Tài liệu Phân tích đa dạng di truyền vùng siêu biến adn ty thể người việt nam thuộc 5 dân tộc kinh, thái, hmong, lolo và giarai​

ơAND ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hà Nội - 2018 Nguyễn Bảo Trang PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÙNG SIÊU BIẾN ADN TY THỂ NGƯỜI VIỆT NAM THUỘC 5 DÂN TỘC KINH, THÁI, HMONG, LOLO VÀ GIARAI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Bảo Trang PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÙNG SIÊU BIẾN ADN TY THỂ NGƯỜI VIỆT NAM THUỘC 5 DÂN TỘC KINH, THÁI, HMONG, LOLO VÀ GIARAI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN THÙY DƯƠNG PGS. TS. NGUYỄN QUANG HUY Hà Nội - 2020 LỜI CẢM ƠN Để thực hiện thành công luận văn thạc sĩ này, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành đến TS. Nguyễn Thùy Dương (Trưởng phòng Hệ gen học người Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Cô là người đã tạo điều kiện cũng như truyền cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học. Trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua, tôi đã nhận được sự dạy dỗ, khích lệ và hỗ trợ nhiều mặt của PGS. TS. Nguyễn Quang Huy (Trưởng khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội). Sự quan tâm, giúp đỡ của thày đã góp phần không nhỏ giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn những sự trợ giúp quý báu đó. Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn của mình đến PGS. TS. Nông Văn Hải (Chủ tịch Hội đồng Khoa học, Viện Nghiên cứu hệ gen), tập thể cán bộ Phòng Hệ gen học người và các cán bộ Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi và tận tình hướng dẫn, trợ giúp tôi thực hiện tốt đề tài nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi để hoàn thành luận văn này. Luận văn được thực hiện trong khuôn khổ của đề tài thuộc Bộ Khoa học và Công nghệ mã số ĐTĐL.CN-05/15 và đề tài cấp cơ sở thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hà Nội, ngày 30 tháng 12 năm 2019 Học viên cao học Nguyễn Bảo Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... iv DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................v MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 Chương 1. TỔNG QUAN .........................................................................................3 1.1. Đặc điểm của ADN ty thể người ........................................................................3 1.1.1. Cấu trúc ADN ty thể .................................................................................. 3 1.1.2. Cấu trúc vùng điều khiển D-loop ở ADN ty thể........................................ 4 1.1.3. ADN ty thể, vùng D-loop và hai đoạn siêu biến HV-I và HV-II trong nghiên cứu di truyền quần thể người .................................................................... 5 1.1.4. Tình hình nghiên cứu di truyền quần thể người Việt Nam dựa trên hai đoạn siêu biến HV-I và HV-II thuộc vùng D-loop và ý nghĩa thực tiễn của đề tài luận văn ................................................................................................................ 8 1.2. Một số đặc điểm dân tộc học của người Kinh, Thái, Hmong, Lolo và Giarai ...9 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................12 2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................12 2.2. Hóa chất và thiết bị ...........................................................................................14 2.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................15 2.3.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số ..................................................... 15 2.3.2. Phương pháp điện di kiểm tra trên gel agarose ....................................... 16 2.3.3. Phương pháp khuếch đại đoạn ADN bằng PCR ...................................... 16 2.3.4. Phương pháp giải trình tự ADN .............................................................. 17 2.3.5. Phương pháp phân tích số liệu ................................................................. 17 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................19 3.1. Tách chiết và tinh sạch ADN tổng số từ các mẫu máu ....................................19 3.2. Khuếch đại đoạn gen chứa trình tự gen HV-I và HV-II ...................................19 i 3.3. Xác định trình tự và phân tích số liệu các đoạn gen HV-I và HV-II của các mẫu nghiên cứu .........................................................................................................21 3.3.1. Xác định các đa hình thuộc hai vùng siêu biến HV-I và HV-II của các mẫu nghiên cứu .................................................................................................. 21 3.3.2. Phân tích thống kê các đa hình thuộc hai vùng siêu biến HV-I và HV-II ở các dân tộc Kinh, Thái, Hmong, Lolo và Giarai ................................................ 24 3.4. Phân tích đa dạng di truyền của các mẫu nghiên cứu thuộc các dân tộc Kinh, Thái, Hmong, Lolo và Giarai trên cơ sở trình tự vùng siêu biến ADN ty thể ..........35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................38 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................39 PHỤ LỤC .................................................................................................................44 ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt bp Base pair Cặp bazơ ADN Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate Dideoxynucleoside triphosphate dNTP Deoxynucleoside triphosphate Deoxynucleoside triphosphate EDTA Ethylene acid EtOH Ethanol Etanol HV1 Hypervariable segment 1 Đoạn siêu biến 1 HV2 Hypervariable segment 2 Đoạn siêu biến 2 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic TAE Tris – acetate – EDTA Tris – acetate – EDTA SNP Single nucleotide polymorphism Đa hình nucleotide đơn diamine tetra-acetic Axit ethylene diamine tetraacetic iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Cấu trúc của ADN ty thể người .....................................................................4 Hình 2. Cấu trúc vùng D-loop của ADN ty thể người ................................................5 Hình 3. Sơ đồ mô tả quá trình di cư của các nhóm đơn bội ADN ty thể người..........6 Hình 4. Ảnh điện di ADN tổng số trên gel agarose 0,8% .........................................19 Hình 5. Ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen HV-I của một số mẫu đại diện trên gel agarose 1% ...........................................................................................20 Hình 6. Ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen HV-II của một số mẫu đại diện trên gel agarose 1% ...........................................................................................20 Hình 7. Kết quả giải trình tự một số mẫu đại diện chứa một số đa hình trên đoạn HV-I ..........................................................................................................................22 Hình 8. Biểu đồ thống kê đa hình trên 2 đoạn HV-I và HV-II của vùng D-loop phát hiện được ở các dân tộc Kinh, Thái, Hmong, Lolo và Giarai khi so sánh với trình tự tham chiếu rCRS .......................................................................................................23 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Mẫu nghiên cứu của mỗi dân tộc Kinh, Thái, Hmong, Lolo và Giarai .......12 Bảng 2. Các đa hình phổ biến có tần suất khác nhau giữa dân tộc Kinh và Thái .....24 Bảng 3. Các đa hình phổ biến có tần suất khác nhau giữa dân tộc Kinh và Hmong ...................................................................................................................................25 Bảng 4. Các đa hình phổ biến có tần suất khác nhau giữa dân tộc Kinh và Giarai ...............................................................................................................................…26 Bảng 5. Các đa hình phổ biến có tần suất khác nhau giữa dân tộc Kinh và Lolo.....27 Bảng 6. Các đa hình phổ biến có tần suất khác nhau giữa dân tộc Thái và Hmong ........... 28 Bảng 7. Các đa hình phổ biến có tần suất khác nhau giữa dân tộc Thái và Lolo .....29 Bảng 8. Các đa hình phổ biến có tần suất khác nhau giữa dân tộc Thái và Giarai.. .30 Bảng 9. Các đa hình phổ biến có tần suất khác nhau giữa dân tộc Hmong và Lolo ...................................................................................................................................31 Bảng 10. Các đa hình phổ biến có tần suất khác nhau giữa dân tộc Hmong và Giarai ...................................................................................................................................32 Bảng 11. Các đa hình phổ biến có tần suất khác nhau giữa dân tộc Lolo và Giarai ...................................................................................................................................33 Bảng 12. Tần suất nhóm đơn bội 182 mẫu nghiên cứu thuộc 5 dân tộc Kinh, Thái, Hmong, Lolo và Giarai ............................................................................................. 36 v MỞ ĐẦU Việc giải mã ADN hệ gen của người được cho là đóng một vai trò quan trọng trong việc tìm hiểu về quá trình tiến hóa, nguyên nhân gây bệnh và sự tương tác giữa môi trường và di truyền ở người. Chính vì điều này đã có rất nhiều nhà khoa học cũng như các phòng thí nghiệm lớn trên toàn thế giới đã và đang tập trung giải mã ADN. Một trong những hướng nghiên cứu được tập trung nhiều nhất là giải mã ADN ty thể do ADN ty thể có các đặc tính như di truyền theo dòng mẹ, ít trao đổi chéo, số lượng bản sao lớn trong mỗi tế bào và ít bị phân hủy theo thời gian. Do đó, các nghiên cứu liên quan đến ADN ty thể đã giải quyết được những vấn đề then chốt trong quá trình tiến hóa và giải thích lịch sử di truyền của các quần thể người ở các vùng địa lý khác nhau cũng như trong các khoảng thời gian khác nhau [23, 33]. Bên cạnh đó, đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng mặc dù cấu trúc hệ gen của các cá thể người tương đối giống nhau (99,9%), sự khác biệt vẫn lên đến 0,1%. Phần khác biệt này chủ yếu là các đa hình nucleotide đơn (SNP) và có ảnh hưởng đến nhân chủng học của mỗi dân tộc. Do đó, các SNP trên ADN ty thể thích hợp để nghiên cứu các mẫu ADN cổ đại, ứng dụng rộng rãi trong sinh học và y học. Trong phân tử ADN ty thể, dù mang chức năng quan trọng, nhưng vùng điều khiển (D-loop) lại có tỷ lệ đột biến cao gấp 10 lần so với vùng mã hóa. Tuy nhiên, sự biến đổi trên vùng D-loop phân bố không đều, trong đó mật độ biến đổi cao nhất của các vị trí đa hình được tìm thấy ở hai đoạn siêu biến 1 và 2 (HV-I và HV-II) [11]. HV-I và HV-II chứa nhiều điểm đa hình, có trình tự thay đổi theo thời gian và khác nhau giữa các vùng địa lý, nên được tập trung nghiên cứu nhiều [15]. Nghiên cứu đa dạng di truyền của các dân tộc Việt Nam hiện nay vẫn còn là một vấn đề mới và chưa có nhiều công trình được công bố. Một số phòng thí nghiệm trọng điểm cũng đang bắt đầu nghiên cứu về vấn đề này để hiểu rõ hơn về nguồn gốc tiến hóa và bổ sung thêm dữ liệu di truyền của các dân tộc Việt Nam. Chính vì điều này, chúng tôi tập trung nghiên cứu về các đa hình nucleotide đơn (SNP) ở vùng siêu biến của ADN ty thể của 5 dân tộc Kinh, Thái, Hmong, Lolo và Giarai với các nội dung chính bao gồm: 1 − Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu của 182 cá thể thuộc 5 dân tộc Kinh, Thái, Hmong, Lolo và Giarai. − Khuếch đại và xác định trình tự hai đoạn gen HV-I và HV-II trên ADN ty thể của các mẫu nghiên cứu. − Phân tích trình tự và phân loại theo nhóm đơn bội của các mẫu nghiên cứu thuộc 5 dân tộc Kinh, Thái, Hmong, Lolo và Giarai. 2 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm của ADN ty thể người ADN ty thể người (mitochondrial DNA – mtDNA) là một trong những đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất đối với hệ thống di truyền người. Trong đó, phần lớn các đột biến được tập trung trên vùng điều khiển D-loop (vùng siêu biến). Chính vì điều này, vùng điều khiển D-loop nắm giữ chìa khóa quan trọng đối với lịch sử tiến hóa và các mối quan hệ di truyền quần thể [9]. 1.1.1. Cấu trúc ADN ty thể Hệ gen ty thể người là phân tử ADN mạch kép, có cấu trúc dạng mạch vòng với kích thước 16569 bp, nằm bên trong ty thể và không liên kết với protein histon. Phân tử ADN ty thể người được chia thành hai vùng là vùng mã hóa chứa 37 gen và vùng không mã hóa (vùng D-loop). ADN ty thể bao gồm hai chuỗi nucleotide: chuỗi nặng (H-strand) có chứa nhiều guanin và chuỗi nhẹ (L-strand) chứa nhiều cytosin. Trong đó, 37 gen mã hóa cho 22 tRNA, 2 rRNA (12S và 16S) tham gia vào quá trình dịch mã ở ty thể và 13 chuỗi polypeptide cần thiết cho hệ thống phosphoryl hóa oxy hóa [35]. Hình 1 thể hiện rõ 13 chuỗi polypeptide này bao gồm 7 tiểu phần của phức hệ I (NADH dehydrogenase) là ND1, ND2, ND3, ND4L, ND4, ND5 và ND6; 1 tiểu phần của phức hệ III (phức hệ bc1) là cytochrome b (Cytb); 3 tiểu phần của phức hệ IV (cytochrome c oxidase) là CO I, CO II và CO III; và 2 tiểu phần của phức hệ V (ATP synthase) là ATPase 6 và 8. Còn tất cả các protein khác của ty thể bảo gồm 4 tiểu đơn vị của phức hệ II (succinate dehydrogenase), tiểu đơn vị ADN polymerase γ của ty thể, các thành phần của RNA polymerase của ty thể, yếu tố phiên mã (mtTFA), các protein ribosome của ty thể, các yếu tố kéo dài chuỗi và các enzyme trao đổi chất của ty thể đều được mã hóa bởi ADN nhân [18]. Hầu hết các gen trên ADN ty thể là liên tục không chứa các đoạn intron, chỉ cách nhau bởi một hoặc hai cặp base không mã hóa. Mã di truyền trên ADN ty thể chỉ sử dụng hai codon kết thúc: 'AGA' và 'AGG', trong khi DNA nhân sử dụng ba codon kết thúc: 'UAA', 'UGA' và 'UAG'. 3 Hình 1. Cấu trúc của ADN ty thể người https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0531556514001181 1.1.2. Cấu trúc vùng điều khiển D-loop ở ADN ty thể Vùng duy nhất không mã hóa ở ADN ty thể là vùng điều khiển, hay còn gọi là vùng D-loop (displacement loop) chiếm khoảng 7% ADN ty thể. Vùng D-loop có chức năng điều hòa sự sao chép của ADN ty thể và sự biểu hiện của các gen. Vùng D-loop chứa các điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ và chứa promoter cho sự phiên mã chuỗi nặng và chuỗi nhẹ. Cấu trúc của D-loop là cấu trúc sợi ba, có kích thước 1121 bp, chứa các trình tự promoter cho quá trình phiên mã và trình tự khởi đầu sao chép cho chuỗi nặng và nhẹ. Các loại ty thể khác nhau thuộc các nhóm đơn bội (halogroup) khác nhau dựa trên trình tự đặc trưng của vùng D-loop. Vùng D-loop định vị ở vị trí 16024-576 trên genome ty thể bao gồm hai đoạn siêu biến 1 và 2 (HV-I và HV-II). Trình tự đoạn siêu biến 1 (HV-I) có kích thước 359 bp (vị trí 16024-16383) và đoạn siêu biến 2 (HV-II) có kích thước 315 bp (vị trí 57-372). Các đoạn siêu biến HV-I và HV-II có các đoạn lặp lại liên tiếp các nucleotide Cytosin, thường được gọi là các đoạn poly C [9]. 4 Hình 2. Cấu trúc vùng D-loop của ADN ty thể người https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0531556514001181 Trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế về ADN ty thể đã công bố hàng nghìn trình tự hoàn chỉnh vùng D-loop của nhiều dân tộc khác nhau thuộc các châu lục trên thế giới. Tuy nhiên, do hai vùng siêu biến HV-I và HV-II có tần số đột biến cao và có chứa nhiều điểm đa hình nên được tập trung nghiên cứu. 1.1.3. ADN ty thể, vùng D-loop và hai đoạn siêu biến HV-I và HV-II trong nghiên cứu di truyền quần thể người ADN ty thể (mtADN) có tốc độ tiến hóa nhanh, không xảy ra hiện tượng tái tổ hợp, đặc điểm quan trọng là di truyền theo dòng mẹ, số lượng bản sao lớn và tỷ lệ đột biến cao, vì vậy mtADN được lựa chọn là một công cụ hữu hiệu trong các nghiên cứu về nhân chủng học tiến hóa người [27]. Phân tích các biến thể trên chuỗi ADN ty thể đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu quan hệ tiến hóa của các cá thể và quần thể, cả trong phạm vi giữa các loài. Vì vậy, những dữ liệu mtADN có thể phục vụ như là một “mã vạch” phân loại cho các loài mục tiêu [37]. Các đột biến trên ADN ty thể xảy ra nhiều hơn 5 đến 10 lần so với ADN nhân [10]. Điều này là có thể vì ở ADN nhân có nhiều cơ chế để sửa chữa các sai hỏng khi quá trình sao chép mắc lỗi. Bên cạnh đó, ty thể là nơi luôn diễn ra các quá trình oxy hóa và sản sinh ra các chất oxy hóa mạnh như các gốc tự do. Các chất này là một nhân tố phát sinh đột biến khi chúng tác động lên hệ gen của ty thể [18]. Một tế bào có trung bình khoảng 4000 ty thể nên các đột biến có hại có thể xảy ra ở tất cả các mô, sinh dưỡng và sinh dục. Ở tế bào sinh dưỡng, các đột biến 5 làm giảm việc sản xuất năng lượng cho tế bào, trong khi đó, ở tế bào sinh dục của mẹ, các đột biến sẽ được truyền cho thế hệ sau và tạo ra các đa hình ADN ty thể. Robin E. D. và Wong R. năm 1988 đã chỉ ra rằng mỗi tế bào chứa 1 bản sao của ADN nhân nhưng lại có hàng trăm bản sao của ADN ty thể cùng với việc ADN ty thể tồn tại ở dạng vòng, nằm trong tế bào chất, do đó việc thu nhận ADN ty thể dễ dàng hơn. Điều này hữu ích với việc thu thập mẫu cho các nghiên cứu [30]. Trong phân tử ADN ty thể, dù mang chức năng quan trọng, nhưng vùng điều khiển (D-loop) lại có tỷ lệ đột biến cao gấp 10 lần so với vùng mã hóa. Tuy nhiên, sự biến đổi trên vùng D-loop phân bố không đều, trong đó mật độ biến đổi cao nhất của các vị trí đa hình được tìm thấy ở hai đoạn siêu biến 1 và 2 (HV-I và HV-II) [11]. HV-I và HV-II chứa nhiều điểm đa hình, có trình tự thay đổi theo thời gian và khác nhau giữa các vùng địa lý, nên được tập trung nghiên cứu nhiều [15]. Hình 3. Sơ đồ mô tả quá trình di cư của các nhóm đơn bội ADN ty thể người [32] Do hệ gen ty thể có đặc tính di truyền theo mẹ nên các đa hình được tích luỹ và phát tán theo các dòng phả hệ mẫu hệ, tạo nên tính đa hình ADN ty thể hay các nhóm đơn bội (Haplogroup) đặc trưng theo quần thể. Theo đó, mỗi haplogroup có một bộ các đa hình nucleotide đơn (Single Nucleotide Polymorphisms – SNP) đặc trưng. Việc phân loại và sắp xếp các nhóm haplogroup sẽ giúp phân tích các dòng ADN ty thể theo phả hệ mẫu hệ, từ đó có thể dựng cây phả hệ tiến hóa các nhóm 6 haplogroup và con đường di cư của ADN ty thể. Các nghiên nhân chủng học phân tử cho thấy, người hiện đại bắt đầu xuất hiện ở châu Phi cách đây khoảng 200.000 năm [16] (hình 3). Nghiên cứu hoàn chỉnh trình tự hệ gen ty thể đã hỗ trợ cho việc xác định lịch sử nhân chủng học tiến hóa của loài người ở các châu lục trên thế giới. Người châu Phi đặc trưng bởi Macro-haplogroup L và 7 haplogroup (L0, L1, L2, L3, L4, L5 và L6) phân bố khắp các lục địa châu Phi. Khoảng 85.000 năm trước, haplogroup L3 di cư ra khỏi vùng Đông Phi tới các lục địa châu Á và châu Âu, các vùng rất đa dạng về môi trường, các dân tộc, các nền văn hóa và ngôn ngữ. Hai dòng ADN ty thể M và N xuất hiện từ L3 là tổ tiên của tất cả các dòng ADN ty thể trên lục địa Á, Âu. Các haplogroup phát sinh từ Macro-haplogroup M xuất hiện tại các lục địa Ấn Độ và Đông Nam Á, điều này chứng tỏ đã có một quá trình thực dân hóa rất nhanh dọc theo bờ biển phía nam châu Á vào khoảng 60.000 năm trước [22, 38]. Một sự mở rộng khác của Macro-haplogroup M theo hướng Bắc châu Á vào khoảng 45.000 năm trước đã tạo ra hơn 30 haplogroup khác. Với quần thể người châu Âu, haplogroup L3 và Macro-haplogroup N tạo nên 9 Macro-haplogroup (H, I, J, K, T, U, V, W và X), xuất hiện phổ biến rộng khắp châu lục cách đây khoảng 45.000 năm [38]. Trong khi với người châu Mỹ, các nghiên cứu nhân chủng học phân tử chỉ ra họ là con cháu của người châu Á, đặc trưng bởi các Macro-haplogroup: A, B, C, D và X vào khoảng 18.000 năm trước [25]. Tại châu Á, Đông Nam Á là vùng rất đa dạng về môi trường, các dân tộc, các nền văn hóa và ngôn ngữ. Các nhà khoa học hiện đang tập trung nghiên cứu về một sô vấn đề như: các dân tộc cư trú ban đầu ở khu vực Đông Á, hướng di cư giữa Đông Nam Á và Bắc Á, các mối quan hệ di truyền của Đông Á, và tác động di truyền của thực tiễn xã hội khác nhau trên dân cư Đông Á. Những hiểu biết bắt nguồn từ ADN ty thể và/hoặc dữ liệu nhiễm sắc thể Y, nghiên cứu các SNP hoặc nhiều locus dữ liệu trong tái sắp xếp toàn bộ gen, kết hợp với việc sử dụng các mô phỏng, phương pháp dựa trên mô hình để suy ra các thông số về nhân chủng học chắc chắn sẽ cung cấp thêm vào lịch sử dân số của khu vực Đông Á [13, 34]. 7 1.1.4. Tình hình nghiên cứu di truyền quần thể người Việt Nam dựa trên hai đoạn siêu biến HV-I và HV-II thuộc vùng D-loop và ý nghĩa thực tiễn của đề tài luận văn Các nghiên cứu về cấu trúc genome ty thể nói chung và vùng D-loop nói riêng của các dân tộc người Việt Nam còn ít, các thông tin còn rất hạn chế và rời rạc. Năm 2002, Oota và cộng sự đã công bố về đoạn HV-I thuộc vùng D-loop trên genome ty thể của 35 cá thể người Việt Nam định cư tại Hoa Kỳ. Năm 2005, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nghiên cứu trình tự vùng điều kiển (D-loop) trên genome ty thể của 5 cá thể người Việt Nam thuộc 3 dân tộc Kinh, Tày và Hmong từ đó ứng dụng để giám định hài cốt liệt sỹ [3, 4]. Năm 2008, Nguyễn Đăng Tôn và cộng sự đã phát hiện 73 đa hình mới xuất hiện khi nghiên cứu tần số các nhóm đơn bội (halogroup) của ty thể ở 78 mẫu nghiên cứu của các cá thể người Việt Nam thuộc 3 dân tộc Kinh, Tày và Mường [5]. Một số nghiên cứu đã bắt đầu tập trung nghiên cứu về sự đa dạng di truyền nhờ phân tích trình tự các đoạn siêu biến trên vùng D-loop của ADN ty thể của một số dân tộc Việt Nam. Năm 2014, nhóm nghiên cứu của Trần Vân Khánh đã nghiên cứu đa dạng di truyền trên dân tộc Mường ở Việt Nam [6]. Năm 2016, Đỗ Mạnh Hưng và cộng sự đã phát hiện được 79 nhóm đơn bội khi phân tích vùng HV-II hệ gen ty thể của 169 cá thể người Việt Nam thuộc các dân tộc Kinh, Mường, Garai và Ê đê [2]. Và gần đây nhất, Trần Thị Thúy Hằng và cộng sự đã giải trình tự vùng HV-I và HV-II của 100 cá thể thuộc hai dân tộc Kinh và Mường và phát hiện được 12 điểm đa hình phổ biến trên cả hai dân tộc này [7]. Có thể thấy rằng các nghiên cứu trong nước về trình tự vùng D-loop hệ gen ty thể của các dân tộc Việt Nam còn rất ít và mới chỉ nghiên cứu với số lượng mẫu nhỏ, không mang tính đặc trưng cho quần thể. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khuếch đại và giải trình tự vùng điều khiển D-loop của 182 mẫu cá thể người Việt Nam thuộc các dân tộc Kinh, Thái, Hmong, Lolo và Giarai. Các số liệu đa hình thu được về vùng điều khiển D-loop của các dân tộc Kinh, Thái, Hmong, Lolo và Giarai sẽ được so sánh với nhau và so sánh với trình tự chuẩn rCRS đã được công bố trên 8 ngân hàng cơ sở dữ liệu về ADN ty thể, từ đó phân loại sơ bộ theo các nhóm đơn bội sử dụng Haplogrep2 và PhyloTree Build 17. 1.2. Một số đặc điểm dân tộc học của người Kinh, Thái, Hmong, Lolo và Giarai Dân tộc Kinh Dân tộc Kinh (Việt) là một dân tộc hình thành tại khu vực địa lý mà ngày nay là miền Bắc Việt Nam và miền nam Trung Quốc. Người Kinh ở Việt Nam có dân số khoảng 65.795.718 người, là dân tộc chính chiếm 86,83% dân số cả nước. Người Kinh cư trú tại tất cả 63 tỉnh và thành phố của Việt Nam và một số nước khác, nhưng đông nhất vẫn là các vùng đồng bằng và thành thị trong nước. Các tỉnh và thành phố có số lượng người Kinh lớn nhất là: Thành phố Hồ Chí Minh (6.699.124 người), Hà Nội (6.370.244 người), Thanh Hóa (2.801.321 người), Nghệ An (2.489.952 người), Đồng Nai (2.311.315 người), An Giang (2.029.888 người). Ngôn ngữ chính sử dụng là tiếng Việt theo nhóm Việt-Mường (ngữ hệ Nam Á) [1]. Do điều kiện sống quần cư, người Kinh kiếm sống chủ yếu bằng sản xuất nông nghiệp, trong đó trồng trọt ruộng nước là chủ đạo. Dân số đông và trải dài khắp lãnh thổ Việt Nam nên trang phục của người Kinh khá đa dạng và phong phú tùy thuộc vào từng vùng miền và mang những nét đặc sắc riêng. Người Kinh thường ở nhà trệt với các khu nhà có thêm sân, vườn và ao. Đại bộ phận người Kinh sinh sống thành từng làng, dăm ba làng họp thành một xã. Gia đình của người Kinh hầu hết là những gia đình nhỏ gồm hai thế hệ theo chế độ phụ quyền nhưng người quản lý kinh tế trong gia đình lại thường là phụ nữ [1]. Dân tộc Thái Dân tộc Thái (còn có tên gọi khác là Tay Thanh, Man Thanh, Tay Mười, Hàng Tổng, Tay Dọ và Thổ) thuộc nhóm ngôn ngữ Tày – Thái (ngữ hệ Thái-Ka Đai). Dân tộc Thái ở Việt Nam có khoảng 1.328.725 người, là dân tộc có dân số đứng thứ 3 tại Việt Nam và định cư chủ yếu ở các tỉnh từ Tây Bắc đến Thanh Hóa, Nghệ An. Họ được phân chia thành hai nhóm chính: Thái Ðen (Tay Ðăm) và Thái Trắng (Tay Ðón hoặc Khao) [1]. 9 Người Thái trồng lúa nước với hệ thống thuỷ lợi nông nghiệp vùng thung lũng độc đáo. Bản người Thái thường gồm 50 nóc nhà sàn. Nhà sàn người Thái đen nóc hình mai rùa, chỏm đầu đốc có khau cút. Nam nữ Thái được tự do tìm hiểu và lựa chọn người vợ, người chồng của mình. Trước, người Thái theo chế độ hôn nhân mua bán và ở rể nên việc lấy vợ và lấy chồng phải qua 2 bước cơ bản là cưới lên (đong khửn) và cưới xuống (đong lông) [1]. Dân tộc Hmong Dân tộc Hmong (còn có tên gọi khác là Mẹo, Mèo, Miêu Hạ và Mán Trắng) có dân số là 787.604 người, đứng hàng thứ 8 trong bảng danh sách các dân tộc ở Việt Nam. Người Mông sinh sống tập trung ở các tỉnh miền núi Bắc Bộ, trong đó tập trung tại các tỉnh như Hà Giang (21,7%), Điện Biên (16%), Sơn La, Lai Châu, Yên Bái và một số ít ở miền núi tỉnh Nghệ An, Đắk Lắk, Thanh Hóa [1]. Kinh tế chủ yếu là nương định canh hoặc nương du canh và ruộng bậc thang trồng ngô, lúa, lúa mạch; nghề phụ có trồng lanh, các cây ăn quả như táo, lê, v.v.. Người Hmong quần tụ trong từng bản vài chục nóc nhà. Người Hmong rất coi trọng dòng họ bao gồm những người có chung tổ tiên. Người cùng họ dù không biết nhau, dù cách xa bao đời nhưng họ vẫn có thể nhận ra nhau qua cách trao đổi các đặc trưng riêng (chẳng hạn như những nghi lễ thờ cúng tổ tiên, nghi lễ ma chay, v.v.). Phong tục cấm ngặt những người cùng họ lấy nhau. Tình cảm gắn bó giữa những người trong họ sâu sắc. Gia đình nhỏ, phụ hệ. Phong tục cướp vợ khá phổ biến [1]. Dân tộc Lolo Dân tộc Lolo (có tên gọi khác là Màn Dì, Mùn Di, Di, La La, Qua La, Ô Man, hay Lu Lộc Màn) thuộc nhóm ngôn ngữ Tạng-Miến (ngữ hệ Hán – Tạng). Dân tộc này có dân số khoảng 3.307 người cư trú ở các huyện Đồng Văn, Mèo Vạc (Hà Giang), Bảo Lạc (Cao Bằng), Mường Khương (Lào Cai) [1]. Người Lolo chủ yếu làm ruộng nước và nương định canh với các cây trồng chính như lúa nếp, lúa tẻ và ngô. Người Lolo sống tập trung trong các bản với tình cộng đồng cao. 30 dòng họ khác nhau thường quần tụ trong phạm vi một làng bản, thờ cúng chung một ông tổ và có một khu nghĩa địa riêng. Họ thích các quan hệ 10 hôn nhân nội bộ tộc người và thực hiện nguyên tắc ngoại hôn giữa các dòng họ. Phong tục cưới xin của người Lolo mang nặng tính gả bán với việc thách cưới cao. Sau hôn nhân cô dâu cư trú bên chồng, con trai cô có thể lấy con gái cậu song không thể ngược lại. [1]. Dân tộc Giarai Người Giarai (có tên gọi khác là Chơ ray, Giơ ray) với dân số khoảng 317.557 người. Họ cư trú tập trung ở vùng núi Tây Nguyên, tỉnh Gia Lai – Kon Tum đến phía Bắc tỉnh Đắc Lắk, với ngôn ngữ chính là tiếng Giarai, một ngôn ngữ thuộc phân nhóm ngôn ngữ Chăm của ngữ tộc Malay-Polynesia trong ngữ hệ Nam Đảo. Người Giarai thuộc nhóm chủng tộc Austronesia [1]. Người Gia Rai là một nhánh lớn của tộc người Rang Đê cổ hay còn gọi là người Ê đê cổ được ghi chép khá nhiều trong các bia ký Chăm Pa, sự tấn công của đế quốc Mông Cổ, sau này là Nam Tiến của người Việt đã đẩy bộ phận người Chăm Pa lên vùng bình nguyên Cheo Reo hòa hợp với người Ê đê cổ tạo ra nhóm tộc người tự gọi là Anak Jarai tức con cái của Giarai. Người Giarai lấy kinh tế trồng trọt là cái gốc của hoạt động sản xuất, trong đó việc trồng lúa là nguồn sống chính của cư dân. Họ ở trong nhà sàn cho mỗi gia đình một vợ một chồng mẫu hệ. Dòng họ của người Giarai theo chế độ mẫu hệ nên phả hệ hoàn toàn tính về dòng mẹ. Mỗi họ là khối cộng đồng máu mủ được tập hợp lại và thường được phân chia nhiều ngành hoặc phân đôi, thành họ khác. Ở dân tộc Giarai, người cùng ngành họ và dòng mẹ bị nghiêm cấm lấy nhau. Do là chế độ mẫu hệ nên phong tục cưới xin thường do nhà gái chủ động. Phong lục chồng chết, vợ lấy em chồng và ngược lại được bảo lưu. Khi đã thành vợ chồng thì đàn ông phải sang nhà vợ và không có trường hợp ngược lại [1]. 11 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng chính của nghiên cứu này là 182 mẫu máu được thu thập từ các cá thể người khỏe mạnh của 5 dân tộc Kinh, Thái, Hmong, Lolo và Giarai sinh sống tại các tỉnh phía Bắc và Tây Nguyên. Trong đó, 51 mẫu máu thuộc dân tộc Kinh, 24 mẫu máu thuộc dân tộc Thái, 41 mẫu máu thuộc dân tộc Hmong, 36 mẫu máu thuộc dân tộc Lolo và 30 mẫu máu thuộc dân tộc Giarai (Bảng 1). Các cá thể người được lựa chọn là những người không có cùng huyết thống, có cả bốn ông bà nội ngoại thuộc cùng một dân tộc. Sau khi được cung cấp thông tin về nghiên cứu và giải thích các nội dung trong phiếu, các đối tượng cho mẫu sẽ điền các thông tin xác nhận đồng ý tự nguyện tham gia nghiên cứu vào “Phiếu đồng ý tự nguyện tham gia nghiên cứu”. Chỉ khi có chữ ký xác nhận của người cho mẫu hoặc người được ủy quyền, việc lấy mẫu máu mới được tiến hành. Mỗi đối tượng nghiên cứu được lấy từ 2-5ml máu toàn phần, các mẫu máu được bảo quản trong ống chống đông chứa EDTA và giữ ở -20oC. Bảng 1. Mẫu nghiên cứu của mỗi dân tộc Kinh, Thái, Hmong, Lolo và Giarai Dân tộc Mã số mẫu Tổng số mẫu Kinh Kinh01, Kinh02, Kinh03, Kinh04, Kinh05, Kinh06, 51 Kinh07, Kinh08, Kinh09, Kinh10, Kinh11, Kinh12, Kinh13, Kinh14, Kinh15, Kinh16, Kinh17, Kinh18, Kinh19, Kinh20, Kinh21, Kinh22, Kinh23, Kinh24, Kinh25, Kinh26, Kinh27, Kinh28, Kinh29, Kinh20, Kinh21, Kinh22, Kinh23, Kinh24, Kinh25, Kinh26, Kinh27, Kinh28, Kinh29, Kinh30, Kinh31, Kinh32, Kinh33, Kinh34, Kinh699, Kinh700, Kinh701, Kinh702, Kinh703, Kinh704, Kinh705, Kinh706, Kinh707, Kinh708, Kinh709, Kinh710, Kinh711, Kinh712, Kinh713, Kinh714, Kinh715 Thái Thai55, Thai56, Thai57, Thai99, Thai130, Thai136, 12 24