Phân họ Vang chứa khoảng 170 chi, 2230 loài và có khoảng 46 loài đã được nghiên cứu [11,12], trong đó nhiều loài được sử dụng cho mục đích y tế có đặc tính chữa bệnh tốt, có ý nghĩa trong ngành công nghệ thuộc da, do đó có giá trị lớn về kinh tế. Lá cây chi Vang còn được sử dụng để chữa trị nấm ngoài da, nhiễm trùng, thuốc nhuận tràng; trong điều trị bệnh phong, bệnh giang mai và làm thuốc trị ho, đau mắt. Chi Vang nguồn gốc Nam Mĩ, thường được trồng rộng rãi ở các vùng nhịêt đới như Ấn Độ, Mauritius, Trung Quốc, Đông Phi, Nam Phi, Mỹ, Mexico, West Indies và Brazil. Chi Muồng có tên khoa học là Cassia bao gồm Muồng xiêm, Muồng lá hẹp, Muồng trâu, Muồng hoàng yến... có hình dạng đặc trưng là hoa màu vàng hoặc màu hồng. Cây có lá kép lông chim với 8-12 đôi lá phụ màu xanh bóng, mềm mại, dài từ 35cm. Các nốt sần trên rễ của các loài trong phân họ này là rất hiếm, và ở những loài có các nốt sần thì chúng cũng có cấu trúc hết sức nguyên thủy [13,14]. 1.2. Tổng quan về cây Muồng lá hẹp 1.2.1. Đặc điểm cây Muồng lá hẹp Cây Muồng lá hẹp là loại cây nhỏ mọc thành bụi cao có thể đến 1-1,5m, lá mọc so le, lá kép lông chim chẵn gồm 5-8 đôi, cuống ngắn, phiến lá chét. Chùm hoa đứng; hoa nhiều, màu vàng, cánh hoa dài bằng lá đài, có 5-10 nhị, bao phấn có lỗ ở đỉnh. Quả đậu dẹp, cỡ 4-7 x 2cm; hạt nâu đậm [15]. Cây có nguồn gốc ở Ả Rập và Xômali và được trồng ở các nước nhiệt đới như Ấn Độ (ở vùng Nam và Tây Bắc), Trung Quốc. Ở nước ta, cây đã được đem về trồng ở Phú Yên, Bắc Giang, trại thuốc Sa Pa và Văn Điển thuộc viện dược liệu Thanh Trì, Hà Nội nhằm mục đích giải quyết nhu cầu nghiên cứu trong nước và xuất khẩu. 4 Muồng lá hẹp là loại cây dễ trồng, không đòi hỏi công chăm bón, tưới nước và không cần sử dụng thuốc trừ sâu. Cây ra hoa vào tháng 10-11, quả vào tháng 1-4 [15]. Quá trình thu hoạch cũng như sơ chế nguyên liệu đơn giản, bảo quản dễ dàng [15]. Lá sau khi thu hái được phơi khô dưới Hình 1.1: Lá cây Muồng lá hẹp đã ánh nắng mặt trời tới khi lá có màu vàng được phơi khô nhạt, vân nâu là đạt yêu cầu [16]. Muồng lá hẹp có vị ngọt đắng và tính hàn. Vị trí, phân loại khoa học của cây. Bảng 1.1: Vị trí và phân loại khoa học của Muồng lá hẹp. Giới (regum) Plantae Bộ (ordo) Fabales Họ (family) Fabaceae Dưới họ (subfamilia) Caesalpinioideae Tông (tribus) Cassieae Chi ( genus) Senna Loài (species) Cassia angustifolia 1.2.2. Thu hái, chế biến Tất cả các bộ phận của cây Muồng lá hẹp đều có thể dùng làm thuốc nhưng được sử dụng nhiều nhất là lá cây. Lá cây có thể thu hoạch quanh năm. Hoa được thu hoạch vào tháng 10-11 và quả thu hoạch vào tháng 4 năm sau. Các bộ phận của cây được thu hái và chế biến đơn giản bằng cách phơi khô và cất vào túi [15]. 5 1.2.3. Công năng và dược tính Từ thế kỷ IX, Muồng lá hẹp được người Ai Cập biết tới và sử dụng làm thuốc nhuận tràng, thuốc tẩy. Sau đó, Muồng lá hẹp được đưa vào Châu Âu và các nước khác trên thế giới. Hiện nay Muồng được coi là một vị thuốc kinh điển và được dùng phổ biến trong cả Đông y và Tây y. Tùy theo liều lượng, Muồng lá hẹp có tác dụng làm thuốc nhuận tràng hoặc làm thuốc tẩy. Ngoài ra, Muồng lá hẹp còn giúp đẩy mạnh quá trình bài tiết của ruột để đào thải các chất cặn bã, độc hại tồn tại gây độc cho đường tiêu hóa, hạn chế sự sinh sôi nảy nở của các sinh vật đường ruột có hại. Bên cạnh đó, Muồng lá hẹp còn có tác dụng ức chế nhiều loại vi khuẩn như Baciluss dysenteriae, Streptococcus spp., Enterococcus spp. và một số loại bệnh gây nấm ngoài da. Do đó, nó có thể chữa trị rất tốt các loại bệnh như bệnh acpet màng tròn, mụn trứng cá, bệnh bạch tạng thậm chí là bệnh phong. Rễ cây còn có tác dụng dược lý trong việc điều trị chứng chảy nước mũi do bị cảm [15]. 1.2.4. Các thành phần đã được tìm thấy trong cây Muồng lá hẹp Trong lá, quả và rễ của cây Muồng lá hẹp đều có chứa các dẫn chất anthranoid. Trong lá có các chất sau đã được phân lập và xác định: chrysophanol, aloe emodin, rhein, emodin. Trong rễ có 2 dẫn chất anthraquinon đã được phân lập được 1,3,8-OH, 2-CH3 -anthraquinon; 1,5-OH, 2-CH3, 8-OCH3, 3-O-glucosyl anthraquinon [15]. Từ cành của cây Muồng lá hẹp đã chiết được emodin có cấu trúc là 1,3,8trihydroxy-8-methyl anthraquinon, phân lập một anthraquinon đặt tên là alatonan có cấu trúc là 2.formyl, 1,3,8- trihydroxy anthraquinon. Từ dịch chiết của lá cây đã tách riêng một flavonglucosid là kaempferol - 3 – O – sophorosid. Chất này có hoạt tính chống viêm khá mạnh [15]. a. Hợp chất anthraquinone Những hợp chất anthraquinone nằm trong nhóm lớn hydroxyquinon. Anthraquinone là những dẫn xuất của 9,10-dixeton-anthraxen. Anthraquinone là sản phẩm thủy phân của anthraglucozit. Phần đường có thể là monoglycoside, diglycoside, 6 triglycoside tùy theo loại hợp chất anthraglucozit. Phần không đường có nhân căn bản là anthraxen. Tính chất của anthraglucozit cũng khác nhau tuỳ theo nó ở dạng oxy hóa hay khử [16]. Dạng khử còn có tác dụng sinh lý mạnh hơn nhưng lại kèm theo tính chất gây kích thích mạnh, gia súc và người hay bị nôn oẹ, đau bụng. Do đó, không hay dùng, những dược liệu chứa anthraquinon ở dạng khử cần được bảo quản 1 năm để các dạng khử chuyển hết sang dạng oxy hoá rồi mới dùng là tốt nhất. Một số loại anthraquinone: Chrysophanol, emodin, aloe-emodin, rhein… Căn cứ vào vòng thơm đính thêm vào nhân quinon mà người ta sắp xếp thành các nhóm: benzenquinon, naphtoquinon, anthraquinon và naphtacenquinon hay còn gọi là anthracyclinon [17]. Dẫn xuất anthraquinone có thể chia thành 3 nhóm: + Nhóm phẩm nhuộm: Các dẫn chất thuộc nhóm này trong cấu trúc có 2 nhóm OH kế cận ở vị trí α và β nên được gọi là nhóm 1,2-dihydroxy anthraquinon. Các chất thuộc nhóm này thường có màu vàng, đỏ đến đỏ tía. + Nhóm nhuận tẩy: Những dẫn chất thuộc nhóm này thường có 2 nhóm OH đính ở vị trí 1,8 và ở vị trí 3 thường là nhóm –CH3, -CH2OH, -CHO hoặc -COOH nên được gọi là nhóm oxymethylanthraquinon. Người ta hay gặp các dẫn chất có cùng cấu trúc trong cùng một loài, chỉ khác nhau ở mức độ oxy hóa của nhóm đính vào C3. Thường có màu vàng nhạt đến vàng. + Nhóm dimer: Một số dẫn chất anthranoid dimer do 2 phân tử ở dạng anthron bị oxy hoá rồi trùng hợp với nhau tạo thành dianthron hoặc tiếp đến các dẫn chất dehydrodianthron [17]. Hoạt tính của anthraquinon: -Aloin và emodin tác dụng kích thích ruột và có tính chất kháng sinh, nó dùng để chống vi khuẩn, virus và như thuốc giảm đau. Aloe-emodin: Giúp da chống lão hóa. Barbaloin giúp cho da giữ ẩm. Hỗn hợp các anthraquinon tác dụng giảm đau, trị viêm da, ngăn ngừa tối đa sự xâm nhập của các độc tố, vi khuẩn [17]. 7 -Tác dụng nhuận tràng, hạ hỏa, giải độc, hoạt huyết, tác dụng lợi mật, cầm máu, kháng khuẩn, lợi tiểu, bảo vệ gan và giảm cholesterol máu. Một số như emodin và rhein trực tiếp ức chế sự sinh trưởng của tế bào ung thư của hắc lựu (melanoma), ung thư vú và ung thư gan như cây đại hoàng [18]. Thuốc trị táo bón kích thích gồm các thuốc chứa dẫn chất anthraquinon: có khá nhiều thuốc là dẫn chất anthraquinon lấy từ dược thảo được dùng trong đông y lẫn tây y như: Cassia angustifolia (phan tả diệp), rheum palmatum (đại hoàng), aloe (lô hội)... Thành phần thuốc xổ là thuốc antraglucozit mà chủ yếu là sennoside [18]. Hợp chất anthraglucozit có trong nhiều loại thực vật như: lô hội, đại hoàng, hoàng tinh, hà thủ ô, dây thìa canh, cây mặt quỉ, cây nhàu, cây muồng trâu, phan tả diệp… Anthraquinone còn được sử dụng làm phụ gia nấu bột giấy nhằm giảm lượng kiềm, rút ngắn thời gian nấu, giảm tải chất thải. Ngoài ra nó còn được sử dụng làm thuốc nhuộm và nghành công nghiệp phân bón [18]. 2.2.3 Hợp chất flavanoid Flavonoid (hoặc bioflavonoid) (bắt nguồn từ Latin flavus nghĩa là màu vàng, màu của flavonoid trong tự nhiên) là một loại chất chuyển hóa trung gian của thực vật. Tuy nhiên một số flavonoid có màu xanh, tím đỏ và cũng có một số khác lại không có màu. Flavonoid có thể được chia thành: + Flavonoids, bắt nguồn từ cấu trúc của 2-phenylchromen-4-one (2-phenyl-1,4benzopyrone) + Isoflavonoids bắt nguồn từ cấu trúc của 3-phenylchromen-4-one (3-phenyl1,4-benzopyrone) + Neoflavonoids bắt nguồn từ cấu trúc của 4-phenylcoumarine (4-phenyl-1,2benzopyrone). Chức năng của flavonoid trong thực vật [19]: 8 + Flavonoid phổ biến ở nhiều loại thực vật và có nhiều chức năng. Flavonoid là một sắc tố sinh học, sắc tố thực vật quan trọng tạo ra màu sắc của hoa, cụ thể giúp sản xuất sắc tố vàng, đỏ, xanh cho cánh hoa để thu hút nhiều động vật đến thụ phấn. Trong thực vật bậc cao, flavonoids tham gia vào lọc tia cực tím (UV), cộng sinh cố định đạm và sắc tố hoa. + Flavonoids có thể hoạt động như một chất chuyển giao hóa học hoặc điều chỉnh sinh lý. Flavonoids cũng có thể hoạt động như các chất ức chế chu kỳ tế bào. Flavonoids được tiết ra bởi rễ các cây chủ để giúp vi khuẩn Rhizobia spp. trong giai đoạn lây nhiễm của mối quan hệ cộng sinh với các cây họ đậu (legumes) như đậu cô ve, đậu hà lan, cỏ ba lá (clover), và đậu nành. Rhizobia sống trong đất có thể cảm nhận được chất flavonoid và tiết ra các chất tiếp nhận. Ngoài ra, một số chất flavonoid có hoạt tính ức chế chống lại các sinh vật gây ra như bệnh ở thực vật như Fusarium oxysporum spp [19]. 1.3. Các phương pháp hiện đại nghiên cứu cấu trúc: Cấu trúc của các chất sau khi tách được phân tích được xác định bằng: - Các phương pháp phổ hiện đại bao gồm: Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESIMS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều 1D-NMR (1H-NMR, 13C-NMR, jmod và DEPT) và hai chiều 2D-NMR (HMBC, HSQC). - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 1.3.1. Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) Phổ khối lượng là một phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên điện tích ion. Thiết bị chuyên dụng là khối phổ kế. Chất nghiên cứu trước tiên được chuyển thành trạng thái hơi, sau đó được đưa vào nghiên cứu trong bộ phận phân tích của máy khối phổ kế. Người ta có thể dùng phương pháp phổ khối để nghiên cứu tất cả các nguyên tố hay hợp chất có thể biến thành dạng khí hay hơi. Đối với các hợp chất vô cơ, phương pháp phân tích phổ khối thường dùng để nghiên cứu thành phần đồng vị hoặc để xác định vết các chất nghiên cứu. 9 Đối với các hợp chất hữu cơ, phương pháp phân tích phổ khối thường được dùng trong quá trình đồng nhất chất hoặc phân tích cấu trúc. + Quá trình ion hóa: Là quá trình bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích dương/âm bằng các phần tử mang năng lượng cao: Sự bắn phá phân tử khảo sát này sẽ làm cho phân tử biến thành ion dương/âm, được gọi là ion phân tử. Quá trình ion hóa có thể được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau:  Phương pháp ion hóa bằng va chạm điện tử: Trong buồng ion hóa, các điện tử phát ra từ cathode làm bằng vonfram hoặc reni, sẽ bay về anode với vận tốc lớn. Các phân tử chất nghiên cứu ở trạng thái hơi sẽ va chạm với điện tử trong buồng ion hóa, có thể nhận năng lượng điện tử và bị ion hóa.  Phương pháp ion hóa bằng trường điện từ: Tại buồng ion hóa, người ta đặt các bộ phận phát ra từ trường, đó là các “mũi nhọn” đặc biệt dưới dạng dây dẫn mảnh (2,5 µm) hay các lưỡi mảnh. Người ta đặt điện cực vào các “mũi nhọn”. Ở tại các “mũi nhọn” sẽ cho một trường điện từ có gradien từ 107 1010 V/cm. Dưới ảnh hưởng của trường điện từ mạnh này, các điện tử bứt khỏi phân tử chất nghiên cứu do hiệu ứng đường hầm và ở đây không gây ra sự kích thích. Vậy trong phương pháp ion hóa này, các ion phân tử được tạo thành vẫn giữ nguyên ở trạng thái cơ bản, do đó các vạch phổ sẽ rất mảnh. Ngoài hai phương pháp ion hóa kể trên, người ta còn dùng các phương pháp khác như: ion hóa hóa học, chiếu xạ bằng các photon, bắn phá nguyên tử nhanh… Tuy nhiên, các phương pháp ion hóa này ít phổ biến hơn so với hai phương pháp vừa mô tả trên đây. + Quá trình phân mảnh: Với năng lượng bắn phá rất cao thì ion phân tử vừa tạo thành có thể biến thành các mảnh ion dương/âm nhỏ hơn, hoặc các ion gốc, hoặc các gốc tự do, hoặc các phân tử trung hòa nhỏ hơn. Quá trình này gọi là quá trình phân mảnh. 10 Sự bắn phá này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phương pháp bắn phá và năng lượng bắn phá. Ion phân tử và các ion mảnh là các phần tử có khối lượng. Nếu gọi khối lượng của một ion là m và điện tích của nó là z thì tỷ số m/z được gọi là số khối. Vì số điện tích trên mỗi ion thường bằng 1 nên giá trị m/z của mỗi ion sẽ đơn giản là khối lượng của nó. Các mảnh ion mang điện tích sẽ được bộ phận ghi nhận tín hiệu của máy khối phổ chuyển thành những mũi phổ tùy theo tỷ lệ m/z này. Ngoài ra trong quá trình phân mảnh còn có sự tạo thành các ion mà thời gian tồn tại của nó rất nhỏ (< 10-5 giây) gọi là ion giả bền, ký hiệu m*. Khi đó máy không thể ghi lại sự xuất hiện của nó đầy đủ được. Tuy nhiên, người ta có thể đánh dấu sự xuất hiện của nó trên phổ và ghi nhận được các ion ban đầu cũng như các ion cuối. Máy khối phổ có 3 bộ phận chính đó là (i) nguồn ion hóa mẫu, (ii) bộ phận phân tích khối, (iii) bộ phận ghi phổ (detector) Hệ thống khối phổ có nhiều loại và được ứng dụng rất đa dạng trong các lĩnh vực khác nhau. Trong đó, có hai loại hệ thống hay được sử dụng chính trong proteomics là MALDI-TOF và ESI-MS/MS. ESI (ElectroSpray Ionization) là thuật ngữ chỉ phương pháp ion hóa mẫu bằng phương pháp phun chùm ion trong dung dịch tạo thành đám sương mù với các giọt nhỏ dễ bay hơi. Cơ chế hoạt động của nguồn ESI khá đơn giản. Dưới áp lực dòng liên tục, đường kính cột bé và hiệu điện thế cao (2500V), chất hữu cơ sẽ được phun tơi thành các giọt nhỏ đa điện tích ra khỏi đầu kim phun. Kim phun sẽ tạo thành các giọt nhỏ, như đám sương mù (đám mây khí ion), dễ bay hơi, các giọt này chứa chất hữu cơ và các thành phần dung môi khác. Quá trình bay hơi được thực hiện bởi nhiệt độ hoặc màng chắn khí nitơ (curtain gas) làm cho mẫu dễ bay hơi. Kết quả là chỉ còn chất hữu cơ tích điện và bay vào bộ phận phân tích khối của máy khối phổ liên tục MS/MS. Nguồn ESI ion hóa mẫu trong dịch lỏng. Khi đó chất hữu cơ sẽ tồn tại ở dạng ion bởi vì chúng chứa các nhóm chức, và điện tích của chúng phụ thuộc vào pH của dung môi. Nguồn ESI hay được kết nối trực tiếp với hệ sắc ký lỏng và phân tích các 11