Tài liệu Phương pháp xác định đường khử đường tổng

Báo cáo Hóa học Thực phẩm Phương pháp xác định đường khử-đường tổng PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG KHỬ ĐƯỜNG TỔNG A.CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TỔNG QUÁT . I. Phương pháp Bertrand Phương pháp này dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm ( glucose, fructose, maltose) có thể dễ dàng khử đồng (II) oxid thành đồng (I) oxid có màu đỏ gạch, qua đó tính được lượng đường khử Định lượng đường khử thường dùng thuốc thử Fehling 1 và 2 .Khi trộn hỗn hợp này ta có phản ứng : CuSO4 + 2NaOH Cu(OH)2 + Na2SO4 Các phản ứng tiếp theo như sau: Cu2O + Fe2(SO 4)3 + H2SO 4 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O 10FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4 5Fe2(SO4)3 + 2MnSO4 + K2SO 4 + 8H2O Từ lượng KMnSO4 tiêu tốn từ đó ta tính được Cu(I) và tính được lượng Cu. Do đó tính được lượng đường đã dùng Vi dụ bảng tìm hàm lượng glucoza bằng phương pháp BERTRAND BẢNG TÌM LƯỢNG GLUCOZA Glucoza KMnO4 Glucoza KMnO4 Glucoza KMnO4 Glucoza KMnO4 (mg) 0,1N(ml) (mg) 0,1N(ml) (mg) 0,1N(ml) (mg) 0,1N(ml) 10 3,24 34 10,4 57 16,9 81 23,2 11 3,55 35 10,7 58 17,2 82 23,4 12 3,87 36 11,0 59 17,4 83 23,7 SVTH: HC04TP1 – Trường ĐHBK TPHCM Trang 1 Báo cáo Hóa học Thực phẩm Phương pháp xác định đường khử-đường tổng 13 4,17 37 11,3 60 17,7 84 14 4,49 38 11,6 61 18,0 85 15 4,80 39 11,9 62 18,2 86 16 5,12 40 12,2 63 18,5 87 17 5,43 41 12,5 64 18,8 88 18 5,73 42 12,7 65 19,0 89 19 6,05 43 13,0 66 19,3 90 20 6,36 44 13,3 67 19,5 91 21 6,67 45 13,6 68 19,8 92 22 6,96 46 13,9 69 20,1 93 23 7,27 47 14,1 70 20,2 94 24 7,57 48 14,4 71 20,5 95 25 7,84 49 14,7 72 20,8 96 26 8,14 50 15,0 73 21,1 97 27 8,45 51 15,2 74 21,3 98 28 8,74 52 15,5 75 21,6 99 29 9,03 53 15,8 76 21,8 100 30 9,33 54 16,1 77 22,1 31 9,63 55 16,4 78 22,4 32 9,94 56 16,6 79 22,6 33 10,10 80 22,9 II.Phương Pháp Luff-Schoorl Trong môi trường OH nhẹ, glucose bị khử trong thuốc thử Lupso cho kết tủa Cu2O, dùng để định lượng glucose CuSO4 + 4NaCO3 + 2HOOC- CH2 – C – CH2- COOH CH2 - COONa COOH CH2 - COONa O- Cu – O SVTH: HC04TP1 – Trường ĐHBK TPHCM Trang 2 23,9 24,1 24,3 24,6 24,8 25,1 25,3 25,6 25,9 26,1 26,3 26,6 26,8 27,0 27,3 27,5 27,8 Báo cáo Hóa học Thực phẩm C Phương pháp xác định đường khử-đường tổng COONa NaOOC C (A) CH2 - COONa CH2OH – (CHOH)4 – CHO + 2A + 2H2O – COOH CH2 - COONa Cu2O + CH2OH – (CHOH)4 COOH + 4NaOOC – CH2 – C – CH2 – COONa OH Cu2O + I2 + 4HCl 2CuCl2 + 2HI + H2O I2 + Na2S2O3 Na2S4O6 + 2NaI (Natrithiosulfat) Từ lượng Natrithiosulfat dùng để chuẩn độ lượng Iod dư ,ta có thể xác định được lượng đường ban đầu. Vi dụ :bảng tìm lượng glucoza theo LUFF-SCHOORL BẢNG ĐỂ TÌM LƯỢNG GLUCOZA THEO LUFF-SCHOORL Natri thiosunfat Natri thiosunfat Glucoza Glucoza 0,1N 0,1N ml mg Hiệu số ml mg Hiệu số 1 2,4 13 33,0 2,4 2,7 2 4,8 14 35,7 2,4 2,8 3 7,2 15 38,5 2,5 2,8 4 9,7 16 41,3 SVTH: HC04TP1 – Trường ĐHBK TPHCM Trang 3 Báo cáo Hóa học Thực phẩm 5 6 7 8 9 10 11 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 Phương pháp xác định đường khử-đường tổng 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 17 44,2 18 47,1 19 50,0 20 53,0 21 56,0 22 59,1 23 62,2 2,9 2,9 2,9 3,0 3,1 3,1 3,1 2,7 12 30,3 III. Phương pháp dùng đường kế Dựa trên sự phân cực ánh sáng của saccharose và dùng đường kế đo năng suất quang phân cực của sacchorose Dụng cụ : đường kế ,nhiệt kế .Bình định mức 100ml ,cân phân tích Cân 2,6 g đường khử cho vào cốc nước cất, cho vào bình định mức, cho dung dịch vào đường kế. Đọc chỉ số hàm lượng Saccharose trên đường kế. Trong 1 ống nghiệm, hút 1ml dung dịch saccharose và 1ml thuốc thử Fehling (pha 4 ml thuốc thử Fehling). Đun sôi cách thủy trong 3 phút, không có hoặc có ít trầm đỏ hiện ra. IV. Phương pháp định lượng đường khử bằng 3,5dinitrosalycylic acid Có một vài tác nhân được dùng để định lượng đường nhờ đặc tính của đường. 3,5-đinitrosalicylic acid (DNS) có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành 3-amino-5-nitrosalicylic có màu đỏ cam SVTH: HC04TP1 – Trường ĐHBK TPHCM Trang 4 Báo cáo Hóa học Thực phẩm Phương pháp xác định đường khử-đường tổng V.Định lượng đường khử theo Schaffer-Hartmann: Nếu ta pha trộn một dung dịch những ion đồng nhị thì ta có một cân bằng hóa học theo định luật tác dụng khối lượng : Cu++ + 4I 2Cu+ +2I- + I2 Nếu có một chất nào đó nhận mất tất cả ion Cu++ cân bằng hoàn toàn dịch chuyển về phía trái ,trong dung dịch bây giờ chỉ có các chất hóa học oxalocuivric và những ion I chứ không còn một iod tự do nào nữa. Bây giờ nếu ta thêm vào dung dịch một lượng thừa KIO3 và acid hóa dung dịch, IO3 - gặp ion I- phóng thích một lượng thừa ion là A . Nếu ta khử một phân hợp chất oxalo Cu2+ thành Cu+ 2Cu++ + 2OH2Cu+ + H2O + O _ _ CHO + O COOH và acid hóa sau 5KI + KIO3 + 3H2SO4 3I2 + 3H2O + 3K2SO4 Ion Cu+ sẽ hợp với một lượng I- cho CuI . Do đó khi acid hóa chỉ một phần I- còn lại tác dụng với KIO3 để phóng thích một lượng iod a. Vì vậy hiệu số ( A – a) tương ứng với lượng đường dựa vào phản ứng trên. VI. Phương pháp màu trên phổ quang kế Ferricyanur 2K3Fe(CN)6 + KOH 2K4Fe(CN)4 + H2O + O CH2OH - (CHOH)4 – CHO + O HOOC – (CHOH)4 - COOH Các loại đường khử có khả năng khử Ferricyanur ( Fe3+) thành ferrocyanur ,ion này sẽ có màu xanh đậm ( xanh prusse). Nhờ vậy ta có thể dùng phương pháp này để định lượng đường . SVTH: HC04TP1 – Trường ĐHBK TPHCM Trang 5 Báo cáo Hóa học Thực phẩm Phương pháp xác định đường khử-đường tổng Thuốc thử A: 1,33g Na 2CO3 + 162,5mg KCN + 250 ml nước cất Thuốc thử B : 375 mg K3Fe(CN)6 + 250 ml nước cất Thuốc thử C : 375 mg Fe{(NH4(SO4)2} + 250g sodium lauryl sulfat + 250ml H2SO4 0,005N Dung dịch mẫu 0,02 mg/ml cân 0,01 g hòa tan trong 500ml nước c ất Cho 1ml A + 1ml B đun sôi cách thủy, làm lạnh, cho 5ml ddC. Để yên trong 15 phút rồi đọc độ hấp thụ ở 690 nm. VII. Phương pháp đo màu Nếu rọi một dòng sáng (cường độ I0) vào một cuvet đựng dung dịch thì một phần nhỏ của nó (cường độ I r) bị phản xạ từ mặt cuvet, một phần khác (cường độ Ia) bị dung dịch hấp thụ, phần còn lại (cường độ I t) đi qua cuvet. Giữa các đại lượng này có hệ thức sau: I0 = Ia + Ir + It (1) Trong thực tế, vì đối với một loại phân tích ta chỉ sử dụng m ột cuvet, nên cường độ dòng sáng phản xạ là không đổi, nó lại không lớn nên có thể bỏ qua. Do đó phương trình trên có thể đơn giản thành: I0 = Ia + It (2) Bằng cách đo trực tiếp ta có thể xác định được cường độ dòng sáng rọi vào (Io) và dòng sáng đi qua dung dịch thí nghiệm (I t). Đại lượng Ia có thể tìm được theo hiệu số các đại lượng Io và It, chứ không đo trực tiếp được nó. Dựa trên nhiều thực nghiệm, P. Bougueur rồi I. Lambert đã thi ết l ập định luật phát biểu như sau: Những lớp chất hữu cơ chiều dày đồng nhất, trong những điều kiện khác như nhau, luôn luôn hập phụ một tỉ lệ như nhau của dòng sáng rọi vào những lớp chất đó. Định luật này được biểu diễn bởi phương trình: I t  I o .e  KL (3) Trong đó: It – Cường độ dòng sáng sau khi qua dung dịch Io – Cường độ dòng sáng rọi vào SVTH: HC04TP1 – Trường ĐHBK TPHCM Trang 6 Báo cáo Hóa học Thực phẩm Phương pháp xác định đường khử-đường tổng e – Cơ số logarit tự nhiên L – Chiều dày của lớp K – Hệ số hấp phụ Nếu đổi sang cơ số logarit thập phân ta được phương trình có dạng: I t  I o .10  KL (4) Trong phương trình này, hệ số K gọi là hệ số tắt. Từ định luật này ta suy ra: 1. Tỉ số giữa cường độ dòng sáng sau khi xuyên qua lớp dung dịch v ới cường độ dòng sáng rọi vào, không phụ thuộc vào cường độ tuyệt đối c ủa dòng sáng rọi vào. 2. Nếu chiều dày lớp dung dịch tăng theo cấp số cộng thì cường độ dòng sáng sau khi xuyên qua lớp đó giảm theo cấp số nhân. Để hiểu rõ ý nghĩa và trị số của hệ số K, ta giả thiết rằng cường độ dòng sáng sau khi qua lớp dung dịch giảm đi 10 lần, tức là: It 1  10  1 I o 10 Theo phường trình (4) thì 10 – KL = 10 – 1 = 10 và KL=1 Do đó: K  (5) 1 L Như vậy, khi hệ số tắt có trị số bằng đại lượng nghịch đảo của chiều dày lớp dung dịch (thường đo bằng cm) thì có khả năng làm c ường đ ộ dòng sáng đi qua nó yếu đi 10 lần. Hệ số K chỉ phụ thuộc vào bản chất chất tan và bước sóng ánh sáng rọi vào. Do đó định luật Bougueur_Lambert chỉ đúng cho tia đơn s ắc, t ức là cho ánh sáng có bước sóng xác định. Khi nghiên cứu sự hấp thụ ánh sáng bởi dung dịch, Beer đã xác định rằng hệ số tắt k tỉ lệ với nồng độ của chất hấp thụ, tức là: K=L C (6) Ở đây: C- Nồng độ chất tan  - Hệ số không phụ thuộc nồng độ. SVTH: HC04TP1 – Trường ĐHBK TPHCM Trang 7 Báo cáo Hóa học Thực phẩm Phương pháp xác định đường khử-đường tổng Định luật Beer tương tự định luật Bougueur_Lambert Đinh luật Bougueur_Lambert khảo sát sự thay đổi độ hấp phụ ánh sáng dung dịch có nồng độ không đổi, khi thay đổi chiều dày l ớp h ấp ph ụ. Còn định luật Bia khảo sát sự thay đổi độ hấp phụ ánh sáng bởi dung dịnh có chiều dày không đổi, khi thay đổi nồng độ. Kết hợp các công thức (4) và (6) ta được phương trình của định luật cơ bản của phương pháp đo màu: định luật Bougueur_Lambert -Beer: I t  I o .10   . L.C (7) Nếu nồng độ C được biểu diễn bằng phân tử gam/lít, còn chiều dày lớp L – bằng cm thì  gọi là hệ số tắt phân tử, đó là hệ số phụ thuộc vào bước sóng của ánh sáng rọi vào, bản chất chất tan, nhiệt độ dung dịch. Bằng cách biến đổi phương trình (7) ta có thể rút ra ý nghĩa của một đại lượng thường gặp trong phương pháp đo màu. Tỷ số giữa cường độ dòng sáng sau khi qua dung dịch (I t) với cường độ dòng sáng rọi vào dung dịch (Io) gọi là độ truyền qua, ký hiệu bằng: T It 10  CL Io Đại lượng T ứng với chiều dày lớp dung dịch bằng 1cm gọi là h ệ s ố truyền qua. Log của đại lượng nghịch đảo với độ truyền qua gọi là độ tắt, ký hiệu E (extinction) hay mật độ quang,ký hiệu D (optical dencity). E D Lg I 1 Lg o  .C.L T It Từ công thức này ta suy ra rằng mật độ quang D tỷ lệ thuận với nồng độ chất tan trong dung dịch. VIII.Phương Pháp Sắc Ký Giấy 1.Nguyên lý cơ bản của phương pháp : Có nhiều phương pháp sắc ký nhưng trong kỹ thuật chế biến thực phẩm, phương pháp sắc ký giấy được dùng nhiều nhất. 2.Giấy sắc ký : là loại giấy có khả năng giữ trên bề mặt một lượng nước lớn. Trong khí quyển bão hoà hơi nước, giấy thấm được 22% nước, SVTH: HC04TP1 – Trường ĐHBK TPHCM Trang 8 Báo cáo Hóa học Thực phẩm Phương pháp xác định đường khử-đường tổng theo trọng lượng giấy. Giấy sắc ký là loại giấy đặc biệt làm từ loại bông cao cấp, có hàm lượng xenluloza rất cao (>99%). Trị số Rf: Trị số Rf của một chất là chỉ số giữa quãng đường đi đựơc của chất đó trên quãng đường đi của dung môi (di động) trên giấy. Rf  trình : AB AC Giữa trị số Rf và hệ số phân bố (  ) liên hệ với nhau theo phương    A  1  1  P  R f  Trong đó : A- Độ ẩm giấy P- Khối lượng giấy Căn cứ vào trị số Rf (trong cùng một hệ dung môi, ở cùng một nhiệt độ) ta có thể biết được thứ tự sắp xếp của các chất cần phân chia trên gi ấy, nghĩa là có thể định tính đựơc các chất (các giá trị R f của các chất thường được công bố trong các sách). Tuy nhiên, trong thực tế, nhất là ở điều kiện nước ta (khí hậu, thiết bị, v.v…) giá trị Rf của chất cần phân chia thường không giữ được cố định, nên cách tốt nhất để nhận biết từng chất (định tính) là cho chất tiêu chu ẩn và chất cần phân chia chạy song song trên cùng một giấy sắc ký. Muốn tủ sắc ký bão hoà hơi dung môi thì tủ phải kín và trong tủ nên đặt một số cốc chứa dung môi, trong mỗi cốc có đựng một vài tấm giấy sắc ký. - Trong lượng phân tử : nói chung trị số R f tăng theo chiều tăng của trọng lượng phân tử các chất cần phân chia. - Dung môi : thường dùng rượu nhiều cacbon (butylic, amylic) làm dung môi chạy sắc ký các chất. Nếu tăng hàm lượng nước trong hệ dung môi thì Rf cũng tăng. Đặc biệt, nếu thêm axit hoặc bazơ vào hệ dung môi, sẽ làm thay đổi độ phân ly của chất tan, ảnh hưởng đ ến sự tích điện của nhóm chức phân cực của chất tan, do đó làm thay đổi rõ rệt trị số Rf, thậm chí có khi làm thay đổi cả thứ tự sắp xếp của các v ết chất tan trên sắc phổ. 3.Dung môi : SVTH: HC04TP1 – Trường ĐHBK TPHCM Trang 9 Báo cáo Hóa học Thực phẩm Phương pháp xác định đường khử-đường tổng Khả năng phân chia các chất phụ thuộc chủ yếu và hệ số phân b ố c ủa ch ất tan giữa hai tướng di động và bất động. Do đó việc lựa chọn dung môi có ý nghĩa quan trọng hàng đầu. Căn cứ để chọn dung môi di động : - Cần phải chọn dung môi di động nào mà trong dung môi đó các ch ất b ị phân chia có độ tan bé và cố định. Nếu chất bị phân chia có đ ộ tan l ớn thì nó sẽ di chuyển song song với dung môi. Nếu có độ tan bé trong dung môi di động thì chất cần phân chia sẽ nằm ngay tại vết chấm. Để phân chia tốt các chất thì hệ số phân bố của chúng ph ải l ớn h ơn 1 (   1 ), nghĩa là độ tan của chúng trong dung môi bất động phải lớn hơn dung môi di động. - Ngoài ra còn phải biết độ tan của các chất cần phân chia trong h ỗn hợp của chúng khác nhau thế nào trong dung môi. Trường hợp không khác nhau thì không thể phân chia được. - Đối với các chất tan trong nước thì dùng dung môi hữu cơ hoặc h ỗn hợp dung môi hữu cơ – nước để làm dung môi di động. Ngược lại, đối với các chất tan được trong dung môi hữu cơ mà không tan trong nước, thì dùng dung dịch nước bão hoà dung môi hữu c ơ làm dung môi di động. Trong trường hợp đầu, dung môi bất động là nước; trường hợp sau là các dung môi phân cực hoặc ít phân cực. 4.Các phương pháp chạy sắc ký Phương pháp một chiều : người ta cho dung môi di động chạy từ đầu trên của giấy xuống hoặc từ đầu dưới của giấy lên. Cho dung môi di động từ dưới lên chỉ có kết quả tốt khi các chất cần phải chia có R f khác nhau rõ rệt. Vì dung môi lúc này ngoài việc chịu tác dụng của lực mao dẫn hút lên, còn bị trọng lực kéo xuống. Cho dung môi di động từ trên xuống thường được dùng để tách h ỗn hợp các chất có Rf gần nhau. Ưu điểm của phương pháp này là : nhờ sức hút của trọng lực làm dung môi chạy xuống nhanh hơn, giúp cho các chất dễ tách khỏi nhau hơn. Tuy nhiên, phương pháp trên xuống đòi hỏi thao tác phức tạp hơn, nên để tách hỗn hợp ít chất và các chất có R f khác nhau rõ rệt, người ta hay dung phương pháp dưới lên. - Phương pháp hai chiều : ưu điểm của phương pháp này là tách đ ựơc h ỗn hợp các chất có Rf rất gần nhau mà trong phương pháp một chiều không thể SVTH: HC04TP1 – Trường ĐHBK TPHCM Trang 10 Báo cáo Hóa học Thực phẩm Phương pháp xác định đường khử-đường tổng tách ra đựơc. Trong phương pháp này, người ta cho hai dung môi chạy theo hai chiều giấy vuông góc với nhau. Ngoài ra còn phương pháp sắc ký tròn, cho dung môi chạy t ừ tâm gi ấy đặt nằm ngang toả ra các phía, song khả năng tách cũng không tốt l ắm, nên phương pháp này cũng ít phổ biến. 5. Các thuốc hiện màu sắc ký : Giấy sắc ký sau khi được nhỏ các chất cần phân chia, đ ể khô và cho vào tủ chạy sắc ký thì sau một thời gian nhất định, dung môi chạy trên giấy đến một đoạn nhất định, lấy giấy ra khỏi tủ và để khô và phun các thu ốc hi ện màu để hiện vết các chất cần phân chia trên sắc phổ. Nói chung, các thuốc hiện màu sắc ký là các chất hoá học, có phản ứng tạo thành hợp chất màu với chất cần phân chia (trong những điều ki ện ph ản ứng nhất định : nồng độ thuốc hiện, nồng độ các chất cần phân chia, nhiệt độ, v.v…) Có hai loại thuốc hiện màu sắc ký : - Thuốc hiện chung : là loại thuốc hiện có phản ứng với nhiều chất trong cùng hỗn hợp chất cần phân chia. - Thuốc hiện đặc biệt : là thuốc hiện chỉ có phản ứng đặc hiệu v ới một chất trong hỗn hợp chất cần phân chia. 6.Sắc ký định lượng : Định lượng là khâu cuối cùng, tiếp sau khâu định tính (tách các ch ất c ần phân chia trên giấy sắc ký). Thường tiến hành định lượng như sau : Sau khi sắc phổ được hiện màu bằng thuốc hiện thích hợp, dùng bút chì khoanh những vòng tròn diện tích bằng nhau quanh vết màu chất c ần xác định và chất chuẩn (chấm trên cùng một giấy sắc ký và cùng m ột đi ều ki ện chạy sắc ký) đồng thời khoanh một hoặc hai vòng trên khoảng giấy trắng (không có vết màu) để làm mẫu trắng. Sau đó cắt những khoanh tròn ra kh ỏi giấy và cho vào ống so màu, cho dung môi thích hợp đ ể thôi màu. Để m ột thời gian cho màu thôi ra hết, rồi đem đo màu trên máy so màu với kính l ọc và cuvet thích hợp. B.CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CAC LỌAI ĐƯỜNG I.Phương pháp định tính 1. Các phép thử hóa học Hydro Phép thử Điều kiện Kết quả SVTH: HC04TP1 – Trường ĐHBK TPHCM Trang 11 Báo cáo Hóa học Thực phẩm carbon Đường khử Glucose Fructose Phương pháp xác định đường khử-đường tổng Dung dịch Benedict Nghiền mẫu mô với một chút Đổi màu 3 nước, lọc cho 2 cm dịch chiết hoặc cho 3 vào ống nghiệm, thêm 2 cm dung kết tủa màu dịch Benedict, đun nóng tới 950C đỏ gạch Maltose trong 2 phút Lactose Dung dịch Cho 1 cm3 dung dịch Feling 1 và Đổi màu 3 Fehling 1 và 1cm dung dịch Fehling 2 vào hoặc cho 3 2 2cm dung dịch chiết mô, đến kết tủa màu 0 92 C trong 2 phút đỏ gạch Đường Dung dịch Thử như với đường khử sẽ Đổi màu không khử Benedict không cho phản ứng. Đun nóng 2 hoặc cho Saccharose cm3 dung dịch chiết mô tươi với kết tủa màu (đường mía) 1 cm3 dung dịch HCl loãng để đỏ gạch thủy phân đường mía thành các đường đơn , trung hòa bằng NaOH, làm phép thử như đối với đường khử Tinh bột Iot trong Nhỏ lên mẫu mô làm nát với nhiệt Màu xanh dung dịch độ trong phòng đen KI Glycogen Iot trong Nhỏ lên mẫu mô làm nát với nhiệt Màu đỏ tím dung dịch độ trong phòng KI Cellulose Dung dịch Cho lát cắt mô cho vào dung dịch Màu tím Schultz và đưa lên kính quang học để xem Lignin Dung dịch Cho lát cắt mô cho vào dung dịch Màu sáng đỏ phlorluxin và đưa lên kính quang học để xem acid hóa 2. Các phép thử bằng Enzym ♦ Glucose : xác định bằng Enzym hexokinase theo các phản ứng sau hexokin SVTH: HC04TP1 – Trường ĐHBK TPHCM Trang 12 Báo cáo Hóa học Thực phẩm Phương pháp xác định đường khử-đường tổng D-glucose + ATP phosphat + NADP+ ADP + glucose-6- G-6-phosphat dehydrogenase ADP + glucose-6-phosphat + NADP+ gluconate-6-phosphat + + NADPH +H ♦ Fructose : enzym hexokinase cũng tácđộng lên fructose . Xác định fructose sau khi đã xác định glucose D-glucose + ATP phosphat ADP + Fructose -6Glucose phospho isomerase ADP + Fructose -6-phosphat ♦ Galactose : Galactose dehyrogen + D-galactosenic acid + NADH + H NAD+ Glucose-6-phosphat D-galactose + Mannose : xác định mannose tự do theo phương trình phản ứng sau Hexokinase D-mannose + ATP Mannose-6-phosphat ADP + Phosphomannos Mannose-6-phosphat Fructose-6-phosphat ♦Saccharose : Saccharose thường không có trong tế bào động vật, xác định saccharose theo phương trình phản ứng sau đây: D-fructosidase SVTH: HC04TP1 – Trường ĐHBK TPHCM Trang 13 Báo cáo Hóa học Thực phẩm Phương pháp xác định đường khử-đường tổng Sacchrose + H2O fructose D-glucose + D- ♦ Maltose Maltose + glucosidase H2O 2 D-glucose ♦ Lactose thường có trong sữa - Lactose D-glucose + H2O D-galactose + ♦ Rafinose có trong củ cải đường -galactosidase Rafinose Saccharose + H2O D-galactose + ♦Tinh bột : có nhiều trong thực vật và trong một số vi sinh vật Tinh bột n-D-glucose Amyloseglucosida se + (n – 1) H2O 3. Phản ứng với amin thơm Nhiều amin thơm sẽ đông đặc lại với aldose và cetose trong acid acetic tinh khiết để hình thành các sản phẩm màu mà hệ số hấp thu của những chất này được dùng để định tính cho một glucid hoặc một nhóm glucid Sử dụng những amin thơm hoặc đo lường hấp thu ở những bước sóng xoay chiều xen kẻ để cho ra một độ riêng biệt cho mỗi loại đường. SVTH: HC04TP1 – Trường ĐHBK TPHCM Trang 14 Báo cáo Hóa học Thực phẩm Phương pháp xác định đường khử-đường tổng Glucose, mantose, glactose phản ứng với toluidine tạo ra các sản phẩm có màu xanh với cùng hệ số cực đại hấp thụ ở 630nm trong khi đó fructose không hấp thu ở bước sóng này . Disaccharide phản ứng ở những cấp độ khác nhau và pentose cho sản phảm màu mà phân tử có hệ số hấp thu trong khoảng 480-630nm Các amin thơm được sử dụng bao gồm p-aminosalicylic acid, paminobezoic, diphenylamin, p-aminophenol .P-aninophenol hoạt động ở nhóm ketose được dùng để định lượng fructose 4. Phản ứng với acid mạnh và phenol Khi đun một acid mạnh với pentose và hexose bị đehydrat hóa tạo thành dẫn xuất furfural và hyroxyfurfural . Nhóm andehyde của nhón này sẽ ngưng tụ với hỗn hợp phenolic tạo thành sản phẩm có màu làm cơ sở cho việc định tính glucid. SVTH: HC04TP1 – Trường ĐHBK TPHCM Trang 15 Báo cáo Hóa học Thực phẩm Phương pháp xác định đường khử-đường tổng Phản ứng màu của chất đường  Phản ứng màu tổng quát (phản ứng Molish) Tất cả các chất đường đều cho máu tím đối với dung dịch Naphthol trong H2SO4 đậm đặc. Đổ trong ống nghiệm 1ml dung dịch đường 1% và 2 giọt dung dịch Naphthol 15% trong rượu. Lắc đều, nghiêng ống và cho H2SO4 đậm đặc từ từ theo thành ống. Có sự tạo thành một lớp màu tím hiện ra ở mặt ngăn cách giữa hai chất lỏng. Nếu thay thế bằng anthrone tạo thành sản phẩm có màu xanh. SVTH: HC04TP1 – Trường ĐHBK TPHCM Trang 16 Báo cáo Hóa học Thực phẩm Phương pháp xác định đường khử-đường tổng  Phản ứng khử của đường Tính khử oxygen của cetose và aldose  Phản ứng với thuốc thử Fehling Thuốc khử này là dung dịch CuSO4 với dung dịch soude đậm đặc và tartrat kép natrium và kalium. Tác dụng của soude đậm đặc lên CuSO4 cho hydroxyd đồng( CuO , H2O) tan trong dung dịch nhờ sự hiện diện của tartrat . 2(CuO , H2O) → Cu2O + 2H2O + O Trong một ống nghiệm đổ 1ml thuốc thử Fehling và 1ml dung dịch glucose . Đun sôi cách thủy trong 5 phút có trầm hiện đỏ gạch Cu2O nhờ sự khử đồng nhị thành đồng nhất bởi glucose  Phản ứng với acid piric 2ml piric + 1 giọt kiềm đặc +1 ml glucose cho màu vàng SVTH: HC04TP1 – Trường ĐHBK TPHCM Trang 17 Báo cáo Hóa học Thực phẩm  Phương pháp xác định đường khử-đường tổng Phản ứng với thuốc thử phenyl hydrozin Trong môi trường acid acetic, chất đường tác dụng với phenyl hydrozin cho ta một hợp chất gọi là osazon được biểu tính ở dạng tinh thể, quang tính và dung điểm của chúng. Thuốc thử phenyl hydrazine Cân 1g Chlohyrate Phenyl hydrazine và 3g CH3-COONa thêm 1ml CH3COOH đậm đặc và 5 ml nước cất. Đun nhẹ lắc đều để hòa tan.  Phản ứng với thuốc thử phenyl hydrazin  SVTH: HC04TP1 – Trường ĐHBK TPHCM Trang 18 Báo cáo Hóa học Thực phẩm Phương pháp xác định đường khử-đường tổng Trong ống thử đựng 1ml thuốc thử phenyl hydrazin ta thêm 1ml trong những dung dịch sau đây : glucose, fructose , galactose , lactose , maltose, arabinose và xylose Đun sôi cách thủy trong 30 phút để nguội từ từ ta được một tinh thể màu vàng II.Phân tích định lượng Dựa vào các phương pháp đã trình bày trong phần A,ta có thể định lượng các loại đường  Một vài cách xác định các loại đường cụ thể Phân tích đường mía : Thành phần đường mía Lượng ( min- max)(g) Saccharose 71- 81,5 Đường khử 0,1- 0,5 Xơ bã 8- 13 Nước 80- 88 Xác định Saccharose : Phương pháp chỉ thị xanh methylen Phản ứng đường khử cũng tương tự như phương pháp Bertrand chỉ khác là Cu2O tạo nên được hòa tan bằng ferrocyanur kali, cuối cùng chỉ thị xanh methylen chuyển thành không màu Dung dịch Fehling A : 35 g CuSO4 .5H2O + 0.05 g xanh methylen + nước cất thành 100ml dung dịch Fehling B: 117g kali tatrat + 9,4 g kali ferrocyanur K4(Fe(CN)6) + 26,4 g NaOH + nước cất tạo thành 100ml dung dịch Cân 10g Saccharose cho vào bình định mức 200ml, cho thêm 100g nước cất và 1ml dung dịch HCl đặc. Đem đun trong nồi cách thủy ở 700C trong 30 phút, để nguội cho thêm nước cất để được dung dịch đường 5% Cân 10g đường khử cho vào bình nón 250 ml, cho 10 ml nước cất, 5 ml dung Fehling A và 5 ml dung dịch Fehling B, đem đun sôi, nhỏ nhanh dung dịch glucose tiêu chuẩn vào, màu xanh dung dịch sẽ chuyển thành không màu. X= (VO – V1)0.1 SVTH: HC04TP1 – Trường ĐHBK TPHCM Trang 19 Báo cáo Hóa học Thực phẩm Phương pháp xác định đường khử-đường tổng G G: Lượng đường kính đem phân tích VO : thể tích glucose chuẩn 0,1 g mẫu chuẩn V1: thể tích glucose chuẩn 0,1 g mẫu đường Đường cát, đường phèn, đường bột : Xác định hàm lượng đường khử Thành phần : cho 2g đường vào bình nón 250ml, thêm 100 ml nước cất, nhỏ vài giọt phenolphtalein 10%, trung hòa dung dịch bằng NaOH 20% + 20 – 50 ml dd Pb(CH3COONa)2 Lấy 25 ml dung dịch làm mẫu thử cho vào bình nón, cho thêm 25 ml dd F.A + 25 ml dd F.B, tiếp tục định lượng đường bằng một trong các cách trên . Xác định hàm lượng Saccharose: theo phương pháp Bertrand X= (A – B) . 0,95 A: lượng glucose sau thủy phân. B: lượng đường khử xác định được ở trên. Màu sắc Mùi Vị Hình thức Đường cát Vàng nhạt, vàng nâu. Đường bìnhthường Ngọt, không chua, không đắng Tinh thể đều, rời, khô. Đường phên Nâu tươi, nâu sẫm Thơm mùi đường Ngọt, không chua, không đắng Khối chữ nhật, sắc cạnh Đường bột Vàng nhạt, vàng nâu Thơm mùi đường Ngọt, không chua, không đắng Hạt nhỏ, tơi  Phân tích Glucose từ sản phẩm giàu tinh bột : Xác định hàm lượng glucose, maltose, dextrin, tinh bột trong sản phẩm : a) Phương pháp Bertrand cải tiến : Xác định glucose: Dùng thuốc thử oxi hóa riêng glucose : CuSO4 + 4NaCH3COO Na2SO4 + Na2 [Cu(CH3COO)4] SVTH: HC04TP1 – Trường ĐHBK TPHCM Trang 20